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CN105102475A - 钠通道敏感性芋螺肽和类似物，包括其组合物和方法 - Google Patents

钠通道敏感性芋螺肽和类似物，包括其组合物和方法 Download PDF

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CN105102475A
CN105102475A CN201380031793.7A CN201380031793A CN105102475A CN 105102475 A CN105102475 A CN 105102475A CN 201380031793 A CN201380031793 A CN 201380031793A CN 105102475 A CN105102475 A CN 105102475A
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peptides
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B·R·格林
J·咖也瓦克
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D·尤斯卡米
G·布拉杰
B·奥利韦拉
A·威肯登
Y·刘
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Janssen Pharmaceuticals Inc
University of Utah Research Foundation Inc
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Abstract

本发明涉及芋螺肽，其在锥体螺的毒液中以微量天然地可获得，或为天然地可获得的肽的类似物，并且其阻断钠通道。

Description

钠通道敏感性芋螺肽和类似物，包括其组合物和方法
发明领域
本发明涉及芋螺肽(conopeptide)和其类似物，其可控制或另外影响电压门控的钠通道，如Nav1.1-1.7通道的行为。许多芋螺肽在锥体螺(芋螺属)的毒液中以微量被发现。因此，本发明涉及化学、生物化学、分子生物学和药学等领域。
发明背景
本文利用的所有的出版物、专利和其它材料通过引用被并入。
芋螺属中海洋腹足类的毒液已产生为数众多的的结构和功能不同的肽组分。锥体螺毒液中鉴定的渐增种类的生物活性肽已提供对在使神经活性分子进化以适合它们不同的生物学目的中芋螺属物种采取的表面上无尽种类的方向的了解。
芋螺属中的生物活性肽(“芋螺肽”)被分成两大类：非富含二硫化物的和富含二硫化物的。后者通常称作芋螺毒素。非富含二硫化物的分类包括没有半胱氨酸的芋螺肽(contulakins和conorfamides)，和具有形成单个二硫键的两个半胱氨酸的芋螺肽(conopressins和contryphans)。包括富含二硫化物的分类的芋螺肽具有两个或多个二硫键。针对这些结构不同的芋螺肽鉴定的主要分类的分子靶标是电压门控和配体门控离子通道超家族的成员等等。
许多这些肽的结构和功能已确定。三种分类的靶标已被阐明：电压门控离子通道；配体门控离子通道和G蛋白连接的受体。
靶向电压门控离子通道的芋螺肽包括延迟钠通道失活的那些，以及对钠通道、钙通道和钾通道特异性的阻断剂。靶向配体门控离子通道的肽包括NMDA和血清素受体拮抗剂，以及竞争和非竞争性烟碱受体拮抗剂。对G蛋白受体起作用的肽包括神经降压素和血管加压素受体激动剂。芋螺毒素的药物选择性至少部分由特定的二硫键框架结合二硫化物环内高变的氨基酸限定。
电压门控的钠通道在包括肌肉的肌细胞以及中枢和周围神经系统的神经元在内的所有可兴奋细胞中被发现。在神经元细胞中，钠通道主要负责产生动作电位的快速上升。以该方式，钠通道对神经系统中电信号的开始和传播是必要的。钠通道合适和适当的功能因此对神经元的正常功能是必需的。因此，认为异常的钠通道功能为许多种医学病症——包括癫痫、心律失常、肌强直和疼痛——的基础。
目前存在电压门控的钠通道(VGSC)α亚单位家族的至少九个已知成员。该家族的名称包括CNx、SCNAx和Navx.x。VGSC家族已被系统发生地分成两个亚家族Nav1.x(除SCN6A外的所有)和Nav2.x(SCN6A)。Nav1.x亚家族可被在功能上细分成两类，对河豚毒素的阻断敏感的那些(TTX-敏感性或TTX-s)和抵抗河豚毒素的阻断的那些(TTX-抵抗性或TTX-r)。
Nav1.7，可选地写作NaV1.7、(PN1，SCN9A)VGSC，对河豚毒素的阻断敏感并且优选在周围交感神经和感觉神经元中表达。SCN9A基因已从包括人、大鼠和兔的许多物种克隆，并显示人和大鼠基因之间约90％的氨基酸同一性。
附图简述
图1A和1B显示C.geo1类似物对hNaV1.7的浓度响应曲线。图1A：内部截短的合成肽C.geo1[des-Ser34]的IC50值被计算为1.8μM。图1B：浓度响应曲线在全长肽上重复，除含有在位置24的氨基丁酸等排置换的类似物(C.geo1[C24Abu])外。
详细描述
在描述和要求保护本发明中，以下术语将根据下面提出的定义来使用。
单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”可包括复数的指示物，除非上下文另外清楚地指示。因此，例如，提及“一(a)肽”包括提及一个或更多这样的肽，提及“所述类似物”可包括提及一个或更多这样的类似物。
如本文所用，“对象”指可获益于根据本公开方面的组合物或方法施用的哺乳动物。对象的实例包括人，并还可包括其它动物如马、猪、牛、狗、猫、兔和水生哺乳动物。
如本文所用，术语“肽”可用于指天然或合成的分子，其包括两个或更多的氨基酸——由一个氨基酸的羧基与另一个的α氨基连接。本发明的肽不受长度限制，因此“肽”可包括多肽和蛋白质。氨基酸序列分别以氨基至羧基方向从左至右书写。
如本文所用，关于肽，术语“分离的”指已从其最初的环境去除的物质，如果该物质天然存在。例如，活的动物中存在的天然存在的肽不是分离的，但是从自然系统中共存的物质中的一些或全部分离的相同肽是分离的。这样的分离的肽可以是组合物的部分，并仍然是分离的，因为组合物不是其自然环境的部分。″分离的″肽还包括通过重组DNA技术合成或产生的物质或合成地产生的物质。
除非另外限定，本文使用的所有技术和科学术语具有与该发明所属领域的技术人员通常理解相同的意义。
如本文所用，术语“基本上”指作用、特性、性质、状态、结构、项目或结果的完全或几乎完全的范围或程度。例如，“基本上”被密封的物体将指该物体被完全密封或被几乎完全密封。与绝对完全的偏差的确切允许的程度在一些情况中可取决于特定的上下文(环境，context)。然而，通常说完全的接近将是这样的以具有相同的整体结果，好像获得绝对和完全完成。当以否定的含义使用时，“基本上”的使用是同等可适用的，指作用、特性、性质、状态、结构、项目或结果的完全或接近完全的缺少。例如，“基本上没有”颗粒的组合物将完全缺少颗粒，或几乎完全缺少颗粒，以至于效果将是相同的，好像它完全缺少颗粒。换言之，“基本上没有”成分或要素的组合物可仍然实际上含有这样的项目，只要不存在其可测量的效果。
如本文所用，术语“约”用于通过提供给定的值可以是端点“之上一点”或“之下一点”而不影响期望的结果而对数值范围端点提供灵活性。
