CN105026565B

CN105026565B - 一个棉花离子通道类蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN105026565B
Application number: CN201280076371.7A
Authority: CN
Inventors: 何云蔚; 王建胜; 王君丹; 梁远金; 梁丽
Original assignee: Biocentury Seed Industry Co Ltd
Current assignee: Biocentury Seed Industry Co Ltd
Priority date: 2012-10-23
Filing date: 2012-10-23
Publication date: 2017-12-12
Anticipated expiration: 2032-10-23
Also published as: WO2014063271A1; CN105026565A

Abstract

提供了一种来源于棉花的离子通道蛋白SOS1及其编码基因，以及其在培育耐盐性提高的转基因植物中的应用。

Description

一个棉花离子通道类蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及离子通道类蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一个来源于棉花的离子通道类蛋白SOS1及其编码基因，以及其在培育耐盐性提高的转基因植物中的应用。

背景技术

盐胁迫是世界农业生产最重要的非生物逆境危害之一，盐渍土壤通常以钠盐、钙盐或镁盐为主，成为影响植物生长、导致粮食和经济作物减产的主要因素。世界上盐碱土的面积约有4亿公顷，占灌溉农田的1/3。盐碱地在中国分布广泛，现有盐碱地面积约0.4亿公顷。随着我国人口增加，耕地减少，盐碱地资源的开发利用有着极其重要的现实意义。而植物抗盐碱、耐干旱能力的提高和适宜在盐碱地上生长并具有较高经济和生态价值的植物种或品系的选育，则是利用盐碱地经济、有效的措施。对绝大多数农作物来说，大多数植物对盐碱、干旱的耐受性差，只能生长在氯化钠含量为0.3％以下的土壤上，土壤中过量的Na⁺会对植物体的正常的生长代谢产生毒害作用。因此如何在盐渍环境下提高作物产量就成为全世界农业生产中十分重要的问题。

植物的耐盐性是一个十分复杂的数量性状，其耐盐机制涉及从植株到器官、组织、生理生化直至分子的各个水平。各国的科学家也为此做了大量的工作，并取得了很多新进展，特别在利用高等模式植物拟南芥来研究植物的耐盐分子机理方面，使该领域的研究有了突破性的进展(Zhu JK.2002.Salt and drought stress singal transduction inplants.Annu.Rev.Plant Biol.53：1247-1273；Zhang ZL.2011.Arabidopsis FloralInitiator SKB1Confers High Salt Tolerance by Regulating Transcription andPre-mRNA Splicing through Altering Histone H4R3and Small NuclearRibonucleoprotein LSM4Methylation.Plant Cell，23：396-411)。高等植物细胞可有多种途径感受外界环境中物化参数的变化，从而将胞外的信号变为胞内信号，通过系列的信号传导最后将胁迫信号传递至细胞核内，激活转录因子，而激活转录因子再作用于功能基因，启动逆境应答基因的表达从而提高植物的耐逆性。尽管研究者已从不同侧面开展了大量研究，但由于其机制十分复杂，植物抗盐中的许多重要问题仍有待探索。例如，植物抗盐的关键因子仍未找到；植物耐盐的分子机制并不十分清楚。

发明内容

本发明人利用SSH与RACE相结合的方法克隆出了棉花的一个离子通道类蛋白(本文命名为SOS1)的编码基因的DNA序列。并发现将其导入转基因植株后，可明显改善转基因植株的抗盐性，而且这些性状可稳定遗传。

本发明第一方面提供棉花的一个离子通道类蛋白SOS1的编码基因，其序列为SEQID NO：2。

本发明第二方面提供一种重组表达载体，其含有本发明第一方面所述的基因并且所述基因的核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接；优选地，所述载体为附图2所示的35S-GhSOS1-2300载体。

本发明第三方面提供一种重组细胞，其含有本发明第一方面所述的基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体；优选地，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。

