CN104994870A - 用于诊断和治疗钩端螺旋体病的方法和蛋白质抗原组合物 - Google Patents

Abstract

使用基于来自钩端螺旋体属基因组的ORF表达的蛋白质组阵列鉴别出与钩端螺旋体病相关的新颖的免疫显性抗原性蛋白质和肽。公开了所述抗原性蛋白质和肽在钩端螺旋体病感染的诊断和分期中的组合物、方法和用途以及所述抗原性蛋白质和肽在预防性和治疗性疫苗中的组合物、方法和用途。

Description

用于诊断和治疗钩端螺旋体病的方法和蛋白质抗原组合物

本申请要求于2012年12月12日提交的临时申请号61/736391的优先权。这些和所有其它引用的外来材料的全部内容均以引用方式并入本文中。当以引用方式并入的参考文献中的术语的定义或使用与本文提供的术语的定义不一致或相反时，以本文提供的该术语的定义为准。

技术领域

本发明的领域是用于诊断和治疗各种病症和疾病、特别是钩端螺旋体病的组合物和方法。

背景技术

钩端螺旋体病是由感染钩端螺旋体属(Leptospira)细菌而引起的广泛的重大疾病。所述疾病由于人与受感染的家养动物或野生动物接触或通过与它们的尿液接触而传播给人。众多种动物物种可充当所述细菌的储库。因此，人钩端螺旋体病经常被认为是最广泛的动物传染性疾病。传统处于患钩端螺旋体病的高风险的群体包括农夫、兽医、军事人员、矿工和处理污水的个体。然而，也已经观察到不同的传播模式。已经将钩端螺旋体病的爆发与例如强调户外活动的生态旅游和体育赛事的娱乐活动关联。

患有钩端螺旋体病的个体在所述疾病的早期阶段显示众多种相对非特异性的临床症状，包括发热、头痛、发冷和严重的肌肉疼痛，使得基于临床发现的早期诊断变得困难。遗憾的是，5-15％的感染导致严重的多系统并发症，包括黄疸、肾衰竭和出血。严重的钩端螺旋体病具有5-40％的死亡率。与严重贫困相关的状况已导致钩端螺旋体病在巴西和其它国家市区的流行，且具有高死亡率。

不仅对于评估疾病的全球负担，而且对于提供早期诊断来说，缺乏快速且可靠的现场护理(point-of-care)诊断测试都是主要障碍。当前的诊断测试主要依赖于结合钩端螺旋体脂多糖(LPS)的抗体的检测并且对于抗生素疗法最有效的早期疾病是不灵敏的。

特别是在疾病的早期可治疗时期，钩端螺旋体病的诊断是困难的。目前，存在钩端螺旋体属的最直接证明是通过分离和培养或PCR。遗憾的是，细菌学分离是昂贵的过程，需要训练有素的技术人员和专门的设施。在钩端螺旋体病的情况下，钩端螺旋体属的敏感特性使这进一步复杂化，其需要使用非常新鲜的样品。另外，所述生物体在培养中生长相对缓慢，得出结果需要数周。因此，PCR被证明是用于在样品中鉴别钩端螺旋体属的更有用工具。然而，PCR方法仍然需要专门的设备和高技术水平来恰当地进行，并且尽管是灵敏的，但可能不足以定量评估钩端螺旋体属感染的时期。

钩端螺旋体病还可以使用表征个体对所述生物体的免疫反应的血清学方法来诊断。目前用于钩端螺旋体病的血清学诊断的参考方法是微量凝集测试(MAT)，其中对患者血清凝集培养的钩端螺旋体属的能力进行表征。遗憾的是，这种方法受限于需要培养用于测定的钩端螺旋体属和所述生物体的异质性。

