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CN105026546A - 重组生物 - Google Patents

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CN105026546A
CN105026546A CN201380062580.0A CN201380062580A CN105026546A CN 105026546 A CN105026546 A CN 105026546A CN 201380062580 A CN201380062580 A CN 201380062580A CN 105026546 A CN105026546 A CN 105026546A
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CN
China
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microalgae
transgenic
desaturase
seq
omega
Prior art date
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Pending
Application number
CN201380062580.0A
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乔纳森·A·内皮尔
奥莉加·萨亚诺瓦
玛丽·汉密尔顿
罗亚尔·瓦埃齐
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Rothamsted Research Ltd
Original Assignee
Rothamsted Research Ltd
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Publication date
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Abstract

本发明涉及具有增加的ω-3长链多不饱和脂肪酸的产生的基因改造的生物。

Description

重组生物
发明领域
本发明涉及具有增加的ω-3长链多不饱和脂肪酸的产生的转基因生物，特别是转基因微藻，相关方法和应用。
前言
长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFAs)长度上具有至少20个碳的碳骨架，并且包含多个去饱和双键。基于第一个双键在甲基或脂肪酸末端的位置，可以将长链多不饱和脂肪酸分组成ω-3或ω-6类。
目前，充分确定了ω-3 LC-PUFAs，特别是二十碳五烯酸(EPA；20：5Δ5，8，11，14，17)和二十二碳六烯酸(DHA；22：6Δ4，7，10，13，16，19)是主要的人体营养成分，并且在婴儿和儿童的生长和发育中以及在通过其对免疫系统的作用而保持健康方面具有重要的作用(Voigt等，2000；Calder，2003)。越来越多的来自临床研究的证据表明在人的饮食中存在ω-3LC-PUFAs对诸如心血管疾病、肥胖、代谢综合征和湿疹(eczema)的病症具有治疗作用(Navarro等，2000；Nugent，2004；Das，2002)。
尽管海洋鱼类是EPA和DHA主要的饮食来源，但是鱼类资源的耗尽和海洋环境的污染表明亟需LC-PUFAs的替代和持久来源。在水生食物链中，海洋微生物是主要的LC-PUFAs生产者，并且已经证明富含EPA和DHA的微藻是用于人类消费的鱼油的有希望的替代来源。因此，已经成功地开发了寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)和裂壶藻物种(Schizochytrium sp.)的商业培育，用于DHA生产，并且已经证明一些海洋微生物有潜力用于EPA的工业生产(微拟球藻(Nannochloropsis)物种，Phaeodactylum物种，菱形藻属物种(Nitzshia spp.))(Harwood和Guschina，2009)。然而，高价值的产品，如ω-3 LC-PUFAs的商业生产维持起来是昂贵的，并且这表示实质性的技术挑战。
增加LC-PUFAS水平的一种方法是使用酰基-CoA依赖性的去饱和酶(Venegas-Caleron等，2010)。近年来，相当多的注意力集中在改造高等植物用来在其种子油中产生非常长链的多不饱和脂肪酸(VLC-PUFAs)。最近，已经证明了在转基因拟南芥属(Arabidopsis)和荠蓝(Camelina)植物中使用来自青绿藻(Ostreococcus tauri)(OtD6)的酰基-CoA-依赖性Δ6-去饱和酶合成LC-PUFAs的优点(Sayanova O.，等，2012，Ruiz-Lopez N.，等，2012)。这些研究表明，LC-PUFA途径的第一步，即，Δ6-去饱和作用是限速步骤。
作为生产LC-PUFAs的替代方式，在微藻的代谢改造方面存在日益增加的兴趣，并且藻类品种的遗传改造代表着一种有希望的可持续性生产ω-3油的策略。产生用于商业生产的增加水平的LC-PUFAs的有效的微藻重组改造将解决全球的需求，并且以这种方式操作的微藻可用作食品添加剂和动物饲料，包括水产养殖，以满足全球的需求。
三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)是一种单细胞硅藻(diatom)，其积聚多至30％的EPA和仅是痕量的DHA，并且被认为是良好的EPA工业生产资源(Molina Grima等，1996)。首次使用[14C]乙酸盐的标记实验表明三角褐指藻(P.tricornutum)通过脂肪酸的延长和需氧去饱和作用从头合成EPA(Moreno等，1979)。在脉冲追踪实验中，Arao和Yamada已经证明了EPA可以通过4种不同途径合成，并且优选的途径涉及ω-6和ω-3途径的中间物(Arao和Yamada，1994)。大部分的EPA存在于半乳糖脂中，而不是中性脂质，如甘油三酯(Arao等，1987；Yongmanitchai和Ward，1993)。近来，已经克隆并表征了编码参与三角褐指藻中EPA生物合成的Δ5-和Δ6-去饱和酶的基因(Domergue等，2002)。证明两种去饱和酶是这两种途径贡献相等的微粒体酶，并且它们支持所述优选的路径在ω-6和ω-3途径中同时作用。这表明参与三角褐指藻中的EPA生物合成的Δ6-和Δ5-去饱和作用以及Δ6-延长作用在内质网(ER)中发生，并且刚合成的EPA之后输入到质体中。仅有少量的EPA生物合成途径的所有中间物的存在表明三角褐指藻已经发展了高度有效的积聚EPA作为单一的终产物的机制(Arao和Yamada，1994)。在一些微藻中，DHA可以通过这样合成：用特异性的Δ5-延长酶将EPA延长为二十二碳五烯酸(DPA；22：5Δ7，10，13，16，19)，然后用Δ4-去饱和酶将DPA转化为DHA。
本发明的目的是减少在各种生物中、特别是在藻类中生产LC-PUFAs的缺点。
发明概述
本发明一般涉及具有增加的LC-PUFAs的产生、特别是ω-3LC-PUFAs(如DHA和/或EPA)的产生的转基因生物，特别是转基因微藻。所述转基因生物，特别是转基因微藻，表达一种或多种编码参与LC-PUFAs生物合成途径的多肽的异源核酸。本发明还涉及用于制备转基因生物、特别是转基因微藻的方法，所述转基因生物、特别是转基因微藻的应用，和用于增加生物中、特别是微藻中LC-PUFAs的产生、特别是ω-3LC-PUFAs、更特别是DHA和/或EPA的产生的方法。本发明还涉及分离的核酸及其在用于增加转基因生物中LC-PUFAs的产生、特别是ω-3LC-PUFAs的产生的方法中的应用。
本发明人已经证明可以用重组方法操作微藻，从而利用异源基因表达产生增加量的LC-PUFAs，特别是EPA和DHA。本发明人已经令人惊讶地证明了来自青绿藻的Δ5-延长酶的单独的异源表达导致三角褐指藻中增加的DHA积聚，在转基因藻株中DHA水平达到多至总脂肪酸的13％。本发明人还已经证明在三角褐指藻中过量表达OtD6对EPA水平具有积极的作用。这些发现为在转基因微藻中表达异源基因并通过代谢改造而增强LC-PUFAs生物合成途径的功效提供了证据。此外，其他产生EPA/DHA的生物体，包括动物和植物，可以以通过过量表达来自青绿藻的Δ5-延长酶的相同方式进行操作。
因此，在一个方面中，本发明涉及具有增加的一种或多种ω-3LC-PUFA的产生的转基因微藻。在一个实施方案中，所述ω-3 LC-PUFA选自DHA和/或EPA。在另一个方面中，本发明涉及转基因微藻在生产ω-3LC-PUFAs中的应用。在另一个方面中，本发明涉及一种用于制备具有增加的ω-3 LC-PUFAs含量的转基因微藻的方法。在另一个方面中，本发明涉及一种用于增加微藻中多种ω-3 LC-PUFA中的一种的产生的方法，所述方法包括：
a)在微藻中引入异源核酸并进行表达，
b)培育所述微藻，和
c)从转基因微藻获得所述多种ω-3 LC-PUFA中的一种。
在另一个方面中，本发明涉及一种用于增加微藻中DHA的产生的方法。在另一个方面中，本发明涉及一种用于增加微藻中EPA的产生的方法。
本发明还涉及从本文所述的微藻分离的油或包含所述的转基因微藻或来源于其的产物的组合物以及它们的应用。
在另一个方面中，本发明涉及用于制备饲料的方法，所述方法包括：
a)培育本文所述的转基因微藻，和
b)从所述转基因微藻获得所述多种ω-3 LC-PUFA中的一种。
在另一个方面中，本发明涉及包含SEQ ID No.7或9的分离的核酸，其编码包含SEQ ID No.8或10的Δ6-去饱和酶(Ost809Δ6)，其功能变体或与SEQ ID No.8或10具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性的Δ6-去饱和酶，以及它们的应用。本发明还涉及包含SEQ ID No.15或17的分离的核酸，其编码包含SEQ ID No.16或18的Δ4-去饱和酶(Ost809Δ4)，其功能变体或与SEQ ID No.16或18具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源性的Δ4-去饱和酶，以及它们的应用。在另一个方面中，本发明涉及包含SEQ ID No.19的分离的核酸，其编码包含SEQ ID No.20的Δ6-延长酶(FcELO6)，其功能变体或与SEQ ID No.20具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源性的Δ6-延长酶，和包含SEQ ID No.21的分离的核酸，其编码包含SEQ ID No.22的Δ5-去饱和酶，其功能变体或与SEQ ID No.22具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源性的Δ5-去饱和酶，以及它们的应用。
在另一个方面中，本发明涉及本文所述的分离的核酸在增加微藻或高等植物中ω-3 LC-PUFAs、特别是DHA和/或EPA的产生中的应用。
此外，本发明涉及转基因生物，优选微藻，其通过表达异源Δ5-延长酶而具有增加的DHA水平。
附图
在下述非限制性附图中进一步描述本发明。
图1.野生和表达青绿藻(O.tauri)Δ6去饱和酶的转基因三角褐指藻在两个不同的生长阶段在不同生长条件下的EPA含量：a)20℃60μmol光子m-2s-1；b)20℃25μmol光子m-2s-1；c)18℃25μmol光子m-2s-1。
图2a.在指数期(E)和静止期(S)过程中野生型和表达OtElo5的转基因三角褐指藻细胞的总脂肪酸组成。培养物在60μmol光子m-2s-1的恒定照射下在20℃振荡生长。每个值表示三次独立的实验的平均值±SD。
b.野生型和表达OtElo5的转基因三角褐指藻中的EPA＜DPA和DHA含量。培养物在70rpm的恒定振荡下在20℃60μmol m-2s-1生长。每个测量是三次生物学重复的平均值。
图3.野生型(A)和表达Ostreococcus Elo5的转基因三角褐指藻(B)的酰基-CoA分布图。B中LC-PUFA酰基-CoAs的积聚用虚线框出。内部标准(istd)是17：00酰基-CoA。
图4.野生型和转基因OtElo5三角褐指藻细胞的总FA提取物中的EPA和DHA含量。
图5A.在生长静止期，野生型和转基因三角褐指藻的TAG种类的分布。
图5B.在不同生长阶段，野生型和转基因三角褐指藻的TAG种类的分布。
图6.在生长周期的不同阶段，野生型和表达OtElo5的转基因三角褐指藻的TAG种类中的DHA分布：A-特定TAGs中的DHA；B-含有DHA的TAG百分数(％)。
图7.ω-3 PUFA生物合成途径(示意图)。
图8.在存在外源底物18：3n-3(ALA)的条件下，在转基因酵母中表达Ost809Δ6-去饱和酶。(BPX72柱)。注意，ALA向更高不饱和形式的转化(SDA-箭头表示的)。使用含有空载体(pYES2-C)的酵母菌株没有发生转化，并且仅在通过加入半乳糖(Gal+；B)诱导Ost809去饱和酶表达时发生转化。
图9.酵母中Ost809Δ6的功能表征(BPX72柱)。对酵母细胞补充LA和ALA。Ostreococcus 809Δ6在补充有18：2(LA)和18：3(ALA)二者的酵母中表达。注意，ALA，而不是LA，向更高不饱和形式的特定转化。使用含有空载体(pYES2-C)的酵母菌株没有发生转化，并且仅在通过加入半乳糖(Gal+；B)诱导Ost809去饱和酶表达时发生转化。
图10.在DPA(C22：5n-3)的存在下，表达Ost809Δ4去饱和酶的转基因酵母的FAMEs模式。Ostreococcus 809Δ4在补充有外源22：5(DPA)的酵母细胞中的表达。注意，22：5n-3向更高不饱和形式(22：6n-3；DHA-箭头)的转化。使用含有空载体(pYES2-C)的酵母菌株没有发生转化，并且仅在通过加入半乳糖(Gal+；B)诱导Ost809D4去饱和酶表达时发生转化。NB。这些C22PUFAs在HP1GC柱上充分解析-在这一情形中，与较少饱和的形式相比，(聚)不饱和脂肪酸更早地洗脱下来-这与上文所用的BPX72柱相比是相反的。
图11.表达FcElo6(BPX72柱)的转基因酵母的FAMEs模式。对酵母补充18：3n-6(GLA)。在补充有外源18：3(GLA)的酵母细胞中表达圆柱拟脆杆藻(Fragilariopsis cylindrus)Elo6。注意，18：3ALA向延长形式20：3n-3(箭头)的转化。使用含有空载体(pYES2-C)的酵母菌株没有发生转化，并且仅在通过加入半乳糖(Gal+；B)诱导拟脆杆藻属(Fragilariopsis)Elo6表达时发生转化。
图12.显示n-3特异性Ost809Δ6去饱和酶与其他Δ6-去饱和酶之间的关系的系统树。
图13.FcElo6的表达导致DHA水平增加多至14-17％。来自表达FcElo6的Pt细胞的总FA模式的GC-MS分析。
图14.载体系统pPTOS2的示意性表示。
图15.在三角褐指藻中共表达两种异源性ω-3 LC-PUFA生物合成活性。Pt_WT，pPhOS2.1(表达OtElo5)和pPhOS2.2(表达OtD6Pt与OtElo5)细胞在16℃和20℃生长的S期期间的脂肪酸组成。值是三次实验的平均值(+/-标准误差)。
图16.pPhOS_Ppglut(表达OtElo5与Pp葡萄糖转运蛋白(Ppglucosetransporter))细胞在20℃，100μmol m-2s-1在以70rpm恒速振荡下生长的S期期间的脂肪酸组成。N＝1。
图17.pPhOS_Hsglut(表达OtElo5和人葡萄糖转运蛋白)细胞在20℃，100μmol m-2s-1在以70rpm恒速振荡下生长的S期期间的脂肪酸组成。N＝1。
图18.Wt和pPhOS_Ppglut Pt细胞在暗处的生长。
详述
现在进一步描述本发明。在下述段落中，更详细的定义本发明的不同方面。这样定义的每个方面可以与任意一个或多个其他方面组合，除非有清楚的相反指示。特别地，任意表示为优选的或有利的特征可以与任意其他一种或多种表示为优选或有利的特征组合。
除非另外指明，本发明的实施将利用微生物学、组织培养、分子生物学、化学、生物化学和重组DNA技术的常规技术，这在本领域技术人员的能力内。此类技术在参考文献中充分解释。
本发明涉及微藻中脂肪酸生物合成途径的遗传操作。具体地，本发明涉及用于增加生物、特别是微藻中LC-PUFAs、特别是ω-3 LC-PUFAs(例如，多种ω-3 LC-PUFA中的一种)的产生的方法。
取决于最接近脂肪酸碳链甲基端的第一个双键的位置(n)，多不饱和脂肪酸可以分成两个大家族。因此，ω-6脂肪酸具有距离分子的ω端(甲基)六个碳原子的第一不饱和双键，并且，另外具有总计两个以上的双键，每个后续的不饱和性发生在距离该分子羧基端3个另外的碳原子处。相反，ω-3脂肪酸在距离分子ω端三个碳原子处具有第一个不饱和键，并且另外具有总计三个以上的双键，每个后续的不饱和性发生在距离该分子羧基端3个另外的碳原子处。
表I总结了ω-3脂肪酸在整个说明书中所用的通称和缩写：
表I
通称 缩写 简化符号
油酸 OA 18：1Δ9
亚油酸 LA 18：2Δ9，12
γ-亚麻酸 GLA 18：3Δ6，9，12
二-高γ-亚麻酸 DGLA 20：3Δ8，11，14
花生四烯酸 ARA 20：4Δ5，8，11，14
α-亚麻酸 ALA 18：3Δ9，12，15
十八碳四烯酸 SDA 18：4Δ6，9，12，15
二十碳四烯酸 ETA 20：4Δ8，11，14，17
二十碳五烯酸 EPA 20：5Δ5，8，11，14，17
二十二碳五烯酸 DPA 22：5Δ7，10，13，16，19
二十二碳六烯酸 DHA 22：6Δ4，7，10，13，16，19
有多种酶参与图7所示的ω-3 PUFA生物合成途径。这些包括去饱和酶和延长酶。
