CN105008529B - 一个棉花半胱氨酸蛋白酶cysp1‑1及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一个来源于棉花的半胱氨酸蛋白酶cysp1‑1及其编码基因，以及其在培育耐旱性提高的转基因植物中的应用。

Description

一个棉花半胱氨酸蛋白酶cysp1-1及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及半胱氨酸蛋白酶及其编码基因与应用，特别是涉及一个来源于棉花的半胱氨酸蛋白酶cysp1-1及其编码基因，以及其在培育耐旱性提高的转基因植物中的应用。

技术背景

非生物胁迫，如干旱、盐渍、极端温度、化学污染和氧损伤等能够对植物的生长发育造成严重的危害，对作物产量造成极大损失，其中干旱对作物产量的影响，在诸多自然逆境中占首位，其危害相当于其它灾害之和，是许多地区是农业发展的瓶颈。据统计，世界干早、半干旱地区占陆地面积的34％；我国干早、半干旱地区约占国土面积的52％，年受旱面积达200～270万公顷，全国灌溉区每年缺水约300亿立方米，因缺水而少收粮食350～400亿公斤；特别是我国主要产粮区如华北、东北和西北，是我国缺水最严重的地区，春旱频繁达到十年九遇。

由于植物的耐胁迫性大多属于数量性状，现有可利用的种质资源匮乏，采用常规育种技术改良植物胁迫耐性的难度相当大，培育出真正的耐胁迫品种就尤为困难。近年来，随着对植物抗逆分子机理研究的不断深入和分子生物学技术的迅猛发展，抗逆研究已经从生理水平深入到分子水平，促进了植物抗逆基因工程的发展。当植物在受到胁迫时会产生相应的应答反应，来降低或消除给植株带来的危害。植物的这种应答反应是一个涉及多基因、多信号途径、多基因产物的复杂过程。这些基因及其表达产物可以分为3类：(1)参与信号级联放大系统和转录控制的基因及产物；(2)直接对保护生物膜和蛋白质起作用的基因及其表达产物；(3)与水和离子的摄入和转运相关的蛋白质。近年来，通过转基因技术提高植物对胁迫耐受能力的研究，以及对胁迫具有耐受能力的农作物、旱生植物和盐生植物的研究都取得了显著的成果，对胁迫相关基因和信号转导系统也有了更进一步的了解(LiuQ.1998.Two transcription factors，DREB1and DREB2，with an EREBP/AP2DNA bindingdomain，separate two cellular signal transduction pathways in drought and lowtemperature responsive gene expression，respectively，in Arabidopsis.PlantCell，10：1391-1406；KANGJY.2002.Arabidopsis basic leucine zipper proteins thatmediate stress responsive abscisic acid signaling。Plant Cell，14：343-357；ABEH.2003.Arabidopsis AtMYC2(bHLH)and AtMYB2(MYB)function as transcriptionalactivators in abscisic acid signaling.Plant Cell，15：63-78.)。

半胱氨酸蛋白酶作为一类重要的蛋白酶家族，广泛参与植物的各种生理过程。许多研究表明在环境胁迫如低温、干旱和盐胁迫条件下半胱氨酸蛋白酶mRNA会累积，其负责逆境条件下受损或变性蛋白的降解，为新蛋白的合成提供肽段或游离的氨基酸。但就目前的研究状况而言，由于其机制十分复杂，许多植物对逆境下的生物化学和生理学上的响应机制仍有待深入研究。在抗逆应答基因的功能及表达调控方面的研究将对植物抗逆相关的信号传递途径之间的联系以及整个信号传递网络系统的研究提供重要的基础。

发明内容

本发明人利用SSH(抑制差减杂交)与RACE(cDNA末端快速扩增)相结合的方法克隆了棉花的一个半胱氨酸蛋白酶(本文命名为cysp1-1)的编码基因。并发现将其导入受体植物后，可明显改善转基因植株的耐旱性，而且这些性状可稳定遗传。