本发明第四方面提供一种改善植物耐盐性的方法，包括：将本发明第一方面所述基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达；优选地，所述植物是烟草。

本发明第五方面提供一种制备转基因植物的方法，包括：在有效产生植物的条件下培养含有本发明第一方面所述基因、本发明第二方面所述的重组表达载体的植物或植物组织；优选地，所述植物是烟草。

本发明第六方面提供本发明第一方面所述的基因、本发明第二方面所述的重组表达载体或者本发明第三方面所述的重组细胞用于改善植物耐盐性以及用于植物育种的用途；优选地，所述植物是烟草。

本发明第七方面提供发明第一方面所述的基因编码的氨基酸序列，如SEQ ID NO：1所示。

附图说明

图1是GhSOS1的植物表达载体(35S-GhSOS1-2300)的构建流程。

图2是GhSOS1的植物表达载体(35S-GhSOS1-2300)的质粒图。

图3是GhSOS1转基因T1代烟草植株(图右，T₁W3)和作为对照的非转基因烟草植株(图左)的耐盐模拟实验结果。

图4是GhSOS1转基因T1代烟草植株和非转基因对照植株在转录水平上的蛋白表达验证结果。M为Marker，1-8为正常生长转基因植株，9-12为对照植株，13为正对照(GhSOS1)。

具体实施方式

下面结合非限制性实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1 盐胁迫下棉花SSH文库构建：

具体方法为：

利用Clontech公司的PCR-select^TM cDNA Subtraction Kit试剂盒所示的方法通过抑制差减杂交方法构建差减文库。在实验过程中以经NaCl处理6h的棉花幼苗的根的mRNA作为样品(tester)，以未处理的棉花幼苗的根的mRNA作为对照(driver)。

(1)供试材料：

非洲棉(国家棉花中期库，获取单位中国棉花研究所，统一编号：ZM-06838)播种到灭过菌的蛭石上，在25℃、光暗周期16h/8h条件下培养，每周浇1/2MS培养基(9.39mM KNO₃，0.625mM KH2PO₄，10.3mM NH₄NO₃，0.75mM MgSO₄，1.5mM CaCl₂，50μM KI，100μM H₃BO₃，100μMMnSO₄，30μM ZnSO₄，1μM Na₂MoO₄，0.1μM CoCl₂，100μM Na₂EDTA，100μM FeSO₄)一次。当苗株长高达25-30cm时用于实验。

(2)材料处理：

将供试幼苗分为2组，每组4株。第一组为对照组，在25℃、光照下培养，放置到1/2MS液体培养基中。第二组为处理组，25℃、光照下培养，放置到添加有终浓度为200mM NaCl的1/2MS液体培养基中，处理6小时，处理完毕后及时剪取两组幼苗的根，用液氮迅速冷冻后，于-70℃冰箱中保存。

(3)总RNA提取：

分别取对照和NaCl处理的棉花根0.5g，用植物RNA提取试剂盒(invitrogen)提取棉花的总RNA。用HITACHI公司的紫外分光光度计U-2001测定总RNA在260nm和280nm的吸光度值，OD260/OD280比值为1.8-2.0，表明总RNA纯度较高，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，28S条带的亮度约为18S条带的2倍，表明RNA的完整性良好。使用Qiagen公司的Oligotex mRNA纯化试剂盒(purification of polyA+RNA from total RNA)分离mRNA。

(4)抑制消减杂交：

按Clontech公司的PCR-select^TM cDNA Subtraction Kit试剂盒所示的方法进行抑制差减杂交。应用Clontech的PCR-Select cDNA Subtraction Kits差减杂交试剂盒，先将Driver和Tester的mRNA分别反转录，得到双链cDNA，再以2μg Tester和2μg Driver cDNA作为起始材料进行差减杂交。在37℃水浴下分别将Tester cDNA和Driver cDNA用RsaI酶切1.5h，然后将酶切后的Tester cDNA分成两等份，连接上不同的接头，而Driver cDNA不连接接头。两种连接有不同接头的Tester cDNA分别与过量的Driver混合，进行第一次差减杂交。将两种第一次差减杂交的产物混合，再与新鲜变性的Driver cDNA进行第二次差减杂交，通过两次抑制性PCR扩增差异表达的片段，使其得到富集。