通过遗传方式已经在不同的生物中鉴定了参与油产生的多种基因，并且这些基因中的一些的DNA序列是公众可获得的。非限制性的实例显示如下：
本文中所有序列IDs的引用都通过引用而明确地结合。
另外，专利参考文献提供多种参与多不饱和脂肪酸产生的基因的另外的DNA序列(和/或关于上述基因中的一些的详情及其分离方法)(例如，参见：美国专利号5,968,809(Δ5-去饱和酶)；美国专利号5,972,664和美国专利号6,075,183(Δ5去饱和酶)；WO 91/13972和美国专利号5,057,419(Δ9-去饱和酶)；WO 93/11245(Δ15-去饱和酶)；WO 94/11516.美国专利号5,443,974和WO 03/099216(Δ12-去饱和酶)；U.S.2003/0196217 A1(Δ17-去饱和酶)；WO 02/090493(Δ4-去饱和酶)；和WO 00/12720与U.S.2002/0139974A1(延长酶))。
术语“去饱和酶”用在本文中是指可以去饱和(即，在一种或多种脂肪酸中引入双键以产生单-或多-不饱和脂肪酸或目的前体)的多酶复合物的多肽成分。一些去饱和酶对两种以上的底物有活性。通过用关于脂肪酸去饱和酶的基因转化适当的宿主并且确定其对该宿主的脂肪酸模式的作用而凭经验确定该脂肪酸去饱和酶的特异性可能是合乎需要的。分离自多种生物的编码去饱和酶的核酸可以按照本发明的各个方面进行使用，并且在本文中记载了实例，包括Ostreococcus物种。
去饱和酶包括ω-3-去饱和酶，Δ6-去饱和酶，Δ5-去饱和酶，Δ12-去饱和酶，Δ19-去饱和酶，Δ17-去饱和酶和Δ4-去饱和酶。
术语“延长酶”用在本文中是指可以延长脂肪酸碳链产生比该延长酶所作用的脂肪酸底物长两个碳的酸的多肽。分离自多种生物的编码延长酶的核酸可以按照本发明的各个方面使用，并且本文中记载了实例，包括Ostreococcus物种。
由延长酶系统催化的反应的实例是GLA转化为DGLA，SDA转化为ETA，ARA转化为DTA和EPA转化为DPA。通常，延长酶的底物特异性略微宽泛些，但是由链长和不饱和的程度与类型二者区分。
例如，C14/16延长酶利用C14底物(例如，肉豆蔻酸)，C16/18延长酶利用C16底物(例如，棕榈酸酯)，C18/20延长酶利用C18底物(例如，GLA，SDA，LA，ALA)，并且C20/22延长酶(也称作Δ5-延长酶)利用C20底物(例如，ARA，EPA)。
由于一些延长酶具有宽泛的特异性，因此，单个酶可以能够催化几种延长酶反应(例如，由此作用为C16/18延长酶与C18/20延长酶)。通过用关于脂肪酸延长酶的基因转化适当的宿主并且确定其对该宿主的脂肪酸模式的作用而凭经验确定该脂肪酸延长酶的特异性可能是合乎需要的。
延长酶包括Δ6-，Δ5-和Δ9-延长酶。Δ5-延长酶通常不被认为是DHA生产中的限速酶，并且通常假定LC-PUFA途径中的第一步，即，D6-饱和，是限速的。
下文描述本发明涉及在转基因微藻中产生ω-3 LC-PUFAs的实施方案。技术人员应该理解，这些实施方案不限于转基因微藻，而是可以适用于其他的生物，来产生ω-3 LC-PUFAs。所述生物可以是动物，例如，哺乳动物。在一个实施方案中，人是特别排除在外的。在另一个实施方案中，所述生物是植物，例如，农作物。
在第一方面中，本发明涉及具有增加的ω-3 LC-PUFAs(例如，一种或多种ω-3 LC-PUFA或总ω-3 LC-PUFA含量)产生的转基因微藻。按照本发明的不同方面，ω-3 LC-PUFAs可以选自SDA，ETA，EPA，DPA或DHA。在一个实施方案中，所述ω-3 LC-PUFAs是DHA。在另一个实施方案中，所述ω-3脂肪酸是EPA。
按照本文所述的本发明的不同方面，DHA或EPA产生的增加以总脂肪酸(TFA)中不同ω-3 LC-PUFAs的单个含量进行测量。换言之，所述增加以总脂肪酸含量的百分数进行测量。优选地，与对照微藻(mol％)相比，所述增加是至少2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％或更多。
在一个实施方案中，所述ω-3 LC-PUFAs是DHA。在本发明的转基因微藻中，与对照微藻相比，所述DHA含量增加至少1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％或更多。在一个实施方案中，所述ω-3 LC-PUFAs是DHA。在本发明的转基因微藻中，DHA含量比对照微藻高至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少6倍，至少7倍，至少8倍，至少9倍或至少10倍。优选地，总DHA含量至少是总脂肪酸含量(mol％)的10％。
在另一个实施方案中，所述ω-3 LC-PUFAs是EPA。在本发明不同方面所述的转基因微藻中，EPA含量增加至少2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％。优选地，总EPA含量至少是总脂肪酸含量(mol％)的20％。
按照本发明的不同方面，与对照微藻相比，总脂肪酸含量、LC-PUFAs含量、ω-3 LC-PUFAs或单种脂肪酸如DHA的含量增加。用于本文的对照微藻是没有按照本发明的方法改造的微藻。因此，所述对照微藻没有进行遗传改造来表达本文所述的核酸以改变LC-PUFA含量。在一个实施方案中，对照微藻是野生型微藻。在另一个实施方案中，对照微藻是没有携带本文所述的方法的转基因而是表达不同的转基因的微藻。所述对照微藻典型是相同的藻类物种。
术语“总脂肪酸含量”在本文中是指在给定的样品中可以通过基质酯转化法(base transesterification method)衍生成脂肪酸甲酯的所有细胞脂肪酸的总和(本领域已知，例如，如在Sayanova等，(1997)；Sayanova等，(2003)FEBS Lett.2003年5月8日；542(1-3)：100-4中所述)。
按照本发明的不同方面，增加在静止期测量。
按照本发明的不同方面，术语微藻包括所有具有产生LC-PUFAs的能力的微藻。所述藻类可以是异养或自养藻类。
技术人员已知术语“微藻”包括来自一些不同的生物学组的单细胞、光合成的微生物，例如，包括，真核绿藻门(chlorophyta)，红藻门(rhodophyta)，不等鞭毛藻(heterokont)，藻类的定鞭藻(haptophyta)门和原核蓝细菌(cyanobacteria)。
已经在宽泛种类的海洋微藻中发现了EPA，包括，在下述纲中：硅藻纲(Bacillariophyceae)(硅藻类)，绿藻纲(Chlorophyceae)，金藻纲(Chrysophyceae)，隐藻纲(Cryptophyceae)，Eustigamatophyceae和青绿藻纲(Prasinophyceae)(见表II)。因此，按照本发明的不同方面，微藻可以选自这些目、纲或种。
按照本发明的不同方面，微藻可以选自表II列出的微藻。
表II：海洋微藻中的PUFAs的比例
*海洋球石藻(Emiliania huxleyiis)是Coccolithus huxleyi目前接受的名称。
在一个实施方案中，优选作为PUFAs的主要生产者的自养微藻。例如，微藻可以选自褐指藻(Phaeodactylum)，微拟球藻(Nannochloropsis)，Thraustochytrium或裂壶藻(Schizochytrium)。其他属包括螺旋藻属(Spirulina)，杜氏藻属(Dunaliella)，小球藻属(Chlorella)，海链藻属(Thalassiosira)，Isochrysis，紫球藻属(Porphyridium)，微拟球藻，Pavlova，角毛藻属(Chaetoceros)，隐甲藻属(Crypthecodinium)，Fraigilariopsi和菱形藻属(Nitzshia)。
例如，微藻可以选自钙质角毛藻(Chaetoceros calcitrans)，球等鞭金藻(Isochrysis galbana)，路氏巴夫藻(Pavlova lutheri)，Pseudoisochrysisparadoxa，四肩突四鞭藻(Tetraselmis suecica)和中肋骨条藻(Skeletonemacostatum)，微绿球藻(Nannochloropsis oculata)，假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)，Pavlova lutheria，Porphyridium irregular，寇氏隐甲藻，Porphyridium purpureum和Porphyridium cruentum。
在一个实施方案中，微藻是硅藻。硅藻是在海洋和淡水生态系统中普遍存在的褐藻，其负责大约20％的全球初级生产力。硅藻的定义特征是其模式华丽的硅化的细胞壁(称为硅藻细胞)，其表现出物种特异性的纳米级结构。
硅藻可以是环纹硅藻(centric diatom)或羽状硅藻(pennate diatom)。在一个实施方案中，硅藻属于舟形藻目(Naviculales)。在一个实施方案中，硅藻是三角褐指藻或假微型海链藻。在优选的实施方案中，硅藻是三角褐指藻。在另一个实施方案中，硅藻是拟脆杆藻属物种，例如，圆柱拟脆杆藻。
技术人员应该理解本发明的多个方面不限于三角褐指藻。实际上，技术人员应该理解，本发明可以适用于任何具有合成EPA和/或DHA的能力的微藻。
本发明不同方面所述的转基因微藻表达一种或多种异源转基因，所述异源转基因编码一种或多种参与LC-PUFAs生物合成的核酸。关于序列的“异源的”意指来源于外来物种的序列，或者，如果来自相同的物种，通过故意的人为干预在其组成和/或基因组基因座上与其天然形式基本上不同的序列。所述异源转基因优选地来源于或分离自微藻。在一个实施方案中，所述异源转基因来源于或分离自青绿藻纲，例如，Ostreococcus物种。异源转基因的序列可以被修饰为最适于在靶标生物中表达的密码。因此，本发明涉及通过重组方法获得的转基因生物。
例如，所述异源转基因可以编码Δ15-去饱和酶，Δ6-去饱和酶，Δ5-去饱和酶，Δ4-去饱和酶，Δ12-去饱和酶，Δ5-延长酶，Δ6-延长酶或它们的组合中的一种或多种。
在一个实施方案中，转基因微藻表达编码Δ5-延长酶的异源核酸。因此，在一个方面中，本发明涉及表达编码Δ5-延长酶的核酸的转基因微藻。例如，所述转基因微藻表达编码Δ5-延长酶的核酸，但是不表达任意其他编码参与调节LC-PUFAs的生物合成途径的多肽的转基因。在其他实施方案中，所述转基因微藻表达编码Δ5-延长酶的核酸和一种或多种参与调节LC-PUFAs的生物合成途径的异源转基因，例如，Δ6-去饱和酶，如OtD6，如实施例4所示。因此，其中共同表达编码Δ5-延长酶和Δ6-去饱和酶的核酸的实施方案是本发明的具体部分。Δ5-延长酶和Δ6-去饱和酶如本文所定义。
在一个实施方案中，本文所述的基因微藻共表达不参与调节LC-PUFAs的生物合成途径的异源核酸，例如，实施例5所示的葡萄糖转运蛋白基因，连同参与调节LC-PUFAs的生物合成途径的异源核酸，如OtElo5。如在实施例中所示，可以使用载体，允许两种参与不同特性的调节的异源核酸的共表达-一种用于ω-3s，并且一种通过表达葡萄糖转运蛋白而允许藻类在黑暗中生长。那么如果对细胞提供外源碳源，如葡萄糖，则其可以在黑暗中生长。因此，在一个实施方案中，在培养表达参与调节LC-PUFAs生物合成途径的基因(如OtElo5)和葡萄糖报道基因的藻类时，提供外源碳源，如葡萄糖。可以按照本发明使用的编码葡萄糖报道基因的核酸的实例如SEQ ID No.23和SEQ ID No.25所示。代表性的肽显示为SEQ ID No.24和SEQ ID No.26。
用于本文时，词语“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸”或“多核苷酸”意欲包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)，RNA分子(例如，mRNA)，天然存在的、突变的、合成的DNA或RNA分子，以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。其可以是单链的或双链的。所述核酸或多核苷酸包括，但不限于，结构基因的编码序列，反义序列，和不编码mRNAs或蛋白产物的非编码调节序列。这些术语还包括基因。术语“基因”或“基因序列”广泛地用于指与生物学功能相关的DNA核酸。因此，基因可以包括如基因组序列中的内含子和外显子，或者可以仅包括如cDNAs中的编码序列，和/或可以包括与调节序列组合的cDNAs。在本发明的不同方面的一个实施方案中，优选cDNA序列合成的(推定的)开放阅读框，cDNA的类似物。
为了本发明的目的，“转基因的”、“转基因”或“重组体”意指，例如，关于核酸序列、表达盒、基因构建体、载体或自主复制元件，如包含核酸序列的人工染色体，或转化了本发明所述的核酸序列、表达盒或载体的生物，通过重组方法产生的所有那些构建体，其中
(a)编码用于本发明的方法的蛋白的核酸序列，或
(b)与本发明所述的核酸序列可操作连接的遗传控制序列，例如，启动子，或
(c)a)和b)
没有处于其天然的遗传环境中，或者已经通过重组方法(如诱变)修饰，对于修饰，可以采取下述形式，例如，一个或多个核苷酸残基的置换、添加、缺失、倒置或插入。所述天然的遗传环境应该理解为意指原始微藻中的天然基因组或染色体基因座或在基因组文库中的存在。
因此，用于本发明的目的的转基因微藻理解为意指在其核内和或质体基因组中包含异源多核苷酸的微藻。所述异源多核苷酸优选稳定地整合到基因组内，以使所述多核苷酸连续传至后续的代。所述异源多核苷酸可以单独或作为重组DNA构建体的一部分而整合到基因组中。
在本发明的情形中，Δ5-延长酶催化EPA向DPA的转化。因此，按照本发明的不同方面，可以使用任意编码催化EPA向DPA的转化的Δ5-延长酶的核酸作为转基因。在一个实施方案中，用于本发明的Δ5-延长酶来源于或分离自Ostreococcus，优选青绿藻。优选地，所述Δ5-延长酶是来源于或分离自青绿藻的OtElo5。在一个实施方案中，本发明所述的转基因微藻表达包含SEQ ID No.1的核酸，其功能变体或编码Δ5-延长酶的序列，其中所述延长酶与SEQ ID No.2具有至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的同源性。在优选的实施方案中，所述微藻是三角褐指藻，并且所述核酸编码包含SEQ ID No.2或由SEQ ID No.2组成的Δ5-延长酶。
按照本发明的各个方面使用的功能变体是生物学活性变体。例如，SEQ ID No.1的生物学活性变体是这样的核酸序列：当在诸如三角褐指藻的微藻中表达时，其增加DHA的产生。术语变体包括已经针对在靶标生物中表达(例如，针对在三角褐指藻中的表达)进行密码子优化而改变的序列。
因此，如本领域技术人员应该理解的，应该理解，本发明的使用特定多核苷酸的各个方面，包括方法和应用，涵盖多于特指的序列，而且还包括肽中不影响生物学功能的改变。例如，核酸片段中导致在给定位点产生化学等价氨基酸而不影响所编码的多肽的功能特性的改变在本领域中是熟知的。例如，关于氨基酸丙氨酸(一种疏水氨基酸)的密码子可以被编码另一种疏水性较小的残基(如甘氨酸)或疏水性较高的残基(如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子置换。类似地，也可以预计导致以一种带负电荷的残基置换另一种(如以天冬氨酸置换谷氨酸)或以一种带正电荷的残基置换另一种(如意赖氨酸置换精氨酸)的变化产生功能性等价的产物。也预测导致多肽分子的N端和C端部分的改变的核苷酸变化不改变所述多肽的活性。每一种提议的修饰是本领域普通技术人员公知的，所编码的产物的生物学活性保留的确定也是公知的。
在一个实施方案中，本发明不同方面所述的核酸可操作地连接到调节序列上。
术语“调节元件”在本文中与“控制序列”和“启动子”可互换使用，并且所有术语应该在广义上采用，用来指能够影响其所连接的序列的表达的调节性核酸序列。术语“启动子”典型地是指位于基因转录起点上游并且其参与RNA聚合酶和其他蛋白的识别和结合，由此指导可操作连接的核酸的转录的核酸控制序列。前述术语所包括的是来源于经典真核基因组基因的转录控制序列(包括准确转录起始所需要的TATA盒，具有或不具有CCAAT盒序列)和响应发育和/或外部刺激或以组织特异性方式改变基因表达的另外的调节元件(即，上游激活序列，增强子和沉默子)。该术语还包括经典原核基因的转录调节序列，在该情形中，其可以包括-35盒序列和/或-10盒转录调节序列。术语“调节序列”还包括赋予、激活或增强细胞中、组织或器官中的核酸分子的表达的合成的融合分子或衍生物。
在实施例中鉴定了适当的启动子。例如，如果微藻是三角褐指藻，则所述启动子可以是三角褐指藻启动子fcpA。然而，技术人员应该理解也可以使用其他的启动子。例如，适当的启动子也可以选自响应于特定的环境或化学刺激的可诱导的启动子。
术语“可操作性地连接”用在本文中是指启动子序列与目的基因之间的功能性连接，以使所述启动子序列能够起始所述目的基因的转录。
所述转基因可以是载体的一部分，所述载体除了一个或多个调节序列之外还包含选择标记。这些在本领域中是已知的。微藻的转化可以通过本领域已知的标准步骤进行，例如，通过粒子轰击或电穿孔。
表达编码Δ5-延长酶的核酸的转基因微藻特征在于，与对照微藻相比，DHA和DPA增加。具体地，作为总脂肪酸含量的百分数测量的所述增加是对照微藻的至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少6倍，至少7倍，至少8倍，至少9倍或至少10倍。具体地，DHA含量是对照微藻的至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少6倍，至少7倍，至少8倍，至少9倍或至少10倍。优选地，总DHA含量是总LC-PUFAs含量(％mol)的至少10％。在一个实施方案中，表达编码Δ5-延长酶的核酸的转基因微藻不表达编码另一种参与LC-PUFAs途径的调节(优选参与ω-3 LC-PUFAs途径的调节)的多肽的第二转基因。
