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CN105026568A - 来自纤维素系生物质的乙醇生产方法 - Google Patents

来自纤维素系生物质的乙醇生产方法 Download PDF

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CN105026568A
CN105026568A CN201480015044.XA CN201480015044A CN105026568A CN 105026568 A CN105026568 A CN 105026568A CN 201480015044 A CN201480015044 A CN 201480015044A CN 105026568 A CN105026568 A CN 105026568A
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CN
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fermentation
cellulose
ethanol
yeast
quality
Prior art date
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Application number
CN201480015044.XA
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Inventor
长崎宏
铃木裕也
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Cosmo Oil Co Ltd
Original Assignee
Cosmo Oil Co Ltd
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Abstract

本发明提供一种即使在纤维素系生物质水解物中存在发酵阻碍物质时也有效地生产乙醇的方法。一种乙醇的生产方法，其特征在于，向发酵槽内的空气供给速度为0.0001～100L/小时/g干燥菌体重量的条件下，使用属于中间假丝酵母(Candida？intermedia)的酵母使含纤维素系生物质水解物的发酵用液发酵。

Description

来自纤维素系生物质的乙醇生产方法
技术领域
本发明涉及通过使用纤维素系生物质水解物的乙醇发酵生产乙醇的方法。
背景技术
纤维素系生物质从环境方面出发作为利用微生物的发酵的乙醇生产原料受到注目。尤其是最近从未利用生物质的有效活用的观点出发，正在研究如木材、纸类、或蔗渣(甘蔗的渣)、玉米秸秆(玉米的芯、茎、叶等)以及稻类的农业废弃物等纤维素系的生物质原料的利用(专利文献1～3)。
然而，为了使用纤维素系生物质通过微生物的发酵生产乙醇，需要将纤维素系生物质中含有的纤维素或半纤维素、它们的一部分解物即多糖类进行分解，得到以作为己糖的葡萄糖、甘露糖和半乳糖或作为戊糖的木糖为主成分的糖化液，将该糖化液中的糖供给至微生物的发酵。并且，作为该纤维素系生物质的分解方法，已知稀硫酸法或水热分解法等水解法和酶法。其中，酶法中的糖化在糖化液不生成糠醛、5-羟基甲基糠醛(HMF)等呋喃化合物、乙酸、甲酸、乙酰丙酸的过度分解物，但需要多种类且大量的酶，对于工业化在成本方面存在问题。另一方面，已知稀硫酸法、水热分解法等水解法在成本方面有优势，但生成糠醛、5-羟基甲基糠醛(HMF)等呋喃化合物、乙酸、甲酸、乙酰丙酸等弱酸等各种过度分解物(副生成物)，这些副生成物阻碍来自单糖的乙醇生产(非专利文献1～3)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2006-88136号公报