已进行尝试来鉴别和产生特定的钩端螺旋体属蛋白质或肽，其可用于诊断钩端螺旋体病的传统免疫测定(例如酶免疫测定或侧向流测试)。例如，在欧洲专利号2205625B1(授予Chang)和美国专利申请号2012/0100143(授予Chang)中，公开了许多用于诊断和预防钩端螺旋体病的钩端螺旋体属外膜蛋白(即LP 1454、LP 1118、LP 1939、MCEII、CADF-likel、CADF-like2、CADF-like3、Lp0022、Lpl499、Lp4337、Lp328、L21)和表面蛋白(即LigA和LigB)。类似地，美国专利号7,531,177(授予Nascimento等人)描述了使用表面相关蛋白质LpL53、OMPL55、OMPL16、OMPL31、OMPL15、OMPL20、LpL23、LpL22、OMPL17、OMPL30、OMPL27、OMPL21、OMPL22、MPL17、MPL21、OMPAL21、OMPL63、OMPL14、MPL36、MPL39、MPL40和MPL21作为用作免疫接种物质以及用于钩端螺旋体属的免疫学测定的抗原。然而，以所述方法预选潜在抗原将它们限定为钩端螺旋体属表面蛋白质，所述蛋白质虽然可被个体的免疫系统获取，但可能不包括可用的靶标。

其它研究人员已使用各种方法从更多种类的蛋白质鉴别潜在的钩端螺旋体属抗原。例如，美国专利号7,635,480(授予Andre-Fontaine等人)公开了使用通过用来自钩端螺旋体属的致病菌株的全细胞进行免疫而产生的血清标记来自致病菌株和非致病菌株的蛋白质；随后在由此标记的蛋白质之间进行区别使得鉴别出可用于预防和鉴别钩端螺旋体病的肽。在美国专利号8,445,658(授予Ko等人)中描述的另一种方法中，研发出钩端螺旋体属基因组的噬菌体文库并且使用来自康复的钩端螺旋体病患者的免疫血清来选择具有已诱发免疫反应的蛋白质的克隆。鉴别了数种先前未鉴别出的蛋白质抗原(即BigL1、BigL2和BigL3)，以及许多先前已知的钩端螺旋体属抗原。虽然所述方法减少了通过特定类别的蛋白的预选所引入的偏差，但它们仅仅鉴别了已诱发抗体的蛋白质和/或蛋白质片段。然而，所述方法未能特异性地鉴别和提供可用于诊断性和预防性目的、产生特别强的和/或广泛的抗体反应的钩端螺旋体属抗原。

本文所标识的所有出版物均在此以引用方式并入，其并入程度如同具体地且单独地指示将每一单独的出版物或专利申请以引用方式并入一般。当所并入的参考文献中的术语的定义或使用与本文提供的该术语的定义不一致或相反时，适用本文提供的该术语的定义，而不适用参考文献中的该术语的定义。

因此，仍然需要可用于通过免疫学方法诊断钩端螺旋体病和/或可用于生产预防性和治疗性疫苗的免疫显性钩端螺旋体属抗原。

发明内容

本发明主题提供用于诊断、预防和治疗钩端螺旋体病的设备、系统和方法。在一个方面，包含问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)的天然和重组多肽的组合物可用于患者诊断。在另一方面，包含问号钩端螺旋体的天然和/或重组多肽的组合物可用作预防性和/或治疗性疫苗。还涵盖用于选择抗原的富集分析方法、用于鉴别血清学诊断抗原或疫苗抗原的方法以及用于产生诊断测定的方法，所述诊断测定用于针对所述蛋白质的抗体。

本发明主题的一个实施方案是包含两种或更多种与载体缔合的抗体反应性抗原的抗原组合物。所述抗原与从来自暴露于钩端螺旋体病或以其它方式感染钩端螺旋体病的群体的血清获得的抗体具有已知的、定量的和/或以其它方式表征的反应性(例如相互作用强度)。在一些所述实施方案中，此类抗原的已知抗体反应性平均处于由钩端螺旋体病患者产生的抗体的结合亲和力的较高三分位组(upper tertile)中。类似地，在本发明构思的其它此类实施方案中，钩端螺旋体病患者中产生的并且针对一种或多种此类抗原的抗体的平均数量处于所述较高三分位组中。类似地，在其它此类实施方案中，反应性以钩端螺旋体病感染的活性状态为特征。至少两种所述抗原具有已知的与疾病参数的关联，所述疾病参数例如先前或目前对钩端螺旋体病的暴露、急性钩端螺旋体病感染、潜伏性钩端螺旋体病感染、复发性钩端螺旋体病感染、钩端螺旋体病病原携带状态(carrier state)和对钩端螺旋体病感染的至少部分免疫性。合适的抗原包括LIC11352、LIC12544、LIC12631、LIC10464-s1、LIC11335、LIC20301、LIC10486、LIC10191、LIC11389、LIC11437、LIC20087、LIC10623、LIC10998、LIC10215、LIC11271、LIC10491-s1、LIC13050、LIC11210、LIC10524、LIC11456、LIC12476、LIC11570、LIC13244、LIC13238、LIC11885、LIC11008、LIC13242、LIC11336、LIC20250、LIC10525、LIC10464-s2.1、LIC20118、CopLigAU(独特的):重复A7’-13、CopLigBU(独特的):重复B7’-12和CopLigB:重复1-16、nt154-173(核苷酸154-173)或其片段。此类抗原或其片段可作为纯化的或至少部分纯化的蛋白质或肽(例如具有大于60％的纯度)提供。所述组合物的至少两种所述抗原可存在于至少40％的暴露于钩端螺旋体病的群体中。在本发明构思的一些实施方案，抗原组合物的载体是例如用于疫苗(例如，治疗性疫苗)制剂中药物载体。在替代实施方案中，载体是至少两种所述抗原在其上可彼此区别的不溶性载体。此类不溶性载体可用于诊断测定，并且包括固体载体和可悬浮粒子，在所述固体载体中，抗原被布置在单独的且可区别的位置(例如，在阵列中)处，在所述可悬浮粒子中，抗原被布置在不同的且可区别的粒子群上。