在本发明的不同方面的一个实施方案中，所述表达编码Δ5-延长酶的异源核酸的转基因微藻还可以表达一种或多种编码一种或多种参与LC-PUFAs途径的调节、优选参与ω-3 LC-PUFAs途径的调节的多肽的另外的异源核酸。换言之，所述转基因微藻包含一种或多种编码一种或多种参与LC-PUFAs途径的调节的多肽的另外的转基因。所述多肽优选地选自图7所示的参与ω-3 PUFA生物合成途径的任一种去饱和酶或延长酶。还可以使用去饱和酶和延长酶的任意组合。因此，所述核酸可以编码Δ15-去饱和酶，Δ6-去饱和酶，Δ5-去饱和酶，Δ4-去饱和酶，Δ6-去饱和酶，Δ5-延长酶，Δ6-延长酶或它们的组合中的一种或多种。
在一个实施方案中，所述核酸编码Δ6-去饱和酶。在本发明的情形中，Δ6-去饱和酶催化ALA向SDA转化以及LA向GLA转化。Δ6-去饱和酶记述在WO 93/06712，US 5,614,393，US 5614393，WO 96/21022，WO02/1557和WO 99/27111中，并且还描述了其在转基因生物中生产的应用，例如，在WO 98/46763，WO 98/46764和WO 98/46765中。在一个实施方案中，用于本发明的Δ6-去饱和酶来源于或分离自Ostreococcus，优选来自青绿藻的OtD6(Domergue等(2005)，AY746357)。在一个实施方案中，所述核酸包含SEQ ID No.3或5，并且编码包含或由SEQ ID No.4或6组成的6Δ-去饱和酶，其功能变体或编码与SEQ ID No.4或6具有至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的同源性的6Δ-去饱和酶的多肽。
在另一个实施方案中，所述Δ6-去饱和酶是来自微藻OstreococcusRCC 809。优选地，所述核酸包含SEQ ID No.7或9，并且编码包含或由SEQ ID No.8或10组成的来自微藻Ostreococcus RCC 809的6Δ-去饱和酶、其功能变体或编码与SEQ ID No.8或10具有至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的同源性的6Δ-去饱和酶的序列。
在另一个实施方案中，所述核酸编码Δ4-去饱和酶。按照本发明的不同方面，Δ4-去饱和酶可以来源于或分离自赫氏圆石藻(E.huxleyi)。因此，在一个实施方案中，所述核酸包含SEQ ID No.11，其编码包含或由SEQID No.12组成的Δ4-去饱和酶，其功能变体或与SEQ ID No.12具有至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同源性的Δ4-去饱和酶。
在另一个实施方案中，所述Δ4-去饱和酶来源于或分离自假微型海链藻(T.pseudonana)。因此，在一个实施方案中，所述核酸包含SEQ ID No.13，其编码包含或由SEQ ID No.14组成的Δ4-去饱和酶，其功能变体或与SEQ ID No.14具有至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同源性的Δ4-去饱和酶。
在另一个实施方案中，所述Δ4-去饱和酶来源于或分离自Ostreococcus RCC809。在一个实施方案中，所述核酸包含SEQ ID No.15或17，其编码包含或由SEQ ID No.16或18组成的Δ4-去饱和酶，其功能变体或与SEQ ID No.16或18具有至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同源性的Δ4-去饱和酶。
在另一个实施方案中，Δ6-延长酶来源于圆柱拟脆杆藻。在一个实施方案中，所述核酸包含SEQ ID No 19，其编码包含或由SEQ ID No.20组成的Δ6-延长酶，其功能变体或与SEQ ID No.20具有至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同源性的Δ6-延长酶。
在另一个实施方案中，Δ5-去饱和酶来源于圆柱拟脆杆藻。在一个实施方案中，所述核酸包含SEQ ID No 21，其编码包含或由SEQ ID No.22组成的Δ5-去饱和酶，其功能变体或与SEQ ID No.22具有至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同源性的Δ6-延长酶。
在另一个方面中，本发明的转基因微藻表达编码Δ6-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶、Δ9-延长酶或它们的组合的异源核酸。在本文中定义了这些酶。
在一个方面中，本发明的转基因微藻表达编码Δ6-去饱和酶的异源核酸。因此，在另一个方面中，本发明还涉及表达编码Δ6-去饱和酶的异源核酸的转基因微藻。例如，所述转基因微藻表达编码Δ6-去饱和酶的核酸，但是不表达参与LC-PUFAs生物合成途径的调节的任意其他转基因。在其他实施方案中，所述转基因微藻表达Δ6-去饱和酶和参与LC-PUFAs生物合成途径的调节的另外的转基因，例如，Δ5-延长酶，如在实施例中所示的OtElo5。
在一个实施方案中，所述微藻是三角褐指藻。在一个实施方案中，包含或由SEQ ID No.3或5组成的核酸编码Δ6-去饱和酶或编码与SEQID No.4或6具有至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％同源性的Δ6-去饱和酶的序列。在优选的实施方案中，所述微藻是三角褐指藻，并且所述核酸编码包含或由SEQ ID No.4或6组成的Δ6-去饱和酶。
表达编码Δ6-去饱和酶的核酸的转基因微藻特征在于，与对照微藻相比，总脂肪酸含量，特别是ω-3 LC-PUFA含量改变。具体地，与对照微藻相比，ω-3 LC-PUFA含量增加至少2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％或更多。特别地，与对照微藻相比，EPA含量增加至少2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％。优选地，总EPA含量是总LC-PUFAs含量(mol％)的至少20％。此外，转基因微藻中的DHA含量也增加至少0.5％。
在一个实施方案中，本发明的不同方面排除涉及生产生物燃料的实施方案。
在另一个方面中，本发明涉及用于产生具有增加的ω-3 LC-PUFA含量的转基因微藻的方法，所述方法包括在微藻中引入并表达编码参与LC-PUFAs生物合成途径的多肽的异源核酸。所述ω-3脂肪酸可以选自ALA，SDA，ETA，EPA，DPA或DHA。在一个实施方案中，所述ω-3LC-PUFAs是DHA。在另一个实施方案中，所述ω-3脂肪酸是EPA。所述核酸可以编码Δ6-去饱和酶，Δ5-去饱和酶，Δ4-去饱和酶，Δ5-延长酶，Δ6-延长酶或它们的组合。
在一个实施方案中，所述方法涉及产生具有增加的DHA水平的转基因微藻，所述方法包括用编码Δ5-延长酶的异源核酸转化微藻。按照这一实施方案，所述方法可以进一步包括用一种或多种调节ω-3脂肪酸的产生的另外的异源核酸转化所述微藻，例如，用编码Δ6-去饱和酶的核酸转化。在另一个实施方案中，没有向所述微藻中引入调节ω-3脂肪酸产生的另外的核酸并作为异源核酸表达。
在另一个实施方案中，本发明涉及用于产生具有增加的EPA水平的转基因微藻的方法，所述方法包括用编码Δ6-去饱和酶的核酸转化微藻。按照这一实施方案，所述方法可以进一步包括用一种或多种调节ω-3LC-PUFAs的产生的另外的核酸转化所述微藻。在另一个实施方案中，没有向所述微藻中引入另外的调节ω-3脂肪酸产生的核酸。
在一个实施方案中，所述方法包括用一种或多种不调节ω-3LC-PUFAs产生的另外的核酸(例如，葡萄糖转运蛋白基因)转化所述微藻。
通过那些方法获得的或可通过那些方法获得的微藻也在本发明的范围内。
在另一个方面中，本发明涉及用于增加微藻中多种ω-3 LC-PUFA中的一种的产生的方法，所述方法包括：
a)培育本文所述的转基因微藻，并且
b)从所述转基因微藻获得所述多种ω-3 LC-PUFA中的一种。
具体地，本发明涉及用于增加微藻中一种或多种ω-3 LC-PUFAs的产生的方法，所述方法包括：
a)在微藻中引入并表达编码参与LC-PUFAs生物合成途径的多肽的异源核酸，
b)培育表达所述异源核酸的转基因微藻，并且
c)从所述转基因微藻获得一种或多种ω-3脂肪酸。
所述转基因微藻如本文所述，并且在允许产生一种或多种ω-3LC-PUFAs的条件下培育。所述核酸可以编码如本文所述的Δ15-去饱和酶，Δ6-去饱和酶，Δ5-去饱和酶，Δ4-去饱和酶，Δ12-去饱和酶，Δ5-延长酶，Δ6-延长酶或它们的组合。
在一个实施方案中，所述方法涉及增加微藻中的DHA产生，所述方法包括：
a)在微藻中引入并表达编码Δ5-延长酶的异源核酸，
b)培育表达所述异源核酸的转基因微藻，并且
c)从所述转基因微藻获得DHA。
所述微藻如本文所述。所述Δ5-延长酶如本文所述。在一个实施方案中，所述微藻不包含和表达编码参与调节ω-3 LC-PUFAs的合成的酶的第二异源核酸。在另一个实施方案中，所述微藻包含并表达编码参与调节ω-3 LC-PUFAs的合成的多肽的第二异源核酸。在另一个实施方案中，所述微藻包含并表达编码不参与调节ω-3 LC-PUFAs的合成的多肽(例如，葡萄糖转运蛋白)的第二异源核酸。所述转基因微藻在允许DHA产生的条件下培育。
在一个实施方案中，所述方法涉及增加微藻中的DHA产生，所述方法包括：
a)在三角褐指藻中引入并表达编码Δ5-延长酶的异源核酸，
b)培育表达所述异源核酸的三角褐指藻，并且
c)从三角褐指藻获得所述DHA。
所述微藻如本文所述。所述Δ5-延长酶如本文所述。在一个实施方案中，所述微藻不包含和表达编码参与调节ω-3 LC-PUFAs的合成的酶的第二异源核酸。在另一个实施方案中，所述微藻包含并表达编码参与调节ω-3 LC-PUFAs的合成的酶的第二异源核酸。在另一个实施方案中，所述微藻包含并表达编码不参与调节ω-3 LC-PUFAs的合成的多肽(例如，葡萄糖转运蛋白)的第二异源核酸。
三角褐指藻在允许DHA产生的条件下培育。这些条件将是技术人员所清楚的。例如，优选的三角褐指藻培养条件是约20℃，在约60-80μmol光子m-2s-1的恒定照射下。在一个实施方案中，所述方法包括用一种或多种不调节ω-3 LC-PUFAs的产生的另外的核酸(例如，葡萄糖转运蛋白基因)转化所述微藻，并且供应外源碳源。所述藻可以在黑暗中生长。
在另一个实施方案中，所述方法涉及增加微藻中的EPA，所述方法包括：
a)在微藻中引入并表达编码6Δ-去饱和酶的异源核酸，
b)培育所述转基因微藻，并且
c)从所述转基因微藻获得所述EPA。
所述微藻如本文所述。所述6Δ-去饱和酶如本文所述。所述微藻在允许EPA产生的条件下培育。
在一个实施方案中，所述方法涉及增加微藻中的EPA产生，所述方法包括：
a)在三角褐指藻中引入并表达编码6Δ-去饱和酶的异源核酸，
b)培育三角褐指藻，并且
c)从三角褐指藻获得所述EPA。
所述微藻如本文所述。所述Δ6-去饱和酶如本文所述。三角褐指藻在允许EPA产生的条件下培育。
这些条件是技术人员所清楚的。例如，优选的三角褐指藻培养条件是约20℃，在约0-80μmol光子m-2s-1的恒定照射下，或优选约18℃，在约25μmol光子m-2s-1的恒定照射下。在一个实施方案中，所述方法包括用一种或多种不调节ω-3 LC-PUFAs产生的另外的核酸(例如，葡萄糖转运蛋白基因)转化所述微藻，并且供应外源碳源。所述藻可以在黑暗中生长。
在另一个方面中，本发明涉及用于制备油、脂质或脂肪酸组合物的方法，所述方法包括：
a)在允许产生一种或多种ω-3 LC-PUFAs的条件下培育本文所述的转基因微藻，并且
b)从所述转基因微藻获得所述一种或多种ω-3 LC-PUFAs。
在优选的实施方案中，所述ω-3 LC-PUFAs是DHA或EPA。
在另一个方面中，本发明涉及从本文所述的转基因微藻分离的ω-3LC-PUFAs或油。
通过本发明的方法产生的脂肪酸可以以油、脂质或游离脂肪酸的形式从微藻中分离。因此，本发明的一个实施方案是已经通过本发明的方法产生的油、脂质或脂肪酸或其级分，特别优选包含EPA或DHA并且来源于转基因微藻的油、脂质或脂肪酸组合物。
术语“油”或“脂质”应该理解为意指包含不饱和的、优选酯化的脂肪酸的脂肪酸混合物。所述油或脂质在ω-3多不饱和的，或有利地，酯化的脂肪酸中优选是高的。在特别优选的实施方案中，所述油或脂质具有高ALA、ETA、EPA、DPA和/或DHA含量，优选高EPA和/或DHA含量。
为了分析，例如，脂肪酸含量可以在通过脂质(如三酰甘油和/或磷脂)转酯作用将脂肪酸转化为甲基酯后由气相色谱确定。
以本发明的方法产生的ω-3多不饱和酸，例如，EPA和DHA，可以是脂肪酸衍生物的形式，例如，鞘脂，磷酸甘油脂，脂质，糖脂，磷脂，单酰甘油，二酰甘油，三酰甘油或其他脂肪酸酯。
存在的ω-3及其他多不饱和脂肪酸可以例如通过用碱(例如，水性KOH或NaOH)处理或酸水解(有利地在诸如甲醇或乙醇的醇的存在下)或通过酶裂解而释放出来，并且，例如，通过相分离和随后的酸化(例如，通过H2SO4酸化)而分离出来。脂肪酸还可以不经上述处理步骤直接释放出来。
如果需要进一步的纯化，可以使用标准方法。所述方法可以包括萃取、用尿素处理、分级结晶、HPLC、分馏、硅胶层析、高速离心或蒸馏或这些技术的组合。反应基团(如酸或烯基基团)的保护可以在任意步骤通过已知的技术(例如，烷基化，碘化，使用丁羟甲苯(BHT))进行。所用的方法包括使脂肪酸甲基化以产生甲基酯。类似地，保护基团可以在任意步骤去除。理想地，例如，包含ALA、STA、ETA、EPA、DPA和DHA的级分的纯化可以通过用尿素处理和/或分馏而实现。
在本领域中，从藻类中大规模纯化脂肪酸的方法是已知的。例如，使用光生物反应器、开放的池子、跑道式养殖或混合系统培育微藻藻株，以增加细胞密度。通过过滤、絮凝或离心将藻类细胞与培养基分离，然后干燥以提高提取。然后，通常使用非水混溶有机溶剂进行脂质提取。典型地使用己烷作为溶剂进行较大规模的提取。随后，通过分馏(分子级)或冻凝而从总脂质中分离不饱和脂肪酸，由此降低油温以沉淀更多饱和脂质。提高PUFA油的质量、保存期和数量的进一步处理可以包括过滤、漂白、除臭、精制和抗氧化剂添加。这些方法全部是本领域技术人员已知的。
在另一个方面中，本发明还涉及本文所述的转基因生物、优选微藻在制备脂肪酸、优选ω-3脂肪酸中的应用。本发明包括本文所述的转基因生物、优选微藻或由本文所述的转基因生物、优选微藻获得的油、脂质、脂肪酸在饲料、食品、化妆品、营养药或药物中应用。本发明包括本文所述的转基因生物、优选微藻在制备饲料、食品、化妆品、营养药或药物中的应用。在另一个方面中，本发明还涉及本文所述的转基因微藻作为动物、优选鱼类的饲料的应用。
在另一个方面中，本发明还涉及包含本文所述的转基因微藻或由所述微藻获得的脂肪酸、优选ω-3脂肪酸、油或脂质的组合物。在优选的实施方案中，所述组合物包含本文所述的转基因微藻或由其获得的或可由其获得的产物，如油。在一个实施方案中，所述组合物可以是药物组合物、化妆品、食品，包括食品补充剂，或动物饲料。具体地，本发明涉及包含本文所述的转基因微藻或从所述藻类获得的脂肪酸、优选ω-3脂肪酸、油或脂质的食品。这可以是饮食补充剂的形式，包括鱼油。本发明还涉及动物饲料，特别是用于水产养殖的动物饲料，其包含本文所述的转基因微藻或从所述藻类获得的脂肪酸、优选ω-3脂肪酸，油或脂质。
在另一个方面中，本发明涉及包含本文所述的转基因微藻、从所述微藻获得的脂肪酸、优选ω-3脂肪酸、油或脂质的组合物，所述组合物用在药物中。具体地，所述组合物可以用于降低高血压个体的血压和心率，减少猝死的危险，减少炎症，并且减少长期的动脉粥样硬化(atherosclerosis)和缺血性心脏病(ischemic heart disease)的危险。所述组合物还可以用于治疗湿疹(eczema)或代谢综合征。此外，富含DHA的饮食与提高的认知能力和抑郁相关，并且对关节炎和II型糖尿病具有积极作用(Horrocks等，1999)。因此，本发明还涉及包含本文所述的转基因微藻或从所述微藻获得的脂肪酸、优选ω-3脂肪酸、油或脂质的组合物，所述组合物用于治疗或预防心血管病症，所述心血管病症包括动脉粥样硬化，血栓形成(thrombosis)，高血压，心肌梗死(myocardial infarction)和动脉粥样硬化，炎症病症，抑郁症，认知减退，关节炎和II型糖尿病。本发明的范围还包括治疗或预防心血管和炎症病症、抑郁症、认知减退、关节炎和II型糖尿病的方法，所述方法给有此需要的患者施用包含治疗量的本文所述的转基因微藻或从所述微藻获得的脂肪酸、优选ω-3脂肪酸、油或脂质的组合物。本发明还涉及包含本文所述的转基因微藻的组合物在制备用于治疗心血管病症的药物中的应用，所述心血管病症包括动脉粥样硬化、血栓形成、高血压、心肌梗死和动脉粥样硬化、炎症病症、抑郁症、认知减退、关节炎和II型糖尿病。
在优选的实施方案中，所述组合物可以包含本文所述的表达编码Δ6-去饱和酶的核酸的转基因微藻和/或表达编码Δ5-延长酶的核酸的转基因微藻，或可以从所述转基因微藻获得。
本发明人已经表明，可以使用重组方法操作微藻以利用异源基因表达产生增加量的LC-PUFAs，特别是EPA和DHA。本发明人已经令人惊讶地证明单独的来自青绿藻的Δ5-延长酶的异源表达在三角褐指藻中导致增加的DHA累积，在转基因藻株中的DHA水平达到多至总脂肪酸的13％。技术人员应该理解，本发明不限于藻类，并且实际上可以适用于任意制备EPA/DHA的生物。因此，本发明还涉及具有增加的DHA水平的表达异源Δ5-延长酶(优选来源于青绿藻的Δ5-延长酶)的转基因生物。在一个实施方案中，在所述转基因生物中不表达其他的转基因。在另一个实施方案中，可以如本文所述表达其他转基因。此外，本发明还涉及用于增加转基因生物中的DHA产生的方法。这通过在所述生物中表达异源Δ5-延长酶(优选来源于青绿藻的Δ5-延长酶)而实现。在本文中描述了所述方法的详情。