本发明第一方面提供棉花的一个半胱氨酸蛋白酶cysp1-1的编码基因(本文命名为Ghcysp1-1)，其序列为SEQ ID NO：2。

本发明第二方面提供一种重组表达载体，其含有本发明第一方面所述的基因，其是通过所述基因插入到一种表达载体而获得的，优选地，所述表达载体是pCAMBIA2300；并且所述基因的核苷酸序列与所述重组表达载体的表达控制序列可操作地连接；优选地，所述重组表达载体为附图2所示的rd29A-Ghcysp1-1-2300载体。

本发明第三方面提供一种重组细胞，其含有本发明第一方面所述的基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体；优选地，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。

本发明第四方面提供一种改善植物耐旱性的方法，包括：将本发明第一方面所述的基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达；优选地，所述植物是烟草。

本发明第五方面提供一种制备转基因植物的方法，包括：在有效产生植物的条件下培养含有本发明第一方面所述的基因或本发明第二方面所述的重组表达载体的植物或植物组织；优选地，所述植物是烟草。

本发明第六方面提供本发明第一方面所述的基因、本发明第二方面所述的重组表达载体或者本发明第三方面所述的重组细胞用于改善植物耐旱性以及用于植物育种的用途；优选地，所述植物是烟草。

本发明第七方面提供由本发明第一方面所述基因编码的氨基酸序列，如SEQ IDNO：1所示。

附图说明

图1是Ghcysp1-1的植物表达载体(rd29A-Ghcysp1-1-2300)的构建流程(图1a-1b)。

图2是Ghcysp1-1的植物表达载体(rd29A-Ghcysp1-1-2300)的质粒图。

图3是Ghcysp1-1转基因烟草T₀代植株(图中，T₀A₅；右，T₀A₁₁)和作为对照的非转基因烟草植株(图左，CK)的耐旱模拟实验结果。

图4是利用反转录PCR对T₀代转基因烟草植株和非转基因对照植株中Ghcysp1-1基因的转录水平进行分子水平检测的结果。M为标示物DNA Ladder Marker(DL2000)，1-5为非转基因的对照烟草植株，6-18为耐旱效果显著的转基因烟草T₀代植株，19-24耐旱效果不显著的转基因烟草T₀代植株。

具体实施方式

实施例

下面结合非限制性实施例对本发明进行进一步说明。

下面实施例中提到的限制性内切酶均购自New England Biolabs公司。

实施例1、干旱胁迫下棉花SSH文库构建：

具体方法为：

按照Clontech公司的PCR-select^TM cDNA Subtraction Kit试剂盒说明书所示的方法通过抑制差减杂交方法构建差减文库。在实验过程中以生长过程中干旱处理的棉花幼苗叶子的mRNA作为样本(tester)，以未处理的棉花幼苗叶子的mRNA作为对照(driver)。具体步骤如下：

(1)供试材料：

冀棉14(国家棉花中期库，获取单位中国棉花研究所，统一编号：ZM-30270)播种到灭菌的蛭石上，在25℃、光周期16小时光照/8小时黑暗条件下培养，每周浇1/2MS培养基(9.39mM KNO₃，0.625mM KH₂PO₄，10.3mM NH₄NO₃，0.75mM MgSO₄，1.5mM CaCl₂，50μM KI，100μM H₃BO₃，100μM MnSO₄，30μM ZnSO₄，1μM Na₂MoO₄，0.1μM CoCl₂，100μM Na₂EDTA，100μMFeSO₄)一次。当苗株高达25-30cm时用于实验。

(2)材料处理：

将供试幼苗分为2组，每组4盆，每盆1株。第一组为对照组，在25℃、光照培养，正常用1/2MS浇灌；第二组为干旱处理组，在25℃、光周期16小时光照/8小时黑暗条件下培养，停止浇灌，10天后及时剪取两组幼苗顶端1/3的叶片，用液氮迅速冷冻后，于-70℃冰箱中保存。