本发明主题的另一实施方案是用于诊断哺乳动物中的钩端螺旋体病的抗原组合物，其包括两种或更多种与载体缔合的抗体反应性抗原。所述抗原与从来自暴露于钩端螺旋体病或以其它方式感染钩端螺旋体病的群体的血清获得的抗体具有已知的、定量的和/或以其它方式表征的反应性(例如相互作用强度)。在一些所述实施方案中，此类抗原的已知抗体反应性平均处于由钩端螺旋体病患者产生的抗体的结合亲和力的较高三分位组中。类似地，在本发明构思的其它此类实施方案中，钩端螺旋体病患者中产生的并且针对一种或多种此类抗原的抗体的平均数量处于较高三分位组中。类似地，在其它此类实施方案中，反应性以钩端螺旋体病感染的活性状态为特征。至少两种所述抗原具有已知的与疾病参数的关联，所述疾病参数例如先前或目前对钩端螺旋体病的暴露、急性钩端螺旋体病感染、潜伏性钩端螺旋体病感染、复发性钩端螺旋体病感染、钩端螺旋体病病原携带状态和对钩端螺旋体病感染的至少部分免疫性。合适的抗原包括LIC11352、LIC12544、LIC12631、LIC10464-s1、LIC11335、LIC20301、LIC10486、LIC10191、LIC11389、LIC11437、LIC20087、LIC10623、LIC10998、LIC10215、LIC11271、LIC10491-s1、LIC13050、LIC11210、LIC10524、LIC11456、LIC12476、LIC11570、LIC13244、LIC13238、LIC11885、LIC11008、LIC13242、LIC11336、LIC20250、LIC10525、LIC10464-s2.1、LIC20118、CopLigAU(独特的):重复A7’-13、CopLigBU(独特的):重复B7’-12和CopLigB:重复1-16,nt154-173或其片段。此类抗原或其片段可作为纯化的或至少部分纯化的蛋白质或肽(例如具有大于60％的纯度)提供。所述组合物的至少两种所述抗原可存在于至少40％的暴露于钩端螺旋体病的群体中。在一些实施方案中，载体是至少两种所述抗原在其上可彼此区别的不溶性载体。所述不溶性载体可用于诊断测定，并且包括固体载体和可悬浮粒子，在所述固体载体中，抗原被布置在单独的且可区别的位置(例如，在阵列中)处，在所述可悬浮粒子中，抗原被布置在不同的且可区别的粒子群上。可选择地，在一些实施方案中，载体包括分布于基质(例如，多孔膜或纤维片)上的可悬浮粒子，其中所述基质包括孔、间隙空间或允许流体流过所述基质的其它开孔。