(5)cDNA消减文库的构建与初步筛选、克隆、鉴定

正向消减杂交cDNA片段的第二次PCR产物(QIAquick PCR Purification Kit纯化，购自Qiagen)与pGEM-T Easy(购自Promega试剂盒)载体连接，依照pGEM-T Easy试剂盒的程序，具体步骤如下：用200μl PCR管依次加入下列成分：纯化的正向差减杂交cDNA片段的第二次PCR产物3μl，T4连接酶缓冲液5μl，pGEM-T Easy载体1μl，T4DNA连接酶1μl，于4℃连接过夜。取10μL连接反应产物，加入到100μL感受态大肠杆菌JMI09(购自TAKARA)中，冰浴30min、热休克60s、冰浴2min，另加250μL LB培养液(1％Tryptone购自OXOID，0.5％YeastExtract购自OXOID，1％NaCl购自国药)置37℃水浴中，以225r/min振荡培养30min，取200μL菌液种植于含50μg/mL氨苄青霉素的LB(同上)/X-gal/IPTG(X-gal/IPTG购自TAKARA)培养板上，37℃培育18h。计数培养板中直径＞1mm的清晰白色及蓝色菌落数，随机挑取300个白色菌落(编号：Gh-S2-001至Gh-S2-300)。将所有白色克隆挑于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基的96孔细胞培养板(CORNING)中，37℃培养过夜后加甘油至终浓度20％，于-80℃保存备用。以巢式PCR引物Primer 1和Primer 2R(Clontech公司的PCR-select^TM cDNASubtraction Kit试剂盒自带)进行菌液PCR扩增，得到231个阳性克隆，对所有阳性克隆在送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序

(6)差异克隆的cDNA测序分析：

将上述231个差异克隆的DNA测序，将DNA测序结果去除载体和不明确序列及冗余的cDNA后，共得到203个有效EST(unigene)。

实施例2 棉花离子通道类编码基因GhSOS1的克隆

克隆子Gh-S2-073去掉冗余DNA后，序列为SEQ ID No：3，序列分析表明该序列的编码的氨基酸序列属于离子通道类蛋白SOS1，本文将克隆子Gh-S2-073编码的全长基因命名为GhSOS1，该基因对应的蛋白命名为SOS1。

SEQ ID No：3

GhSOS1全长基因的克隆

根据已经获得的SEQ ID No：3序列，设计两条特异性引物，作为3’RACE的5’端特异性引物。

GhSOS1 GSP1：SEQ ID NO：4：

TCAGCTCTGAAACTGGAAGCCG

GhSOS1 GSP2：SEQ ID NO：5：

CAGCAGCCAAGAAGCGTATACT

实验步骤按试剂盒说明书操作(3’RACE System for Rapid Amplification ofcDNA Ends试剂盒购自invitrogen公司)。

用SEQ ID NO：4与3’端引物AUAP(试剂盒自带)，以mRNA逆转录的cDNA为模板进行第一轮PCR扩增。具体步骤如下：Ex Taq购自TAKARA，50μl PCR反应体系：5μl 10×ExBuffer，3μl 2.5mM的dNTP，2.0μl mRNA反转录的cDNA，1.0μl Ex Taq、10μM的引物SEQ IDNO：4和AUAP各2.0μl，以及35μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，33个循环后，72℃延伸10min。