专利文献2：日本特开2008-54676号公报
专利文献3：日本特开2008-260811号公报
非专利文献
非专利文献1：A.Petersson等，“A 5-hydroxymethyl furfuralreducing enzymes encoded by the Saccharomyces cerevisiae ADH6 geneconveys HMF tolerance”，Yeast 2006年，第23卷，p.455-464
非专利文献2：J.A.van Maris等，“Alcoholic fermentation of carbonsources in biomass hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae”，Antonievan Leeusenhoek，2006年，第90卷，p.391-418
非专利文献3：E.Palmqvist和B.Hahn-Hagardal，“Fermentation oflignocellulosic hydrolysate.II:inhibitors and mechanisms ofinhibition”，Bioresource Technology，2000年，第74卷，p.25-33
发明内容
本发明的课题提供即使在纤维素系生物质水解物中存在发酵阻碍物质的情况下也可有效地生产乙醇的方法。
本发明的发明人等为了解决上述课题进行了深入研究，其结果发现，在使用含有纤维素系生物质水解物的发酵用液生产乙醇的方法中，通过使用属于中间假丝酵母的酵母在特定的通气条件下发酵，即使在发酵用液中存在来自纤维素系生物质水解物的发酵阻碍物质的情况下也能够持续有效地生成乙醇，完成了本发明。
即，本发明提供以下〔1〕～〔3〕。
〔1〕一种乙醇的生产方法，其特征在于，向发酵槽内的空气供给速度为0.0001～100L/小时/g干燥菌体重量的条件下，使用属于中间假丝酵母(Candida intermedia)的酵母使含纤维素系生物质水解物的发酵用液发酵。
〔2〕如〔1〕所述的乙醇的生产方法，其中，发酵是将含纤维素系生物质水解物的发酵用液以0.0002～2L/小时/g干燥菌体重量的供给速度供给至发酵槽内的连续法。
〔3〕如〔1〕或〔2〕所述的乙醇的生产方法，其中，属于中间假丝酵母(Candida intermedia)的酵母是被命名为4-6-4T2且以FERM BP-11509保藏的酵母。
根据本发明的乙醇的生产方法，可以由存在发酵阻碍物质的纤维素系生物质水解物有效地生产乙醇。
附图说明
图1是表示在发酵用液中添加乙酸0.5质量％(0.08mol/L)，利用各酵母生产乙醇时的乙醇浓度经时变化的图。
图2是表示在发酵用液中添加乙酸0.3质量％(0.05mol/L)、糠醛0.1质量％(0.010mol/L)和HMF0.1质量％(0.008mol/L)，利用各酵母生产乙醇时的乙醇浓度经时变化的图。
图3是表示在发酵用液中添加乙酸0.3质量％(0.050mol/L)、乙酰丙酸0.3质量％(0.026mol/L)和甲酸0.2质量％(0.043mol/L)，利用各酵母生产乙醇时的乙醇浓度经时变化的图。
图4是表示在发酵用液中添加糠醛0.22质量％(0.023mol/L)或HMF0.68质量％(0.054mol/L)，利用中间假丝酵母4-6-4T2(FERMBP-11509)生产乙醇时的乙醇浓度经时变化的图。
图5是表示中间假丝酵母NBRC10601的连续发酵中的乙醇生产浓度经时变化的图。
图6是表示中间假丝酵母4-6-4T2(FERM BP-11509)的连续发酵中的乙醇生产浓度经时变化的图。
具体实施方式