本发明主题的又一实施方案是用作哺乳动物中的钩端螺旋体病疫苗的抗原组合物，其中所述抗原组合物包括两种或更多种与载体缔合的抗体反应性抗原。所述抗原与从来自暴露于钩端螺旋体病或以其它方式感染钩端螺旋体病的群体的血清获得的抗体具有已知的、定量的和/或以其它方式表征的反应性(例如相互作用强度)。在一些此类实施方案中，此类抗原的已知抗体反应性平均处于由钩端螺旋体病患者产生的抗体的结合亲和力的较高三分位组中。类似地，在本发明构思的其它此类实施方案中，钩端螺旋体病患者中产生的并且针对一种或多种此类抗原的抗体的平均数量处于较高三分位组中。类似地，在其它此类实施方案中，反应性以钩端螺旋体病感染的活性状态为特征。至少两种所述抗原具有已知的与疾病参数的关联，所述疾病参数例如先前或目前对钩端螺旋体病的暴露、急性钩端螺旋体病感染、潜伏性钩端螺旋体病感染、复发性钩端螺旋体病感染、钩端螺旋体病病原携带状态和对钩端螺旋体病感染的至少部分免疫性。合适的抗原包括LIC11352、LIC12544、LIC12631、LIC10464-s1、LIC11335、LIC20301、LIC10486、LIC10191、LIC11389、LIC11437、LIC20087、LIC10623、LIC10998、LIC10215、LIC11271、LIC10491-s1、LIC13050、LIC11210、LIC10524、LIC11456、LIC12476、LIC11570、LIC13244、LIC13238、LIC11885、LIC11008、LIC13242、LIC11336、LIC20250、LIC10525、LIC10464-s2.1、LIC20118、CopLigAU(独特的):重复A7’-13、CopLigBU(独特的):重复B7’-12和CopLigB:重复1-16,nt154-173或其片段。此类抗原或其片段可作为纯化的或至少部分纯化的蛋白质或肽(例如具有大于60％的纯度)提供。所述组合物的至少两种所述抗原可存在于至少40％的暴露于钩端螺旋体病的群体中。在本发明构思的一些实施方案，抗原组合物的载体是例如用于疫苗(例如，治疗性疫苗)制剂中药物载体。所述组合物可另外包括佐剂。

根据本发明优选实施方案的以下详细描述以及附图，本发明主题的各种目的、特征、方面和优点将变得更加显而易见，附图中相同的标记代表相同的组件。

附图说明

图1示意性地描绘了用于产生用于鉴别免疫显性钩端螺旋体属抗原的蛋白质组阵列的方法。

图2是典型蛋白质组微阵列的显微照片，所述蛋白质组微阵列使用针对存在于微阵列的所有位点处的肽标记物的抗体来询问。

图3是来自一系列钩端螺旋体属蛋白质组阵列的所观察到的信号强度的热图，所述蛋白质组阵列由来自健康对照个体、患有急性钩端螺旋体病个体和患有恢复期钩端螺旋体病的个体的血清来询问，该热图图解说明了对许多蛋白质和肽抗原的差异反应。

图4A和图4B显示了来自健康个体和急性期钩端螺旋体病患者的血清(图4A)和来自健康个体和恢复期钩端螺旋体病患者的血清(图4B)的差异反应性抗原和交叉反应性抗原的信号强度和BHp值。

图5A和图5B显示了来自用来自不同对照组中个体的血清对一系列钩端螺旋体属蛋白质组阵列询问的结果。图5A显示了来自不同个体的信号强度的热图。图5B显示了不同对照组随所表征的抗原数增加的累积信号强度。

图6A和图6B显示了各种免疫显性抗原的ROC曲线。图6A显示了许多个别抗原的ROC曲线。图6B显示了抗原组合的ROC曲线。

图7是用于确认钩端螺旋体属蛋白质组阵列结果的一系列免疫印迹的照片。

具体实施方式

本发明主题提供用于诊断、预防和治疗钩端螺旋体病的设备、系统和方法。利用微阵列方法来展示问号钩端螺旋体的蛋白质组的全部或部分，以允许用来自处于钩端螺旋体病不同阶段中的受感染群体的血清以及用来自未受感染个体的对照血清询问生物体的潜在抗原。这允许同时鉴别诱发对疾病的阶段或时期特有的免疫反应的特定抗原和表征所述反应的程度(例如，通过比较信号强度与适当对照的信号强度)。对代表不同时期的钩端螺旋体病的群体内的特征性抗原的鉴别允许鉴别可用于疾病的诊断和分期的蛋白质抗原。对免疫反应程度的表征允许选择诱发高亲和力(affinity)、高亲合力(avidity)和/或高表达的抗体的抗原(即免疫显性抗原)，所述抗原特别可用于钩端螺旋体病的高灵敏度测定以及用于预防或治疗所述疾病的疫苗。在一个方面，包含问号钩端螺旋体的天然和重组多肽的组合物可用于患者诊断。在另一方面，包含问号钩端螺旋体的天然和/或重组多肽的组合物可用作预防性和/或治疗性疫苗。还涵盖用于选择抗原的富集分析方法、用于鉴别血清学诊断抗原或疫苗抗原的方法以及用于产生用于针对所述蛋白质的抗体的诊断测定的方法。

