CN105037538A - 优化的Fc片段及其优化方法和应用 - Google Patents
优化的Fc片段及其优化方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105037538A CN105037538A CN201510548566.2A CN201510548566A CN105037538A CN 105037538 A CN105037538 A CN 105037538A CN 201510548566 A CN201510548566 A CN 201510548566A CN 105037538 A CN105037538 A CN 105037538A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- optimized
- fragment
- expression
- protein
- fcs
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 title claims abstract description 53
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 title claims abstract description 53
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 23
- 238000005457 optimization Methods 0.000 claims abstract description 17
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 17
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 7
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 40
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 29
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 13
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 claims description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 6
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 6
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 5
- 239000000945 filler Substances 0.000 claims description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 5
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 claims description 4
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 claims description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 2
- 241000132152 Polymyxa Species 0.000 claims 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims 1
- 239000000463 material Substances 0.000 claims 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 claims 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 claims 1
- 230000002744 anti-aggregatory effect Effects 0.000 abstract description 12
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 abstract description 5
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 abstract description 3
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 abstract description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 abstract description 3
- 230000001788 irregular Effects 0.000 abstract description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 4
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000000978 circular dichroism spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 2
- 108010093965 Polymyxin B Proteins 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920000024 polymyxin B Polymers 0.000 description 2
- 229960005266 polymyxin b Drugs 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 1
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 238000011056 performance test Methods 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明提供了优化的Fc片段及其优化方法和应用。优化的Fc片段，是通过将Fc片段的N端的不规则卷曲的7个氨基酸截除得到的。优化方法，包括利用RT-PCR，从血样中扩增出野生型Fc，再设计引物将野生型Fc的N端的7个氨基酸进行截断，扩增出优化Fc片段的扩增步骤。还包括表达与纯化步骤。本发明用于含有Fc片段的改造的应用。本发明提供的Fcs骨架，稳定性更好，可降低单克隆抗体或者Fc融合蛋白的生产、纯化、保存成本；抗聚集能力更好，可降低因为蛋白的聚集而导致临床使用风险。本发明提供的优化的Fc片段骨架可应用于完整的IgG或者相关的Fc融合蛋白以及用于进一步研究给相关生物制剂的血浆半衰期的带来的影响。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药工程技术领域，尤其涉及优化的Fc片段及其优化方法和应用。
背景技术
抗体以其特异性强、灵敏度高，广泛应用于各个领域，尤其是生命科学研究和临床治疗如ELISA、Westernblot、免疫荧光分析、疾病快速诊断以及作为生物制剂治疗各种疾病。因此，进入21世纪以来，人们也开始越来越关注治疗性抗体药物的研发与临床应用，这是因为它对人体毒副作用小、具有天然和高度特异性的疗效，并且创造出了巨大的社会效益和经济效益。
同时，基于Fc片段的融合蛋白不仅以其分子量相对较小而具有很好的组织渗透性，而且偶联的Fc片段可与Fc受体(FcRn)等效应分子相互作用，因而延长了药物的血浆半衰期以及可诱导ADCC、CDC效应或者吞噬作用。
然而，这些抗体药物以及Fc融合蛋白作为生物活性大分子，它也有自身的局限性，如稳定性差、抗聚集能力弱，在其表达、纯化、贮存等过程中，会倾向于聚集或者降解。而蛋白聚集所导致的免疫原性，不仅降低了药效，同时也给临床应用带来很大的风险。因此，提高抗体热稳定性与抗聚集能力是该领域亟待解决的问题之一。
发明内容
针对现有技术的上述缺陷和问题，本发明的目的是提供优化的Fc片段及其优化方法和应用。解决了现有Fc片段的热稳定性和抗聚集能力差的技术问题。
为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
优化的Fc片段，是通过将Fc片段的N端的不规则卷曲的7个氨基酸截除得到的。
本发明中涉及的Fc片段可以采用不同物种的免疫球蛋白的Fc片段，具体地，如哺乳动物等，更具体地，如人类。
优化方法，包括利用RT-PCR，从血样中扩增出野生型Fc，再设计引物将野生型Fc的N端的7个氨基酸进行截断，扩增出优化Fc片段的扩增步骤。
进一步地，所述扩增步骤中，以人源血样为例，野生型Fc的扩增方法为：人源血样抽提细胞总RNA，逆转录得到cDNA；以cDNA为模板进行PCR反应，得到野生型Fc基因片段；PCR反应中采用的正向引物为5-TCGCTACCGTGGTGGCC CAGGCGGCCGCACCTGAACTCCTGGGGGGAC-3，反向引物为5-GTGGTGGTGGTGGCCGGCCTGGCCTTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC-3。