(1)酵母
本发明的乙醇的生产方法使用属于中间假丝酵母(Candidaintermedia)的酵母。作为该酵母，只要是属于中间假丝酵母(Candidaintermedia)的酵母则没有特别限定，例如，可以是可从独立行政法人制品评价技术基础机构(NITE)获得的中间假丝酵母“NBRC10601”等，也可以是中间假丝酵母的突变株。其中，特别优选使用以下酵母：本发明的发明人通过以中间假丝酵母“NBRC10601”为亲株按照常用方法使其自然突变，挑选与亲株相比乙醇生产能力高的菌株而取得的中间假丝酵母被命名为“4-6-4T2”，并以“FERM BP-11509”保藏在独立行政法人制品评价技术基础机构专利生物保藏中心(NITE)(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)的酵母(原保藏日，2011年9月6日)。
上述4-6-4T2具有在葡萄糖和木糖的共存下由葡萄糖和木糖短时间且高效地生产乙醇的能力。这里，是指在葡萄糖和木糖的共存下在至少含有葡萄糖和木糖的原料液体(发酵用液)中使4-6-4T2共存。如上所述，以往的酵母的木糖的消耗效率不充分，或具有来自葡萄糖或木糖中的任一者的乙醇生产能力，但葡萄糖和木糖这两者存在时，由于分解代谢产物阻抑，直至葡萄糖完全地消耗为止木糖几乎没有消耗，4-6-4T2即使在葡萄糖和木糖这两者存在的情况下，也具有来自这两者的短时间且高效地生产乙醇的能力。
此外，4-6-4T2可由含有葡萄糖和木糖的原料液体短时间且高效地生产乙醇，但此时几乎未生成作为副生成物的木糖醇。此外，4-6-4T2除来自这种糖的乙醇的生产能力以外，具有与亲株同等的性质。
另外，作为可生产来自纤维素系生物质水解物的乙醇的酵母，还已知树干毕赤酵母(Pichia stipitis)，休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)和嗜鞣管囊酵母(Pacysolen tannophilus)等。这些酵母可以消耗在纤维素系生物质水解物中的糖类中也难以消耗的木糖而生产乙醇。然而，这些酵母在纤维素系生物质水解物中含有的发酵阻碍物质存在下无法充分地生产乙醇，因此即使使用这些酵母代替本发明中使用的属于中间假丝酵母的酵母也无法达成如本发明的有效的乙醇生产。
(2)含纤维素系生物质水解物的发酵用液
本发明的乙醇的生产方法中含有纤维素系生物质水解物作为碳源。
这里，纤维素系生物质是指含有纤维素和半纤维素的生物质。通过将这样的生物质中的纤维素水解而可得到葡萄糖，另一方面，通过将半纤维素水解而可得到葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖。另外，纤维素系生物质水解物中的各糖类的含有比率根据纤维素系生物质的种类而不同，但均含有葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖。
本发明中，作为水解的原料的纤维素系生物质从乙醇生产中的经济的优势的观点出发，优选为从农业残渣(稻杆、麦杆等、蔗渣、玉米秸秆等)、林业残渣(材木等)等得到的生物质。
本发明中使用的纤维素系生物质水解物是指通过稀硫酸法、水热分解法等将纤维素系生物质水解而得到的生物质水解物。例如，可以通过以下方法得到适合于乙醇生产的糖化液：在稀硫酸法中使纤维素系生物质干燥后，进行粉碎，以重量成为10倍量的方式在其中添加蒸馏水和硫酸(0.2～0.5质量％)，在190℃～210℃水解5～10分钟(P-M.Bondesson等，“Ethanol and biogas production after steampretreatment of corn stover with or without the addition of sulphuricacid”，Biotechnol.,for Biofuel.2013年，第6卷，p.1-11)；此外，在水热分解法中将纤维素系生物质在190℃～210℃水解5～10分钟(同上文献)。