所述生物可以是动物，例如，哺乳动物。在一个实施方案中，特别排除人。在另一个实施方案中，所述生物是植物，例如，单子叶植物或双子叶植物，例如，农作物。农作物包括，但不限于，玉蜀黍(maize)，水稻(rice)，小麦(wheat)，油菜(oilseed rape)/芸苔(canola)，高粱属的(sorghum)，大豆(soybean)，向日葵(sunflower)，紫花苜蓿(alfalfa)，马铃薯(potato)，番茄(tomato)，烟草(tobacco)，葡萄(grape)，大麦(barley)，豌豆(pea)，豆类(bean)，芸豆(field bean)，莴苣(lettuce)，棉花(cotton)，甘蔗(sugar cane)，甜菜(sugar beet)，椰菜(broccoli)或其他蔬菜类芸苔属(brassicas)或白杨。
在另一个方面中，本发明涉及编码新型形式的去饱和酶和延长酶的分离的核酸，其可以用于在藻类和高等植物中异源重组ω-3长链多不饱和脂肪酸生物合成途径。具体地，本发明涉及编码Δ6-去饱和酶(Ost809Δ6)、Δ4-去饱和酶(Ost809Δ4)和Δ6-延长酶(FcELO6)及其对应的多肽的分离的核酸。
在一个实施方案中，本发明涉及包含SEQ ID No.7或9的分离的核酸，其编码包含或由SEQ ID No.8或10组成的Δ6-去饱和酶(Ost809Δ6)，其功能变体或与SEQ ID No.8或10具有至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％同源性的Δ6-去饱和酶。所述序列还可以针对在靶标生物中的表达而进行密码子优化。
在一个实施方案中，本发明涉及包含SEQ ID No.15或17的分离的核酸，其编码包含或由SEQ ID No.16或18组成的Δ4-去饱和酶(Ost809Δ4)，其功能变体或与SEQ ID No.16或18具有至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％同源性的Δ4-去饱和酶。所述序列还可以针对在靶标生物中的表达而进行密码子优化。
在一个实施方案中，本发明涉及包含SEQ ID No.19的分离的核酸，其编码包含或由SEQ ID No.20组成的Δ6-延长酶(FcELO6)，其功能变体或与SEQ ID No.20具有至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％同源性的Δ6-延长酶。所述序列还可以针对在靶标生物中的表达而进行密码子优化。
在一个实施方案中，本发明涉及包含SEQ ID No.21的分离的核酸，其编码包含或由SEQ ID No.22组成的Δ5-去饱和酶，其功能变体或与SEQ ID No.22具有至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源性的Δ5-去饱和酶。所述序列还可以针对在靶标生物中的表达而进行密码子优化。
本发明还涉及包含上述详细说明的分离的核酸中的一种或多种的载体。所述载体可以进一步包含调节序列。
本发明还涉及具有增加的ω-3 LC-PUFAs产生的转基因微藻，其中所述微藻表达包含SEQ ID No.7，9，15，17，19或21的核酸或表达编码与SEQ ID No.8，10，16，18，20或22具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％同源性的肽的序列。包含所述转基因微藻，由其分离的油或脂质的组合物以及本文所述的在药物或药物配制中的应用、治疗方法或饲料、食品、药物或营养药也在本发明的范围内。
不希望受到理论限制，本发明人相信这些核苷酸的活性将证明可用于异源重建藻类和植物中ω-3长链多不饱和脂肪酸生物合成途径。例如，Ost809Δ6酶的优越的底物偏好性使其与其他Ostreococcus D6-去饱和酶区分开来，并且可以用于使底物经由n-3途径的流出最大化。类似地，将证明Ost809Δ4活性可用于转基因光合生物中DPA向DHA的特异性转化，而FcELO6活性提供可以将GLA延长为20：3n-6的方式。
因此，在另一个实施方案中，本发明涉及分离的核酸在产生具有增加的ω-3脂肪酸含量的转基因生物中的应用，所述分离的核酸选自下述：包含或由SEQ ID No.7或9组成的核酸，其编码包含或由SEQ ID No.8或10组成的Δ6-去饱和酶(Ost809Δ6)，其功能变体或与SEQ ID No.8或10具有至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％同源性的Δ9-去饱和酶；包含或由SEQ ID No.16或18组成的核酸，其功能变体或与SEQ ID No.16或18具有至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％同源性的Δ4-去饱和酶；包含或由SEQ ID No.19组成的核酸，其编码包含或由SEQ ID No.20组成的Δ6-延长酶(FcELO6)，其功能变体或与SEQ ID No.20具有至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％同源性的Δ6-延长酶；或包含或由SEQ ID No.21组成的核酸，其编码包含或由SEQ ID No.22组成的Δ5-去饱和酶，其功能变体或与SEQ ID No.22具有至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％同源性的Δ5-去饱和酶。具体地，本发明涉及编码Δ6-去饱和酶(Ost809Δ6)的分离的核酸使底物经由n-3途径的流出最大化并且产生提高水平的EPA和/或DHA的应用。在另一个实施方案中，本发明涉及编码Δ4-去饱和酶(Ost809Δ4)的分离的核酸使DPA转化为DHA的应用。在另一个实施方案中，本发明涉及编码Δ6-延长酶的分离的核酸使GLA延长为20：3的应用。
在另一个实施方案中，本发明涉及选自下述的分离的核酸在增加DHA含量中的应用：包含或由SEQ ID No.19组成的核酸，其编码包含或由SEQ ID No.20组成的Δ6-延长酶(FcELO6)，其功能变体或与SEQ IDNo.20具有至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％同源性的Δ9-延长酶；或包含或由SEQ ID No.21组成的核酸，其编码包含或由SEQ ID No.22组成的Δ5-去饱和酶，其功能变体或与SEQ ID No.22具有至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％同源性的Δ5-去饱和酶。如实施例中和图13所示，DHA增加至少10％，例如，增加14-17％。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种用于产生具有增加的ω-3LC-PUFAs(特别是DHA和/或EPA)产生的转基因生物的方法，所述方法包括用下述分离的核酸转化生物：包含或由SEQ ID No.7或9组成的分离的核酸，其编码包含或由SEQ ID No.8或10组成的Δ6-去饱和酶(Ost809Δ6)，其功能变体或与SEQ ID No.8或10具有至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％同源性的Δ6-去饱和酶；包含或由SEQ ID No.16或18组成的核酸，其功能变体或与SEQ ID No.16或18具有至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％同源性的Δ4-去饱和酶；包含或由SEQ ID No.19组成的核酸，其编码包含或由SEQ ID No.20组成的Δ6-延长酶(FcELO6)，其功能变体或与SEQ ID No.20具有至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％同源性的Δ6-延长酶；或包含或由SEQ ID No.21组成的核酸，其编码包含或由SEQ ID No.22组成的Δ5-去饱和酶，其功能变体或与SEQ ID No.22具有至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％同源性的Δ5-去饱和酶。
在一个实施方案中，本发明涉及产生具有增加的DHA产生的转基因生物的方法，所述方法包括用选自下述的分离的核酸转化生物：包含或由SEQ ID No.19组成的核酸，其编码包含或由SEQ ID No.20组成的Δ6-延长酶(FcELO6)，其功能变体或与SEQ ID No.20具有至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％同源性的Δ6-延长酶；或包含或由SEQ ID No.21组成的核酸，其编码包含或由SEQ ID No.22组成的Δ5-去饱和酶，其功能变体或与SEQ ID No.22具有至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％同源性的Δ5-去饱和酶，以增加DHA含量。如实施例中和图13所示，DHA增加至少10％，例如，增加14-17％。
在另一个实施方案中，本发明涉及用于增加ω-3脂肪酸的产生的方法，所述方法用下述分离的核酸转化生物：包含或由SEQ ID No.7或9组成的分离的核酸，其编码包含或由SEQ ID No.8或10组成的Δ6-去饱和酶(Ost809Δ6)，其功能变体或与SEQ ID No.8或10具有至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％同源性的Δ6-去饱和酶；包含或由SEQ ID No.16或18组成的核酸，其功能变体或与SEQ ID No.16或18具有至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％同源性的Δ4-去饱和酶；包含或由SEQ ID No.19组成的核酸，其编码包含或由SEQ ID No.20组成的Δ6-延长酶(FcELO6)，其功能变体或与SEQ ID No.20具有至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％同源性的Δ9-延长酶；或包含或由SEQ IDNo.21组成的核酸，其编码包含或由SEQ ID No.22组成的Δ5-去饱和酶，其功能变体或与SEQ ID No.22具有至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％同源性的Δ5-去饱和酶。
在一个实施方案中，本发明涉及用于增加ω-3脂肪酸的产生的方法，所述方法用选自下述的分离的核酸转化生物：包含或由SEQ ID No.19组成的核酸，其编码包含或由SEQ ID No.20组成的Δ6-延长酶(FcELO6)，其功能变体或与SEQ ID No.20具有至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％同源性的Δ6-延长酶；或包含或由SEQ ID No.21组成的核酸，其编码包含或由SEQ ID No.22组成的Δ5-去饱和酶，其功能变体或与SEQ ID No.22具有至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％同源性的Δ5-去饱和酶，以增加DHA含量。如实施例中和图13所示，DHA增加至少10％，例如，增加14-17％。
在所述方法的一个实施方案中，方法可以进一步包括用一种或多种调节ω-3脂肪酸的产生的另外的核酸转化所述微藻。在另一个实施方案中，没有向所述微藻中引入调节ω-3脂肪酸的产生的另外的核酸。可以引入其他异源核酸，例如，编码葡萄糖转运蛋白的核酸。
在另一个方面中，本发明涉及用包含本文定义的分离的核酸中的一种或多种(具体是包含SEQ ID No.1，3，5，7，9，15，17，19或21的分离的核酸)的载体转化的宿主细胞。在一个实施方案中，所述宿主细胞用包含本文定义的分离的核酸中的一种的载体转化，并且在所述生物中不表达其他参与调节LC-PUFAs生物合成途径调节的异源转基因。
所述宿主细胞可以是藻类或高等植物细胞。例如，所述宿主细胞是微藻。在一个实施方案中，所述宿主细胞是硅藻。所述宿主细胞还可以包含一种或多种另外的转基因。例如，所述宿主细胞可以是本文所述的表达编码Δ5-延长酶的核酸的转基因微藻。
按照上述方法所述的转基因生物可以是微藻或高等植物。优选地，按照所述的方法的转基因生物是微藻。术语微藻在本文中其他位置定义，并且包括硅藻。在一个实施方案中，所述微藻是三角褐指藻。术语高等植物包括单子叶植物和双子叶植物。在一个实施方案中，所述植物是本文所述的农作物。
本公开内容中所引用的所有参考文献通过引用关于其完整的公开内容以及在本申请中特别提及的公开内容结合在本文中。
除非另外指明，“和/或”用在本文中应该视为多个指定的特征或成分中每一个的特别公开，在每个组合中具有或不具有另外一个。例如，“A，B和/或C”应该视为(i)A，(ii)B，(iii)C，(iv)A和B，(v)B和C或(vi)A和B和C中的每一个的特别公开，正如同每一个在本文中单独描述一样。
除非上下文另外指明，上述特征的描述和定义不限于本发明的任一具体的方面或实施方案，并且同等地适用于所述的所有方面和实施方案。
在下述非限制性实施例中进一步描述本发明。
实施例
实施例1产生过表达Δ6-去饱和酶的转基因藻类和产生过表达Δ5-延长酶的转基因藻类
材料和方法
藻株和生长条件
三角褐指藻UTEX 646在ESAW培养基(Harrison等，1980)中在18℃和20℃在恒定照射(30μmol和60μmol光子m-2s-1)的白色荧光灯下以适度的振荡生长。已经在指数和停滞生长期过程中进行了野生型和转基因藻类的分析。
质粒设计和克隆
关于来自青绿藻的Δ6-去饱和酶OtD6(Domergue等，2005)和青绿藻Δ5-延长酶OtElo5的编码序列(Meyer等，2004)分别作为Kpn-Xba和EcoRV-SacI片段插入到由P.G.Kroth博士(Universitat Konstanz，德国)馈赠的pPha-T1载体(Zaslavskaia等，2000)中。OtD6的编码区用作模板来化学合成(Genscript Corporation，NJ)用于在三角褐指藻中表达的密码子优化的核苷酸序列OtD6PT。将该密码子优化的Δ6-去饱和酶序列利用EcoRV-SacI位点克隆到pPha-T1载体中。将关于来自三角褐指藻的Δ6-去饱和酶PtD6的编码序列(Domergue等，2002)作为BamHI-XbaI片段插入到pPha-T1载体(Zaslavskaia等，2000)中。
生物弹道转化
按照之前所述(Zaslavskaia等，2000；Kroth 2007)进行三角褐指藻的生物弹道转化。将经过轰击的细胞转移到含有75μg/ml博来霉素(zeocin)的ESAW琼脂平板上。将所述博来霉素平板放置在荧光灯(50μmol m-2s-1)的24小时光照下并且在20℃温育3周。将所选的博来霉素-抗性藻落转移至新鲜博来霉素平板上，并且在被转移至减去抗生素的液体培养基之前将2ml ESAW+博来霉素培养物用于脂质分析。
脂肪酸分析
通过离心收集藻类或酵母细胞。按照所述(Garces和Mancha，1993)以少量修改提取脂肪酸并甲基化。收集15ml藻类培养物整分试样；甲基化后，浓缩庚烷级分，并且重悬在40μl溶剂中，然后注射1μl到GC柱中。使用Agilent DB-225柱通过GC分析提取的总脂肪酸的甲基酯衍生物，并用已知的标准进行鉴定。
酰基-CoA模式
通过离心收集藻类细胞，在液氮中冷冻，并且按照Larson和Graham(2001)进行提取，用荧光酰基-亚乙烯基-CoA衍生物的定量分析或用阳离子模式的电喷射离子化串联质谱法(多反应监测)来进行反相LC。为了分析亚乙烯基-CoA衍生物，使用之前所述的方法和梯度条件(Larson和Graham 2001)进行HPLC(Agilent 1200 LC系统；Phenomenex LUNA150·2mm C18(2)柱)；而LC-MS/MS+MRM分析在Haynes等2008所述的方法后进行(Agilent 1200 LC系统；Gemini C18柱，2mm内径，150mm，具有5mm的颗粒)。为了鉴定和校准的目的，从Sigma购买作为游离酸或锂盐的酰基链长度为C14至C20的标准酰基-CoA酯。
脂质模式
通过点喷射离子化三联四极质谱法(API 4000 QTRAP；AppliedBiosystems)分析TAGs和PLs的分子种类。通过存在头基片段和由ESI形成的完好脂质离子的质量/电荷(Welti等，2002；Devaiah等，2006，具有Xiao等2010所述的修改)定义极性脂质的分子种类。所述基于头基片段的串联的ESI-MS/MS前体和产物离子扫描不能确定单个脂肪酰基种类。相反，极性脂质是在种类、总酰基碳和酰基碳-碳双键的总数水平上定义的。与一系列的极性脂质内标比较来定量极性脂质。按照Krank等(2007)测量的三酰甘油(TAGs)由存在一个酰基片段和由完好的脂质形成的离子的质量/电荷(中性损失模式)来定义。这允许鉴定一种TAG酰基种类和总酰基碳和另外两条链中酰基双键的总数。该方法不允许单独地鉴定另外两种氨基酸，也不允许鉴定单个酰基链在甘油上占据的位置(sn-1，sn-2或sn-3)。TAGs以与极性脂质相似的方式进行定量，包括减去背景，修匀(smoothing)，整合，同位素重叠和样品峰与内标的那些峰的比较(使用LipidView，Applied Biosystems)。然而，尽管种类内的极性脂质表现出相似的质谱响应因子，不同TAG种类的质谱反应是变化的，这归因于单个分子TAG种类的差异性的离子化。在本文所示的数据中，对所述数据没有应用反应校正。所述数据针对内标tri15：0和tri19：0标准化。
