CN105106231A - 壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物在制备抗肿瘤组合物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物在制备抗肿瘤组合物中的应用，所述的壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物是羧甲基壳聚糖去甲斑蝥素衍生物、羟乙基壳聚糖去甲斑蝥素衍生物或羟丙基去甲斑蝥素衍生物，所述的壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物分子中的羧甲基、羟乙基或羟丙基的摩尔百分数大于50%，去甲斑蝥素衍生物的摩尔百分数不小于10%。本发明的壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物具有显著的抑制肿瘤组织生长的作用，其效果优于去甲斑蝥素，在体内的存留时间长，从而降低了去甲斑蝥素的用药量，减少了毒副作用，具有减毒增效作用，在制备抑制和治疗抗肿瘤的药物、医疗器械、保健食品及生物制剂中应用，具有广阔的前景。
Description
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，涉及一种壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物及其在制备抑制和治疗肿瘤的组合物中的应用。
背景技术
恶性肿瘤严重危害着人类健康，位于重大疾病的首位，死亡率极高。我国作为一个发展中国家，随着人口老龄化进程的加快，以及环境污染问题的存在，恶性肿瘤发病率持续上升，肿瘤的防治形势非常严峻。
去甲斑蝥素(norcantharidin，NCTD)为斑蝥活性成分斑蝥素的衍生物，是我国开发的治疗癌症的药物。与斑蝥素比较，去甲斑蝥素的肾脏毒性和对泌尿系统的刺激作用有所减小，同时具有升高白细胞作用，并有较强的抗肿瘤作用，临床上用于肝癌、胃癌、结肠癌等的治疗。尽管去甲斑蝥素的毒性已经有所减小，但仍然存在对泌尿系统的毒性，同时其在体内的分布广泛、吸收消除时间短，降低了其对肿瘤的治疗效果，也增加了对其它脏器组织的毒性。因此，研究去甲斑蝥素的新型衍生物，降低用药量，延长其体内存留时间，具有十分重要的意义。
壳聚糖及其衍生物具有多种生物活性，如提高机体免疫力、抗肿瘤、调节血糖、调节血脂等，同时可生物降解吸收，分子结构中的氨基、羟基等活性基团，易于进行化学修饰。这些性质使其作为抗肿瘤药物载体具有独特的优势。申请号为200810229077.0的中国发明专利公开了一种水溶性斑蝥素和/或去甲斑蝥素壳聚糖衍生物及其制备方法，由壳聚糖和斑蝥素或者去甲斑蝥素反应得到，该衍生物水溶性好，毒副作用小，并具有抗肿瘤活性。关于壳聚糖的生物相容性研究的文献报道较多，由于壳聚糖不溶于水，其在体内的生物降解可产生局部的炎症反应。
发明内容
本发明的目的是提供一种壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物及其在制备抗肿瘤组合物中的应用，以弥补现有技术的上述不足。
羧甲基壳聚糖、羟乙基壳聚糖、羟丙基壳聚糖均为水溶性壳聚糖，与不溶于水的壳聚糖不同，羧甲基壳聚糖、羟乙基壳聚糖、羟丙基壳聚糖在体内易被人体吸收，经腹腔给药后，由腹腔吸收，血液运转，经肝脏降解，肾脏代谢，经尿液排出，其吸收降解无毒副作用。羧甲基壳聚糖、羟乙基壳聚糖、羟丙基壳聚糖在体内可降解生物材料研究中应用已有广泛的研究报道，在生物体的组织相容性好，而不溶于水的壳聚糖则会在体内引起局部炎症。
为实现上述发明目的，本发明采用以下具体的技术方案：
一种壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物在制备抑制和治疗肿瘤的组合物中的应用。
上述组合物是药物、医疗器械、保健食品或生物制剂。
上述壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物是羧甲基壳聚糖去甲斑蝥素衍生物、羟乙基壳聚糖去甲斑蝥素衍生物或羟丙基壳聚糖去甲斑蝥素衍生物。
上述壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物具体是由羧甲基壳聚糖、羟乙基壳聚糖或羟丙基壳聚糖与去甲斑蝥素反应生成。
所述的壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物，具有以下分子结构特征：