如本文所用，多个项目、结构要素、组成要素和/或物质可以为了方便而存在于共同的名单中。然而，这些名单应被解释为名单的每个成员被个别地鉴定为单独和独特的成员。因此，这样的名单的个体成员不应仅基于它们在共同分组中的呈现，而被解释为同一名单任何其它成员的事实上相等物——在没有相反的指示的情况下。
浓度、量和其它数值数据在本文可以以范围形式被表达或呈现。应当理解，这样的范围形式仅为了方便和简洁而使用，因此应被灵活地解释为不但包括被明确地描述为范围界限的数值，而且包括该范围内包括的所有单个数值或子范围，好像每个数值和子范围被明确地描述。作为实例，“约1至约5”的数值范围应被解释为不但包括明确描述的约1至约5的值，而且包括指示的范围内的单个值和子范围。因此，该数值范围包括单个值如2、3和4和子范围如1-3、2-4和3-5等，以及单个的1、2、3、4和5。
该相同的原则适用于仅描述一个数值作为最小值或最大值的范围。此外，这样的解释应适用，而不管范围的宽度或正被描述的特性。
详细描述
本公开提供新的肽，其显示在阻断钠通道中的活性，包括多种相关的组合物和方法。更具体地，这些肽至少阻断电压门控的钠通道。本文中的许多描述与NaV1.7钠通道有关；然而应当理解，目前的范围包括电压门控或另外的任何钠通道，其受目前的肽的影响。注意，这些肽利用毒液分部分离(分馏，fractionation)、测序、克隆和转录组学的组合而衍生自纹芋螺(Conusgeographus)的毒液，并且目前的范围另外包括天然存在的肽、完全或部分合成的肽和其相关的类似物。
目前的肽可通过从芋螺属毒液的分离而被鉴定。另外，目前的肽可利用重组DNA技术，通过利用常规技术如逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)的使用或退化探针的使用筛选多种芋螺属物种的cDNA文库而被鉴定。RT-PCR的引物基于信号序列中的保守序列和推进器肽基因的3′非翻译区。与这些探针杂交的克隆可被分析以鉴定满足最小尺寸需要的那些，即，具有大约300个核苷酸(对于前体肽)的克隆，如对于正被检查的特定cDNA文库利用位于cDNA克隆位点两侧的PCR引物所测定的。这些最小尺寸的克隆然后可被测序。然后检查序列存在具有上面提到的肽特性的肽。测试该方法鉴定的肽的生物活性，如本文、美国专利号5,635,347或本领域常规所描述的。
目前的肽足够小以通过本领域熟知的技术被化学合成。肽通过合适的方法合成，如通过专有的固相技术(Merrifield固相合成)，通过部分固相技术，通过片段凝结或通过经典溶液偶联(solutioncouplings)。合适的技术由美国专利号4,105,603；3,972,859；3,842,067；3,862,925；4,447,356；5,514,774；5,591,821和7,115,708的公开内容来例示，每个通过引用被并入本文。在非限制性方面，固体肽合成程序可利用低预负载的王氏树脂结合假脯氨酸Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(ψMe，Mepro)-OH来优化以获得粗制线性产物的提高的纯度。
本文描述的各种肽还可通过利用美国专利号4,447,356；5,514,774和5,591,821——其公开内容通过引用被并入本文——中描述的技术，从特定芋螺属物种的分离和纯化而获得。本文描述的肽还可通过本领域熟知的重组DNA技术产生。
化学合成或重组DNA技术产生的肽可被分离，被还原(如需要)和被氧化以形成二硫键。一种形成二硫键的方法是在冷的室温下或在室温持续延长时期的线性肽的空气氧化。该程序导致大量生物活性的、二硫化物连接的肽的产生。氧化的肽可利用反相高效液相色谱法(HPLC)或类似方法分部分离以分离具有不同连接构型的肽。此后，通过比较这些部分(馏分，fraction)与天然物质的洗脱或通过利用测定，具有最大生物学效能的正确键合的特定部分可被测定。然而，由于由较小生物效能的其它部分的存在产生的稀释，稍微更高的剂量可以是有利的。
本文描述的肽的突变蛋白、类似物或活性片段也被考虑。目前的肽衍生的突变蛋白、类似物或活性片段可根据已知技术合成，包括保守氨基酸置换，如美国专利号5,545,723(具体参见第2栏第50行至第3栏第8行)；5,534,615(具体参见第19栏第45行至第22栏第33行)和5,364,769(具体参见第4栏第55行至第7栏第26行)——每个通过引用被并入本文——中所概括描述的。
在本发明的一个方面，提供具有7个半胱氨酸残基的新的肽，其中所述肽具有X1X2CX4X5X6X7X8X9CX11X12X13X14X15X16CCX19X20X21CX23C24X25X26X27X28C^(SEQID033)的序列。注意，X1-2、X4-9、X11-16、X19-21、X23和X25-28每个可独立地是允许产生的肽的功能性并且保持半胱氨酸残基的间距的任何氨基酸。C24是半胱氨酸或取代的半胱氨酸，^是羧化的C端，如在本文中进一步讨论的。
一方面，X27可以是赖氨酸或甘氨酸。另一方面，X6可以是羟脯氨酸或丙氨酸。再一方面，X23可以是天冬氨酸、γ-羧基谷氨酸或天冬酰胺。在另外的方面，X25可以是酪氨酸或天冬氨酸。
一方面，本发明提供具有序列GWCGDOGATCGKLRLYCCSGFCX23C24X25TKTC-X30^(SEQID001)的肽，其中O是羟脯氨酸，X23是天冬氨酸、天冬酰胺或羧基谷氨酸，C24是半胱氨酸或取代的半胱氨酸，X25是酪氨酸或天冬氨酸，X30是0至6个氨基酸的肽，并且^是羧化的C端。一方面，肽可以是分离的肽。另一方面，肽可以是合成的肽。为数众多的合成程序和技术是已知的，并且认为可用于产生合成的肽的任何这样的技术处于目前的范围内。例如，一方面，固体肽合成可被利用。
考虑许多种取代和/或变化，其允许钠通道的调节程度的可变性。以下取代和/或变化因此被期望仅仅是本发明实施方式的示例，并且不应被视为限制。表1例如显示在本发明的背景下获得的肽类似物的非限制性实例以展示少数考虑的部分。在一些实施方式中，来自SEQID001的C24是无巯基取代的半胱氨酸。在其它实施方式中，C24由可选的氨基酸残基置换。
在其它实施方式中，SEQID001的C24残基与许多种有用的肽形成二聚体。一方面，例如二聚体可以是根据SEQID001的第二肽，其在表1中显示为SEQID015。注意，第二肽可具有SEQID001的精确序列，与SEQID001基本上相似的序列，或任何程度的修饰——其允许肽的有益的功能性。
在其它实施方式中，C24用分子通过二硫键被可逆地修改。为数众多的二硫键是已知的，并且认为允许肽的足够功能性的可被利用的任何这样的键合处于目前的范围内。这样的取代分子的非限制性实例可包括谷胱甘肽、半胱氨酸、半胱胺、DTNB、硒代半胱氨酸、硒代谷胱甘肽和C24与链烷硫代磺酸盐试剂或硫代硫酸盐试剂反应的任何产物以及其组合。来自表1的显示可逆的取代的少数实例包括SEQID003、SEQID008、SEQID009、SEQID011、SEQID012、SEQID013、SEQID015、SEQID019、SEQID020和SEQID021。
在其它方面，C24被分子不可逆地取代。考虑为数众多的不可逆的取代，并且认为允许肽的足够功能性的任何这样的取代处于目前的范围内。不可逆地取代的分子的非限制性实例包括乙酰胺基甲基、C24与马来酰亚胺、乙烯基砜和相关的α，β-不饱和体系的反应产物、β-卤乙胺、α-卤羰基，或其组合。显示不可逆的取代的来自表1的一个实例是SEQID014。