结果
产生过表达Δ6-去饱和酶的转基因藻类
将青绿藻Δ6-去饱和酶的天然编码的OtD6和针对在三角褐指藻中表达密码子优化的核苷酸序列克隆到pPha-T1载体中，分别产生表达盒OtD6N和OtD6Pt，并且得到的构建体用于转化三角褐指藻。
OtD6N构建体的表达
通过用OtD6N转化获得13个博来霉素抗性的藻落，并且选择用于进一步的筛选。将所选的藻落转移至液体培养基中，并且鉴定一些含有OtD6N的阳性转化体。我们已经研究了温度和光对野生型和转基因三角褐指藻中的EPA和总脂肪酸的产生的影响。培养物在以不同光强度(25μmol和60μmol光子m-2s-1)的恒定光照下在不同温度(18℃和20℃)生长。在细胞生长的指数期(E)和静止期(S)过程中进行GC-MS分析。野生型和突变体的脂肪酸模式表明，棕榈油酸(16：1Δ9)，EPA(20：5n-3)，棕榈酸(16：0)和肉豆蔻酸(14：0)是在两个阶段生长的藻类细胞中检测到的主要的FAs。与Tonon等(Tonon 2002)从在18℃，240μE m-2s-1生长的三角褐指藻(CCAP 1052/1A)细胞培养物的研究得到的结果相似，当在我们的研究中所用的三角褐指藻UTEXS 646的细胞从指数期向静止期过渡时，EPA和DHA的量减少。脂肪酸分析揭示，在用Otd6N转化并在20℃以25μmol和60μmol光子m-2s-1的光强度生长的细胞中，当向静止期过渡时，EPA和DHA减少。然而，在20℃，60μE m-2s-1在静止期生长的Otd6N细胞中的EPA和DHA水平高于野生型三角褐指藻中的那些水平(与野生型中的18.5％的EPA和1.3％的DHA相比，在Otd6N中，21.2％的EPA和1.8％的DHA)(表III，图1)。相反，我们发现在18℃，25μE m-2s-1生长的转基因Otd6N细胞中，与指数期相比，静止期间的EPA和DHA水平增加，并且显著高于野生型样品(与野生型中的16.5％的EPA和0.9％的DHA相比，在Otd6N中30.2％的EPA和1.8％的DHA)。在Δ6-不饱和脂肪酸(GLA和SDA)组合物(其是很少存在的)的比较中，来自野生型和Otd6N转基因三角褐指藻的脂肪酸模式没有显示出差异。
OtD6PT构建体的表达
选择通过转化OtD6PT获得的4个博来霉素抗性藻落，来接种培养物，用于进一步的筛选和GC-MS分析。对于在不同光强度和温度生长的转基因Otd6Pt细胞，观察到在静止期间EPA和DHA水平减少的相同趋势(表III，图1)。重组细胞表达较高水平的EPA(与野生型中18.5％和16.8％相比，分别地，在静止期在20℃，60μE m-2s-1为20.8％和在18℃，25μEm-2s-1为22.2％)。除了检测到较高水平的EPA之外，我们还观察到DHA水平的增加，在两个生长期之间变动较小(表III，图1)。
产生过表达OtElo5的转基因藻类
在最初的筛选中鉴定通过转化OtElo5得到的3个博来霉素抗性藻落，并且用于接种培养物，用于进一步的筛选和GC-MS分析。培养物在20℃在以60μmol光子m-2s-1的恒定照射下生长。在细胞生长的指数期(E)和静止期(S)进行转化了OtElo5的三角褐指藻的FAMEs分析，并且揭示在转基因克隆中DPA以2.8-4.7％的范围存在，而在野生型细胞中没有检测到(表IV，图2a)。在指数生长期中，与野生型的35.9％相比，在转化的克隆中的EPA水平减少至平均17.7％，并且在静止生长期间，与野生型的18.5％相比，在过表达Elo5基因的克隆中减少至8.2％。与野生型中的2.0％和1.3％相比，在所有3个转基因克隆中观察到DHA的实质性的增加，分别为，指数期平均为7.4％，静止期平均为10.4％。当过渡至静止期时，DHA积累已经增加。
确定酰基-CoA汇集物组成
为了更好地理解硅藻中的酰基去饱和作用的过程，确定野生型(WT)和转基因三角褐指藻(表达OtElo5-延长酶)中酰基-CoA汇集物的组成(图3)。对静止生长期的野生型三角褐指藻的酰基-CoA模式的研究揭示，棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸和EPA-CoA是最丰富的，由此证明相对于总脂肪酸酰基-CoA汇集物中的天然脂肪酸水平之间的直接关系。EPA-CoA占酰基-CoA汇集物的5.7％，这表明该水平的EPA-CoA潜在地可能作为通过对22：5n-3延长和对22：6n-3去饱和合成DHA的中间物。在野生型三角褐指藻的CoA汇集物中仅检测到痕量(＜1.0)的22：4n-6、22：5n-3(DPA)和DHA。如在图3中可以看出，转基因三角褐指藻的相似的分析证明22：4n-6、22：5n-3(EPA)和DHA水平的显著增加，伴随着EPA水平的减少。如在图4中所示，对不同细胞生长阶段的酰基-CoA汇集物的组成的详细分析揭示EPA和DHA从指数期到静止期逐渐累积，在静止期表现出5.2％和6.3％的最大水平。
TAG分子种类模式
在该研究中，我们鉴定并比较了由WT和OtElo5转基因三角褐指藻形成的TAGs的分子种类，并且研究了响应从指数期到静止期的过渡TAG合成的变化。培养物在20℃在以60μmol光子m-2s-1恒定照射下生长并用ESI-MS分析。由藻类脂质提取物的直接融合ESI-MS获得的质谱显示大多数分子离子在750和950质量/电荷(m/z)之间观察到。我们在WT三角褐指藻中检测到26种单个的TAG种类。WT的油提取物主要由下述组成：TAGs 46：1，46：2，48：1，48：2，和48：3与50：3，具有棕榈酸(16：0)，棕榈油酸(16：1)，和肉豆蔻酸(14：0)取代物。TAG 48：1(16：0/16：0/16：1)和48：2(16：0/16：1/16：1)组成在三角褐指藻细胞的整个时程分析中表达的主要的TAG分子种类(图5a和5B)。从表达OtElo5-延长酶的细胞中检测到TAG分子种类多样性的增加(具有多至29种个体TAGs)。具体地，观察到新的TAG种类，即54：8，54：9和56：8，并且转基因细胞表现出显著更高水平的54：7。DHA掺合在TAGs 52：7，54：7，54：8，54：9和56：8中。时程(图6)还揭示，随着细胞由指数生长期过渡为静止期，TAGs 54：7和56：8似乎使得更多的DHA结合到TAGs中。当培养物从对数期过渡为静止期时，TAGs分子种类52：7，54：8和54：9表现出或多或少恒定的DHA比例。含有DHA的TAGs的水平在指数期平均为12.5％，在静止期平均为10.5％。
表III.WT与表达青绿藻Δ6去饱和酶的转基因三角褐指藻在不同生长条件下在另个生长阶段的脂肪酸组成(摩尔％)，其中E是指数期，S是静止生长期。每次测量是三次生物学重复的平均值。
表IV.WT与表达Ot Elo5的转基因三角褐指藻在指数期(E)和静止期(S)的脂肪酸组成(摩尔％)。培养物在20℃60μmol m-2s-1在以70rpm恒速振荡下生长。每次测量是三次生物学重复的平均值。
过论
多种海洋微生物产生高水平的EPA和DHA，但是仅有很少的物种具有将这些脂肪酸以三酰甘油(TAGs)的形式分配到储备脂质中的能力。大部分藻类物种以TAGs积累饱和的和单不饱和脂肪酸(Harwood，1998；Roessler，1990b)。已经在Parietochloris incise(Bigogno等，2002)、淡水红藻Porphyridium cruentum(Cohen等，2000)和海洋微藻微绿球藻、三角褐指藻、假微型海链藻和路氏巴夫藻(Tonon等，2002)中观察到LC-PUFAs分配成TAGs。因此，为了理解负责微藻中将LC-PUFAs掺合到储备油中的过程，这些物种是进一步研究的良好的候选物。
目前，通常接受油脂性藻类在最佳生长条件下产生少量TAG(Hu等2008)。影响微藻中三酰甘油累积和脂肪酸组成的主要因素是温度和光强度。通常，认为脂肪酸不饱和性随着温度降低而增加，并且低光度有利于PUFAs形成。例如，在三角褐指藻UTEXS 640中，对于EPA产生的最佳培养温度是21.5-23℃(Yongmanitchai W.和Ward O.，1991)。由于微藻生长的最佳温度通常高于n-3PUFAs形成的最佳温度(Jiang和Chen，2000)，已经利用一种温度转换策略来增加整体n-3PUFAs(包括EPA)的产生。已经在多种不同的藻类物种中观察到这样的现象，包括P.cruentum(Springer等，1994)，微拟球藻物种(Sukenik，1991)和畸雌腐霉(P.irregular)(Stinson等，1991)。然而，Ohta等(1993)观察到P.purpureum的最佳生长温度还产生具有最高EPA含量的生物量。这些结果表明，对于个体微藻物种，应该仔细地研究温度对细胞生长和n-3PUFA产生的影响。
之前已经报道了三角褐指藻中TAG种类的模式(Yongmanitchai和Ward 1993；Yu等，2009)。我们观察到与这些早先的研究所述相同的掺合到TAGs中的主要的脂肪酸(即，14：0，16：0，16：1，16：3和20：5)。Yongmanitchai和Ward 1993通过反相HPLC分析仅鉴定了18种TAG分子种类。由于ESI-MS的高分辨率和灵敏性，Yu等，2009能够检测藻类油提取物中两倍更多的种类(通过HPLC他们检测到了18种种类中的14种，以相当的百分比组成)。然而，没有检测到TAGs 48：7，48：9，48：12和54：10，这可以由三角褐指藻藻株和培养条件的差别来解释。
实施例2
鉴定并表征藻类和植物中PUFAs生物合成的新活性
2.1鉴定来自微藻Ostreococcus RCC809的Δ6-去饱和酶
使用已知的N端细胞色素b5-融合去饱和酶作为查询物，用BLAST分析绿藻Ostreococcus RCC809的基因组。该分析揭示存在一些编码推定的PUFA去饱和酶的基因。将推定的开放阅读框用作模板来化学合成(Genscript Corporation，NJ)针对在硅藻中表达密码子优化的核苷酸序列。
在酵母中功能表征推定的Ostreococcus RCC809Δ6-去饱和酶。
将密码子优化的推定的Δ6-去饱和酶的开放阅读框(SEQ ID No.s7-10，以下称为Ost809Δ6)作为KpnI-SacI片段插入在酵母表达载体pYES2(Invitrogen，NJ)的半乳糖-诱导的GAL1启动子之后。Ost809Δ6
利用醋酸锂法用质粒DNA转化酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株W303-1A。培养物在2％(v/v)棉子糖的存在下在22℃生长48小时，并且如所述(Sayanova等，2001)通过在存在0.5mM亚油酸(LA，18：2n-6)和1％(w/v)tergitol NP-40(Sigma)的条件下加入半乳糖至2％来诱导转基因的表达。
通过在存在一定范围的潜在的脂肪酸底物的条件下在酿酒酵母中的表达研究来研究候选去饱和酶Ost809Δ6(预测编码461个氨基酸的C18Δ6-去饱和酶)的预测的功能。然后，通过GC-FID分析来自酵母细胞的总脂肪酸甲基酯，并且通过GC-MS和与真正的标准物的共迁移来证实新的峰的性质。如图8中所示，合成的编码Ost809Δ6的ORF的表达证实将外源供应的底物(α-亚麻酸，ALA；C18：Δ9，12，15)转化为Δ6-去饱和的产物SDA(18：4，n-3)的酶促能力。在不存在半乳糖的条件下，这些外源底物ALA不被转化成SDA。因此，基于这些结果，证实Ost809Δ6是D6-去饱和酶。通过在生长培养基中外源供应等量的LA和ALA来确定Ost809Δ6的底物选择性。如图9中所示，Ost809Δ6仅识别n-3脂肪酸ALA作为底物，而n-6底物没有被去饱和。这与从青绿藻中鉴定的Δ6-去饱和酶(Domergue等，2005)明显不同，其表现出针对作为底物的LA和ALA二者的活性。由此，对于排他性产生Δ6-去饱和的n-3脂肪酸，Ost809Δ6是优越的和独特的。
对酵母培养物补充不同的潜在的FA底物(在表V中列出)，但是仅在存在ALA时检测到O809d6的去饱和作用活性。
2.2鉴定来自O809的推定的Δ4-去饱和酶
用之前功能性表征的Δ4-去饱和酶序列检索Ostreococcus RCC809基因组序列http：//genome.jgi-psf.org/OstRCC809_2/OstRCC809_2.home.html，并且检测明显的Δ4-去饱和酶候选物(JGI蛋白ID#40461)的存在。将推定的开放阅读框用作模板来化学合成(Genscript Corporation，NJ)对在硅藻三角褐指藻中表达密码子优化的核苷酸序列(SEQ ID No.s 15-18)。
在酵母中功能性表征来自O809的推定的Δ4-去饱和酶。
将对在三角褐指藻中表达密码子优化的推定的Δ4-去饱和酶的开放阅读框作为KpnI-SacI片段插入在酵母表达载体pYES2(Invitrogen，NJ)的半乳糖-诱导的GAL1启动子之后。
如在图10中可以看出，Ost809蛋白40461的半乳糖依赖性表达导致DPAΔ4-去饱和成为DHA，这证实该ORF作为C22Δ4-去饱和酶的功能，并且在此基础上，我们指定该基因为Ost809Δ4。注意，在不存在诱导剂(半乳糖)时，没有检测到DHA，在不存在Ost809Δ4 ORF时，也没有检测到DHA。
2.3鉴定来自圆柱拟脆杆藻的Δ6-延长酶
利用已知的Δ6-延长酶序列(如来自秀丽隐杆线虫的Δ6-延长酶-Beaudoin等，2000)作为询问物用BLAST分析海洋硅藻圆柱拟脆杆藻的公众可获得的基因组序列(http：//genome.jgi-psf.org/Fracyl/Fracyl.home.html)，并且利用候选物开放阅读框(指定为Frag#177742)作为模板来化学合成(GenscriptCorporation，NJ)对在假微型海链藻(T.pseudonana)中表达密码子优化的核苷酸序列。
在转基因酵母中功能性表征FcΔ6-延长酶
准确如前文所述，用克隆到酵母表达载体pYES2中的密码子优化的ORF进行酿酒酵母中Frag#177742的异源表达。利用该构建体的半乳糖-介导的诱导来证实该ORF作用为Δ6-延长酶，特异性将C18 Δ6-不饱和底物(如GLA)延长为C20形式。如在图11中可以看出的，GLA延长为20：3仅在存在半乳糖和ORF Frag#177742时发生。基于这些结果，将其重新指定为FcELO6。
表V.测试底物的列表：
Ost809 D6
18：2，ALA，GLA，18：2&18：3，20：4n-6(ARA)，20：2，ERA，ETA，22：5n-6(DPA)FcElo6
18：2，GLA，GLA&SDA
Ost809Δ4
DPA
(加下划线的底物是起作用的那些底物)
表VI.表达Ost809Δ6、FcElo6或Ost809Δ4的酵母细胞的脂肪酸组成和这些中的每一种的底物特异性
表VII.底物特异性
基于新形式的Δ6-去饱和酶(Ost809Δ6)、Δ4-去饱和酶(Ost809Δ4)和Δ6-延长酶(FcELO6)的鉴定，很有可能这些活性将证明可用于在藻类和植物中异源构建ω-3长链多不饱和脂肪酸生物合成途径。例如，Ost809Δ6酶的优越的底物偏好性使其与其他Ostreococcus Δ6-去饱和酶区分开来，并且可以用于使底物经由n-3途径的流出最大化。类似地，Ost809Δ4活性将证明可用于在转基因光合生物中将DPA特异性转化为DHA，而FcELO6活性提供可将GLA延长为20：3n-3的方式。
实施例3
在三角褐指藻中表达单一ω-3 LC-PUFA生物合成基因能够增加DHA的内源性积累
材料和方法
藻株和生长条件
三角褐指藻UTEX 646在ESAW培养基中(Harrison等，1980)在20℃在白色荧光灯恒定照射(100μmol光子m-2s-1)下适度振荡生长。在静止生长期间进行野生型和转基因藻的分析。
质粒设计和克隆
Δ6-延长酶FcElo6(蛋白ID 177742)的编码序列作为模板来化学合成(Genscript Corporation，NJ)针对在假微型海链藻中表达密码子优化的核苷酸序列。将密码子优化的序列分别作为EcoRV-SacI片段插入到pPha-T1载体(Kroth，2007；Zaslavskaia等，2000)中。
结果
FcElo6的表达导致DHA水平增加至14-17％(图13)。
实施例4
两种基因的共表达
材料和方法
设计双基因载体pPhOS2和转化盒
用合成序列替换含有MCS的pPha-T1载体中的EcoRI-HindIII片段，所述合成序列包含由3个具有独特的限制性位点的多克隆位点(MCSs)侧连的fcpA终止子和fcpA启动子(图14)。将青绿藻Δ5-延长酶OtElo5的编码序列作为KpnI-SacI片段插入到pPhOS载体的位置1处，产生pPhOS2.1.1构建体。将针对在三角褐指藻中表达青绿藻Δ6-去饱和酶OtD6Pt编码序列而优化的密码子作为BamHI-XbaI片段插入到pPhOS2.1.1的位置2处，产生pPhOS2.2.1构建体。
结果和讨论
在转基因三角褐指藻中的多基因表达