所述的壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物的分子结构中，R1为去甲斑蝥素和/或H、COCH3、CH2COONa、CH2COOK、CH2CH2OH、CH2CHOHCH3，R2为H、CH2COONa、CH2COOK、CH2CH2OH或CH2CHOHCH3，R3为H、CH2COONa、CH2COOK、CH2CH2OH或CH2CHOHCH3；其中R1为去甲斑蝥素的摩尔百分数不小于10%，即去甲斑蝥素的取代度不小于10%，R1为乙酰基（COCH3）的摩尔百分数小于50%；分子中的羧甲基（CH2COONa或CH2COOK）、羟乙基（CH2CH2OH）或羟丙基（CH2CHOHCH3）的摩尔百分数大于50%。本发明的壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物，其特征是：羧甲基（CH2COONa或CH2COOK）、羟乙基（CH2CH2OH）或羟丙基（CH2CHOHCH3）的取代位主要是C6-O位，也可以有少量的取代位是C3-O位或C2-N位，取代度大于50%（摩尔百分数），C2-N位的乙酰基（COCH3）小于50%（摩尔百分数），去甲斑蝥素的取代位是在C2-N位，去甲斑蝥素的取代度不小于10%（摩尔百分数）。
壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物的制备方法，包括以下步骤：
（1）取壳聚糖衍生物，蒸馏水溶解，搅拌溶解，调pH，得壳聚糖衍生物溶液；所述壳聚糖衍生物选自羧甲基壳聚糖、羟乙基壳聚糖或羟丙基壳聚糖；
（2）取去甲斑蝥素，溶解，得去甲斑蝥素溶液；
（3）搅拌下将去甲斑蝥素溶液滴加到壳聚糖衍生物溶液中，避光反应；
（4）反应物装入透析袋中，用蒸馏水透析，透析物经冷冻干燥，得壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物。
本发明的壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物具有显著的抑制肿瘤组织生长的作用，其效果优于去甲斑蝥素，在体内的存留时间长，从而降低了去甲斑蝥素的用药量，减少了毒副作用，具有减毒增效作用，在制备抑制和治疗抗肿瘤的药物、医疗器械、保健食品及生物制剂中应用，具有广阔前景。
具体实施方式
下面通过具体实施例来进一步详细说明本发明。
实施例1：壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物的制备
以水溶性的羧甲基壳聚糖、羟乙基壳聚糖、羟丙基壳聚糖为底物与去甲斑蝥素反应，制备了壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物，具体制备过程如下：
（1）壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物1的制备：称取1.0g羧甲基壳聚糖（羧甲基取代度95.5%，脱乙酰度83.2%，分子量96.5kD，糖单元摩尔数0.0033摩尔），置于50ml的三口瓶中，加入25ml蒸馏水，搅拌溶解，加三乙胺调pH9，得羧甲基壳聚糖溶液。称取2.2g去甲斑蝥素（0.012摩尔），溶解于10ml丙酮，得去甲斑蝥素丙酮溶液。搅拌下将去甲斑蝥素丙酮溶液滴加到羧甲基壳聚糖溶液中，室温、避光反应24h，反应物装入透析袋中，用蒸馏水透析，透析物经冷冻干燥，得1.15g壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物1（羧甲基壳聚糖去甲斑蝥素衍生物A）。
（2）羧甲基壳聚糖去甲斑蝥素衍生物B的制备：取1.0g羧甲基壳聚糖（羧甲基取代度82.4%，脱乙酰度88.6%，分子量1.4kD，糖单元摩尔数0.0044摩尔），置于50ml的三口瓶中，加入10ml蒸馏水，搅拌溶解，加三乙胺调pH8.0，得羧甲基壳聚糖溶液。称取0.75g去甲斑蝥素（0.0044摩尔），溶解于5ml丙酮，得去甲斑蝥素丙酮溶液。搅拌下将去甲斑蝥素丙酮溶液滴加到羧甲基壳聚糖溶液中，45℃、避光反应12h，反应物装入透析袋中，用蒸馏水透析，透析物经冷冻干燥，得0.91g壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物2（羧甲基壳聚糖去甲斑蝥素衍生物B）。
（3）壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物3的制备：称取2.0g羟乙基壳聚糖（羟乙基取代度78.2%，脱乙酰度88.5%，分子量126.6kD，糖单元摩尔数0.01摩尔），置于50ml的三口瓶中，加入10ml蒸馏水，10ml甘油，搅拌溶解，加三乙胺调pH9.0，得羟乙基壳聚糖溶液。称取7g去甲斑蝥素（0.04摩尔），溶解于15ml丙酮，得去甲斑蝥素丙酮溶液。搅拌下将去甲斑蝥素丙酮溶液滴加到羟乙基壳聚糖溶液中，室温、避光反应24h，反应物装入透析袋中，用蒸馏水透析，透析物经冷冻干燥，得3.12g壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物3（羟乙基壳聚糖去甲斑蝥素衍生物A）。