进一步地，所述扩增步骤中，以人源血样为例，优化的Fc片段的扩增方法为：以野生型Fc基因片段为模板进行PCR反应，得到优化的Fc片段；其中，PCR反应中采用的正向引物为5-TCGCTACCGTGGTGGCCCAGGCGGCCCCGTCAGTCTTCCTCTTCC-3，反向引物为5-GTGGTGGTGGTGGCCGGCCTGGCCTTTACC CGGAGACAGGGAGAGGCTC-3。
进一步优选的技术方案为，在扩增步骤完成后，还包括表达与纯化步骤；所述表达与纯化步骤具体为：将SfiI酶切后的优化Fc片段与原核表达载体进行连接、转化相应的表达宿主菌得到优化Fc菌株；再对优化Fc菌株进行原核表达，纯化得到优化Fc片段的目的蛋白。
具体地，所述原核表达载体采用表达载体pCom，相应的表达宿主菌采用大肠杆菌HB2151。或者其它原核表达载体和相应的表达宿主菌。
进一步地，在表达与纯化步骤中，首先采用琼脂糖凝胶电泳回收优化Fc片段，然后用SfiI酶切优化Fc片段，再胶回收，得到SfiI酶切后的优化Fc片段。
进一步地，在表达与纯化步骤中，原核表达具体操作如下：将优化Fc菌株接种到10mlSB培养基，于37℃、250rpm摇床培养3～4小时；随后，按2％接种量接种到500mlSB培养基，于37℃、250rpm摇床培养至OD600达到0.6时，加入250μl浓度为200μg/mlIPTG于37℃诱导表达过夜。
具体地，所述SB培养基的组成为：1L培养基中含30g胰蛋白胨、20g酵母提取物和10gMOPS，pH值用5MNaOH调至7.0。
进一步地，在表达与纯化步骤中，纯化具体操作如下：经原核表达后，第一次离心收集菌体，用50mlPBS重悬，加入250μl多粘菌素B室温处理30min，再次离心收集上清；将收集的上清过滤后，用Ni-NTA填料纯化优化的Fc蛋白；将镍柱洗脱后的优化的Fc蛋白稀释到50ml，进一步用ProteinG填料分别纯化优化的Fc蛋白，随后用截留分子量为10kD的超滤离心管超滤浓缩优化的Fc目的蛋白；其中，第一次离心的参数为：8000g，4℃，15min；再次离心的参数为：10000g，4℃，15min。
本发明的优化的Fc用于含有Fc片段的改造的应用。
进一步地，本发明的优化的Fc用于全长单克隆抗体、抗体片段与Fc的融合蛋白、生物活性蛋白与Fc的融合蛋白、生物活性化合物与Fc的偶联产物等的含有Fc片段的改造的应用。
本发明以Fc为骨架，对其进行定向修饰改造，最终得到稳定性与抗聚集性得到提高的新的Fc克隆。本发明提供的优化的Fc片段骨架可应用于完整的IgG或者相关的Fc融合蛋白以及用于进一步研究给相关生物制剂的血浆半衰期的带来的影响。
本发明通过CD、分子筛、荧光检测仪、紫外分光光度计、ELISA等方法对优化的Fc片段的二级结构、存在形式、稳定性、抗聚集性进行了鉴定，用野生型Fc进行对照。ELISA实验也证明Fcs能够与Fc受体(FcRn)相结合，因此，修饰改造后的Fcs提高了自身稳定性的同时并没有破坏自身生物学效应。
本发明提供的Fcs骨架，其优点在于：首先，相对于野生型的Fc，其稳定性更好，可降低单克隆抗体或者Fc融合蛋白的生产、纯化、保存成本；其次，相对于野生型的Fcs，其抗聚集能力更好，可降低因为蛋白的聚集而导致临床使用风险。
本发明中，制备优化Fc的方法不仅限于对SeqIDNo.3序列中的Fc的改造，也包括对其它各类抗体分子的Fc片段的改造，比如，对不同类型的免疫球蛋白，来源于不同物种的免疫球蛋白的改造。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是现有Fc片段的结构示意图；
图2是本发明的优化方法中Fc、Fcs蛋白的蛋白免疫印迹检测结果图；
图3是本发明的优化方法中纯化后的Fc、Fcs蛋白的SDS-PAGE检测结果图；
图4是本发明的Fcs和Fc的AKTA分析结果曲线图；
图5是本发明的Fcs和Fc的圆二色CD光谱法检测蛋白分子构象的曲线图；
图6是本发明的Fcs和Fc蛋白的圆二色CD光谱法检测热稳定性的曲线图；
图7是本发明的Fcs和Fc蛋白的变性剂条件下稳定性分析拟合曲线图；
图8为本发明的Fc、Fcs蛋白的抗聚集性的OD320nm经时曲线图；
图9为本发明的Fc、Fcs蛋白与FcRn在不同pH值下结合的OD405在不同浓度下的拟合曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明的优化的Fc片段，是以Fc基因片段为骨架，对其进行修饰，将Fc片段的N端的不规则卷曲的7个氨基酸截除后，最终得到稳定性与抗聚集性得到提高的优化的Fc克隆，命名为Fcs。下面以“Fcs”代表本发明的优化的Fc片段。其中，Fc基因片段可以是不同物种的免疫球蛋白中Fc片段。
下面以人类的免疫球蛋白的Fc片段为改造对象，说明本发明的优化的Fc片段的优化方法，包括以下步骤：
为了方便将本发明的Fcs(优化的Fc片段)与Fc的各项性能进行比对，在本实施例1的优化方法中同时记载了Fc的扩增及表达纯化的步骤。
步骤一、扩增Fc、Fcs基因片段