为了促使多个异源基因在三角褐指藻中的表达，构建新的载体(指定为pPhOS2-图14)。该载体是基于之前所述的pPha-T1载体(Zaslavskaia等，2000)，并且包含两个用于插入目的基因的具有特有的限制性位点的多克隆位点(MCS)。这些MCS中的每一个侧连FcpA基因的启动子和终止子区域(Zaslavskaia等，2000)，以促进两种插入基因的共同表达。青绿藻Δ5-延长酶OtElo5的编码序列插入在pPhOS2载体的位置1处，并且将得到的构建体pPhOS2.1.1用来转化三角褐指藻。培养物在20℃和16℃在恒定照射(60μmol光子m-2s-1)下生长。得到多个(5个)不依赖性博来霉素-抗性藻落，并且用于接种培养物，用于进一步的GC-MS分析。在所分析的pPhOS2.1.1藻株中的平均DHA水平为9.0％(表VIII；图1)，与之前用在pPHa-T1中的OtElo5表达所观察到的水平相似，这证实这种改良的载体的功能性。随后，将青绿藻Δ6-去饱和酶OtD6Pt的密码子优化的编码序列插入到构建体pPhOS2.1.1的位置2处，产生两基因(加上选择标记基因ble)pPhOS2.2.1载体。将这一表达质粒通过生物弹道学引入到三角褐指藻中，并且得到多个不依赖性的博来霉素抗性藻落，并将其用于接种培养物，用于进一步的筛选。培养物在16和20℃在恒定照射(60μmol光子m-2s-1)下生长。表达单个基因或双重基因构建体的转基因藻株的FAMEs分析揭示在共表达OtElo5和OtD6Pt的转基因藻株中DHA水平进一步增加，这表明本文所证明的对于高价值脂质特性的三角褐指藻中反复代谢改造的潜力(图15，表VIII)。
表VIII.野生型(Pt_WT)与表达pPhOS2.1和pPhOS2.2的转基因三角褐指藻在16℃和20℃的脂肪酸组成(Mol％)。每次测量是3次生物学重复的平均值(±标准误差)。
实施例5
自养生长
材料和方法
设计双重基因载体pPhOS2和转化盒
用合成序列替换含有MCS的pPha-T1载体的EcoRI-HindIII片段，所述合成序列包含由3个具有特有的限制性位点的多克隆位点(MCSs)侧连的fcpA终止子和fcpA启动子(图16)。将青绿藻Δ5-延长酶OtElo5的编码序列作为KpnI-SacI片段插入到pPhOS载体的位置1处，产生pPhOS2.1.1构建体。对于在三角褐指藻中表达来自小立碗藓(Physcomitrella patens)(指定为Ppglut1)和人红细胞(指定为Hsglut1)的葡萄糖转运蛋白的编码序列而优化的密码子作为BamHI-XbaI片段插入到pPhOS2.1.1的位置2处，产生pPhOS_Ppglut和pPhOS_HSglut构建体。将得到的构建体用来通过生物弹道学转化三角褐指藻。
结果
通过用这两个表达盒转化得到多个(＞10个)不依赖性的博来霉素抗性藻落，并将其用于接种培养物，用于进一步的GC-MS分析。选择表达pPhOS_Ppglut和pPhOS_HSglut构建体的积累DPA和升高水平的DHA的转基因三角褐指藻藻株用于进一步的分析。(图16和图17)。将转化体转移至含有0.5％葡萄糖的固体培养基上，放置在完全的黑暗中，并且监测生长(图18)。
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序列表
显示与cDNA类似的核酸。
SEQ ID No 1核酸序列OtElo5
atgagcgcctccggtgcgctgctgcccgcgatcgcgtccgccgcgtacgcgtacgcgacgtacgcctacgcctttgagtggtcgcacgcgaatggcatcgacaacgtcgacgcgcgcgagtggatcggtgcgctgtcgttgaggctcccggcgatcgcgacgacgatgtacctgttgttctgcctggtcggaccgaggttgatggcgaagcgcgaggcgttcgacccgaaggggttcatgctggcgtacaatgcgtatcagacggcgttcaacgtcgtcgtgctcgggatgttcgcgcgagagatctcggggctggggcagcccgtgtgggggtcaaccatgccgtggagcgatagaaaatcgtttaagatcctcctcggggtgtggttgcactacaacaacaaatatttggagctattggacactgtgttcatggttgcgcgcaagaagacgaagcagttgagcttcttgcacgtttatcatcacgccctgttgatctgggcgtggtggttggtgtgtcacttgatggccacgaacgattgtatcgatgcctacttcggcgcggcgtgcaactcgttcattcacatcgtgatgtactcgtattatctcatgtcggcgctcggcattcgatgcccgtggaagcgatacatcacccaggctcaaatgctccaattcgtcattgtcttcgcgcacgccgtgttcgtgctgcgtcagaagcactgcccggtcacccttccttgggcgcaaatgttcgtcatgacgaacatgctcgtgctcttcgggaacttctacctcaaggcgtactcgaacaagtcgcgcggcgacggcgcgagttccgtgaaaccagccgagaccacgcgcgcgcccagcgtgcgacgcacgcgatctcgaaaaattgactaa
SEQ ID No 2氨基酸序列OtElo5
MSASGALLPAIASAAYAYATYAYAFEWSHANGIDNVDAREWIGALSLRLPAIATTMYLLFCLVGPRLMAKREAFDPKGFMLAYNAYQTAFNVVVLGMFAREISGLGQPVWGSTMPWSDRKSFKILLGVWLHYNNKYLELLDTVFMVARKKTKQLSFLHVYHHALLIWAWWLVCHLMATNDCIDAYFGAACNSFIHIVMYSYYLMSALGIRCPWKRYITQAQMLQFVIVFAHAVFVLRQKHCPVTLPWAQMFVMTNMLVLFGNFYLKAYSNKSRGDGASSVKPAETTRAPSVRRTRSRKID＊
SEQ ID No 3 OtD6核酸序列
atgtgcgtggagacggaaaataacgatgggatccccacggtggagatcgcgttcgacggtgagcgcgagcgggcggaggcaaacgtgaagctgtccgcggagaagatggagccggcggcgctggcgaagacgttcgcgaggcggtacgtcgtgatcgagggggtggagtacgatgtgacggattttaagcacccgggaggaacggttattttctatgcgttgtcaaacaccggggcggacgcgacggaagcgttcaaggagtttcatcatcggtcgagaaaggcgaggaaagccttggcggcgctcccgtctcgaccggccaagacggccaaggtggacgacgcggagatgctccaagatttcgccaagtggcggaaagaattggagagagatggattcttcaagccctctccggcgcacgtggcgtatcgcttcgccgagctcgcggcgatgtacgctctcgggacgtacctgatgtacgctcgatacgtcgtctcctcggtgctcgtgtacgcttgctttttcggcgcccgatgcggttgggtgcagcacgagggcggacacagctcgctgacgggcaacatttggtgggacaagcgcatccaggccttcacagccgggttcggtctcgccggtagcggcgacatgtggaactcgatgcacaacaagcatcacgcgacgcctcaaaaggttcgtcacgacatggatctggacaccacccccgcggtggcgttcttcaacaccgcggtggaagacaatcgtccccgtggctttagcaagtactggttgcgccttcaggcgtggaccttcatccccgtgacgtccggcttggtgctccttttctggatgtttttcctccacccctccaaggctttgaagggtggcaagtacgaagagttggtgtggatgctcgccgcgcacgtcatccgcacgtggacgatcaaggcggtgaccggattcaccgcgatgcagtcctacggcttatttttggcgacgagctgggtgagcggctgctatctgtttgcacacttctccacgtcgcacacgcacctggatgtggtgcccgcggacgagcatctctcctgggttcgatacgccgtcgatcacacgatcgacatcgatccgagtcaaggttgggtgaactggttgatgggctacctcaactgccaagtcatccaccacctctttccgagcatgccgcagttccgccagcccgaggtatctcgccgcttcgtcgcctttgcgaaaaagtggaacctcaactacaaggtcatgacctacgccggtgcgtggaaggcaacgctcggaaacctcgacaacgtgggtaagcactactacgtgcacggccaacactccggaaagacggcgtaa
SEQ ID No 4 OtD6氨基酸序列
MCVETENNDGIPTVEIAFDGERERAEANVKLSAEKMEPAALAKTFARRYVVIEGVEYDVTDFKHPGGTVIFYALSNTGADATEAFKEFHHRSRKARKALAALPSRPAKTAKVDDAEMLQDFAKWRKELERDGFFKPSPAHVAYRFAELAAMYALGTYLMYARYVVSSVLVYACFFGARCGWVQHEGGHSSLTGNIWWDKRIQAFTAGFGLAGSGDMWNSMHNKHHATPQKVRHDMDLDTTPAVAFFNTAVEDNRPRGFSKYWLRLQAWTFIPVTSGLVLLFWMFFLHPSKALKGGKYEELVWMLAAHVIRTWTIKAVTGFTAMQSYGLFLATSWVSGCYLFAHFSTSHTHLDVVPADEHLSWVRYAVDHTIDIDPSQGWVNWLMGYLNCQVIHHLFPSMPQFRQPEVSRRFVAFAKKWNLNYKVMTYAGAWKATLGNLDNVGKHYYVHGQHSGKTA＊
SEQ ID No 5密码子优化的OtD6Pt核酸序列
ggtaccaagcttgatatcaccaaaatgtgtgtcgaaacggaaaacaacgatggaatccccacggtcgaaattgcctttgatggagaacgcgaacgcgccgaagccaacgtcaagctctccgccgaaaagatggaacccgccgccttggccaagaccttcgcccgtcgctacgtcgtcattgaaggtgtcgaatacgatgtcaccgacttcaagcacccgggaggtacggtcatcttttacgccctctccaacaccggagccgacgccacggaagccttcaaggaatttcaccaccgttcccgcaaggcccgtaaggccctcgccgccttgccctcgcgcccggccaagaccgccaaggtcgacgatgccgaaatgcttcaggatttcgccaagtggcgtaaggaactcgaacgcgacggcttctttaagccctccccggcccacgtcgcctaccgttttgccgaactcgccgccatgtacgcccttggaacctacctcatgtacgcccgttacgtcgtctcctcggtcttggtctacgcctgcttctttggtgcccgctgtggatgggtccagcacgaaggcggacactcctcgctcaccggaaacatttggtgggataagcgtatccaagccttcacggccggatttggtttggccggctccggagacatgtggaactcgatgcacaacaagcaccacgccaccccccagaaggtccgtcacgacatggatctcgacaccacgccggccgtcgccttctttaacaccgccgtcgaagataaccgtccccgcggattctccaagtactggcttcgtctccaagcctggaccttcattcccgtcacgtccggtttggtcctcttgttttggatgttctttcttcacccgtcgaaggccctcaagggtggcaagtacgaagaattggtctggatgcttgccgcccacgtcattcgtacctggacgatcaaggccgtcaccggtttcacggccatgcagtcctacggcttgtttcttgccacctcctgggtctcgggttgctacctcttcgcccacttttccacctcgcacacgcacttggatgtcgtccccgccgacgaacacctttcctgggtccgctacgccgtcgaccacaccattgacattgacccgtcgcagggatgggtcaactggctcatgggttacttgaactgtcaagtcatccaccacctcttcccctccatgccgcagtttcgtcaacccgaagtctcgcgtcgcttcgtcgcctttgccaagaagtggaacttgaactacaaggtcatgacctacgccggagcctggaaggccacgcttggaaaccttgataacgtcggaaagcactactacgtccacggccagcactcgggaaagaccgcctaagagctcggtaccctcgag
SEQ ID No 6密码子优化的OtD6氨基酸序列
MCVETENNDGIPTVEIAFDGERERAEANVKLSAEKMEPAALAKTFARRYVVIEGVEYDVTDFKHPGGTVIFYALSNTGADATEAFKEFHHRSRKARKALAALPSRPAKTAKVDDAEMLQDFAKWRKELERDGFFKPSPAHVAYRFAELAAMYALGTYLMYARYVVSSVLVYACFFGARCGWVQHEGGHSSLTGNIWWDKRIQAFTAGFGLAGSGDMWNSMHNKHHATPQKVRHDMDLDTTPAVAFFNTAVEDNRPRGFSKYWLRLQAWTFIPVTSGLVLLFWMFFLHPSKALKGGKYEELVWMLAAHVIRTWTIKAVTGFTAMQSYGLFLATSWVSGCYLFAHFSTSHTHLDVVPADEHLSWVRYAVDHTIDIDPSQGWVNWLMGYLNCQVIHHLFPSMPQFRQPEVSRRFVAFAKKWNLNYKVMTYAGAWKATLGNLDNVGKHYYVHGQHSGKTA
SEQ ID No 7来自Ostreococcus RCC809的Δ6-去饱和酶核酸
atgcgcgtcgaaacggaggacgacaacgttccgacggtcaccgtcggactgtcggaggagagcgacgggatgaagggggcgagaaaccccggggcgcgggcgtggaaatcgacgctcgagccgcacgcggtggccaagtcgttcgatcgacggtgggtcaaggttgacggcgtcgagtacgacgtcacggattttaagcatccgggtggatctgtgatttattacatgctgtcgaacaccggagcggacgcgacggaggcgttcaaagagtttcattatcggtcgaaaaaggcgagaaaggcgttggcggcgttgccgcagcgcgagccggaggacgcgtcgccagtggaagacgcgaatatgttgaaggatttcgcgaaatggcgcaaagatttggagcgcgagggtttctttaaaccgtcgccggcgcacgtggcgtacagattcgcggaactcgcggccatgttcgcgctcgggacggcgttgatgtacgctcgatggcacgccacctcagtcttcgtcaccgcgtgctttttcggcgcgcggtgcggttgggtgcaacacgagggtggtcacagctcgctgacggggagcatttggtgggacaagcgaatccaagcgttcaccgccggtttcggattagcatcgagcggcgacatgtggaacctcatgcacaacaagcaccacgccactccgcaaaaggtgcgacacgacatggacctcgacaccacgccggcggtggccttcttcaacactgcggtcgaggaaaaccgtccgcgcaagttcagtaagttatggttgcgcgtgcaggcgtggacgttcgtcccggtcacctctggtttggtgttgctcgcctggatgtacctcttgcatccgagacacattgctcgccgtaaaaactacgaagaggctgcgtggatcgtcgccgcgcacgtcatccgcacgtcggtcatcaaagccgtgaccggttactcctggatcacgtgctacggtttgttcttgtccaccatgtgggtgagcggctgctacctctttgcgcacttctccacgtctcacacgcacctcgacgtcgttccgagcgataagcatctctcttgggtgcgatacgccgtcgaccacaccatcgacatcgacccgagcaagagcgtcgtcaactggttgatgggttacctgaactgccaggtcatccatcacttgtttccggacatgcctcagttccgtcagcccgaagtctctcgccgcttcgtctcctttgcgaaaaagtggaacctcaattacaaggtcatgagctactacggcgcgtggaaggccaccttcggtaacttgaacgaggtcggcaagcactattacatccaaggttctcaaatcacgaagaagacggtgtaa
SEQ ID No 8来自Ostreococcus RCC809的Δ6-去饱和酶