纤维素系生物质水解物中，作为随着水解处理产生的发酵阻碍物质，含有糠醛和5-羟基甲基糠醛(HMF)等呋喃化合物、乙酸、甲酸和乙酰丙酸等弱酸等。代表性的发酵阻碍物质的纤维素系生物质水解物中的通常的含量例如若是糠醛、HMF则为0.0～0.05mol/L，若是乙酸、甲酸、乙酰丙酸则为0.0～0.15mol/L左右(H.B.Klinke等“Inhibiton ofethanol-producing yeast and bacteria by degradation productsproduced during pre-treatment of biomass”，Appl.Microbiol.Biotechnol.66卷p.10-26)。
这些发酵阻碍物质例如若是乙酸等弱酸则即使在发酵用液中存在0.02mol/L左右通常也会显著降低乙醇生产效率，但使用本发明的乙醇的生产方法时，即使作为发酵阻碍物质的弱酸存在0.02mol/L以上，对乙醇生产效率也几乎没有影响，进而，即使存在0.04mol/L以上也可以没有问题地高效地进行乙醇生产。另一方面，若大于0.20mol/L，则容易对乙醇生产效率产生影响，因此优选为0.20mol/L以下，更优选为0.15mol/L以下，进一步优选为0.12mol/L以下，特别优选为0.08mol/L以下。应予说明，上述含量是全部的弱酸的合计的含量。
此外，若是糠醛、HMF等呋喃化合物则即使在发酵用液中存在0.01mol/L左右通常也会显著降低乙醇生产效率，但使用本发明的乙醇的生产方法时，即使作为发酵阻碍物质的呋喃化合物存在0.01mol/L以上，对乙醇生产效率也几乎没有影响，进而，即使存在0.02mol/L以上也可以没有问题地高效地进行乙醇生产。另一方面，若大于0.10mol/L，则容易对乙醇生产效率产生影响，因此优选为0.10mol/L以下，更优选为0.070mol/L以下，特别优选为0.040mol/L以下。应予说明，上述含量是全部的呋喃化合物的合计的含量。
因此，本发明的乙醇生产方法当然可以在不含弱酸、呋喃化合物的条件下良好地生产乙醇，但从容易得到虽然存在发酵阻碍物质但可以由纤维素系生物质水解物良好地生产乙醇这样的效果的观点出发，优选发酵用液中弱酸含有0.02mol/L～0.15mol/L和/或呋喃化合物含有0.01mol/L～0.10mol/L。进而，更优选在发酵用液中弱酸含有0.04mol/L～0.12mol/L和/或呋喃化合物含有0.02mol/L～0.07mol/L。
本发明的乙醇的生产方法中，使用含有该纤维素系生物质水解物的发酵用液进行乙醇的发酵生产，该发酵用液中的纤维素系生物质水解物的含量可以适当选择，但在投入至发酵槽之前的发酵用液中以总量基准、总单糖类换算更优选为0.1～20质量％，进一步优选为0.5～15质量％，特别优选为1～10质量％。对于优选的各糖浓度，木糖为0.1～10质量％，优选为0.5～5质量％的范围内，葡萄糖和其它己糖合计为0.0～15质量％，优选为0.5～5质量％的范围内。
本发明的乙醇生产中使用的发酵用液中除纤维素系生物质水解物以外，还可以含有适当必要的成分。例如，作为除纤维素系生物质水解物以外的碳源，可以含有葡萄糖、甘露糖、半乳糖和木糖等糖类。另外含有这种糖类时，作为单糖的浓度，按与来自纤维素系生物质水解物的糖类的合计，优选为0.1～10质量％，更优选为1～5质量％。此外，也可以添加氨基酸、尿素、多聚蛋白胨、不含氨基酸的氮源等氮源、酵母提取物等。另外，如下所述，使用连续发酵法作为发酵方式时，培养槽中的含有乙醇的发酵液的除去时酵母也被除去，大多需要发酵槽内的酵母的增殖，因此进行长期的连续发酵时，优选以适合于酵母的增殖的方式适当含有这种成分。