采取人源血样，用TrizolReagent(Invitrogen公司)抽提细胞总RNA，得到的细胞总RNA溶解于50μL无RNA酶的水中。然后用M-MLV逆转录酶试剂盒(Promega公司)，采用随机引物，逆转录得到cDNA。
根据IgG1的Fc的基因序列(GenBank:KJ905798.1)，分析其氨基酸序列，设计Fc、Fcs基因的正、反向引物扩增目的片段：正向引物1：5-TCGCTACCGTGGTGGCCCAGGCGGCCGCACCTGAACTCCTGGGGGGAC-3,正向引物2：5-TCGCTACCGTGGTGGCCCAGGCGGCCCCGTCAGTCTTCCTCTTCC-3(横线标注为SfiI酶切位点)；反向引物：5-GTGGTGGTGGTGGCCGGCCTGGCCTTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC-3(横线标注为SfiI酶切位点)。
先用正向引物1与反向引物以cDNA为模板进行PCR反应，得到Fc基因片段(核苷酸序列如SEQIDNO：1所示)；再用正向引物2与反向引物以Fc基因片段为模板进行PCR反应，从而得到含有Fcs基因片段(核苷酸序列如SEQIDNO：3所示)。
琼脂糖凝胶电泳回收Fc、Fcs基因片段。
步骤二、表达并纯化Fc、Fcs
用SfiI酶切Fc、Fcs基因和载体pCom(Addgene)，胶回收，将SfiI酶切后的Fc基因、Fcs基因分别与载体pCom连接、转化E.coliHB2151感受态，随后挑取单克隆送测序。根据测序结果，挑取序列正确的单克隆用于后续实验。其中，原核表达载体不限于上述的载体pCom，还可以采用其它原核表达载体和相应的表达宿主菌。
将上述得到的Fc、Fcs菌株分别接种到10mlSB培养基(1L培养基中含30g胰蛋白胨、20g酵母提取物和10gMOPS，pH值用5MNaOH调至7.0)，于37℃、250rpm摇床培养3～4小时。随后，按2％接种量分别接种到500mlSB培养基，于37℃、250rpm摇床培养至OD600达到0.6时，加入250μl浓度为200μg/mlIPTG于37℃诱导表达过夜。表达后，以鼠抗Histag为第一抗体、HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗为进行蛋白免疫印迹检测，检测结果如图2所示。泳道1：Fc培养基；泳道2：Fc周质空间；泳道3：Fcs培养基；泳道4：Fcs周质空间；M：蛋白质marker。从图2中明显可见Fc、Fcs蛋白的表达。
随后，离心(8000g，4℃，15min)收集菌体，用50mlPBS重悬，加入250μl多粘菌素B室温处理30min，再次离心(10000g，4℃，15min)收集上清。将收集的上清过滤后，用Ni-NTA填料(GE公司)纯化Fc、Fcs蛋白。将镍柱洗脱后的Fc、Fcs蛋白分别稀释到50ml，进一步用ProteinG填料分别纯化Fc、Fcs蛋白，随后用截留分子量为10kD的超滤离心管(MerckMillipore公司)超滤浓缩Fc蛋白(氨基酸序列如SEQIDNO：2所示)和Fcs目的蛋白(氨基酸序列如SEQIDNO：4所示)，经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证其纯度，如图3所示。
本发明对实施例1得到的Fc蛋白和Fcs目的蛋白进行了多项性能测试，进行分析对比，证明本发明的优化的FC基因片段的优点。
(1)Fc、Fcs的分子构象与存在形式
AKTA分析Fc、Fcs存在形式：将纯化后的Fc、Fcs蛋白浓缩到1mg/ml，PBS(pH7.4)为洗脱缓冲液，过ColumnSuperdex200Increase10/300GL，其中，流速为1ml/min，进而对其存在形式进行检测。检测得到的曲线图如图4所示，图中，“●”代表Fcs蛋白，“■”代表Fc蛋白；对照标准曲线可以发现，Fc和Fcs这两个蛋白分子量约为45kDa，结果表明它们以二聚体形式存在。
圆二色CD光谱法检测蛋白分子构象：将纯化后的Fc、Fcs蛋白稀释到50μg/ml，PBS(pH7.4)为对照，在近紫外端(波长λ＝190nm～260nm)不同波长条件下检测其平均摩尔椭圆度(即圆二色性)，进而分析蛋白二级结构。检测结果曲线如图5中所示，图中，“●”代表Fcs蛋白，“■”代表Fc蛋白；分析可知，在λ＝218nm处有一个明显波谷，表明上述蛋白二级结构为β-折叠。
(2)Fc、Fcs的稳定性
a、热稳定性：利用圆二色谱仪比较Fc、Fcs蛋白(50μg/ml)热稳定性，PBS溶液为空白对照，设置温度梯度条件为每2min升高1℃，终止反应温度为94℃，每30s在波长λ＝218nm处检测并记录数据，供分析使用。得到的检测曲线如图6中所示，图中，“●”代表Fcs蛋白，“■”代表Fc蛋白；在波长λ＝218nm时，在不同温度下检测其左右圆偏振光的摩尔吸光系数之差，进而比较其热稳定性差异，分析可知，修饰改造后的Fcs的热稳定性比Fc高3.5℃。