（4）壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物4的制备：称取2.0g羟乙基壳聚糖（羟乙基取代度78.2%，脱乙酰度88.5%，分子量126.6kD，糖单元摩尔数0.01摩尔），置于50ml的三口瓶中，加入10ml蒸馏水，10ml甘油，搅拌溶解，加三乙胺调pH9.0，得羟乙基壳聚糖溶液。称取7g去甲斑蝥素（0.04摩尔），溶解于10ml丙酮，5ml甘油，5ml聚乙二醇2000，得去甲斑蝥素丙酮溶液。搅拌下将去甲斑蝥素丙酮溶液滴加到羟乙基壳聚糖溶液中，室温、避光反应12h，反应物装入透析袋中，用蒸馏水透析，透析物经冷冻干燥，得3.12g壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物4（羟乙基壳聚糖去甲斑蝥素衍生物B）。
（5）壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物5的制备：称取2.1g羟丙基壳聚糖（羟丙基取代度73.1%，脱乙酰度85.2%，分子量105kD，糖单元摩尔数0.01摩尔），置于50ml的三口瓶中，加入20ml蒸馏水，搅拌溶解，加三乙胺调pH7.5，得羟丙基壳聚糖溶液。称取5g去甲斑蝥素（0.03摩尔），溶解于10ml丙酮，10ml甘油，得去甲斑蝥素丙酮溶液。搅拌下将去甲斑蝥素丙酮溶液滴加到羟丙基壳聚糖溶液中，室温、避光反应24h，反应物装入透析袋中，用蒸馏水透析，透析物经冷冻干燥，得2.5g壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物5（羟丙基壳聚糖去甲斑蝥素衍生物A）。
（6）壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物6的制备：称取2.1g羟丙基壳聚糖（羟丙基取代度73.1%，脱乙酰度85.2%，分子量105kD，糖单元摩尔数0.01摩尔），置于50ml的三口瓶中，加入20ml蒸馏水，搅拌溶解，加三乙胺调pH7.5，得羟丙基壳聚糖溶液。称取5g去甲斑蝥素（0.03摩尔），溶解于10ml丙酮，5ml甘油，5ml聚乙二醇2000，得去甲斑蝥素丙酮溶液。搅拌下将去甲斑蝥素丙酮溶液滴加到羟丙基壳聚糖溶液中，室温、避光反应12h，反应物装入透析袋中，用蒸馏水透析，透析物经冷冻干燥，得2.5g壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物6（羟丙基壳聚糖去甲斑蝥素衍生物B）。
由于去甲斑蝥素在210nm波长处有特征性紫外吸收峰，因此配制去甲斑蝥素标准溶液为对照，用紫外分光光度法测定实施例3制备的6种壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物的去甲斑蝥素的摩尔百分数，即去甲斑蝥素的取代度。测定结果显示：
壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物1的去甲斑蝥素取代度为54.2%；
壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物2的去甲斑蝥素取代度为12.8%；
壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物3的去甲斑蝥素取代度为73.6%；
壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物4的去甲斑蝥素取代度为74.8%；
壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物5的去甲斑蝥素取代度为28.1%；
壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物6的去甲斑蝥素取代度为36.9%。
在实施例1中，以羧甲基壳聚糖、羟乙基壳聚糖或羟丙基壳聚糖为底物，与去甲斑蝥素反应制备壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物，该反应对羧甲基壳聚糖、羟乙基壳聚糖或羟丙基壳聚糖的分子量没有限制，不同分子量的羧甲基壳聚糖、羟乙基壳聚糖或羟丙基壳聚糖与去甲斑蝥素反应均能达到同样的效果。