另一方面，提供具有SEQID001的序列的肽，其中X23是天冬氨酸，C24是未取代的半胱氨酸，以及X25是酪氨酸，其中这样的序列是GWCGDOGATCGKLRLYCCSGFCDCYTKTC-X30^(SEQID022)。在更具体的方面，X30可以是SEQID002，其中产生的肽将是GWCGDOGATCGKLRLYCCSGFCDCYTKTCKDKSSA(SEQID023)。
在另外的方面，提供具有SEQID001的序列的肽，其中X23是天冬氨酸，C24被胱胺取代，以及X25是酪氨酸。在更具体的方面，X30可以是SEQID002，其中产生的肽可具有SEQID011的序列。
还注意，在一些方面，根据本发明方面的肽可进一步包括标记，如例如，荧光标记。这样的标记的肽可用于探查文库，如小分子文库。
表1
注意，许多种氧化折叠方法可用于产生肽类似物，并且认为任何有用的折叠技术处于目前的范围内。用于产生表1的示例性肽的各种折叠方法可以如下：在存在GSSH∶GSH的1∶1混合物的情况下折叠可用于产生SEQIDs003-009和SEQID014；在存在胱胺的情况下折叠可用于产生SEQID011和SEQIDs019-021；在存在胱氨酸的情况下折叠可用于产生SEQID012；和在存在铜离子的情况下折叠可用于产生SEQID010和SEQIDs016-018。作为其它实例，SEQID015和SEQID013可通过将其分别与DMSO和埃尔曼试剂(DTNB)反应而从SEQID010制备。肽可随后通过，例如RPHPLC被纯化，并且质量可通过MALDI质谱法被验证。
在本发明的另一方面，提供具有DWCGDAGDACGTLKLRCCSGLCNQYSGTCTG^(SEQID24)的序列的肽，其中^是羧化的C端。再一方面，提供具有CVGRDSKCGPPPCCMGMTCNYERVRKCT^(SEQID25)的序列的肽，其中^是羧化的C端。
表2显示作为IC50数据给出的多种活性肽类似物对hNaV1s亚型的选择性概况(profile)。该表中的数据显示所有三种肽都是hNav1.7的有效抑制剂。它们还显示C.geo1[desGSH](SEQID010)和C.geo1[胱胺](SEQID011)之间hNav1.7效能的相似性，这表明第二类似物可用作较不稳定的C.geo1[desGSH](SEQID003)的替代物。这些数据揭示类似物不阻断抗TTX的hNaV1.5。
表2
注意，给定的肽中的许多氨基酸可以是可变的，并且认为这样的变化处于目前的范围内。例如，Pro残基可用羟基-Pro取代；羟基-Pro残基可用Pro残基取代；Arg残基可由Lys、鸟氨酸、高精氨酸、去甲Lys(nor-Lys)、N-甲基-Lys、N，N-二甲基-Lys、N，N，N-三甲基-Lys或任何合成的碱性氨基酸取代；Lys残基可由Arg、鸟氨酸、高精氨酸、去甲Lys或任何合成的碱性氨基酸取代；Tyr残基可用任何合成的含有羟基的氨基酸取代；Ser残基可用Thr或任何合成的羟基化的氨基酸取代；Thr残基可用Ser或任何合成的羟基化的氨基酸取代；Phe和Trp残基可用任何合成的芳族氨基酸取代；并且Asn、Ser、Thr或Hyp残基可被糖基化。Tyr残基还可用3-羟基或2-羟基同分异构体(分别为间-Tyr或邻-Tyr)和相应的O-硫-和O-磷-衍生物取代或可用去甲Tyr(nor-Tyr)、硝基-Tyr、单-碘-Tyr或二-碘-Tyr取代。脂肪族氨基酸可由带有非天然的多达和包括n＝8的脂肪族分支或线性侧链CnH2n+2的合成衍生物取代。Leu残基可用Leu(D)取代。Trp残基可用卤-Trp、Trp(D)或卤-Trp(D)取代。卤素是碘、氯、氟或溴；优选碘用于卤素取代的Tyr和溴用于卤素取代的Trp。此外，卤素可被放射性标记，例如，125I-Tyr。
合成的芳族氨基酸的实例包括，但不限于，硝基-Phe、4-取代的-Phe，其中取代基是C1-C3烷基、羧基、羟甲基、磺基甲基、卤素、苯基、-CHO、-CN、-SO3H和-NHAc。合成的含有羟基的氨基酸的实例包括，但不限于，4-羟甲基-Phe、4-羟苯基-Gly、2，6-二甲基-Tyr和5-氨基-Tyr。合成的碱性氨基酸的实例包括，但不限于，N-1-(2-吡唑啉基)-Arg、2-(4-胡椒碱基(piperinyl))-Gly、2-(4-胡椒碱基)-Ala、2-[3-(2S)吡咯啉基(pyrrolininyl))-Gly和2-[3-(2S)吡咯啉基)-Ala。这些和其它合成的碱性氨基酸、合成的含有羟基的氨基酸或合成的芳族氨基酸由RSPAminoAcidAnalogues，Inc.，Worcester，MA描述在通过引用并入本文的BuildingBlockIndex，Version3.0(1999Catalog，含有羟基的氨基酸和芳族氨基酸，4-47页，碱性氨基酸，66-87页；还参见网站“amino-acids.com”)中，并可获自RSPAminoAcidAnalogues，Inc.，Worcester，MA。
在其它方面，Asn残基可被修饰以含有N-聚糖，并且Ser、Thr和Hyp残基可被修饰以含有O-聚糖(例如，g-N、g-S、g-T和g-Hyp)。聚糖可指任何N-、S-或O-连接的单-、二-、三-、多-或寡糖，其可通过本领域已知的合成或酶方法学连接于天然氨基酸或修饰氨基酸的任何羟基、氨基或巯基。构成聚糖的单糖可包括D-阿洛糖、D-阿卓糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-古洛糖、D-艾杜糖、D-半乳糖、D-塔罗糖、D-半乳糖胺、D-葡糖胺、D-N-乙酰-葡糖胺(GlcNAc)、D-N-乙酰-半乳糖胺(GalNAc)、D-岩藻糖或D-阿拉伯糖。这些糖可被结构上修饰，例如用一个或多个O-硫酸盐、O-磷酸盐、O-乙酰或酸性基团如唾液酸，包括其组合在内。聚糖还可包括相似的多羟基基团，如D-青霉胺2，5和其卤化的衍生物或聚丙二醇衍生物。糖苷键是β和1-4或1-3，优选1-3。聚糖和氨基酸之间的键合可以是α或β，优选α并且是l-。
粘蛋白型O-连接的寡糖通过GalNAc残基连接于Ser或Thr(或目前的肽的其它羟基化的残基)。单糖构建模块(buildingblocks)和连接于该第一GalNAc残基的键合限定“核心聚糖”，它们之中八个已被鉴定。对于每个核心聚糖限定糖苷键的类型(取向和连接性)。合适的聚糖和聚糖类似物进一步在美国专利号6,369,193中和在国际公开号WO00/23092中被描述，每个通过引用被并入本文。一方面，聚糖可以是Gal(β1→3)GalNAc(α1→)。
目前的肽可以是药理学上有益的，因为它们在动物中，例如在Nav1.7通道阻断或抑制中显出活性。因此，并入这样的肽的化合物可在指示钠通道(例如Nav1.7)阻断剂或抑制剂的病症的治疗中具有应用。
一方面，考虑药物组合物，其包括在药学上可接受的载体中的与SEQID001具有至少95％序列同一性的肽，包括其药学上可接受的盐或溶剂合物。另一方面，肽可具有SEQID001的序列。再一方面，X23可以是天冬氨酸，C24可以是未取代的半胱氨酸，以及X25可以是酪氨酸。在另外的方面，X30可以是SEQID002。另外，另一方面，X23可以是天冬氨酸，C24可以用胱胺取代，以及X25可以是酪氨酸。在另外的方面，X30可以是SEQID002。