所得的PCR产物用双馏水稀释50倍后取2.0μl作为模板，用SEQ ID NO：5与3’端引物AUAP进行第二轮PCR扩增，具体步骤如下：50μl PCR反应体系：5μl 10×Ex Buffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μl稀释的第一轮PCR产物，1.0μl Ex Taq、10μM的引物SEQ ID NO：5和AUAP各2.0μl，以及35μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，33个循环后，72℃延伸10min。第二次PCR产物回收片段约为2400bp条带(GelExtraction Kit购自OMEGA)连接于pGEM-T Easy Vector，转化到大肠杆菌JM109(具体方法同上)，随机挑取10个白色菌落于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，37℃培养过夜后加甘油至终浓度20％，-80℃保存备用。SEQ ID NO：5与3’端引物AUAP进行菌液PCR扩增，得到3个阳性克隆，送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序测序，获得该基因的cDNA的3’端。

根据已经获得的SEQ ID No：3序列，设计三条特异性引物，作为5’RACE的3’端特异性引物。

GhSOS1 GSP3：SEQ ID NO：6：

TCTTCCAGAAACTTCCTCGCCT

GhSOS1 GSP4：SEQ ID NO：7：

GCAACTACACTGTCACCTATAA

GhSOS1 GSP5：SEQ ID NO：8：

ACAGATTGCATCAACAGATTTG

实验步骤按试剂盒说明书操作(5’RACE System for Rapid Amplification ofcDNA Ends试剂盒购自invitrogen公司)。

用SEQ ID NO：7与5’通用引物AAP(试剂盒自带)，以mRNA逆转录的cDNA(反转录引物SEQ ID NO：6)为模板进行第一轮PCR扩增，具体步骤如下：Ex Taq购自TAKARA，50μl PCR反应体系：5μl 10×Ex Buffer，3μl 2.5mM的dNTP，2.0μl mRNA反转录的cDNA，1.0μl ExTaq、10μM的引物SEQ ID NO：7和AAP各2.0μl，以及35μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，33个循环后，72℃延伸10min。所得的PCR产物用双蒸水稀释50倍后取2.0μl作为模板，用SEQ ID NO：8与3’端引物AUAP进行第二轮PCR扩增，具体步骤如下：50μl PCR反应体系：5μl10×Ex Buffer，3μl 2.5mM的dNTP，2.0μl稀释的第一轮PCR产物，1.0μl Ex Taq、10μM的引物SEQ ID NO：8和AUAP各2.0μl，以及35μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，33个循环后，72℃延伸10min。第二次PCR回收片段约为1700bp条带(Gel Extraction Kit购自OMEGA)连接于pGEM-T Easy Vector，转化到JM109(具体方法同上)，随机挑取10个白色菌落于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，37℃培养过夜后加甘油至终浓度20％，-80℃保存备用。SEQ ID NO：8与3’端引物AUAP进行菌液PCR扩增(反应体系及反应条件同上)，得到4个阳性克隆，送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序测序，获得该基因的cDNA的5’端。

所得的5’RACE产物克隆测序后，与3’RACE产物测序结果拼接。获得GhSOS1的cDNA序列SEQ ID NO：9。

SEQ ID NO：9：

根据GhSOS1全长cDNA序列设计一对引物如下：

GhSOS1F：SEQ ID NO：10：

ATGGAGGAAGTGAAAGAGTATCTAT

GhSOS1R：SEQ ID NO：11：

TTAAGAAGCCTGGTGGAATGATAG

通过SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11来克隆GhSOS1全长。

采用TaKaRa的PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以棉花的cDNA为模板进行PCR反应。50μlPCR反应体系：10μl 5×PS Buffer，3μl 2.5mM的dNTP，2.0μl cDNA，1.0μl PrimeSTAR、10μM的引物SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11各2.0μl，以及30μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，33个循环后，72℃延伸10min。