(3)总RNA提取：

分别取对照组和干旱处理组的棉花叶子0.5g，用植物RNA提取试剂盒(Invitrogen)提取棉花的总RNA。用HITACHI公司的紫外分光光度计U-2001测定总RNA在260nm和280nm的吸光度值，OD260/OD280比值为1.8-2.0，表明总RNA纯度较高，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，28S条带的亮度约为18S条带的2倍，表明RNA的完整性良好。使用Qiagen公司的Oligotex mRNA纯化试剂盒(从总RNA中纯化polyA+RNA)分离mRNA。

(4)抑制差减杂交：

为了增加获得表达序列标签(Expressed sequence tag，EST)(unigene)的有效性，避免基因无酶切位点及所获得序列在非翻译区。本实验室按照差减试剂盒中记载的方案，由两组mRNA分别以引物Oligo(dT)₁₈(TTTTTTTTTTTTTTTTTT)进行逆转录，并将所得cDNA用RsaI，HaeIII进行消化，做两组抑制差减，其他步骤及方法按Clontech公司的PCR-select^TM cDNA Subtraction Kit试剂盒所示的方法进行抑制差减杂交，最后合并两组正向差减杂交cDNA片段的第二次PCR产物。

(5)cDNA差减文库的构建与初步筛选、克隆及鉴定

将合并的正向差减杂交cDNA片段的第二次PCR产物(QIAquick PCR PurificationKit纯化，购自Qiagen)与pGEM-T Easy(购自Promega试剂盒)载体连接，依照pGEM-T Easy试剂盒产品说明书所示方法，具体步骤如下：用200μl PCR管依次加入下列成分：纯化的正向差减杂交cDNA片段的第二次PCR产物3μl、T4连接酶缓冲液5μl、pGEM-T Easy载体1μl、T4DNA连接酶1μl，于4℃连接过夜。然后取10μL连接反应产物，加入到100μL感受态大肠杆菌JM109(购自TAKARA)中，冰浴30min，热休克60s，冰浴2min，另加250μL LB液体培养基(含有1％胰蛋白胨(Tryptone，购自OXOID)、0.5％酵母提取物(Yeast Extract，购自OXOID)和1％NaCl(购自国药))后置于37℃摇床中，以225r/min振荡培养30min，然后从中取200μL菌液种植于含50μg/mL氨苄青霉素、40μg/mL X-gal、24μg/mL IPTG(X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)购自TAKARA)的LB(同上)固体培养平板上，37℃培育18h。计数培养板中直径＞1mm的清晰白色及蓝色菌落数，随机挑取300个白色菌落(编号：Gh-C001至Gh-C300)。将所挑取的白色菌落接种于96孔细胞培养板(CORNING)中的含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃培养过夜后加甘油至甘油终浓度20％(体积比)，于-80℃保存备用。对所培养的菌落克隆以巢式PCR引物Primer 1和Primer 2R(来自Clontech公司的PCR-selectTM cDNA Subtraction Kit试剂盒)进行菌液PCR扩增验证，得到243个阳性克隆，将所有阳性克隆送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序。

(6)差异克隆的cDNA测序分析：

将DNA测序结果去除载体和不明确序列及冗余的cDNA后，共得到167条表达序列标签(Expressed sequence tag，EST)(unigene)。经BlastN发现其中82条unigene在GenBank中有同源序列(蛋白同源性50％以上)，23条EST功能未知或者为假定蛋白，另有35条未获得同源匹配，推测可能是处于3’、5’末端非翻译区的较短序列。

实施例2棉花半胱氨酸蛋白酶编码基因Ghcysp1-1的克隆

将实施例1获得的有效克隆子之一Gh-C192的测序结果去掉冗余DNA后，序列为SEQID NO：3，序列分析表明该序列的编码的氨基酸序列与已知半胱氨酸蛋白酶序列有较高同源性，本文将克隆子Gh-C192编码的全长基因命名为Ghcysp1-1，对应的蛋白命名为cysp1-1。