b、变性剂条件下稳定性分析：配置浓度为0M到10M的尿素溶液，浓度梯度为0.5M，共21个样品；然后将Fc、Fcs蛋白加入不同浓度梯度的尿素溶液中4℃过夜处理，体积为600μl，Fc、Fcs蛋白终浓度均为50μg/ml。随后，用荧光检测仪器在280nm激发，340nm处检测各个样品荧光信号强度，比较Fc、Fcs蛋白的稳定性。检测结果如图7中所示的拟合曲线，图中，“■”拟合的曲线为Fcs的曲线，“○”拟合的曲线为Fc的曲线；从图中可以发现相比Fc，Fcs的荧光信号下降趋势更缓慢，表明Fcs在变性剂条件下更加稳定。
(3)Fc、Fcs的抗聚集性
将Fc、Fcs蛋白终浓度调整为1mg/ml，在60℃水浴锅热处理，每隔30min取样，通过紫外分光光度计在λ＝320nm处检测吸光度并记录数据，比较Fc、Fcs蛋白的抗聚集性强弱。其中，PBS溶液为空白对照。得到的Fc、Fcs蛋白OD320nm经时曲线如图8中所示，图中，“●”拟合的曲线为Fcs的曲线，“■”拟合的曲线为Fc的曲线；从图中可以发现Fcs信号上升趋势较缓，表明其抗聚集能力更好。
(4)比较Fc、Fcs蛋白与Fc受体(FcRn)在不同pH条件下的亲和力
采用ELISA测定Fc、Fcs和FcRn的结合，步骤如下：
步骤1包被：用2μg/ml的FcRn蛋白包被costar96halfwells板子，贴上保鲜膜，4℃冰箱过夜。
步骤2洗涤：吸出反应液，将孔内液体甩干，加满洗涤液，浸泡3min甩干，反复三次。
步骤3封阻：向反应板中每孔加入100μl3％脱脂奶粉(37℃，2h)。
步骤4洗涤：吸出反应液，将孔内液体甩干，加满洗涤液，浸泡3min甩干，反复三次。
步骤5检样：将Fc、Fcs蛋白稀释到不同pH(pH6.0,pH7.4)的PBS缓冲液，终浓度为50μg/ml，每组2孔加入50μl具体稀释度的蛋白(1：3稀释)，然后将板子贴保鲜膜静置于37℃培养箱2小时。
步骤6洗涤：同步骤4，分别用不同pH的PBS溶液洗三次。
步骤7加HRP酶标抗体：加入anti-flag单抗，每孔50μl(1：1500稀释)，然后静置于37℃培养箱2小时。
步骤8洗涤：同步骤6。
步骤9显色：每孔加入50μlABTS反应底物，室温避光处理15min后检测。
步骤10检测：用酶标仪器检测OD405。
根据检测的OD405值，绘制不同pH值下，OD405在不同浓度下的拟合曲线，如图9中所示，图中，“▲”拟合的曲线为pH值为6时的Fcs的曲线，“■”拟合的曲线为pH值为6时的Fcs的曲线，“△”拟合的曲线为pH值为7.4时的Fcs的曲线，“□”拟合的曲线为pH值为7.4时的Fcs的曲线。分析可知，Fc与FcRn在不同pH条件下亲和力不同，在pH6.0时，与FcRn保持高亲和力；在pH7.4时，与FcRn亲和力降低，进而可维持其血浆浓度的动态平衡。图中数据表明，本发明的经过修饰改造的Fcs依旧保持与FcRn依赖于不同pH的结合活性。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.优化的Fc片段，其特征在于：是通过将Fc片段的N端的不规则卷曲的7个氨基酸截除得到的。
2.如权利要求1所述的优化的Fc片段的优化方法，其特征在于：包括利用RT-PCR，从血样中扩增出野生型Fc，再设计引物将野生型Fc的N端的7个氨基酸进行截断，扩增出优化Fc片段的扩增步骤。
3.根据权利要求2所述的优化方法，其特征在于：所述扩增步骤中，以人源血样为例，野生型Fc的扩增方法为：人源血样抽提细胞总RNA，逆转录得到cDNA；以cDNA为模板进行PCR反应，得到野生型Fc基因片段；PCR反应中采用的正向引物为5-TCGCTACCGTGGTGGCCCAGGCGGCCGCACCTGAACTCCTGGGGGGAC-3，反向引物为5-GTGGTGGTGGTGGCCGGCCTGGCCTTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC-3。
4.根据权利要求3所述的优化方法，其特征在于：所述扩增步骤中，优化的Fc片段的扩增方法为：以野生型Fc基因片段为模板进行PCR反应，得到优化的Fc片段；其中，PCR反应中采用的正向引物为5-TCGCTACCGTGGTGGCCCAGGCGGCCCCGTCAGTCTTCCTCTTCC-3，反向引物为5-GTGGTGGTGGTGGCCGGCCTGGCCTTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC-3。
5.根据权利要求2至4之一所述的优化方法，其特征在于：在扩增步骤完成后，还包括表达与纯化步骤；所述表达与纯化步骤具体为：将SfiI酶切后的优化Fc片段与原核表达载体进行连接、转化相应的表达宿主菌得到优化Fc菌株；再对优化Fc菌株进行原核表达，纯化得到目的蛋白优化的Fc片段。
6.根据权利要求5所述的优化方法，其特征在于：在表达与纯化步骤中，首先采用琼脂糖凝胶电泳回收优化Fc片段，然后用SfiI酶切优化Fc片段，再胶回收，得到SfiI酶切后的优化Fc片段。