MRVETEDDNVPTVTVGLSEESDGMKGARNPGARAWKSTLEPHAVAKSFDRRWVKVDGVEYDVTDFKHPGGSVIYYMLSNTGADATEAFKEFHYRSKKARKALAALPQREPEDASPVEDANMLKDFAKWRKDLEREGFFKPSPAHVAYRFAELAAMFALGTALMYARWHATSVFVTACFFGARCGWVQHEGGHSSLTGSIWWDKRIQAFTAGFGLASSGDMWNLMHNKHHATPQKVRHDMDLDTTPAVAFFNTAVEENRPRKFSKLWLRVQAWTFVPVTSGLVLLAWMYLLHPRHIARRKNYEEAAWIVAAHVIRTSVIKAVTGYSWITCYGLFLSTMWVSGCYLFAHFSTSHTHLDVVPSDKHLSWVRYAVDHTIDIDPSKSVVNWLMGYLNCQVIHHLFPDMPQFRQPEVSRRFVSFAKKWNLNYKVMSYYGAWKATFGNLNEVGKHYYIQGSQITKKTV
SEQ ID No 9用于在假微型海链藻中表达密码子优化的来自OstreococcusRCC809的Δ6-去饱和酶(Ost809Δ6)核酸
atgcgtgtggaaaccgaagacgataatgtgccaactgttactgtgggattgtcagaggagtccgatggaatgaagggagcaaggaaccccggagcacgtgcttggaagtcgacgttggagccgcacgccgtggcaaagtcattcgatcgtaggtgggttaaggttgacggagtcgaatacgacgtaactgatttcaagcatcccggaggatcagttatctactatatgctttctaacaccggagctgatgccactgaggctttcaaggaatttcactatcgtagtaagaaggccaggaaggcacttgctgccctcccaca
acgtgagcctgaagacgcttcgccagtcgaggatgccaatatgctcaaggacttcgcaaagtggcgtaaggatttggagagggaaggattctttaagccaagtcctgctcacgtggcctaccgtttcgccgaactcgcagctatgtttgctttgggaactgcccttatgtatgcacgttggcatgctacgtctgtcttcgtaacagcctgtttctttggagcaaggtgtggatgggtgcaacacgagggaggacattcttccttgaccggatccatctggtgggataagcgtattcaggcattcactgctggatttggacttgccagttcgggagacatgtggaacctcatgcacaataagcaccatgcaacgccacaaaaagttaggcatgatatggacctcgataccactcctgcagtggctttctttaacacagctgttgaggaaaatcgtcctaggaagttctctaagttgtggcttcgtgtccaggcctggacctttgtgcccgttacttccggattggtactcttggcatggatgtaccttctccacccgcgtcatatcgctcgtaggaagaactatgaggaagccgcatggattgtggctgcccatgttatcaggacctccgtcattaaggctgtaacgggatacagttggatcacatgttatggactcttcttgtcgactatgtgggtctcaggatgctacctcttcgctcacttttcaacgtctcacacacatttggacgtggttccatctgataagcacctttcctgggtgcgttacgccgttgatcataccatcgacattgatccttccaagagtgtcgtaaactggctcatgggatatttgaactgtcaggttatccaccatttgttccccgacatgccgcaatttcgtcagcccgaagtcagtcgtaggttcgtatcgtttgccaagaagtggaaccttaattacaaggtcatgtcttactatggagcctggaaggcaaccttcggaaatctcaacgaagtcggaaagcactactacatccaaggaagtcaaatcacaaagaagacggtttag
SEQ ID No 10来自Ostreococcus RCC809的密码子优化的Δ6-去饱和酶氨基酸
MRVETEDDNVPTVTVGLSEESDGMKGARNPGARAWKSTLEPHAVAKSFDRRWVKVDGVEYDVTDFKHPGGSVIYYMLSNTGADATEAFKEFHYRSKKARKALAALPQREPEDASPVEDANMLKDFAKWRKDLEREGFFKPSPAHVAYRFAELAAMFALGTALMYARWHATSVFVTACFFGARCGWVQHEGGHSSLTGSIWWDKRIQAFTAGFGLASSGDMWNLMHNKHHATPQKVRHDMDLDTTPAVAFFNTAVEENRPRKFSKLWLRVQAWTFVPVTSGLVLLAWMYLLHPRHIARRKNYEEAAWIVAAHVIRTSVIKAVTGYSWITCYGLFLSTMWVSGCYLFAHFSTSHTHLDVVPSDKHLSWVRYAVDHTIDIDPSKSVVNWLMGYLNCQVIHHLFPDMPQFRQPEVSRRFVSFAKKWNLNYKVMSYYGAWKATFGNLNEVGKHYYIQGSQITKKTV
SEQ No.11对于在拟南芥中表达密码子优化的来自赫氏圆石藻(E.Huxleyi)(EhD4)的Δ4-去饱和酶
atgggaggcgccggcgcgagcgaggctgaacggcccaagtggaccacgatccacgggcggcacgtcgatgtgtcaaagttccgccacccgggtgggaacatcatcgagctcttctatggcatggactcgacgagcgcgttcgagcagttccacggccaccacaagggcgcgtggaagatgctcaaggcgctgccgaccaaggaggtcgaccccgccgacgtgccgcagcagccgcaggagcacgttgccgagatgacgcggctgatgacgtcgtggcgcgagcgcggcctctttaagccgcgccccgtcgcctcgggcatctacggtctcgccgtcgtcgctgccatcgtcgcgtgcatcgcctgcgcgccgcacgcgccggtgctgagcgggatcgggctcggcagctgctgggcgcagtgcggcttcctgcagcacatgggcgggcaccgcgagtggggggtgcggtactccttcctcctgcagcacttcttcgagggcctcctcaagggcgggtccgcctcgtggtggcgcaaccgccacaacaagcatcacgcaaagactaacgtgctcggcgaggacggcgacctgcggacgactcccttcttcgcctgggacccgacgctcgccaagaaggttccagactggtcgctcaagacgcaggccttcaccttcctccccgccctcggagcgtacgtctttgtctttgccttcacgatccgcaagtatgccgtcgtcaagaagctctggcacgagctcgcactcatgatcgcgcactacgcgatgttctactacgcgctgcagctcgccggtgcgtcgctcggcagcggcctcgccttttactgcaccggctacgcctggcaaggcatctacctcggcttcttcttcggcctgtcccacttcgcggtcgagcgagtcccctccaccgccacctggctcgagtcgtccatgatcggcaccgtcgactggggaggctcctccgccttttgcggctacgtctccggcttcctcaacatccagatcgagcaccacatggcgccgcagatgccgatggagaacctgcgccagatccgcgccgactgcaaggcgagcgcggagaagctcgggcttccctatcgcgagctctccttcgccggcgcggtcaagctgatgatggtcggcctctggcgcacggggagggacgagctgcagctgcgctccgacaggcgcaagtactcgcgcacccaggcctacatggcggccgcctcggcggtggtggagaacctcaaggcggactag
SEQ No.12对于在拟南芥中表达密码子优化的来自赫氏圆石藻的Δ4-去饱和酶
MGNGNLPASTAQLKSTSKPQQQHEHRTISKSELAQHNTPKSAWCAVHSTPATDPSHSNNKQHAHLVLDITDFASRHPGGDLILLASGKDASVLFETYHPRGVPTSLIQKLQIGVMEEEAFRDSFYSWTDSDFYTVLKRRVVERLEERGLDRRGSKEIWIKALFLLVGFWYCLYKMYTTSDIDQYGIAIAYSIGMGTFAAFIGTCIQHDGNHGAFAQNKLLNKLAGWTLDMIGASAFTWELQHMLGHHPYTNVLDGVEEERKERGEDVALEEKDQESDPDVFSSFPLMRMHPHHTTSWYHKYQHLYAPPLFALMTLAKVFQQDFEVATSGRLYHIDANVRYGSVWNVMRFWAMKVITMGYMMGLPIYFHGVLRGVGLFVIGHLACGELLATMFIVNHVIEGVSYGTKDLVGGASHGDEKKIVKPTTVLGDTPMEKTREEALKSNSNNNKKKGEKNSVPSVPFNDWAAVQCQTSVNWSPGSWFWNHFSGGLSHQIEHHLFPSICHTNYCHIQDVVESTCAEYGVPYQSESNLFVAYGKMISHLKFLGKAKCE＊
SEQ ID No.13来自假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)的D4-去饱和酶核酸
atgggcaacggcaacctcccagcatccaccgcacagctcaagtccacctcgaagccccagcagcaacatgagcatcgcaccatctccaagtccgagctcgcccaacacaacacgcccaaatcagcatggtgtgccgtccactccactcccgccaccgacccatcccactccaacaacaaacaacacgcacacctagtcctcgacattaccgactttgcgtcccgccatccagggggagacctcatcctcctcgcttccggcaaagacgcctcggtgctgtttgaaacataccatccacgtggagttccgacgtctctcattcaaaagctgcagattggagtgatggaggaggaggcgtttcgggattcgttttacagttggactgattctgacttttatactgtgttgaagaggagggttgtggagcggttggaggagagggggttggacaggaggggatcgaaagagatttggatcaaggctttgttcttgttggttggattttggtactgtttgtacaagatgtatactacgtcggatattgatcagtacggtattgccattgcctattctattggaatgggaacctttgcggcattcatcggcacgtgtattcaacacgatggaaatcacggtgcattcgctcagaacaagttactcaacaagttggctgggtggacgttggatatgattggtgcgagtgcgtttacgtgggagcttcagcacatgctggggcatcatccatatacgaatgtgttggatggggtggaggaggagaggaaggagaggggggaggatgttgctttggaagaaaaggatcaggaatcagatccagacgtattctcctccttccctctcatgagaatgcatccccaccatacaacctcatggtatcataaataccaacacctctacgctccacccctctttgcattgatgacacttgccaaagtattccaacaggattttgaagttgccacatccggacgattatatcatattgatgccaatgtacgttatggttcggtatggaatgtcatgaggttttgggctatgaaggtcattacgatgggatatatgatgggattaccaatctactttcatggagtactgaggggagttggattgtttgttattgggcatttggcgtgtggagagttgttggcgacgatgtttattgtgaatcacgtcattgagggtgtgagttatggaacga
aggatttggttggtggtgcgagtcatggagatgagaagaagattgtcaagccaacgactgtattgggagatacaccaatggaaaagactcgcgaggaggcattgaaaagcaacagcaataacaacaagaagaagggagagaagaactcggtaccatccgttccattcaacgactgggcagcagtccaatgccagacctccgtgaattggtctccaggctcatggttctggaatcacttttctgggggactctctcatcagattgagcatcacttgttccccagcatttgtcatacaaactactgtcatatccaggatgttgtggagagtacgtgtgctgagtacggagttccgtatcagagtgagagtaatttgtttgttgcttatggaaagatgattagtcatttgaagtttttgggtaaagccaagtgtgagtag
SEQ ID No.14来自假微型海链藻的D4-去饱和酶氨基酸
MGGAGASEAERPKWTTIHGRHVDVSKFRHPGGNIIELFYGMDSTSAFEQFHGHHKGAWKMLKALPTKEVDPADVPQQPQEHVAEMTRLMTSWRERGLFKPRPVASGIYGLAVVAAIVACIACAPHAPVLSGIGLGSCWAQCGFLQHMGGHREWGVRYSFLLQHFFEGLLKGGSASWWRNRHNKHHAKTNVLGEDGDLRTTPFFAWDPTLAKKVPDWSLKTQAFTFLPALGAYVFVFAFTIRKYAVVKKLWHELALMIAHYAMFYYALQLAGASLGSGLAFYCTGYAWQGIYLGFFFGLSHFAVERVPSTATWLESSMIGTVDWGGSSAFCGYVSGFLNIQIEHHMAPQMPMENLRQIRADCKASAEKLGLPYRELSFAGAVKLMMVGLWRTGRDELQLRSDRRKYSRTQAYMAAASAVVENLKAD＊
SEQ ID No.15来自Ostreococcus RCC809的Δ4-去饱和酶核酸
atgccgacgactcgatcgcgcgcgcgcgtgacgacgccccctcgcgagacgccgacgagagcgaacaccgtcgccgcgctcgatcccgagcgcaagtacacgcgcattcgcggcgtcgtgtacgacgtcacggatttcgccagccgtcatccgggtggcgcgcaattgttatcgctgtgcgtggggagagacgccaccatcctggtggagagtcatcaccttcgtccggaggtggtgcaaaagtacctgaagacgcttcccgtggtggagggcgcggcgggggcgttcgggcccgaggagacgtttccgaaaccgctcgactcggatttgtaccgaaagattcaggggcgcgttcgtaaagagatcgtcgaaccgttgaagatgacgcgcggacgcgagccgcacgggcgaggctggtgcgtgttggacgccggggtggtgttggctttcttcgcgttcgcgttgggagtctattggaagacgccgacggtggcgacggggtgcctgttggggctcgccgggtactggagcggcaccggattgcaacacacggcgaaccacggtggattggcgaagagtgggttttggaatcagttttggggatggctcgggaacgacgtcgccatcgggaagagctcggtggagtggagatatcatcacatggtgagccaccactcgtattgcaacgacgcggacctcgatcaagacgtgtacaccgcgctgccgcttcttcgtttggacccgtcccaggagttgaagtggttccaccgctaccaagcgttctacgcgccgctgatgtggccgatgttgtggctcgccgcgcagtttggcgacgcgcaaaatattttagtggataaggcgtctccgggcgtcgagtacaagggcctcatgaagctcgaagtcgcgctgtacgttctcggaaagtttttgcattttagcttgttgctcggcgtaccggcctacttgcacgggtttgcgaacgccatcgtgccgttcatcgcgtacggtgcgttcggttcgttcg
tcctgtgctggtttttcatcgtcagtcacaacttggaggcgttgaccccaatcaatctgagcaaatccacgaagaatgactggggcgcgtggcaaatcgaaacttccgcgtcctggggcaacggcttctggagctttttctccggcgggttgaatttgcaaatcgagcaccacttgttcccgggttgcgcgcacaacttgtacccgaagatggttcccatcatcaaggaagagtgcgaaaaggctggcgtcacgtacaccggttacggtgggtactttggtctccttcccatcactcgggacatgttcgcgtacttgtacaaaatgggccgacaaagcaaaaagtcggcgtaa