SEQ ID NO：3

Ghcysp1-1全长基因的克隆

已经获得的Ghcysp1-1基因片段(SEQ ID NO：3)，已经有终止密码子TGA，只需要做5’RACE。

根据已经获得的Ghcysp1-1基因片段(SEQ ID NO：3)，设计三条特异性引物，作为反转录引物及5’RACE的3’端特异性引物。

Ghcysp1-1GSP1：SEQ ID NO：4：

GTGGCGATTTTATTTATG

Ghcysp1-1GSP2：SEQ ID NO：5：

GAGTAACGGCTCCATGATC

Ghcysp1-1GSP3：SEQ ID NO：6：

GACGTTTAGGGTCACTCTTTG

实验步骤按试剂盒说明书操作(5’RACE System for Rapid Amplification ofcDNA Ends试剂盒购自Invitrogen公司)。

用SEQ ID NO：5与5’通用引物AAP(试剂盒自带)，以干旱处理组棉花叶子提取的mRNA反转录的cDNA(反转录引物SEQ ID NO：4)为模板进行第一轮PCR扩增，具体步骤如下：Ex Taq购自TAKARA，50μl PCR反应体系：5μl 10×Ex Buffer，3μl 2.5mM的dNTP，2.0μlmRNA反转录的cDNA，1.0μl Ex Taq，10μM的引物SEQ ID NO：5和AAP各2.0μl，以及35μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，33个循环后，72℃延伸10min。所得的PCR产物用双蒸水稀释50倍后取2.0μl作为模板，用SEQ ID NO：6与3’端引物AUAP进行第二轮PCR扩增，具体步骤如下：50μl PCR反应体系：5μl 10×ExBuffer，3μl 2.5mM的dNTP，2.0μl稀释的第一轮PCR产物，1.0μl Ex Taq，10μM的引物SEQ IDNO：6和AUAP各2.0μl，以及35μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，33个循环后，72℃延伸10min。第二次PCR产物回收片段约为600bp条带(Gel Extraction Kit购自OMEGA)连接于pGEM-T Easy载体，转化到JM109(具体方法同上)，随机挑取10个白色菌落于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，37℃培养过夜后加甘油至甘油终浓度为20％(体积比)，-80℃保存备用。用SEQ ID NO：6与3’端引物AUAP进行菌液PCR扩增(反应体系及反应条件同上)，得到3个阳性克隆，送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，获得该基因的cDNA的5’端。

所得的5’RACE产物克隆测序后，与克隆子Gh-C192测序结果拼接，获得

SEQ ID NO：17：

根据SEQ ID NO：17序列设计一对引物如下：

Ghcysp1-1F：SEQ ID NO：7：

ATGGCAACCACAGTAACAC

Ghcysp1-1R：SEQ ID NO：8：

TCAGGCACTGCTAATTTTC

通过SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8来克隆Ghcysp1-1全长。

采用TaKaRa的PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以干旱处理组棉花叶子提取的mRNA反转录的cDNA为模板进行PCR反应。50μl PCR反应体系：10μl 5×PS Buffer，3μl 2.5mM的dNTP，2.0μl cDNA，1.0μl PrimeSTAR，10μM的引物SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8各2.0μl，以及30μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，33个循环后，72℃延伸10min。

PCR扩增产物加A尾：PCR产物加2.5倍体积的无水乙醇，-20℃放置10分钟，离心，去上清，晾干，用21μl双蒸水溶解，加入2.5μl 10×Ex Buffer，0.5μl 5mM的dATP，2.5μl 10×Ex Taq。反应条件：70℃反应30分钟。将得到约1100bp的DNA片段回收(Omega回收试剂盒)，连接至pGEM T-easy载体上，转化JM109(方法同上)，随机挑取10个白色菌落于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，37℃培养过夜后加甘油至甘油终浓度20％(体积比)，-80℃保存备用。用SEQ ID NO：7与SEQ ID NO：8进行菌液PCR扩增(反应体系及反应条件同上)，得到4个阳性克隆，送至英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，序列为SEQ ID NO：2。根据该核苷酸序列，可知该基因编码的PP2Ac-2蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

cysp1-1蛋白的氨基酸序列：SEQ ID NO：1

Ghcysp1-1基因的核苷酸序列：SEQ ID NO：2

实施例3Ghcysp1-1基因的植物表达载体构建

选择植物双元表达载体pCAMBIA2300(购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)作为植物表达载体，用Pnos启动子替换NPTII基因含双增强子的35S启动子，以降低NPTII蛋白在植物中的表达。选择诱导型启动子rd29A及终止子Tnos作为Ghcysp1-1基因的启动子和终止子。