在对钩端螺旋体病的人免疫反应进行表征的其它尝试中，发明人已发现蛋白质抗原研究并非被随机选择用于被免疫系统识别。以蛋白质组规模对成千上万的潜在抗原的抗体反应对进行表征允许对与抗原性相关的分子特征进行精确地分类。另外，此类阵列方法允许对来自同一组表征样品的不同抗体类别和亚类(例如：IgG、IgM、IgA、IgE、IgD)的反应进行快速且方便的表征，并且可用于直接比较来自不同钩端螺旋体种和血清变型以及来自不同哺乳动物宿主的结果。应当了解，蛋白质组微阵列的使用有利地允许鉴别未在现有技术方法中鉴别的可用的问号钩端螺旋体抗原，所述现有技术限制潜在抗原的范围。因此，可鉴别例如通过集中于表面蛋白质的方法未鉴别的潜在可用的抗原。另外，对免疫显性抗原的鉴别允许利用不是仅仅诱发抗体反应、而是诱发强烈且剧烈的抗体反应的问号钩端螺旋体抗原，所述强烈且剧烈的抗体反应特别可用于钩端螺旋体病的血清学检测以及在暴露于问号钩端螺旋体的个体中诱导保护性或治疗性免疫反应的疫苗。

本文所标识的所有出版物均在此以引用方式并入,其并入程度如同具体地且单独地指示将每一单独的出版物或专利申请以引用方式并入一般。当所并入的参考文献中的术语的定义或使用与本文提供的该术语的定义不一致或相反时，适用本文提供的该术语的定义，而不适用参考文献中的该术语的定义。

除非上下文另有明确规定，否则如本文的说明书中和所附权利要求书通篇所用的，“a/an(一)”和“所述/该”的含义包括复数指代。此外，除非上下文另有明确规定，否则如本文的说明书中所用的，“在……中”的含义包括“在……中”和“在……上”。

本文叙述的值的范围仅仅旨在作为个别地表示落在此范围内的每一单独值的简化方法。除非本文另外指明，否则一个范围的各个别值都被并入本说明书中，就如同其在本文中被个别地叙述一样。除非本文另有指明或上下文明显矛盾，否则，本文所描述的所有方法都可按任何合适的顺序进行。除非另外要求，否则，使用本文关于某些实施方案所提供的任何和所有示例或例示性用语(例如，“例如”)仅仅旨在用于更好地阐明本发明，而并不对另外要求保护的本发明范围构成限制。本说明书中的任何用语都不应当解释为表明任何非要求保护的要素对于实施本发明是必不可少的。

本文所公开的本发明的替代要素或实施方案的分组不应被解释为限制。每组成员均可个别地或以与所述组的其它成员或本文所发现的其它要素的任何组合被提及并要求保护。一组的一个或多个成员可出于方便性和/或可专利性的原因被包含于一组之中或从一组之中删除。当进行任何这样的包含或删除时，说明书在本文中被视为含有这样修改的组，由此满足所附权利要求书中所用的所有马库什组(Markush group)的书面描述。