实施例2：壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物对肿瘤组织生长的抑制作用
实验动物为昆明种小鼠，雌雄各半，体重18～20g。复苏小鼠肝癌细胞H22，细胞常规培养后，用生理盐水调节细胞密度1.0×107/ml，接种于初代小鼠腹腔，0.5ml/只。接种5~7天后，进行腹腔传代，连续传3代。取腹腔传代生长良好的H22荷瘤小鼠，以颈椎脱臼法处死。无菌条件下抽取腹水瘤液，离心，用生理盐水调节细胞密度为2.0×107/ml，接种于正常小鼠左前肢腋窝皮下，每只0.2ml，制作小鼠H22荷瘤模型。
造模24h后将荷瘤小鼠随机分组，每组10只：
模型对照组：给予生理盐水；
实验1组：给予壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物1的生理盐水溶液；
实验2组：给予壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物2的生理盐水溶液；
实验3组：给予壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物3的生理盐水溶液；
实验4组：给予壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物4的生理盐水溶液；
实验5组：给予壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物5的生理盐水溶液；
实验6组：给予壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物6的生理盐水溶液；
去甲斑蝥素对照组：给予去甲斑蝥素生理盐水溶液。
模型对照组腹腔注射给予生理盐水；6个实验组分别腹腔注射给予对应的壳聚糖基去甲斑蝥素生理盐水溶液，剂量为10mg/kg·2d；去甲斑蝥素对照组腹腔注射给予去甲斑蝥素生理盐水溶液，剂量为2mg/kg·d。模型对照组、实验组均隔日给药一次，共给药6次，每次给予体积0.5ml，去甲斑蝥素对照组每日给药一次，共给药12次。实验共进行12d。小鼠于末次给药后24h，脱颈椎处死，剖离瘤块，称瘤重，计算抑瘤率。实验结果如表1。
表1壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物对肿瘤组织生长的影响
| 组别 | 抑制率（%） |
| 模型对照组 | — |
| 去甲斑蝥素对照组 | 33.45 |
| 实验1组 | 55.08 |
| 实验2组 | 40.37 |
| 实验3组 | 63.35 |
| 实验4组 | 61.65 |
| 实验5组 | 48.31 |
| 实验6组 | 52.23 |
可以看出，本发明的壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物具有显著的抗肿瘤作用。由此可见，壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物具有显著的抑制肿瘤组织生长的作用，其效果优于去甲斑蝥素，具有增效作用，同时用药次数少。
实施例3：壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物的排泄
以大鼠为实验动物，随机分为7个组，每组3只：
生理盐水对照组：给予生理盐水；
实验1组：给予壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物1的生理盐水溶液；
实验2组：给予壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物2的生理盐水溶液；
实验3组：给予壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物3的生理盐水溶液；
实验4组：给予壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物4的生理盐水溶液；
实验5组：给予壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物5的生理盐水溶液；
实验6组：给予壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物6的生理盐水溶液；
去甲斑蝥素对照组：给予去甲斑蝥素生理盐水溶液。
各组的给予体积均为0.5ml，其中壳聚糖基去甲斑蝥素溶液的浓度为10mg/ml（w/v），去甲斑蝥素溶液的浓度为4mg/ml（w/v），给药后不同时间测定尿液中的去甲斑蝥素累积排泄率。结果如表2。
表2.壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物的累积排泄率