(3)发酵条件
本发明的乙醇生产方法中，需要将空气供给速度设为0.0001～100L/小时/g干燥菌体重量。若偏离该范围，则乙醇生产效率下降。空气供给速度优选为0.005～100L/小时/g干燥菌体重量，更优选为0.005～10L/小时/g干燥菌体重量，优选为0.005～1.0L/小时/g干燥菌体重量。此外，分批发酵法的情况的空气供给速度优选为0.005～1.0L/小时/g干燥菌体重量，更优选为0.005～0.5L/小时/g干燥菌体重量，进一步优选为0.005～0.10L/小时/g干燥菌体重量，特别优选为0.005～0.05L/小时/g干燥菌体重量。连续发酵法的情况的空气供给速度优选为0.05～100L/小时/g干燥菌体重量，更优选为0.05～10L/小时/g干燥菌体重量，进一步优选为0.10～1.0L/小时/g干燥菌体重量，特别优选为0.10～0.5L/小时/g干燥菌体重量。这里空气是指大气，若换算成氧供给量则是它的1/5。
本发明的乙醇生产方法可以通过分批发酵法进行也可以通过连续发酵法进行，但根据本发明，可以改善连续发酵法中的乙醇生产的问题，因此优选通过连续发酵法进行。通过连续发酵法进行本发明时，优选以0.0002～2L/小时/g干燥菌体重量的供给速度将含纤维素系生物质水解物的发酵用液供给至发酵槽内。该供给速度优选为0.005～0.5L/小时/g干燥菌体重量，更优选为0.01～0.05L/小时/g干燥菌体重量。另外，连续发酵法中，以与发酵用液的供给相同的速度进行发酵液的除去。
这里，利用使用纤维素系生物质水解物的酵母的乙醇发酵中，在需氧的条件下，进行纤维素系生物质水解物存在下的酵母的增殖，并且在厌氧的条件下，进行在纤维素系生物质水解物存在下的利用增殖的酵母的乙醇发酵。因此，使用分批发酵方法的乙醇生产中，通过将进行该酵母的增殖的工序以及进行利用增殖的酵母的乙醇发酵的工序交替地进行，可以采用适合于各个工序的条件。但是，存在每次转换工序乙醇生产会中断的难点。
与此相对，使用连续发酵方法的乙醇生产在没有这种工序的转换时优异，但与适于增殖的条件相比，大多采用适于乙醇发酵的条件。其结果，酵母的增殖被抑制，无法进行在发酵槽内补充作为发酵液连续地除去的酵母的程度的增殖，酵母浓度减少，乙醇生产效率也下降。因此，对于以通常的连续发酵法维持高的乙醇生成效率，大多产生补充酵母的需要。
但是，根据本发明的乙醇生产方法，可以有效地取得酵母的增殖与利用增殖的酵母的乙醇发酵的平衡，在连续发酵中不进行酵母的追加供给就持续有效的乙醇的生成。
进而，基于以下叙述的理由，可以说利用使用纤维素系生物质水解物的酵母的乙醇发酵更适合连续式发酵，由此也可有效地连续生产乙醇的本发明的乙醇生产方法的意义大。
即，增殖和发酵工序中，酵母除了存在于纤维素系生物质水解物中的糖以外，也一起混入了作为发酵阻碍物质的糠醛、HMF。混入的这些物质在增殖或发酵过程中通过酵母的细胞内的酶进行氧化和/或还原而无毒化。此时，酶需要辅酶(NADH或NADPH)，但辅酶随着增殖或发酵过程生成(非专利文献1)。因此，增殖和乙醇生产浓度发生变动的分批发酵有时不适于利用使用纤维素系生物质水解物的酵母的乙醇发酵。与此相对，连续发酵中，增殖和乙醇生产浓度几乎保持恒定，因此辅酶的生成浓度也恒定，这些辅酶的供给不会产生过度不足，因此难以受到发酵阻碍物质的影响，能够有效地生产乙醇。
由该观点出发，本发明乙醇生产方法的更优选的条件是空气供给速度0.05～100L/小时/g干燥菌体重量、进一步优选为0.05～10L/小时/g干燥菌体重量、进一步优选为0.10～1.0L/小时/g干燥菌体重量，且将含纤维素系生物质水解物的发酵用液以0.005～0.5L/小时/g干燥菌体重量、进一步优选以0.010～0.05L/小时/g干燥菌体重量的供给速度供给至发酵槽内的连续发酵法。