含有化合物如肽作为有效成分的药物组合物可根据常规的药物配合技术来制备。参见，例如Remington：TheScienceandPracticeofPharmacy，21stEd.，LippincottWilliams&Wilkins，Philadelphia，2005。通常，治疗有效量的活性成分可以与药学上可接受的载体混合。载体可采取多种多样的形式，这取决于期望施用的制剂形式，例如，静脉内、经口、胃肠外或鞘内。递送方法的实例参见美国专利号5,844,077，其通过引用被并入本文。
对于经口施用，化合物可被配制成固体或液体制剂如胶囊、丸剂、片剂、锭剂、熔化物、粉剂、悬浮剂或乳剂。在制备口服剂型的组合物中，任何常用的药学介质可被利用，如例如，在口服液体制剂(如例如，悬浮剂、酏剂和溶液)的情况下，水、二醇、油、醇、调味剂、防腐剂、着色剂、悬浮剂等；或在口服固体制剂(如例如，粉剂、胶囊和片剂)的情况下，载体如淀粉、糖、稀释剂、粒化剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。由于它们在施用中的容易性，片剂和胶囊代表最有利的口服剂量单位形式，在该情况中显然利用固体药学载体。如期望，片剂可通过标准技术包有糖衣或包有肠溶衣。活性剂可被包封以使其稳定通过胃肠道，而同时允许跨过血脑屏障。
对于胃肠外施用，化合物可以溶于药学载体和作为溶液或悬浮液施用。说明性的合适载体是水、盐水、葡萄糖溶液、果糖溶液、乙醇、或动物、植物或合成来源的油。载体还可含有其它成分，例如防腐剂、悬浮剂、增溶剂、缓冲剂等。当化合物正被鞘内施用时，它们还可溶于脑脊髓液。
许多种施用途径是可用的。选择的具体方式将当然取决于选择的特定药物、正被治疗的状况(疾病，condition)的严重性和治疗效果需要的剂量。一般来说，该公开的方法可利用医学上可接受的任何施用方式——指产生活性化合物的有效水平而不引起临床上不能接受的不良反应的任何方式——实施。这样的施用方式包括经口、直肠、舌下、局部、经鼻、经皮或胃肠外途径。术语″胃肠外″包括皮下、静脉内、硬膜外、冲洗、肌肉内、释放泵或注入。例如，根据本发明的活性剂的施用可利用任何合适的递送方法实现，包括通过引用并入本文的美国专利号5,844,077中描述的那些。
可选地，靶向疗法可用于通过利用靶向系统如抗体或细胞特异性配体，将肽组合物更具体地递送到某些类型的细胞。由于许多种原因，靶向可以是期望的，例如如果剂是不能接受地有毒，或如果它将另外需要太高的剂量，或如果它将另外不能进入靶细胞。
活性剂——其是肽——还可在基于细胞的递送系统中被施用，其中将编码活性剂的DNA序列导入经设计用于在患者身体中尤其是在脊髓区域中植入的细胞。合适的递送系统在美国专利号5,550,050和公开的PCT申请号WO92/19195、WO94/25503、WO95/01203、WO95/05452、WO96/02286、WO96/02646、WO96/40871、WO96/40959和WO97/12635中被描述。合适的DNA序列可在开发的序列和已知遗传密码的基础上针对每个活性剂合成地制备。
在一些方面，活性剂可以以治疗有效量施用。活性化合物的″治疗有效量″或简单地″有效量″指足以以适用于任何医学治疗的合理的收益/危险比治疗期望状况的化合物的量。施用的实际量以及施用速度和时间过程可取决于正被治疗的状况的性质和严重性。治疗处方，例如对剂量、时机等的决策处于全科医生或专科医生的职责内，并通常考虑将被治疗的病症、个体患者的状况、递送部位、施用方法和医师已知的其它因素。技术和程序的实例可以在Remington：TheScienceandPracticeofPharmacy中找到。
剂量可以被适当地调节以局部地或全身地达到期望的药物水平。通常，本公开的活性剂在活性成分约0.001mg/kg至约250mg/kg，优选约0.01mg/kg至约100mg/kg，更优选约0.05mg/kg至约75mg/kg的剂量范围显出它们的效果。合适的剂量可以每天以多个亚剂量施用。通常，剂量或亚剂量可含有每个单位剂型约0.1mg至约500mg活性成分。另一个剂量可含有每个单位剂型约0.5mg至约100mg活性成分。剂量通常以较低的水平开始，并增加直到达到期望的水平。在对象中的响应在这样的剂量下不充分的情况中，甚至更高的剂量(或由不同的、更局限性的递送途径引起的有效的更高剂量)可以以达到患者耐受允许的程度而被利用。考虑在例如24小时里连续给药或每天多次给药以实现化合物的适当的全身水平。
有利地，组合物被配制为剂量单位，使每个单位适合供应固定剂量的活性成分。片剂、包衣片、胶囊、安瓿和栓剂是根据本发明的剂型的实例。
注意，精确的个体剂量以及每日剂量可根据标准的医学原理在使用人或动物的医师或兽医的指导下确定。
药物组合物将通常含有按全部组合物的重量计约0.0001至99wt.％或约0.001至50wt.％或约0.01至10wt.％的活性成分。除了活性肽，药物组合物和药物还可含有其它药学上有活性的化合物。其它药学上有活性的化合物的实例包括，但不限于，临床医学全部的主要领域中的镇痛剂、细胞因子和治疗剂。当与其它药学上有活性的化合物一起使用时，本发明的肽可以以药物鸡尾酒的形式被递送。鸡尾酒是与本发明一起可用的化合物的任一种与另一种药物或剂的混合物。在该实施方式中，常用的施用赋形剂(例如，丸剂、片剂、植入物、泵、可注射的溶液等)将含有当前的组合物以及补充的增效剂。鸡尾酒的个体药物每个以治疗有效量施用。治疗有效量将通过上面描述的参数确定；但是，无论如何，是这样的量，其建立在需要药物持续有效达到预期效果一段时间的身体区域中的药物水平。
Nav1.7阻断剂或抑制剂因此可有用地与另一种药理学上有活性的化合物组合，或与两种或更多的其它药理学上有活性的化合物组合，特别是在疼痛治疗中。这样的组合提供显著优势的可能性，包括患者依从性、给药容易性和协同活性。在这样的组合中，本文描述的芋螺肽可以结合其它治疗剂或剂同时、连续或分开施用。可以与本文描述的芋螺肽施用的剂包括通过引用被并入本文的US2012/0010207中描述的剂。
术语″药物组合物″指适合医学施用的物理上离散的相关部分。″剂量单位形式的药物组合物″指适合医学施用的物理上离散的相关单元，每个含有活性化合物的每日剂量或每日剂量的多倍(倍数，multiple)(上至四倍)或因数(几分之一，sub-multiple)(下至四十分之一)，其与载体结合和/或包封在包膜内。是否组合物含有每日剂量，或例如每日剂量的一半、三分之一或四分之一将取决于是否药物组合物一次或，例如分别一天两次、三次或四次施用。
如本文所用，术语″盐″指与无机或有机酸和/或碱形成的酸性和/或碱性盐，优选碱性盐。虽然药学上可接受的盐是优选的，特别是当利用本发明的化合物作为药物时，但是其它盐也发现实用性，例如在加工这些化合物中或当考虑非药物型应用时。这些化合物的盐可通过领域公认的技术来制备。
这样的药学上可接受的盐的实例包括，但不限于，无机和有机加成盐，如分别为盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐或磷酸盐和乙酸盐、三氟乙酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、苯甲酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、延胡索酸盐、马来酸盐、甲烷-磺酸盐、异硫代硫酸盐、茶碱乙酸盐、水杨酸盐等。低级烷基季铵盐等也是合适的。