| 组别 | 24h | 48h | 72h | 96h | 120h | 144h |
| 生理盐水对照组 | — | — | — | — | — | — |
| 去甲斑蝥素对照组 | 85.13% | 98.52% | 99.53% | 99.57% | 99.83% | 99.98% |
| 实验1组 | 28.63% | 37.54% | 42.56% | 51.53% | 59.24% | 65.91% |
| 实验2组 | 27.37% | 35.36% | 41.42% | 47.17% | 55.24% | 63.42% |
| 实验3组 | 24.38% | 28.48% | 39.21% | 45.32% | 52.21% | 60.87% |
| 实验4组 | 22.15% | 26.41% | 35.13% | 42.27% | 50.37% | 58.89% |
| 实验5组 | 21.47% | 26.17% | 36.29% | 41.75% | 46.18% | 52.32% |
| 实验6组 | 20.42% | 22.57% | 31.54% | 37.15% | 43.27% | 49.29% |
实验结果表明，去甲斑蝥素体内排泄快，给药后24小时大部分去甲斑蝥素排出体外，因此去甲斑蝥素治疗的用药次数多，药量大，副作用大。
本发明的壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物是以羧甲基壳聚糖、羟乙基壳聚糖或羟丙基壳聚糖为载体，与去甲斑蝥素反应生成，显著延长了其在体内的存留时间，因此壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物在体内的排泄时间延长，从而降低了去甲斑蝥素的用药量，减少了毒副作用，并且得到显著疗效。
本发明的壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物具有显著的抑制肿瘤组织生长的作用，其效果优于去甲斑蝥素，具有减毒增效作用，在制备抑制和治疗肿瘤的药物、医疗器械、保健食品及生物制剂中应用，具有广阔前景。
Claims (4)
1.一种壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物在制备抑制和治疗肿瘤的组合物中的应用。
2.如权利要求1所述的壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物，其特征是：所述的组合物是药物、医疗器械、保健食品或生物制剂。
3.如权利要求1所述的壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物，其特征是：所述的壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物是羧甲基壳聚糖去甲斑蝥素衍生物、羟乙基壳聚糖去甲斑蝥素衍生物或羟丙基去甲斑蝥素衍生物，所述的壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物分子中的羧甲基、羟乙基或羟丙基的摩尔百分数大于50%，去甲斑蝥素衍生物的摩尔百分数不小于10%。
4.如权利要求1-3所述的壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物的制备方法，其特征是包括以下步骤：
（1）取壳聚糖衍生物，蒸馏水溶解，搅拌溶解，调pH，得壳聚糖衍生物溶液；所述壳聚糖衍生物选自羧甲基壳聚糖、羟乙基壳聚糖或羟丙基壳聚糖；
（2）取去甲斑蝥素，溶解，得去甲斑蝥素溶液；
（3）搅拌下将去甲斑蝥素溶液滴加到壳聚糖衍生物溶液中，避光反应；
（4）反应物装入透析袋中，用蒸馏水透析，透析物经冷冻干燥，得壳聚糖基去甲斑蝥素衍生物。
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| CN1698899A (zh) * | 2005-05-15 | 2005-11-23 | 蒋斯扬 | 以壳聚糖或其衍生物作为药物载体的新型药物组合物 |
| CN101716145A (zh) * | 2009-12-09 | 2010-06-02 | 暨南大学 | 改性壳聚糖靶向载药纳米微球及其制备方法 |
| CN101735335A (zh) * | 2008-11-26 | 2010-06-16 | 沈阳药科大学 | 一种水溶性斑蝥素和/或去甲斑蝥素壳聚糖衍生物及其制备方法 |
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