PCR扩增产物加A尾：PCR产物加2.5倍的无水乙醇，-20℃放置10分钟，离心，去上清，晾干，用21μl双蒸水溶解。加入2.5μl 10×Ex Buffer，0.5μl 5mM的dATP，2.5μl 10×ExTaq。反应条件：70℃反应30分钟。将得到约3300bp的DNA片段回收(Omega回收试剂盒)，连接至pGEM T-easy载体上(得到GhSOS1-pGEM质粒)，转化JM109(方法同上)，随机挑取10个白色菌落于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，37℃培养过夜后加甘油至终浓度20％，-80℃保存备用。SEQ ID NO：10与SEQ ID NO：11进行菌液PCR扩增(反应体系及反应条件同上)，得到4个阳性克隆，送至英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，序列为SEQ ID NO：2，其编码的蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

SOS1蛋白的氨基酸序列：SEQ ID NO：1

GhSOS1编码基因的核苷酸序列：SEQ ID NO：2

实施例3 GhSOS1基因植物表达载体构建

选择植物双元表达载体pCAMBIA2300(购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)作为植物表达载体，用Pnos启动子替换NPTII基因含双增强子的35S启动子，以降低NPTII蛋白在植物中的表达。选择35S及Tnos作为GhSOS1基因的启动子和终止子。

用引物SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13以植物表达载体PBI121(购自北京华夏远洋科技有限公司)为模板扩增Pnos，采用TaKaRa的PrimeSTAR HS DNA聚合酶。50μl PCR反应体系：10μl 5×PS Buffer，3μl 2.5mM的dNTP，1.0μl PBI121，1.0μl PrimeSTAR、10μM的引物SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13各2.0μl，以及31μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，33个循环后，72℃延伸10min。通过EcoRI、BglII酶切连接到pCAMBIA2300(promega，T4连接酶盒)获得pCAMBIA2300-1。

SEQ ID NO：12：

GCACGAATTCGGCGGGAAACGACAATCTGA

SEQ ID NO：13：

ATCCAGATCTAGATCCGGTGCAGATTATTTG

SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15以PBI121为模板扩增Tnos，采用TaKaRa的PrimeSTAR HS DNA聚合酶。50μl PCR反应体系：10μl 5×PS Buffer，3μl 2.5mM的dNTP，1.0μl PBI121，1.0μl PrimeSTAR、10μM的引物SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13各2.0μl，以及31μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，33个循环后，72℃延伸10min。通过KpnI、EcoRI酶切连接到pCAMBIA2300-1(promega T4连接酶盒)获得pCAMBIA2300-2

SEQ ID NO：14：

AAGGGTACCGAATTTCCCCGATCGTTCAAA

SEQ ID NO：15：

TCAGAATTCCCAGTGAATTCCCGATCTAGTA

SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17以pCAMBIA2300为模板扩增35S启动子，采用TaKaRa的PrimeSTAR HS DNA聚合酶。50μl PCR反应体系：10μl 5×PS Buffer，3μl 2.5mM的dNTP，1.0μl pCambia2300质粒，1.0μl PrimeSTAR、10μM的引物SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17各2.0μl，以及31μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，33个循环后，72℃延伸10min。通过HindIII、SalI酶切连接到(连接方法同上)pCAMBIA2300-2获得pCAMBIA2300-3

SEQ ID NO：16：

ACTAAGCTTTAGAGCAGCTTGCCAACATGGTG

SEQ ID NO：17：

TGAGTCGACAGAGATAGATTTGTAGAGAGAGACT

SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19扩增GhSOS1(模板是实施例2所获得的GhSOS1-pGEM质粒)，采用TaKaRa的PrimeSTAR HS DNA聚合酶。50μl PCR反应体系：10μl 5×PS Buffer，3μl 2.5mM的dNTP，1.0μl GhSOS1-pGEM，1.0μl PrimeSTAR、10μM的引物SEQ ID NO：18和SEQID NO：19各2.0μl，以及31μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，33个循环后，72℃延伸10min。通过KpnI、SalI酶切连接到(连接方法同上)pCAMBIA2300-3，获得植物表达载体35S-GhSOS1-2300。