如本文所用，术语″药学上可接受的″载体指无毒的、惰性的固体、半固体的液体填料、稀释剂、包封材料、任何类型的配制辅料，或简单地，无菌含水介质，如盐水。可充当药学上可接受的载体的材料的一些实例是糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖、淀粉如玉米淀粉和马铃薯淀粉、纤维素和其衍生物如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；西黄蓍胶粉；麦芽、明胶、滑石；赋形剂如可可脂和栓剂蜡；油如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，如丙二醇、多元醇如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；酯如油酸乙酯和十二烷酸乙酯、琼脂；缓冲剂如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原的水；等渗盐水、林格氏溶液；乙醇和磷酸盐缓冲液，以及药物配制中使用的其它无毒的相容物质。
根据配制者的判断，湿润剂、乳化剂和润滑剂如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、涂层剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于组合物中。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括，但不限于，水溶性抗氧化剂如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α生育酚等；和金属螯合剂如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
钠通道如Nav1.7可在多种疼痛状态，包括急性、炎性和/或神经性疼痛中发挥作用。小鼠伤害性的神经元中SCN9A基因的缺失导致机械和热痛阈的降低和炎性痛反应的降低或消失。在人类中，Nav1.7蛋白已显示在神经元特别是疼痛神经元中积累。Nav1.7功能突变的获得，家族性和偶发的，已与原发性红斑性肢痛症——以四肢灼痛和炎症为特征的一种疾病——和阵发性极度疼痛病症联系起来。另外，非选择性钠通道阻断剂利多卡因和美西律在家族性红斑性肢痛的情况中可提供症状缓解，并且卡马西平在减少PEPD发作的次数和严重性中是有效的。Nav1.7在疼痛中作用的进一步证据在SCN9A基因功能突变丧失的表型中找到。
因此，在本公开的另一方面，提供治疗钠通道显示活性增加的对象的状况或治疗所述状况的效应(影响，effect)的方法。这样的方法可包括向对象施用如本文已描述的治疗有效量的组合物来调节钠通道的活性。这样的状况的非限制的实例可包括，急性痛、慢性痛、神经性疼痛、癌症痛、糖尿病神经病变、炎性痛、三叉神经痛、围术期疼痛、内脏痛、包括手术后疼痛的伤害性疼痛和涉及内脏、胃肠道、颅结构、肌肉骨骼系统、脊柱、泌尿生殖系统、心血管系统和CNS的混合疼痛类型，包括癌症痛、背和口面疼痛、或其组合。还考虑这样的状况可以是神经学状况，包括脊髓损伤、外伤性脑损伤、周围神经损伤等。
可利用以下动物模型测试本发明的肽在降低或减轻疼痛中的作用，如神经性疼痛的SNL(脊神经结扎)大鼠模型、鹿角菜胶诱导的痛觉过敏模型、弗罗因德完全佐剂(CFA)诱导的痛觉过敏模型、热伤模型、福尔马林模型和贝内特模型以及美国专利申请号2011/0124711A1和美国专利号7,998,980中描述的其它模型。鹿角菜胶诱导的痛觉过敏和(CFA)诱导的痛觉过敏是炎性痛的模型。贝内特模型提供慢性痛的动物模型。
任何上述动物模型可用于评价本发明的肽在治疗疼痛中的有效性。有效性可与没有治疗或安慰剂对照比较。另外或可选地，有效性可以与一种或更多的已知的疼痛缓解药物比较来评价。
通常，生理学疼痛是经设计以预告危险的对象远离潜在的有害刺激的重要保护机制。疼痛系统通过特定组的初级感觉神经元运转，并且在一些情况中由伤害性刺激通过周围转导机制活化。这些感觉纤维在本领域称作伤害性感受器，并且它们的特征是小直径的轴突，具有缓慢的传导速度。伤害性感受器可编码伤害性刺激的强度、持续时间和性质；伤害性感受器突出至脊髓的地形学构造还允许编码刺激位置。
伤害性感受器在伤害性的神经纤维上发现，其中存在两种主要类型：A-δ纤维(有髓鞘的)和C纤维(无髓鞘的)。在背侧角中复杂处理之后，伤害性感受器输入产生的活性直接或通过脑干中继核传递到腹侧基底的丘脑，然后到皮质上，在那里产生疼痛感觉。
疼痛可通常分成急性或慢性。急性痛突然开始并且是短暂的(通常十二周或更少)。它通常与特殊原因如特殊损伤相关，并常常是尖锐的和严重的。它是这样的疼痛种类，其可在由手术、牙的操作、拉伤或扭伤产生的特殊损伤之后发生。急性痛通常不导致任何持续的生理学反应。相比之下，慢性痛是长期痛，通常持续超过三个月并导致显著的生理学和情绪问题。慢性痛的常见实例是神经性疼痛(例如疼痛的糖尿病神经病变、疱疹后神经痛)、腕管综合征、背痛、头痛、癌症痛、关节痛和慢性手术后疼痛。
当实质的损伤通过疾病或创伤发生于身体组织时，伤害性感受器活化的特性改变，并且在外周、损伤周围局部和伤害性感受器终止的中央存在致敏。这些作用导致提高的疼痛感觉。在急性痛中这些机制在促进可更好地使修复过程能够发生的防护行为中可以是有用的。正常的预期将是一旦损伤已治愈，敏感性就返回到正常。然而，在许多慢性痛状态中，高敏性比治愈过程继续更久，并常常是由于神经系统损伤。该损伤常常导致与适应失调和异常活性相关的感觉神经纤维异常。
当不适和异常敏感性是患者症状的特征时，临床疼痛呈现。患者趋于完全多样化，并可呈现多种疼痛症状。这样的症状包括：1)自发性疼痛，其可以是隐约的、强烈的或刺穿的；2)对伤害性刺激的夸大的疼痛反应(痛觉过敏)；和3)由通常无害的刺激产生的疼痛(异常性疼痛)。虽然遭受各种形式的急性和慢性痛的患者可具有相似的症状，但是潜在的机制可以不同，并且可因此需要不同的治疗策略。疼痛还可因此根据不同的病理生理学分成许多不同亚型，包括伤害性的、炎性的和神经性的疼痛。
伤害性疼痛由组织损伤或由可能引起损伤的强烈刺激引起。疼痛传入由损伤部位的伤害性感受器引起的刺激的转导活化，并在它们终止的水平活化脊髓中的神经元。这然后由脊束中转到脑，疼痛在脑被感知(Meyeretal.，1994)。伤害性感受器的活化激活两种类型的传入神经纤维。有髓鞘的A-δ纤维传输迅速，并且是形成尖锐的和刺痛感觉的原因，而无髓鞘的C纤维以较慢的速度传输，并传输隐约的或酸痛。中等至严重的急性伤害性疼痛是来自如下的疼痛的突出特征：中枢神经系统创伤、拉伤/扭伤、烧伤、心肌梗塞和急性胰腺炎、手术后疼痛(任何类型的手术操作之后的疼痛)、创伤后疼痛、肾绞痛、癌症痛和背痛。癌症痛可以是慢性痛如肿瘤相关的疼痛(例如骨痛、头痛、面部疼痛或内脏痛)或与癌症治疗相关的疼痛(例如化疗后综合征、慢性手术后疼痛综合征或放射后综合征)。癌症痛还可响应化疗、免疫疗法、激素疗法或放射疗法而发生。背痛可由于脱垂或破裂的椎间盘或腰面关节、骶髂关节、椎旁肌或后纵韧带的异常。背痛可自然消退，但是在一些患者中，它持续超过12周，变成慢性状况，其可以是特别地虚弱。