如上文所述的，在本发明主题的一些实施方案中，蛋白质组微阵列可用于鉴别与钩端螺旋体病相关的免疫显性抗原。可使用任何合适的微阵列形式，包括平面微阵列、流体微阵列或悬浮微阵列和微孔板。平面微阵列的一般使用方法图解说明于图1中。示例性方法的细节提供于下面的实施例中。如图1中所示，可从钩端螺旋体属种110(在此情况下，问号钩端螺旋体Copenhageni血清变型Fiocruz L1-130株)获得基因组DNA，使用PCR120扩增开放阅读框(ORF)。在一些实施方案中，将所有ORF扩增，而在其它实施方案中，可选择PCR引物来扩增可用ORF亚组。例如，来自例如美国国立生物技术信息中心(the National Center for BiotechnologyInformation)(NCBI)和约翰克雷格文特尔研究所(John Craig Venter Institute)(JCVI)的来源的基因组数据可用于鉴别包括具有潜在生物重要性以及潜在抗原特征的蛋白质的ORF。PCR引物可被设计成包含允许将PCR产物插入合适的克隆载体130(例如线性质粒)中的接头序列(adapter sequence)。此类克隆载体可包含其它可用的序列，例如编码肽序列的序列，所述肽序列提供允许后续分离的标签(例如，聚组氨酸)和/或免疫识别的标签(例如，血凝素)。在一些实施方案中，可能有必要将长的ORF分裂成多个区段，使得ORF的长度不阻碍后续的克隆扩充或克隆表达。在插入合适的克隆载体中后，此类载体可被转移到感受态细胞中用于扩增。可通过合适的选择程序(例如，抗生素抗性)来鉴别转化的细胞，将其分离并且使内容物经受体外转录140以从每个克隆的ORF 150产生蛋白质和/或肽。此类的各蛋白质或肽的每一个均代表了潜在抗原。

由此产生的潜在抗原然后可用于例如通过在微阵列芯片160上的各位点处打印各体外转录产物来产生阵列。所述阵列还可含有测试位点，所述测试位点不含源自钩端螺旋体ORF的材料，例如与所述载体联合的肽(例如聚组氨酸和血凝素)、对照材料或可用于所述阵列的定向和/或自动化表征的材料。应当了解，阵列可含有各位点的重复，其可用于允许从打印错误恢复以及可用于改进总体阵列性能。然后可用含抗体样品来探测或询问170所述阵列。合适的样品包括来自处于钩端螺旋体病不同时期(即急性、慢性、恢复、携带者)的受感染个体的血清、血浆或其它流体以及来自钩端螺旋体病地方流行的区域的个体的对照样品或可选择地来自钩端螺旋体病未发生的地方的对照样品(即未染病(naive)样品)。来自所述样品的抗体与测试位点内的蛋白质或肽之间的复合物形成可通过用针对样品中发现的抗体的二级抗体结合剂180(例如，抗-IgG、抗-IgM、抗-IgA、抗-IgE、抗-IgD)询问阵列来显现。所述二级抗体可带有可被直接显现的可检测“标签”(例如荧光染料或蛋白)或被间接显现的可检测“标签”(例如生物素或酶)。在利用带有被间接显现的标签的二级抗体的实施方案中，可实施后续处理步骤，例如与标记的抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素温育或与产生可检测产物的酶底物温育。应当了解，除了与PCR扩增的ORF联合的蛋白质和肽，体外转录过程140还可产生来源于用于支撑载体130的细胞的不相关蛋白质和肽，并且可能的是，样品可含有针对此类不相关蛋白质和肽的抗体。在这种情况下，在用于询问阵列前，样品可用此类不相关蛋白质(例如，细胞裂解物、不接收外源性DNA的体外翻译过程的产物或在用不接收PCR产物的载体转化后来自体外翻译过程的产物)进行处理。

在用来自适当个体的样品询问阵列并且用二级抗体结合剂显现抗体结合后，可使用阵列扫描器190来确定阵列研究结果。阵列扫描器的形式和设计取决于阵列的形式和设计。例如，可使用流式细胞器或类似的装置来扫描悬浮的且个别锁定的粒子的流体阵列，所述装置能够鉴别个别粒子并且测量来自特征在于与来自样品的抗体形成复合物的每个粒子的信号(例如，荧光)。类似地，来自对平面阵列的研究的结果可使用数码相机、显微镜、光扫描器或其它图像获取装置扫描并且随后使用允许鉴别个别的测试位点和测量与同来自样品的抗体形成复合物相关的信号(例如，荧光、磷光、发光等)的软件。应当了解，此类平面阵列可在数据获取期间经由直角、斜角或外延照明被照明或激发，或可选择地，可在充当一维或二维波导的基底上产生，并且可经由表面等离子体共振提供照明或激发。可选择地，使用微孔板产生的阵列可使用微孔板读数器来表征。可对代表来自样品的抗体与阵列的蛋白质或肽之间的复合物形成的信号进行定量以提供抗体复合物形成195程度的量度。例如，相对于从对照样品或阵列上的对照位点观察到的信号，虽然小但统计学显著的信号可指示已发生与阵列的抗原的复合物形成，但抗体亲和力、亲合力或总体抗体反应相对弱。可选择地，相对于从对照样品或阵列上的位点和/或其它被鉴别抗原观察到的信号，大信号可指示所述抗原是免疫显性抗原，即诱导高亲和力和/或高亲合力抗体或诱导形成相对高浓度的抗体的抗原。可选择地，如果患者中产生的针对所述至少两种抗原的抗体的平均结合亲和力、平均结合亲合力和平均数量中至少一项处于在患者中产生的抗体的结合亲和力、结合亲合力和数量的较高三分位组中，则可认为抗原是免疫显性的。所述免疫显性抗原是用于测定和疫苗中的有吸引力的靶标。