SEQ ID NO：18：

TGACTGCAGATGGAGGAAGTGAAAGAGTATCTAT

SEQ ID NO：19：

AAGGAGCTCTTAAGAAGCCTGGTGGAATGATAG

实施例4 35S-GhSOS1-2300表达载体转化农杆菌

农杆菌LBA4404(购自Biovector Science Lab，Inc)感受态制备：提前1-2天将农杆菌LBA4404在含50μg/ml利福平和50μg/ml链霉素的LB固体培养基上划单斑接种，28℃培养1至2天。挑取单菌落接种于5ml含50μg/ml利福平和50μg/ml链霉素的LB液体培养基中，28℃下摇动培养过夜(约12-16h)至OD600值为0.4，形成种子菌液。取5ml活化后的菌液(1∶20的比例)接种于100ml同样浓度抗生素的LB液体培养基中，28℃摇动培养2-2.5h至OD₆₀₀＝0.8。冰浴菌液10min，每隔3min摇匀一次，令细菌均匀进入休眠状态。于4℃下4000g离心10min，弃上清液；加入一定量预冷10％甘油重悬浮菌体，4℃下4000g离心10min，收集沉淀；用10％甘油重复洗3-4次；加入适量冰浴预冷的10％甘油重新悬浮细菌沉淀，以40μl/管将其分装，于-70℃保存备用。

转化农杆菌：在冰上融化感受态细胞，往40μl的感受态细胞中加入1μl的质粒，混匀后冰浴约10min。将感受态和DNA的混合物用枪转移到预冷的电击杯中，轻敲使悬浮液到达底部，注意不要有气泡。将电击杯(购自bio-rad)放到电击室的滑道上，推动滑道将电击杯放至电击室基座电极处。使用0.1cm的电击杯的时候，MicroPulser(购自bio-rad)的程序设置为“Agr”，电击一次。立即取出电击杯，加入28℃预热的LB培养基。快速而轻柔的用枪将细胞打匀。将悬浮液转入1.5ml的离心管，28℃，225rpm培养1h。取100～200μl的菌液涂布与相应的抗性筛选培养基平板上(LB固体培养基，含50μg/ml利福平、50μg/ml链霉素、50μg/ml卡那霉素)，28℃培养。

实施例5 利用农杆菌介导的转化法获得转基因烟草

用75％酒精浸泡烟草种子(国家烟草中期库，获取单位：中国农科院烟草所，库编号I5A00660)30s，用灭菌双蒸水洗两次。再用0.1％升汞浸泡8min，用灭菌双蒸水洗两次，完成表面灭菌。将表面灭菌的烟草种子置于MS(18.78mM KNO₃，1.25mM KH₂PO₄，20.6mM NH₄NO₃，1.5mM MgSO₄，3.0mM CaCl₂，50μM KI，100μM H₃BO₃，100μM MnSO₄，30μM ZnSO₄，1μM Na₂MoO₄，0.1μM CoCl₂，100μM Na₂EDTA，100μM FeSO₄，7.4g/L琼脂，蔗糖30g/L)上于无菌条件下发芽，制备无菌苗。取无菌苗叶片剪成5mm×5mm大小的叶盘，用处于对数生长期的含表达载体35S-GhSOS1-2300的农杆菌浸染叶盘10min，吸干菌液，在黑暗条件下共培养2天(MS培养基)。将叶片转到分化培养基(MS+1mg/L细胞分裂素(BA)+0.1mg/L萘乙酸(NAA)+50mg/L卡那霉素+500mg/L头孢霉素)上，光照条件下培养45天左右，待芽长大后切下转移到生根培养基(MS+50mg/L卡那霉素+500mg/L头孢霉素)中培养30天左右，待根系发达后将小苗转入仅加有500mg/L头孢霉素的MS培养基上进行编号保存。

取获得的转基因烟草叶片，提取DNA(同实施例3中拟南芥DNA提取方法)，用SEQ IDNO：9：和SEQ ID NO：10(50μl PCR反应体系：5μl 10×Ex Buffer，3μl 2.5mM的dNTP，2.0μlDNA，1.0μl Ex Taq、10μM的引物SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10各2.0μl，以及35μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，33个循环后，72℃延伸10min)，PCR鉴定，保存阳性植株进行编号T₀W1-T₀W20。