用引物SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10，以植物表达载体pBI121(购自北京华夏远洋科技有限公司)为模板扩增Pnos，采用TaKaRa的PrimeSTAR HS DNA聚合酶。50μl PCR反应体系：10μl 5×PS Buffer，3μl 2.5mM的dNTP，1.0μl pBI121，1.0μl PrimeSTAR，10μM的引物SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10各2.0μl，以及31μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，33个循环后，72℃延伸10min。通过EcoRI、BglII酶切将所得的PCR产物按试剂盒说明(Promega，T4连接酶试剂盒)连接到pCAMBIA2300获得pCAMBIA2300-1。

SEQ ID NO：9：

GCACGAATTCATACAAATGGACGAACGGAT

SEQ ID NO：10：

ATCCAGATCTAGATCCGGTGCAGATTATTTG

SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12核苷酸片段为引物，以pBI121为模板扩增Tnos，采用TaKaRa的PrimeSTAR HS DNA聚合酶。50μl PCR反应体系：10μl5×PS Bufier，3μl 2.5mM的dNTP，1.0μl pBI121，1.0μl PrimeSTAR，10μM的引物SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12各2.0μl，以及31μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，33个循环后，72℃延伸10min。通过SacI、EcoRI酶切将所得的PCR产物按试剂盒说明(Promega，T4连接酶试剂盒)连接到pCAMBIA2300-1获得pCAMBIA2300-2。

SEQ ID NO：11：

AAGGAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAAA

SEQ ID NO：12：

TCAGAATTCCCAGTGAATTCCCGATCTAGTA

以SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14为引物，以拟南芥(哥伦比亚型，购自美国俄亥俄州立大学的拟南芥生物资源中心(www.arabidopsis.org))DNA为模板扩增拟南芥rd29A启动子(参考Zeng J.，et L.2002，Preparation of total DNA from“recalcit rant planttaxa”，Acta Bot.Sin.，44(6)：694-697中的方法提取拟南芥DNA)。采用TaKaRa的PrimeSTARHS DNA聚合酶。50μl PCR反应体系：10μl5×PS Bufier，3μl 2.5mM的dNTP，1.0μl拟南芥DNA，1.0μl PrimeSTAR，10μM的引物SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14各2.0μl，以及31μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，33个循环后，72℃延伸10min。通过HindIII、PstI酶切连接到(连接方法同上)pCAMBIA2300-2获得pCAMBIA2300-3。

SEQ ID NO：13：

ACTAAGCTTCCTTCTTGACATCATTCAATTTTA

SEQ ID NO：14：

TGACTGCAGTCCAAAGATTTTTTTCTTTCCAATAG

SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16扩增Ghcysp1-1(模板是实施例2所获得Ghcysp1-1)，采用TaKaRa的PrimeSTAR HS DNA聚合酶。50μl PCR反应体系：10μl 5×PS Buffer，3μl2.5mM的dNTP，1.0μl Ghcysp1-1-pGEM，1.0μl PrimeSTAR，10μM的引物SEQ ID NO：15和SEQID NO：16各2.0μl，以及31μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，33个循环后，72℃延伸10min。通过PstI、SacI酶切连接到(连接方法同上)pCAMBIA2300-3，获得植物表达载体rd29A-Ghcysp1-1-2300。