神经性疼痛目前被定义为由神经系统中的原发病灶或功能障碍引发或引起的疼痛。神经损害可由创伤和疾病引起，因此术语`神经性疼痛`包括具有不同病因学的许多病症。这些包括，但不限于，周围神经病变、糖尿病神经病变、疱疹后神经痛、三叉神经痛、背痛、癌症神经病变、HIV神经病变、假肢痛、腕管综合征、中枢性脑卒中后疼痛和与慢性酒精中毒有关的疼痛、甲状腺功能减退、尿毒症、多发性硬化、脊髓损伤、帕金森氏病、癫痫和维生素缺乏。神经性疼痛是病理性的，因为它没有保护作用。它常常在最初的原因已消散之后存在良好，通常持续数年，显著降低患者的生活质量。神经性疼痛的症状难于治疗，因为它们常常是多样性的，甚至在具有相同疾病的患者之间。它们包括自发性疼痛，其可以是连续的和突发的或异常的引起的疼痛，如痛觉过敏(对有害刺激的敏感性增加)和异常性疼痛(对通常无害刺激的敏感性)。
炎症性过程是复杂系列的生物化学和细胞事件，响应组织损伤或异物的存在而被活化，其导致肿胀和疼痛。关节炎疼痛是最常见的炎性痛。类风湿病是发达国家中最常见的慢性炎性状况之一，并且风湿性关节炎是失能的常见原因。风湿性关节炎的确切病因学未知，但是目前的假设表明遗传学和微生物学因素可能是重要的。据估计，几乎1600万美国人患有症状的骨关节炎(OA)或变性关节病，他们中的大部分超过60岁，因此随着群体年龄的增加，预期增加到4000万，造成这一巨大数量的公共卫生问题。具有骨关节炎的大部分患者由于相关的疼痛而寻求医学关注。关节炎对社会心理和身体功能具有显著影响，并已知是以后生活失能的最主要原因。强直性脊柱炎也是一种风湿性疾病，其引起脊柱和骶髂关节的关节炎。它从贯穿生命发生的背痛的间歇发作改变为攻击脊柱、周围关节和其它身体器官的严重的慢性疾病。
另一种类型的炎性痛是内脏痛，其包括与炎性肠病(IBD)相关的疼痛。内脏痛是与包括腹腔器官的内脏相关的疼痛。这些器官包括性器官、脾和部分消化系统。与内脏相关的疼痛可分成消化性内脏痛和非消化性内脏痛。引起疼痛的通常遇到的胃肠(GI)病症包括功能性肠紊乱(FBD)和炎性肠病(IBD)。这些GI病症包括宽范围的目前只是适度控制的疾病状态，包括，关于FBD，胃食管反流、消化不良、肠激惹综合征(IBS)和功能性腹痛综合征(FAPS)，和关于IBD，克罗恩氏病、回肠炎和溃疡性结肠炎，其所有均规律地产生内脏痛。其它类型的内脏痛包括与痛经、膀胱炎和胰腺炎相关的疼痛和骨盆痛。
应当注意，一些类型的疼痛具有多种病因学，因此可在超过一个区域中被分类，例如背痛和癌症痛二者都具有伤害性和神经性组分。其它类型的疼痛包括：(a)肌肉骨骼病症产生的疼痛，包括肌痛、纤维肌痛、脊椎炎、血清阴性的(非风湿样的)关节病、非关节性风湿病、抗肌萎缩蛋白病、糖原分解、多肌炎和化脓性肌炎；(b)心脏和血管痛，包括心绞痛、心肌梗塞、二尖瓣狭窄、心包炎、雷诺现象、scleredoma和骨骼肌缺血引起的疼痛；(c)头痛，如偏头痛(包括有先兆的偏头痛和无先兆的偏头痛)、丛集性头痛、紧张型头痛混合的头痛和与血管病症相关的头痛；(d)红斑性肢痛；和(e)口面疼痛，包括牙痛、耳痛、口灼伤综合征和颞下颌肌筋膜痛。
实施例
实施例1
毒液筛选
来自10个芋螺属物种的材料已被提取、分部分离和利用QPatch测定筛选hNaV1.7的阻断。芋螺属物种的概述和分部分离数据提供在表1中。基于最初的成果，总共393个部分已被收集和活性筛选。这些最初的粗制部分中，29个部分被鉴定为‘命中(hits)’，其显示≥30％的hNaV1.7的阻断(发现～9.2％的部分有活性)(表3)。
表3
筛选毒液文库概述
实施例2
芋螺肽部分的筛选
根据毒液部分的筛选和去褶合(deconvolution)，我们将地纹芋螺鉴定为在具有阻断hNaV1.7的芋螺肽组分方面有希望的物种。地纹芋螺毒液的最初筛选结果概括在表4中。
表4
来自地纹芋螺的粗分部分离的最初QPatch结果
部分 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
抑制％ 24a 32 21 42 27 37 28 41a 23 59a
部分 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
抑制％ 11 31 15 6 22 8 21 2 10a 15
部分 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
抑制％ 18 26 5 5 9 5 9 15 10 10
部分 31 32 33 34 34 36 37 38 39 40
抑制％ -14 20 42 27 6 3 -1 7 18 13
部分 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50
抑制％ 3 2 20 8 37 40 28 24b 33a 41a
部分 51 52 53 54 55
抑制％ 17a 22 -1 5 -7
芋螺肽材料从大约600mg冻干的地纹芋螺管提取并针对hNaV1.7筛选。对应全部芋螺肽材料的大约6mg相等物的部分量重悬于200μL体积中。
a表示由于密封故障而暴露较短。
bn＝2
显示≥30％的hNaV1.7阻断的部分以粗体指示
实施例3
命中的去褶合和鉴定
地纹芋螺粗制部分的最初筛选显示两种主要的阻断hNaV1.7反应的部分分类(参见表4)。这些部分的进一步纯化产生亚部分，其显示大于30％的hNaV1.7阻断：SubFr34.4(69％)、SubFr34.5(69％阻断)、SubFr33.5(34％阻断)、SubFr33.6(40％阻断)、SubFr33.7(31％阻断)(表5)。
表5
来自地纹芋螺部分的亚部分的QPatch结果
部分 32 32.2 32.3 32.4 32.5 32.6 32.7
抑制％ 20 15 18 18 25 26 29
部分 33 33.3 33.4 33.5 33.6 33.7 33.8
抑制％ 42 31 23 34 40 31 20
部分 34 34.3 34.4 34.5 34.6
抑制％ 27 33 69 69 18
部分 45 45.4 45.5 45.6 45.7
抑制％ 37 22a 13 30 8
部分 46 46.3 46.4
抑制％ 40 11 22
部分 47 47.4 47.5
抑制％ 28 23 23
显示≥30％的hNaV1.7阻断的部分以粗体表示
实施例4
来自地纹芋螺的Nav1.7活性肽的表征
SubFr33.6中鉴定的地纹芋螺活性肽的最初测序成果显示不完全的肽序列(GXCCGDOGATCKLRLYCCSGFCDCYTcTc...)，其中X表示氨基酸序列SEQID026中的错读。为了阐明该肽的全序列，质谱法和分子生物学技术平行使用。
分子生物学方法。由于天然活性肽的有限数量，进行RACE-PCR实验，试图阐明整个肽序列。根据PCR实验，鉴定了整个序列(GWCGDPGATCGKLRLYCCSGFCDCYTKTCKDKSSA)SEQID027。此外，利用分离自地纹芋螺管的RNA，转录组信息证实多个位置中的该序列。
质谱法分析。计算的质量(3739.2Da)——基于获自PCR实验的序列——和实验测定的质量(3934.4Da)差别是195.3Da，提示序列内修饰的残基的存在。
固相肽合成。基于获自PCR的未修饰的序列和转录组数据，地纹芋螺肽类似物利用标准的Fmoc-程序通过SPPS进行设计和合成。最初的合成物缺少Ser-34(在下面)。成功地重复活性肽的合成，产生类似物C.geo1[1-35](SEQID003)和C.geo1[C24Abu](SEQID004)。
SEQID028C.geo1[des-Ser34]：
GWCGDOGATCGKLRLYCCSGFCDCYTKTCKDKS_A^
SEQID029C.geo1[C24Abu，des-Ser34]：