对于上述以外的发酵条件，只要适当选择即可，举出优选条件如下。
乙醇生产中的酵母浓度优选以干燥菌体重量计调整为0.5～5质量％。分批发酵法中，只要在乙醇发酵工序前的增殖工序中调整为该浓度即可。连续发酵法中，可以在培养开始前以成为该浓度的范围的方式接种预培养的酵母，或在接种后将酵母浓度增殖2倍左右，在乙醇生产中可以调整含纤维素系生物质水解物的发酵用液的供给速度(即，发酵液除去速度)、氧浓度等培养条件且以成为该浓度的范围的方式调整。
乙醇生产中的温度优选设为20～35℃。
在分批发酵法的增殖工序、连续发酵法或分批发酵法的增殖工序之前进行的预培养，以及在连续发酵法中在乙醇生产之前为了将菌体量调整为优选浓度而实施的培养可以通过如下的条件进行。作为培养基，可以使用含有作为碳源的纤维素系生物质水解物、葡萄糖、以及选自甘露糖、半乳糖和木糖中的1种以上的糖，进而，适当含有适于繁殖的氨基酸、尿素、多聚蛋白胨、不含氨基酸的氮源等氮源、酵母提取物等的培养基。另外，作为单糖的浓度，优选为合计0.1～10质量％，更优选为1～5质量％，但使用纤维素系生物质水解物作为碳源时，这样的水解物的使用量优选为培养基容量的20容量％以下，更优选为10容量％以下。温度优选为10℃～37℃，更优选为25℃～30℃。pH优选为4～7，更优选为4.5～6.5。此外，在需氧条件下进行预培养时，更优选以5～6进行。
应予说明，本发明中的有效的乙醇生产是指在分批发酵法中从开始发酵24小时以内发酵收率达成70质量％以上，是指在连续发酵法中从开始发酵24小时以后发酵收率也维持在70质量％以上。
实施例1
以下，举出实施例详细地说明本发明，但本发明不限定于这些实施例。
参考例1
按照以下步骤，将保存在独立行政法人制品评价技术基础机构专利生物保藏中心(NITE)的酵母中间假丝酵母(Candida intermedia)“NBRC10601”作为亲株，通过驯化和自然突变取得4-6-4T2株。
首先，将分别含有1质量％的葡萄糖和木糖的乙酸水溶液的pH以氢氧化镁调整为5.0，将该溶液20％和液体培养基(酵母提取物：1％，不含氨基酸的酵母氮源：2％)80％进行混合。在该混合溶液10mL中添加木糖1％，接种1白金耳的酵母中间假丝酵母(Candida intermedia)“NBRC10601”，在30℃培养3天，得到培养液。
接着，与上述同样地将pH调整为5.0的分别含有1质量％的葡萄糖和木糖的乙酸水溶液和液体培养基各混合50％，在该混合液10mL中添加上述3天培养的培养液100μL，进一步培养7天。进而，与上述同样地混合将pH调整为5.0的分别含有1％质量％的葡萄糖和木糖的乙酸水溶液80％和培养基20％，在该混合液10mL中加入上述培养7天的培养液100μL，进一步培养30天，制成驯化菌株液。
将上述驯化菌株液稀释1000倍，涂布于YNB琼脂培养基(葡萄糖：5％，酵母提取物：1％，不含氨基酸的酵母氮源：2％，琼脂：2％)的培养基，以25℃培养4天后，取得形成有菌落的菌株。
将上述取得的菌株涂布于YNB琼脂培养基(海藻糖：2％，酵母提取物：1％，不含氨基酸的酵母氮源：2％，琼脂：2％)的培养基，在25℃培养3天后，确认形成了菌落，以4℃保管。挑选在4℃扩大的菌落，在磷酸缓冲液(木糖：2.5％，KH2PO4：0.1M，pH＝5.0，MgSO4·7H2O：0.006M)中实施乙醇生产试验，挑选比亲株乙醇生产能力高的菌株。
以这种方式进行而挑选目标酵母，将其命名为中间假丝酵母(Candida intermedia)4-6-4T2株。该菌株在独立行政法人制品评价技术基础机构专利生物保藏中心(NITE)保藏，其保藏号为FERMBP-11509。