SEQ ID NO：15：

TGACTGCAGATGGCAACCACAGTAACAC

SEQ ID NO：16：

AAGGAGCTCTCAGGCACTGCTAATTTTC

实施例4rd29A-Ghcysp1-1-2300表达载体转化农杆菌

农杆菌LBA4404(购自Biovector Science Lab，Inc)感受态制备：提前1-2天将农杆菌LBA4404在含50μg/ml利福平和50μg/ml链霉素的LB固体培养基上划单斑接种，28℃培养1至2天。挑取单菌落接种于5ml含50μg/ml利福平和50μg/ml链霉素的LB液体培养基中，28℃下摇动培养过夜(约12-16小时)至OD600值为0.4，形成种子菌液。取5ml培养活化后的菌液(1：20的比例)接种于100ml含50μg/ml利福平和50μg/ml链霉素的LB液体培养基中，28℃摇动培养2-2.5小时至OD600＝0.8。冰浴菌液10min，每隔3min摇匀一次，令细菌均匀进入休眠状态。于4℃下4000g离心10min，弃上清液；加入一定量预冷10％甘油(体积比)重悬浮菌体，4℃下4000g离心10min，收集沉淀；用10％甘油(体积比)重复洗3-4次；加入适量冰预冷的10％甘油(体积比)重新悬浮细菌沉淀，即制得LBA4404感受态细胞，以40μl/管将其分装，于-70℃保存备用。

转化农杆菌：在冰上融化感受态细胞，向40μl的感受态细胞中加入1μl实施例3获得的rd29A-Ghcysp1-1-2300质粒，混匀后冰浴约10min。将感受态和DNA的混合物用微量移液器转移到预冷的电击杯中，轻敲使悬浮液到达底部，注意不要有气泡。将电击杯(购自bio-rad)放到电击室的滑道上，推动滑道将电击杯放至电击室基座电极处。使用0.1cm的电击杯的时候，MicroPulser(购自bio-rad)的程序设置为“Agr”，电击一次。立即取出电击杯，加入28℃预热的LB培养基。快速而轻柔的用微量移液器将感受态细胞打匀。将悬浮液转入1.5ml的离心管，在28℃，以225rpm培养1小时。取100～200μl的菌液涂布于相应的抗性筛选培养基平板上(LB固体培养基，含50μg/ml利福平、50μg/ml链霉素、50μg/ml卡那霉素)，28℃培养。

实施例5利用农杆菌介导的叶盘转化法获得转基因烟草

用75％酒精浸泡烟草种子(国家烟草中期库，获取单位：中国农科院烟草所，库编号I5A00660)30s，用灭菌双蒸水洗两次。再用0.1％升汞浸泡8min，用灭菌双蒸水洗两次，完成表面灭菌。将表面灭菌的烟草种子置于MS(18.78mM KNO₃，1.25mM KH₂PO₄，20.6mM NH₄NO₃，1.5mM MgSO₄，3.0mM CaCl₂，50μM KI，100μM H₃BO₃，100μM MnSO₄，30μM ZnSO₄，1μM Na₂MoO₄，0.1μM CoCl₂，100μM Na₂EDTA，100μM FeSO₄，7.4g/L琼脂，蔗糖30g/L)上于无菌条件下发芽，制备无菌苗。取无菌苗叶片剪成5mm×5mm大小的叶盘，用处于对数生长期的含表达载体rd29A-Ghcysp1-1-2300的农杆菌浸染叶盘10min，吸干菌液，在黑暗条件下共培养2天(MS培养基)。将叶片转到分化培养基(MS+1mg/L细胞分裂素(BA)+0.1mg/L萘乙酸(NAA)+50mg/L卡那霉素+500mg/L头孢霉素)上，光照条件(6小时光照/8小时黑暗(光强3000-4000Lx))下培养45天左右，待芽长大后切下转移到生根培养基(MS+50mg/L卡那霉素+500mg/L头孢霉素)中培养30天左右，待根系发达后将小苗转入仅加有500mg/L头孢霉素的MS培养基上进行编号保存。

取获得的转基因烟草叶片，提取DNA(同实施例3中拟南芥DNA提取方法)，用SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：8(50μl PCR反应体系：5μl 10×Ex Buffer，3μl 2.5mM的dNTP，2.0μlDNA，1.0μl Ex Taq，10μM的引物SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10各2.0μl，以及35μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，33个循环后，72℃延伸10min)，PCR鉴定，保存阳性植株进行编号T₀A₁-T₀A₂₀。