SEQ ID No.16来自Ostreococcus RCC809的Δ4-去饱和酶氨基酸
MPTTRSRARVTTPPRETPTRANTVAALDPERKYTRIRGVVYDVTDFASRHPGGAQLLSLCVGRDATILVESHHLRPEVVQKYLKTLPVVEGAAGAFGPEETFPKPLDSDLYRKIQGRVRKEIVEPLKMTRGREPHGRGWCVLDAGVVLAFFAFALGVYWKTPTVATGCLLGLAGYWSGTGLQHTANHGGLAKSGFWNQFWGWLGNDVAIGKSSVEWRYHHMVSHHSYCNDADLDQDVYTALPLLRLDPSQELKWFHRYQAFYAPLMWPMLWLAAQFGDAQNILVDKASPGVEYKGLMKLEVALYVLGKFLHFSLLLGVPAYLHGFANAIVPFIAYGAFGSFVLCWFFIVSHNLEALTPINLSKSTKNDWGAWQIETSASWGNGFWSFFSGGLNLQIEHHLFPGCAHNLYPKMVPIIKEECEKAGVTYTGYGGYFGLLPITRDMFAYLYKMGRQSKKSA＊
SEQ ID No.17关于在Pt中表达密码子优化的Δ4-去饱和酶OstreococcusRCC809核酸
ggatccggtaccaagcttgatatcaccaaaatgccaactactcgttctcgtgctcgtgttactactccacctcgtgaaactcctactcgtgctaatactgttgctgctttagatccagaacgtaaatatacacgtattcgaggtgttgtatatgatgttactgattttgctagtcgacatccaggtggtgcacaattattatctttatgtgttggtcgtgatgctacaattttagtagaatcacatcatttacgaccagaagttgtacaaaaatatttaaaaacattacctgttgtagaaggtgctgctggtgcatttggtccagaagaaacttttccaaaacctttagatagtgatttatatcgtaaaattcaaggtcgtgttcgaaaagaaattgtagaaccattaaaaatgacacgtggtcgagaacctcatggtcgtggttggtgtgttttagatgctggtgttgtattagctttctttgcttttgcattaggtgtttattggaaaacaccaactgtagctactggttgtttattaggtttagcaggttattggtctggtacaggtttacaacatactgctaatcatggtggtttagcaaaatcaggttttggaatcaattttggggttggttaggaaatgatgttgctattggtaaatcaagtgtagaatggcgttatcatcatatggtttcacatcatagttattgtaatgatgctgatttagatcaagatgtttatacagcattaccattattacgtttagatccttcacaagaattaaaatggtttcatcgttatcaagcattttatgcacctttaatgtggcctatgttatggttagctgcacaatttggtgatgctcaaaatattttagttgataaagcaagtccaggtgtagaatataaaggtttaatgaaattagaagttgctttatatgtattaggaaaattttta
catttttctttattattaggtgttcctgcatatttacatggttttgctaatgcaattgtaccatttattgcttatggtgcatttggttcatttgttttatgttggtttttcattgtaagtcataatttagaagcattaacaccaattaatttatctaaatcaactaaaaatgattggggtgcttggcaaattgaaactagtgcatcttggggtaatggtttttggtcatttttctcaggtggtttaaatttacaaattgaacatcatttatttcctggttgtgctcataatttatatccaaaaatggttcctattattaaagaagaatgtgaaaaagcaggtgttacatatactggttatggtggttattttggtttattaccaattactcgtgatatgtttgcttatttatataaaatgggtcgtcaatctaaaaaatctgcttaagagctcggtaccctcgagtctaga
SEQ ID No.18关于在Pt中表达密码子优化的Δ4-去饱和酶OstreococcusRCC809氨基酸
MPTTRSRARVTTPPRETPTRANTVAALDPERKYTRIRGVVYDVTDFASRHPGGAQLLSLCVGRDATILVESHHLRPEVVQKYLKTLPVVEGAAGAFGPEETFPKPLDSDLYRKIQGRVRKEIVEPLKMTRGREPHGRGWCVLDAGVVLAFFAFALGVYWKTPTVATGCLLGLAGYWSGTGLQHTANHGGLAKSGFWNQFWGWLGNDVAIGKSSVEWRYHHMVSHHSYCNDADLDQDVYTALPLLRLDPSQELKWFHRYQAFYAPLMWPMLWLAAQFGDAQNILVDKASPGVEYKGLMKLEVALYVLGKFLHFSLLLGVPAYLHGFANAIVPFIAYGAFGSFVLCWFFIVSHNLEALTPINLSKSTKNDWGAWQIETSASWGNGFWSFFSGGLNLQIEHHLFPGCAHNLYPKMVPIIKEECEKAGVTYTGYGGYFGLLPITRDMFAYLYKMGRQSKKSA＊
SEQ ID No.19来自圆柱拟脆杆藻(Fragilariopsis cylindrus)的Δ6-延长酶核酸
ccatggggtaccgatatcaccaaaatggacgagtacaaagcaactcttgaatctgttggggatgctatcatccaatgggcagatcctgaaagtcagttcaccgggttcaccaagggatggttcttgacagatttcacatctgcgtttagtattgcacttgtatacgtcttatttgtcatcattggttctcaagtgatgaaagtcttacctgctattgatccgtacccaatcaagtttttttacaatgtatcacaaattatgctgtgtgcttacatgacgattgaagcatgtctgttagcgtaccgtaacggatacactatcatgccatgtgtcggatacaatagagatgatccagcaattggaaatcttttatggttattttatgtttcaaaagtttgggatttttgggataccatctttatcgttttggggaagaagtggagacaactttctttccttcacgtttaccatcataccaccatctttttgttctactggcttaacgcgaatgtcttttatgatggtgatatttatcttaccattgctctgaatggtttcatccatactgttatgtacacatactactttatctgtatgcatactaaagacaagaaaactggaaaatcgcttcctatctggtggaaatcatctttgactttgttgcaattgtttcagttcattaccatgatgtcacagggcttataccttatcatttttggttgtgaatcactttctatccgagtcactgcgacatacgttgtttacatattgtcacttttctttttgtttgcgcaattcttcgttgcatcttacatgcaacctaagaaatcgaagactgcctaagagctcggtaccttaattaa
SEQ ID No.20来自圆柱拟脆杆藻的Δ6-延长酶氨基酸
MDEYKATLESVGDAIIQWADPESQFTGFTKGWFLTDFTSAFSIALVYVLFVIIGSQVMKVLPAIDPYPIKFFYNVSQIMLCAYMTIEACLLAYRNGYTIMPCVGYNRDDPAIGNLLWLFYVSKVWDFWDTIFIVLGKKWRQLSFLHVYHHTTIFLFYWLNANVFYDGDIYLTIALNGFIHTVMYTYYFICMHTKDKKTGKSLPIWWKSSLTLLQLFQFITMMSQGLYLIIFGCESLSIRVTATYVVYILSLFFLFAQFFVASYMQPKKSKTA
SEQ ID No.21来自圆柱拟脆杆藻的Δ5-脱脲酶核酸
SEQ ID No.22来自圆柱拟脆杆藻的Δ5-脱脲酶氨基酸
SEQ ID No.23关于在三角褐指藻中表达密码子优化的P.patensPpHUP1L
SEQ ID No.24推定的PpHUP1L多肽序列
SEQ ID No.25密码子优化用于在三角褐指藻中表达的智人(Homosapiens)HsGLUT1
SEQ ID No.26推定的HsGLUT1多肽序列

Claims (44)

1.具有增加的ω-3 LC-PUFAs产生的转基因微藻。
2.根据权利要求1所述的转基因微藻，其中所述微藻是硅藻。
3.根据权利要求2所述的转基因微藻，其中所述硅藻是三角褐指藻(P.tricornutum)。
4.根据前述权利要求的转基因微藻，其中所述ω-3 LC-PUFA选自EPA或DHA。
5.根据权利要求4所述的转基因微藻，其中所述ω-3 LC-PUFA是DHA。
6.根据权利要求5所述的转基因微藻，其中，与对照微藻相比，作为总脂肪酸的百分数的增加的DHA含量增加至少1％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％或更多。
7.根据前述权利要求的转基因微藻，其表达编码Δ5-延长酶的核酸。
8.根据权利要求7所述的转基因微藻，其中所述核酸包含SEQ ID No.1或包含编码与SEQ ID No.2具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％同源性的Δ5-延长酶的序列。
9.根据权利要求7-9中任一项所述的转基因微藻，其中所述转基因微藻还包含一种或多种编码参与调节LC-PUFA途径的多肽的核酸。
10.根据权利要求9所述的转基因微藻，其中所述核酸编码Δ6-去饱和酶，所述Δ6-去饱和酶包含SEQ ID No.4或6或编码与SEQ ID No.4或6具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％同源性的Δ6-去饱和酶的序列。
11.根据权利要求9所述的转基因微藻，其中所述核酸编码包含SEQID No.8或10的6Δ-去饱和酶，或编码与SEQ ID No.8或10具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％同源性的6Δ-去饱和酶的序列。
12.根据权利要求1-4中任一项所述的转基因微藻，其中ω3-脂肪酸是EPA。
13.根据权利要求12所述的转基因微藻，其中所述微藻表达编码Δ6-去饱和酶的核酸。
14.根据权利要求12所述的转基因微藻，其中所述核酸编码包含SEQID No.4或6的Δ-6去饱和酶，或编码与SEQ ID No.4或6具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％同源性的Δ6-去饱和酶的序列。
15.根据权利要求12所述的转基因微藻，其中所述核酸编码包含SEQID No.8或10的Δ6-去饱和酶，或编码与SEQ ID No.8或10具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同源性的Δ6-去饱和酶的序列。
16.根据权利要求7-15中任一项所述的转基因微藻，其中所述核酸还包含调节序列。
17.根据前述权利要求所述的转基因微藻在制备ω-3 LC-PUFAs或增加一种或多种ω-3 LC-PUFA中的应用。
18.根据权利要求17所述的应用，其中所述ω-3 LC-PUFA是EPA或DHA。
19.根据权利要求17所述的应用，其中所述ω-3 LC-PUFA是DHA。
20.一种用于产生具有增加的ω-3 LC-PUFAs含量的转基因微藻的方法。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述ω-3 LC-PUFA是DHA，并且所述方法包括用编码Δ5-延长酶的核酸转化微藻。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述ω-3 LC-PUFA是EPA，并且所述方法包括用编码Δ6-去饱和酶的核酸转化微藻。
23.一种用于增加微藻中多种ω-3 LC-PUFA中的一种的产生的方法，所述方法包括：
a)在允许多种ω-3 LC-PUFA中的一种的产生的条件下培育根据权利要求1-16任一项中所述的转基因微藻，并且
b)从所述转基因微藻获得所述多种ω-3 LC-PUFA中的一种。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述ω-3 LC-PUFA是DHA，并且所述方法包括：
a)在允许DHA产生的条件下培育根据权利要求5-11或16任一项所述的转基因微藻，并且
b)从所述转基因微藻获得所述DHA。
25.根据权利要求20所述的方法，其中所述ω-3 LC-PUFA是EPA，并且所述方法包括：
a)在允许EPA产生的条件下培育根据权利要求12-16中任一项所述的转基因微藻，并且
b)从所述转基因微藻获得所述EPA。
26.从根据权利要求1-16中任一项所述的微藻分离的油或从根据权利要求1-16中任一项所述的微藻获得的食品、饲料、营养药或化妆品。
27.一种组合物，其包含根据权利要求1-16中任一项所述的转基因微藻或根据权利要求26所述的油。
28.包含根据权利要求1-16中任一项所述的转基因微藻的组合物，其用作药物。
29.包含根据权利要求1-16中任一项所述的转基因微藻的组合物，其用于治疗或预防心血管病症，包括动脉粥样硬化，血栓形成，高血压，心肌梗死和动脉粥样硬化，炎症病症，抑郁症，认知减退，关节炎，湿疹，代谢综合征和II型糖尿病。
30.根据权利要求1-16中任一项所述的转基因微藻或包含根据权利要求1-16中任一项所述的转基因微藻的组合物，其用作食品、饲料、营养药或化妆品。
31.一种用于制备饲料的方法，所述方法包括：
a)在允许产生多种ω-3 LC-PUFA中的一种的条件下培育权利要求1-16中任一项定义的包含异源转基因的转基因微藻，并且
b)从所述转基因微藻获得所述多种ω-3 LC-PUFA中的一种。
32.包含SEQ ID No.7或9的分离的核酸，其编码包含SEQ ID No.8或10的Δ6-去饱和酶(Ost809Δ6)，其功能变体或与SEQ ID No.8或11具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％同源性的Δ6-去饱和酶。
33.包含SEQ ID No.15或17的分离的核酸，其编码包含SEQ ID No.16或18的Δ4-去饱和酶(Ost809Δ4)，其功能变体或与SEQ ID No.16或18具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％同源性的Δ4-去饱和酶。
34.包含SEQ ID No.19的分离的核酸，其编码包含ID No.20的Δ6-延长酶(FωELO6)，其功能变体或与SEQ ID No.20具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％同源性的Δ6-延长酶。
35.包含SEQ ID No.21的分离的核酸，其编码包含ID No.22的Δ5-去饱和酶，其功能变体或与ID No.22具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％同源性的Δ6-延长酶。
36.包含根据权利要求32，33，34和/或35所述的分离的核酸的载体。
37.包含根据权利要求36所述的载体的宿主细胞。
38.根据权利要求37所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是藻类或高等植物细胞。
39.根据权利要求32，33，34和/或34所述的分离的核酸在增加微藻中ω-3 LC-PUFAs的产生、在制备食品、饲料、营养药、化妆品或药物中的应用。
40.根据权利要求39所述的应用，其中所述ω-3 LC-PUFAs是EPA或DHA。
41.一种用于增加微藻中多种ω-3 LC-PUFA中的一种的产生的方法，所述方法包括：
a)在允许多种ω-3 LC-PUFA中的一种的产生的条件下培育包含异源转基因的转基因微藻，所述异源转基因包含权利要求30，31或32中定义的核酸中的一种或多种，并且
b)从所述转基因微藻获得所述多种ω-3 LC-PUPA中的一种。
42.具有增加的DHA水平的转基因生物，其表达异源Δ5-延长酶。
43.根据权利要求42所述的转基因生物，其中所述Δ5-延长酶是来源于青绿藻(Ostreococcus tauri)的Δ5-延长酶。
44.根据权利要求42和43所述的转基因生物，其中在所述生物中不表达其他参与调节LC-PUFAs生物合成途径的异源转基因。
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