GWCGDOGATCGKLRLYCCSGFCD(Abu)YTKTCKDKS_A^
SEQID003C.geo1[1-35]：
GWCGDOGATCGKLRLYCCSGFCDCYTKTCKDKSSA^
SEQID004C.geo1[C24Abu]：
GWCGDOGATCGKLRLYCCSGFCD(Abu)YTKTCKDKSSA^
*注释：Abu＝Fmoc-氨基丁酸；^表示羧化的C端
将合成的肽利用空气氧化和谷胱甘肽辅助的氧化方法折叠。折叠混合物通过半制备RP-HPLC纯化，折叠产物的分子质量通过MALDI-TOF质谱法验证。
电生理学。首先在犹他州大学测试折叠的肽类似物针对来自大鼠的NaV1.7的活性。C.geo1[des-Ser34](SEQID028)显示非常慢的可逆性和产生利用3.3μM肽的70％阻断。C.geo1[C24Abu，des-Ser34](SEQID004)中Cys24用氨基丁酸(Abu)等排取代将NaV1.7阻断降低到在10μM下20％，并迅速可逆(未显示数据)。这些数据提示Cys24对有效的NaV1.7阻断是必需的。因此，随后使用10nmolC.geo1[des-Ser34](SEQID028)用于在QPatch测定中针对人NaV1.7测试(图1)。
RACE-PCR：利用RACE-PCR来捕获整个序列(未修饰的；SEQID030)：GGTQHRALRSTIKLSLLRQHRGWCGDPGATCGKLRLYCCSGFCDCYTKTCKDKSSASSPSVLYPFLPES。未修饰的序列和MALDI-ToF数据之间的Δ质量是+197.1Da，提示序列的修饰。
MALDI-ToF分析：C.geo[1-35，des-Ser34](SEQID028)和C.geo1[1-35](SEQID003)的MALDI-ToF分析显示肽将‘重’305Da，指示在Cys-24形成的肽-GSH加合物。肽加合物可提示大量的Cys-24修饰，例如S-连接的糖基化。
实施例5
检验哪种Cys(Cys22或Cys24)在合成的、折叠的C.geo1中是游离的Cys残基。
折叠的C.geo1[desGSH](SEQID010)中游离半胱氨酸用4-乙烯吡啶(VP)烷基化，然后将肽还原，并将所有剩下的半胱氨酸用碘乙酰胺(IAM-碘乙酰胺)烷基化。然后将该方法处理的肽用内蛋白酶AspN消化，进行分析反相(RP)HPLC，收集所有的产物，并通过MALDI-TOF进行分析。发现峰1(17.16min，分析HPLC；[M+H]+＝1123.56)的质量与消化的C.geo1的肽片段DC(VP)YTKTC(IAM)K(SEQID031)的预期质量([M+H]+＝1123.93)相同。结果显示合成的C.geo1中Cys24为具有游离巯基并可能(二硫化物)连接于GSH的一种。
实施例6
合成的C.geo1中Cys残基的连接性
C.geo1[desGSH](SEQID010)用于该实施例。将肽用4-乙烯吡啶处理和通过HILC纯化。接下来，将其用三(2-羧乙基)膦(TCEP)处理45min，这引起肽的部分还原。最后，将混合物用N-乙基马来酰亚胺(NEM)处理，和通过分析RP-HPLC纯化。收集的峰1至5的质量通过MALDI-TOF来分析。获得以下结果：
a)峰1[M+H]+ 发现的＝3842.37，其对应3个闭合的二硫化物和烷基化的Cys24；
b)峰2[M+H]+ 发现的＝4093.56，2个闭合的二硫化物桥，1个用NEM烷基化的二硫化物；
c)峰3[M+H]+ 发现的＝4345.69，1个闭合的二硫化物桥，2个用NEM烷基化的二硫化物；
d)峰4[M+H]+ 发现的＝4345.66，1个闭合的二硫化物桥，2个用NEM烷基化的二硫化物；
e)峰5[M+H]+ 发现的＝4598.60，3个用NEM烷基化的二硫键。
将标记为峰1、2和3的中间体用TCEP处理1h，然后与IAM反应。产生的物质通过RP-HPLC纯化，然后用修饰的胰蛋白酶处理3h。接下来将该物质通过MALDI-TOF分析。基于全部数据，测定合成的C.geo1[desGSH](SEQID010)中的连接性是：Cys3-Cys18、Cys10-Cys22和Cys17-Cys29，其落入预测的VI/VII半胱氨酸框架中。它也是另外的证实：Cys24不涉及二硫键形成，但是还涉及合成的C.geo1的功能活性。
实施例7
C.geo2的发现
除了分离自地纹芋螺的生物学上有活性的C.geo1肽，第二活性肽已从亚部分34.5(C.geo2)鉴定。分离的肽的QPatch测定产生69％的hNaV1.7阻断。将分离的天然肽通过用二硫苏糖醇和4-乙烯吡啶处理而还原和烷基化，准备用于在犹他州大学通过埃德曼降解测序。测序成果显示XXCGDAGDACGTLKLRCCSGLCNQYSGTCS...(SEQID032)的部分肽序列，其中X表示氨基酸序列中的错读。利用部分序列，通过搜索如前所描述的地纹芋螺转录组数据来检索完全肽序列。C.geo2的完全序列显示标准的ω-芋螺肽半胱氨酸框架和与C.geo1共享相当量的序列同一性(～55％同源)；然而，C.geo2缺少C.geo1中观察到的另外的半胱氨酸(Cys-24)(参见下面的比对)。
C.geo1(SEQID003)GWCGDOGATCGKLRLYCCSGFCDCYTKTCKDKSSA^
C.geo2(SEQID024)DWCGDAGDACGTLKLRCCSGLCNQYSGTCTG^
*注释：粗体表示序列之间的同源性；^表示羧化的C端
特别感兴趣的是，ω-芋螺肽家族的成员通常具有终止密码子之后的C端[Ser-Ser-Ala]三肽。然而，C.geo1(SEQID003)已将三肽并入成熟序列，从而增加该肽家族的C端多样性。
实施例8
C.geo3的发现
3094.35Da的质量在地纹芋螺的活性SubFr33.6(40％的hNav1.7阻断)中被鉴定。肽序列在地纹芋螺的转录组数据中被鉴定(SEQID025)，其特征为相同的质量。然后将其在存在还原和氧化的谷胱甘肽的情况下合成和折叠。相同的期望质量的三个峰被收集，并针对hNav1.7和rNav1.7进行测试。在两种情况中，肽都不是有活性的。
要理解，本申请的上述组合物和方式只是说明本发明的优选实施方式。为数众多的修改和可选的排列可以由本领域技术人员想到，而不背离本发明的精神和范围，并且所附的权利要求意欲涵盖这样的修改和排列。因此，虽然本发明已结合目前认为是本发明最实用的和优选的实施方式在上面被具体和详细地描述，但是对本领域普通技术人员将明显的是可以做出为数众多的修改，包括，但不限于，大小、材料、形状、形式、功能和操作方式、装配和应用的变化，而不背离本文阐述的原理和构思。

Claims (44)

1.分离的肽，其具有序列GWCGDOGATCGKLRLYCCSGFCX23C24X25TKTC-X30^(SEQID001)，其中O是羟脯氨酸，X23是天冬氨酸、天冬酰胺或羧基谷氨酸，C24是半胱氨酸或取代的半胱氨酸，X25是酪氨酸或天冬氨酸，X30是0至6个氨基酸的肽，并且^是羧化的C端。
2.权利要求1所述的分离的肽，其中X是KDKSSA(SEQID002)。
3.权利要求1所述的分离的肽，其中所述肽是合成的肽。
4.权利要求1所述的分离的肽，进一步包括标记。
5.权利要求1所述的分离的肽，其中所述标记是荧光标记。
6.权利要求1所述的分离的肽，其被修饰以含有O-聚糖、S-聚糖或N-聚糖。
7.权利要求1所述的分离的肽，其中C24是无巯基的取代的半胱氨酸.