7.根据权利要求5所述的优化方法，其特征在于：在表达与纯化步骤中，原核表达具体操作如下：将优化Fc菌株接种到10mlSB培养基，于37℃、250rpm摇床培养3～4小时；随后，按2％接种量接种到500mlSB培养基，于37℃、250rpm摇床培养至OD600达到0.6时，加入250μl浓度为200μg/mlIPTG于37℃诱导表达过夜。
8.根据权利要求5所述的优化方法，其特征在于：在表达与纯化步骤中，纯化具体操作如下：经原核表达后，第一次离心收集菌体，用50mlPBS重悬，加入250μl多粘菌素B室温处理30min，再次离心收集上清；将收集的上清过滤后，用Ni-NTA填料纯化优化的Fc蛋白；将镍柱洗脱后的优化的Fc蛋白稀释到50ml，进一步用ProteinG填料分别纯化优化的Fc蛋白，随后用截留分子量为10kD的超滤离心管超滤浓缩优化的Fc目的蛋白。
9.如利要求1所述的优化的Fc片段的应用，其特征在于：优化的Fc用于含有Fc片段的蛋白或者偶联物的改造的应用。
10.根据权利要求9所述的优化的Fc片段的应用，其特征在于：优化的Fc用于含有Fc片段的全长单克隆抗体、抗体片段与Fc的融合蛋白、生物活性蛋白与Fc的融合蛋白、或者生物活性化合物与Fc的偶联物的改造的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510548566.2A CN105037538A (zh) | 2015-08-31 | 2015-08-31 | 优化的Fc片段及其优化方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510548566.2A CN105037538A (zh) | 2015-08-31 | 2015-08-31 | 优化的Fc片段及其优化方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105037538A true CN105037538A (zh) | 2015-11-11 |
Family
ID=54444548
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510548566.2A Pending CN105037538A (zh) | 2015-08-31 | 2015-08-31 | 优化的Fc片段及其优化方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105037538A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108191974A (zh) * | 2017-12-31 | 2018-06-22 | 武汉班科生物技术股份有限公司 | 抗聚集人源IgG抗体CH2结构域突变体及应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1354186A (zh) * | 2000-11-30 | 2002-06-19 | 辽宁卫星生物制品研究所(有限公司) | 带有人lgG1Fc片段分子结构的重组人血管内皮细胞生成抑制因子的制备方法及其制品的用途 |
| CN101410411A (zh) * | 2006-02-09 | 2009-04-15 | 转化技术制药公司 | Rage融合蛋白及使用方法 |
| US20130164286A1 (en) * | 2011-12-26 | 2013-06-27 | Min-Yuan Chou | Fc FUSION PROTEINS |
-
2015
- 2015-08-31 CN CN201510548566.2A patent/CN105037538A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1354186A (zh) * | 2000-11-30 | 2002-06-19 | 辽宁卫星生物制品研究所(有限公司) | 带有人lgG1Fc片段分子结构的重组人血管内皮细胞生成抑制因子的制备方法及其制品的用途 |
| CN101410411A (zh) * | 2006-02-09 | 2009-04-15 | 转化技术制药公司 | Rage融合蛋白及使用方法 |
| US20130164286A1 (en) * | 2011-12-26 | 2013-06-27 | Min-Yuan Chou | Fc FUSION PROTEINS |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108191974A (zh) * | 2017-12-31 | 2018-06-22 | 武汉班科生物技术股份有限公司 | 抗聚集人源IgG抗体CH2结构域突变体及应用 |