实施例6过表达Ghcysp1-1转基因烟草T₀的耐旱模拟实验及功能鉴定

将灭过菌的蛭石用1/2MS培养基浸透。T₀A1-T₀A20及对照烟草组培苗分别移栽至蛭石上。25℃、10小时光培养/14小时暗培养循环，每5天浇一次1/2MS，壮苗培养15天之后，进行干旱胁迫实验，转基因烟草、对照烟草干旱14天(不浇水)，25℃、10小时光培养/14小时暗培养循环。T₀代转基因植株的抗旱性鉴定表明，对照植株都萎蔫严重，而T₀A₅、T₀A₆、T₀A₁₀、T₀A₁₁、T₀A₁₄、T₀A₁₅、T₀A₂₀七个株系共30棵烟草中有21棵能够正常生长，显现出显著的耐旱性(参见图3，以T₀A₅、T₀A₁₁为例，T₀A₆、T₀A₁₀、T₀A₁₄、T₀A₁₅、T₀A₂₀的结果与T₀A₅、T₀A₁₁类似，在此未示出)。

实施例7在转录水平上验证Ghcysp1-1基因表达

分别取对照烟草、耐旱不显著转基因烟草T₀代植株、耐旱显著转基因烟草T₀代植株(生长状况良好)干旱14天的叶子0.05g，用植物RNA提取试剂盒(Invitrogen)提取总RNA。用HITACHI公司的紫外分光光度计U-2001测定总RNA在260nm和280nm的吸光度值，计算各个RNA浓度。依照Invitrogen反转录试剂盒SuperScript III Reverse Transcriptase所示方法进行反转录(2μg总RNA作为模板，反转录引物SEQ ID NO：8)。通过SEQ ID NO：7和SEQ IDNO：8扩增Ghcysp1-1，检测cysp1-1蛋白相对表达情况。采用TaKaRa的PrimeSTARHS DNA聚合酶，以反转录的cDNA为模板进行PCR反应。50μl PCR反应体系：10μl 5×PS Buffer，3μl2.5mM的dNTP，2.0μl cDNA，1.0μl PrimeSTAR，10μM的引物SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8各2.0μl，以及30μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，29个循环后，72℃延伸10min。产物电泳结果如图4所示：M为DNA LadderMarker(DL2000，购自深圳瑞真生物技术有限公司)，1-5为对照烟草，6-18为耐旱显著转基因烟草T₀代植株，19-24为耐旱不显著转基因烟草T₀代植株。图中所示条带大小与Ghcysp1-1的大小一致(约1.1Kbp)。结果表明对照烟草中没有Ghcysp1-1的mRNA，耐旱显著转基因烟草T₀代植株中外源基因Ghcysp1-1的转录较强，耐旱不显著转基因烟草T₀代植株中Ghcysp1-1的转录很弱或没有转录。

Claims (12)

1.棉花的一个半胱氨酸蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.编码权利要求1所述半胱氨酸蛋白酶的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

3.一种重组表达载体，其是通过将权利要求2所述的基因插入到一种表达载体而获得的，并且所述基因的核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接。

4.权利要求3所述的重组表达载体，所述表达载体是pCAMBIA2300。

5.权利要求4所述的重组表达载体，所述重组表达载体为附图2所示的rd29A-Ghcyspl-l-2300载体。

6.一种重组细胞，其含有权利要求2所述的基因或者权利要求3或4所述的重组表达载体，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。

7.一种改善植物耐旱性的方法，包括：将权利要求2所述的基因或者权利要求3-5任一项所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达。

8.权利要求7所述的方法，所述植物是烟草。

9.一种制备转基因植物的方法，包括：在有效产生植物的条件下培养含有权利要求2所述的基因或者权利要求3-5任一项所述的重组表达载体的植物或植物组织。

10.权利要求9所述的方法，其中所述植物是烟草。

11.权利要求2所述的基因、权利要求3-5任一项所述的重组表达载体或者权利要求6所述的重组细胞用于改善植物耐旱性以及用于植物育种的用途。

12.权利要求11所述的用途，其中所述植物是烟草。