8.权利要求1所述的分离的肽，其中C24与SEQID001的第二肽形成二聚体。
9.权利要求1所述的分离的肽，其中C24由可选的氨基酸残基置换。
10.权利要求1所述的分离的肽，其中C24通过二硫键用分子可逆地修饰。
11.权利要求10所述的分离的肽，其中所述分子包括选自下列的成员：谷胱甘肽、半胱氨酸、半胱胺、DTNB、硒代半胱氨酸、硒代谷胱甘肽以及C24与链烷硫代磺酸盐试剂或硫代硫酸盐试剂反应的任何产物，和其组合。
12.权利要求1所述的分离的肽，其中C24用分子不可逆地修饰。
13.权利要求12所述的分离的肽，其中所述分子包括选自下列的成员：乙酰胺基甲基、C24与马来酰亚胺、乙烯基砜和相关的α,β-不饱和体系的反应产物、β-卤乙胺、α-卤羰基，或其组合。
14.权利要求1所述的分离的肽，其中X23是天冬氨酸，C24是未取代的半胱氨酸，和X25是酪氨酸。
15.权利要求14所述的分离的肽，其中X30是SEQID002。
16.权利要求1所述的分离的肽，其中X23是天冬氨酸，C24用胱胺取代，和X25是酪氨酸。
17.权利要求16所述的分离的肽，其中X30是SEQID002。
18.分离的肽，其具有7个半胱氨酸残基和X1X2CX4X5X6X7X8X9CX11X12X13X14X15X16CCX19X20X21CX23C24X25X26X27X28C^(SEQID033)的序列，其中X1-2、X4-9、X11-16、X19-21、X23和X25-28每个独立地是任何氨基酸，C24是半胱氨酸或取代的半胱氨酸，和^是羧化的C端。
19.权利要求18所述的分离的肽，其中所述肽进一步包括荧光标记。
20.权利要求18所述的分离的肽，其中所述肽是合成的肽。
21.权利要求18所述的分离的肽，其中C24是无巯基的取代的半胱氨酸。
22.权利要求18所述的分离的肽，其中C24与SEQID033的第二肽形成二聚体。
23.权利要求18所述的分离的肽，其中C24由可选的氨基酸残基置换。
24.权利要求18所述的分离的肽，其中C24通过二硫键用分子可逆地修饰。
25.权利要求24所述的分离的肽，其中所述分子包括选自下列的成员：谷胱甘肽、半胱氨酸、半胱胺、DTNB、硒代半胱氨酸、硒代谷胱甘肽和C24与链烷硫代磺酸盐试剂或硫代硫酸盐试剂反应的任何产物，和其组合。
26.权利要求18所述的分离的肽，其中C24用分子不可逆地修饰。
27.权利要求26所述的分离的肽，其中所述分子包括选自下列的成员：乙酰胺基甲基、C24与马来酰亚胺、乙烯基砜和相关的α,β-不饱和体系的反应产物、β-卤乙胺、α-卤羰基，或其组合。
28.权利要求18所述的分离的肽，其中X27可以是赖氨酸或甘氨酸。
29.权利要求18所述的分离的肽，其中X6可以是羟脯氨酸或丙氨酸。
30.权利要求18所述的分离的肽，其中X23可以是天冬氨酸、γ-羧基谷氨酸或天冬酰胺。
31.权利要求18所述的分离的肽，其中X25可以是酪氨酸或天冬氨酸。
32.药物组合物，其包括：
药学上可接受的载体中的与SEQID001具有至少90％序列同一性的肽，包括其药学上可接受的盐或溶剂合物。
33.权利要求32所述的药物组合物，其中所述肽具有SEQID001的序列。
34.权利要求32所述的药物组合物，其中X23是天冬氨酸，C24是未取代的半胱氨酸，和X25是酪氨酸。
35.权利要求34所述的药物组合物，其中X30是SEQID002。
36.权利要求32所述的药物组合物，其中X23是天冬氨酸，C24用胱胺取代，和X25是酪氨酸。
37.权利要求36所述的药物组合物，其中X30是SEQID002。
38.治疗钠通道显出活性增加的对象的状况或治疗所述状况的效应的方法，包括向所述对象施用治疗有效量的根据权利要求32所述的组合物来调节所述钠通道的活性。
39.权利要求38所述的方法，其中所述状况或所述状况的效应包括选自下列的成员：急性痛、慢性痛、神经性疼痛、癌症痛、糖尿病神经病变、炎性痛、三叉神经痛、围术期疼痛、内脏痛、包括手术后疼痛的伤害性疼痛和涉及内脏、胃肠道、颅结构、肌肉骨骼系统、脊柱、泌尿生殖系统、心血管系统和CNS的混合疼痛类型，包括癌症痛、背和口面疼痛或其组合。
40.权利要求38所述的方法，其中所述状况是神经学疾病，包括脊髓损伤、外伤性脑损伤、周围神经损伤。
41.肽，其具有序列DWCGDAGDACGTLKLRCCSGLCNQYSGTCTG^(SEQID024)，其中^是羧化的C端。
42.肽，其具有序列CVGRDSKCGPPPCCMGMTCNYERVRKCT^(SEQID025)，其中^是羧化的C端。
43.肽，其具有选自下列的序列：GWCGDOGATCGKLRLYCCSGFCDCYTKTCKDKSSA^(SEQID001)、序列DWCGDAGDACGTLKLRCCSGLCNQYSGTCTG^(SEQID024)、CVGRDSKCGPPPCCMGMTCNYERVRKCT^(SEQID025)以及SEQID001、SEQID024和SEQID025的衍生物，其中一个或更多的羟脯氨酸残基可以用脯氨酸取代；一个或更多的精氨酸残基可以用赖氨酸、鸟氨酸、高精氨酸、去甲Lys、N-甲基-赖氨酸、N,N-二甲基-赖氨酸、N,N,N-三甲基-赖氨酸或任何合成的碱性氨基酸取代；一个或更多的赖氨酸残基可以由精氨酸、鸟氨酸、高精氨酸、去甲赖氨酸或任何合成的碱性氨基酸取代；一个或更多的酪氨酸残基可以用任何合成的含有羟基的氨基酸取代；一个或更多的丝氨酸残基可以用苏氨酸或任何合成的羟基化的氨基酸取代；一个或更多的苏氨酸残基可以用丝氨酸或任何合成的羟基化的氨基酸取代；一个或更多的苯丙氨酸残基可以用任何合成的芳族氨基酸取代；一个或更多的色氨酸残基可以用任何合成的芳族氨基酸取代；和一个或更多的天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸或羟脯氨酸残基可以被糖基化；一个或更多的酪氨酸残基可以用3-羟基或2-羟基异构体(分别为间-Tyr或邻-Tyr)和相应的O-硫-和O-磷-衍生物取代或可用去甲Tyr、硝基-Tyr、单碘-Tyr或二碘-Tyr取代；脂肪族氨基酸可以由带有上至和包括n＝8的非天然脂肪族分支或线性侧链CnH2n+2的合成衍生物取代；Leu残基可用Leu(D)取代；Trp残基可用卤-Trp、Trp(D)或卤-Trp(D)取代；卤素是碘、氯、氟或溴，其任选地被放射性标记。
44.分离的肽，其具有选自SEQID003、SEQID010、SEQID011、SEQID022和SEQID023的序列。
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