| CN108191974B (zh) * | 2017-12-31 | 2021-04-09 | 武汉班科生物技术股份有限公司 | 抗聚集人源IgG抗体CH2结构域突变体及应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111320694A (zh) | 一种由重链抗体的可变区组成的纳米抗体gn2及其制备方法和应用 | |
| CN103342752A (zh) | 一种抗人组织因子单链抗体及其制备方法 | |
| CN105296506B (zh) | 以硫磺菌蘑菇凝集素n-乙酰氨基乳糖胺结合域作为融合标签的目标蛋白表达与纯化方法 | |
| JP2009533429A (ja) | 陽イオン界面活性剤によるタンパク質の精製 | |
| CN108642073A (zh) | 一种梨PbrRALF2蛋白质的体外表达及其多克隆抗体的制备方法 | |
| EP4299745A1 (en) | Anti-sars-cov-2 antibody | |
| CN108179149B (zh) | S100b突变体及其应用 | |
| CN105037538A (zh) | 优化的Fc片段及其优化方法和应用 | |
| CN104610443A (zh) | 一种高稳定性重组降钙素原、制备方法及用途 | |
| CN118561993B (zh) | 靶向尼帕病毒g蛋白的中和性单克隆抗体及其用途 | |
| CN104628851B (zh) | 一种抗狂犬病毒的基因工程抗体、其制备方法和应用 | |
| CN109593133B (zh) | 一种抗人神经生长因子抗体的电荷异构体分离方法 | |
| Pearce et al. | Linear gene fusions of antibody fragments with streptavidin can be linked to biotin labelled secondary molecules to form bispecific reagents | |
| JPWO2013084371A1 (ja) | ヒト心筋由来トロポニンｉに特異的にかつ速やかに結合できる組み換えタンパク質 | |
| CN108165539A (zh) | 一种梨S7-RNase蛋白的体外表达方法及其多克隆抗体的制备方法 | |
| CN106977590A (zh) | 突变的菜豆根瘤菌亲和素蛋白及其应用 | |
| CN108840914B (zh) | 一种具有免疫原性的多肽、其抗体的制备方法以及用途 | |
| US20140124448A1 (en) | IMMUNOAFFINITY SEPARATION MATERIALS COMPRISING ANTI-IgE ANTIBODY DERIVATIVES | |
| CN119464223B (zh) | 分泌抗新型冠状病毒orf8蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株、单克隆抗体、抗体组合物和应用 | |
| CN112239504A (zh) | 一种针对pd-l1的纳米抗体及其应用 | |
| CN104945488B (zh) | 一种具有免疫球蛋白结合能力的多肽 | |
| CN110872355B (zh) | 抗金刚烷胺AMD单链抗体scFv及其制备方法与应用 | |
| CN121342992A (zh) | 抗lag3的全人源单链抗体及其应用 | |
| CN110878116B (zh) | 一种稳定的重组心肌肌钙蛋白及其编码基因和应用 | |
| JP2020511516A (ja) | 組換え抗体断片の精製方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20160118 Address after: 430070, Wuhan District, Hubei, Wuchang province fruit lake street, No. 44, Hongshan District Applicant after: Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences Address before: 430074 Hubei Development Zone, East Lake high tech Avenue, No. 666 Wuhan national biological industry base project B, C, D District R & D building B1 building, Applicant before: WUHAN BANKE BIOTECHNOLOGY CO., LTD. |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20151111 |