实施例6 过表达GhSOS1转基因烟草T1的耐盐模拟实验及功能鉴定

将灭过菌的蛭石用1/2MS培养基浸透。T₀W1-T₀W20及对照烟草种子分别播种在蛭石上，每盆播种15颗种子，25℃、14小时光培养/10小时暗培养循环，每5天浇一次1/2MS，培养25天之后，SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11做PCR检测，去除阴性植株。选取大小一致的转基因烟草及对照烟草做耐盐实验，每盆保留大小较一致的4-5颗苗。转基因烟草、对照烟草浇还200mM NaCl的1/2MS，25℃、14小时光培养/10小时暗培养循环。14天后观察结果，T1代转基因植株(T0代转基因植株的种子长成的植株)的耐盐性鉴定表明，对照植株不能正常生长，而T₁W3、T₁W5、T₁W8、T₁W12、T₁W16、T₁W19六个株系的烟草中能够正常生长，表现出明显的耐盐性(参见图2，以T₁W3为例，T₁W5、T₁W8、T₁W12、T₁W16、T₁W19的结果与T₁W3类似，在此未示出)。

实施例7 在转录水平上验证SOS1蛋白表达

实施6中T₁W3、T₁W5、T₁W8、T₁W12、T₁W16、T₁W19正常生长T1代植株随机选取8棵，实施6中对照植株随机选取4棵，用植物RNA提取试剂盒(invitrogen)提取的总RNA。紫外分光光度测定总RNA在260nm和280nm的吸光度值，计算各个RNA浓度。依照invitrogen反转录试剂盒SuperScript III Reverse Transcriptase所示方法进行反转录(1μg总RNA作为模板，反转录引物SEQ ID NO：11)。通过SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21检测GhSOS1，检测SOS1蛋白相对表达情况。采用TaKaRa的PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以反转录的cDNA为模板进行PCR反应。50μl PCR反应体系：10μl 5×PS Buffer，3μl 2.5mM的dNTP，2.0μl cDNA，1.0μlPrimeSTAR、10μM的引物SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21各2.0μl，以及30μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，28个循环后，72℃延伸10min。产物电泳结果如图4所示：M为DNA Ladder Marker(DL2000，购自深圳瑞真生物技术有限公司)，1-8为转基因植株植株，9-12为对照植株，13为正对照(GhSOS1，SEQ ID NO：2)。图中所示条带大小与正对照的大小一致。结果表明正常生长转基因植株对GhSOS1转录较强，对照植株没有转录。

SEQ ID NO：20：TCTGATTCTTCTGTACATCTTTG

SEQ ID NO：21：TTGAGTGCTTGTTTCGTATGCTC

Claims

1.棉花的一个离子通道类蛋白编码基因，其序列为SEQ ID NO:2。

2.一种重组表达载体，其含有权利要求1所述的基因并且所述基因的核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接。

3.权利要求2所述的载体，其为附图2所示的35S-GhS0S1-2300载体。

4.一种重组农杆菌细胞，其含有权利要求1所述的基因或者权利要求2或3所述的重组表达载体。

5.一种改善烟草耐盐性的方法，包括：将权利要求1所述的基因或者权利要求2或3所述的重组表达载体导入烟草或烟草组织并使所述基因表达。

6.一种制备转基因烟草的方法，包括：在有效产生烟草的条件下培养含有权利要求1所述的基因或者权利要求2或3所述的重组表达载体的烟草或烟草组织。

7.权利要求1所述的基因、权利要求2或3所述的重组表达载体或者权利要求4所述的重组农杆菌细胞用于改善烟草耐盐性或用于烟草育种的用途。

8.权利要求1所述的基因编码的蛋白，其序列如SEQ ID NO:1所示。