实施例1
将中间假丝酵母NBRC10601或中间假丝酵母4-6-4T2(FERMBP-11509)添加至YNB培养基(葡萄糖2质量％和木糖1质量％，2％酵母氮源(不含氨基酸)，1％酵母提取物)，在48小时、温度30℃、pH5.5～6(未调整)下进行预培养。其后，以成为2质量％(干燥菌体重量相当)的方式将菌添加于模拟含纤维素系生物质水解物的发酵用液(葡萄糖3质量％，木糖2质量％，乙酸0.5质量％(0.08mol/L)，0.05M磷酸缓冲液，pH5.5)。使用它以空气供给量为0.01L/h/g干燥菌体重量的形式进行乙醇生产，测定乙醇浓度的经时变化。将其结果示于图1。
另外，实施例1的上述模拟含纤维素系生物质水解物的发酵用液在纤维素系生物质水解物中含有作为代表性的糖类的葡萄糖和木糖，此外，含有乙酸作为纤维素系生物质水解物中的发酵阻碍物质，模拟了含纤维素系生物质水解物的发酵用液。
此外，该乙醇生产中不进行发酵用液的供给、发酵液的除去，即，不使用连续发酵法而通过分批发酵法进行乙醇生产。此外，作为比较，将空气供给设为0L/小时/g干燥菌体重量进行乙醇生产。
实施例2
将中间假丝酵母NBRC10601或中间假丝酵母4-6-4T2(FERMBP-11509)在与实施例1同样的条件下进行预培养后，以成为2质量％(相当于干燥菌体重量)的方式将菌添加于模拟含纤维素系生物质水解物的发酵用液(葡萄糖3％，木糖2％，乙酸0.3质量％(0.05mol/L)，糠醛0.1质量％(0.010mol/L)，5-羟基甲基糠醛(HMF)0.1质量％(0.008mol/L)，0.05M磷酸缓冲液，pH5.5)。使用它以空气供给量为0.01L/h/g干燥菌体重量的形式进行乙醇生产，测定乙醇浓度的经时变化。将其结果示于图2。
另外，实施例2的上述模拟含纤维素系生物质水解物的发酵用液在纤维素系生物质水解物中含有作为代表性的糖类的葡萄糖和木糖，此外，含有乙酸、糠醛、HMF作为纤维素系生物质水解物中的发酵阻碍物质，模拟了含纤维素系生物质水解物的发酵用液。
此外，该乙醇生产中不进行发酵用液的供给、发酵液的除去，即，不使用连续发酵法而通过分批发酵法进行乙醇生产。此外，作为比较，将空气供给设为0L/小时/g干燥菌体重量进行乙醇生产。
实施例3
将中间假丝酵母NBRC10601或中间假丝酵母4-6-4T2(FERMBP-11509)在与实施例1同样的条件下进行预培养后，以成为2质量％(相当于干燥菌体重量)的方式将菌添加于模拟含纤维素系生物质水解物的发酵用液(葡萄糖3质量％，木糖2质量％，乙酸0.3质量％(0.050mol/L)，乙酰丙酸0.3质量％(0.026mol/L)，甲酸0.2质量％(0.043mol/L)，0.05M磷酸缓冲液，pH5.5)。使用它以空气供给量为0.01L/h/g干燥菌体重量的形式进行乙醇生产，测定乙醇浓度的经时变化。将其结果示于图3。
另外，实施例3的上述模拟含纤维素系生物质水解物的发酵用液在纤维素系生物质水解物中含有作为代表性的糖类的葡萄糖和木糖，此外，含有乙酸、乙酰丙酸、甲酸作为纤维素系生物质水解物中的发酵阻碍物质，模拟了含纤维素系生物质水解物的发酵用液。
此外，该乙醇生产中不进行发酵用液的供给、发酵液的除去，即，不使用连续发酵法而通过分批发酵法进行乙醇生产。此外，作为比较，将空气供给设为0L/小时/g干燥菌体重量进行乙醇生产。
实施例4
将中间假丝酵母4-6-4T2(FERM BP-11509)在与实施例1同样的条件下进行预培养后，以成为2质量％(相当于干燥菌体重量)的方式将菌添加于模拟含纤维素系生物质水解物的发酵用液(葡萄糖3质量％，木糖2质量％，糠醛0.22质量％(0.023mol/L)，0.05M磷酸缓冲液，pH5.5)。使用它以空气供给量为0.01L/h/g干燥菌体重量的形式进行乙醇生产，测定乙醇浓度的经时变化。此外，分别使用含有5-羟基甲基糠醛(HMF)0.68质量％(0.054mol/L)代替模拟含纤维素系生物质水解物的发酵用液中的糠醛0.22质量％的发酵用液，作为比较的不含这些发酵阻碍物质的发酵用液，除此以外以相同的条件进行乙醇生产，测定乙醇浓度的经时变化。将其结果示于图4。
另外，实施例4的上述模拟含纤维素系生物质水解物的发酵用液在纤维素系生物质水解物中含有作为代表性的糖类的葡萄糖和木糖，此外含有糠醛或HMF作为纤维素系生物质水解物中的发酵阻碍物质，模拟了含纤维素系生物质水解物的发酵用液。
此外，该乙醇生产中不进行发酵用液的供给、发酵液的除去，即，不使用连续发酵法而通过分批发酵法进行乙醇生产。此外，作为比较，将空气供给设为0L/小时/g干燥菌体重量进行乙醇生产。
实施例5
将中间假丝酵母NBRC10601在与实施例1同样的条件下进行预培养后，以成为2质量％(7.2g(干燥菌体重量))的方式添加于模拟含纤维素系生物质水解物的发酵用液(葡萄糖3质量％，木糖2质量％，乙酸0.5质量％(0.08mol/L)，0.05M磷酸缓冲液，pH5.5)0.36L。使用它，将发酵用液的供给速度设为0.015L/时，将发酵用液的除去速度设为0.015L/时，将空气供给量设为0L/小时/g干燥菌体重量、0.17L/小时/g干燥菌体重量或1.7L/小时/g干燥菌体重量中的任意一个，以连续发酵法进行乙醇生产，测定乙醇浓度的经时变化。将其结果示于图5。
另外，实施例5的上述模拟含纤维素系生物质水解物的发酵用液在纤维素系生物质水解物中含有作为代表性的糖类的葡萄糖和木糖，此外含有乙酸作为纤维素系生物质水解物中的发酵阻碍物质，模拟了含纤维素系生物质水解物的发酵用液。
实施例6
将中间假丝酵母4-6-4T2(FERM BP-11509)在与实施例1同样的条件下进行预培养后，以成为2质量％(相当于7.2g干燥菌体重量)的方式添加于模拟含纤维素系生物质水解物的发酵用液(葡萄糖3质量％，木糖2质量％，乙酸0.5质量％(0.08mol/L)，0.05M磷酸缓冲液，pH5.5)0.36L。使用它，将发酵用液的供给速度设为0.015L/时，将发酵用液的除去速度设为0.015L/时，将空气供给量设为0L/小时/g干燥菌体重量、0.17L/小时/g干燥菌体重量或1.7L/小时/g干燥菌体重量中的任意一个，以连续发酵法进行乙醇生产，测定乙醇浓度的经时变化。将其结果示于图6。
另外，实施例6的上述模拟含纤维素系生物质水解物的发酵用液在纤维素系生物质水解物中含有作为代表性的糖类的葡萄糖和木糖，此外含有乙酸作为纤维素系生物质水解物中的发酵阻碍物质，模拟了含纤维素系生物质水解物的发酵用液。
由图1～图6的结果可知，即使在将含有发酵阻碍物质的纤维素系生物质水解物作为原料的情况下，只要是使用属于中间假丝酵母的酵母且在向发酵槽内的空气供给速度为0.0001～100L/小时/g干燥菌体重量的条件下进行发酵，则乙醇生产效率提高。此外，连续发酵法特别有用。

Claims (3)

1.一种乙醇的生产方法，其特征在于，向发酵槽内的空气供给速度为0.0001～100L/小时/g干燥菌体重量的条件下，使用属于中间假丝酵母(Candida intermedia)的酵母使含纤维素系生物质水解物的发酵用液发酵。
2.如权利要求1所述的乙醇的生产方法，其中，发酵是将含纤维素系生物质水解物的发酵用液以0.0002～2L/小时/g干燥菌体重量的供给速度供给至发酵槽内的连续发酵。
3.如权利要求1或2所述的乙醇的生产方法，其中，属于中间假丝酵母(Candida intermedia)的酵母是被命名为4-6-4T2且以FERMBP-11509保藏的酵母。
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