应当了解，图1中所述的基本方法在鉴别可用于钩端螺旋体病的早期诊断(即通过利用提供强信号的抗原)和钩端螺旋体病特定时期或状态的鉴别中的抗原或抗原小组中具有实用性。例如，可将来自钩端螺旋体病急性病例的样品的结果与来自恢复或康复中的患者的病例的样品的结果进行比较以研发帮助医师诊断和治疗此疾病的测试。类似地，鉴别钩端螺旋体病早期和晚期所特有的免疫显性抗原可通过鉴别可能诱发显著免疫反应的抗原材料来帮助研发可用于预防和/或治疗所述疾病的疫苗。此类免疫显性抗原可个别地使用或分组成小组。此类小组可在改进测定灵敏度、提供感染的精确分期和提供保护性和/或治疗性免疫性方面具有实用性。如果组合中的抗原使得要求来自仅唯一实体的独占或非独占的许可，则这对于因为不得不获得的许可的数目而受挫于基于目前已鉴别重组蛋白产生测定的诊断试剂盒制造商来说将是有吸引力的。

本发明构思的一个所涵盖的实施方案是可包含与载体缔合的多种抗体反应性抗原的抗原组合物。至少两种所述抗原可具有(i)关于受钩端螺旋体病感染的群体的血清的、定量且已知的相对抗体反应性和(ii)已知的与疾病参数(例如疾病的时期、疾病的持续时间、临床结果和先前的暴露)的关联。优选的是，所述多种抗原选自由以下组成的组：LIC11352、LIC12544、LIC12631、LIC10464-s1、LIC11573、LIC11335、LIC20301、LIC10486、LIC10191、LIC11389、LIC11437、LIC20087、LIC10623、LIC10998、LIC10215、LIC11271、LIC10491-sl、LIC13050、LIC11210、LIC10524、LIC11456、LIC12476、LIC11570、LIC13244、LIC13238、LIC11885、LIC11008、LIC13242、LIC11336、LIC20250、LIC10525、LIC10464-s2.1、LIC20118、LIC10973、LIC10464-s2、LIC10406、LIC12180、LIC11074、LIC10546、CopLigAU(独特的):重复A7'-13、CopLigBU(独特的):重复B7'-12和CopLigB:重复l-16,nt154-1743或其片段。

预期本发明构思的抗原可具有已知反应性，并且所述已知反应性可以多种因素或参数为特征。然而，优选的是，所述已知反应性以免疫原性强度和/或钩端螺旋体感染的时程为特征。通常优选的是，所述参数是疾病的活性状态、先前对于病原体的暴露、暴露于病原体的持续时间、慢性感染、过去病史(past disease)、活动性感染、非活动性感染、对病原体感染的至少部分免疫性和/或治疗后的结果。疾病参数可选自由以下组成的组：先前或目前对钩端螺旋体病的暴露，急性感染、潜伏性感染或复发性感染，和对钩端螺旋体病感染的至少部分免疫性。

进一步预期本发明构思的抗原可在群体内具有特征性分布。在所涵盖的实施方案中，至少两种所述抗原或针对所述至少两种所述抗原的抗体可存在于至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或超过90％的暴露于所述至少两种抗原的群体中。任选地，患者中针对所述至少两种抗原产生的抗体的平均结合亲和力和平均数量中的至少一项处于在患者中产生的抗体的结合亲和力和数量的较高三分位组中。

在本发明构思的一些实施方案中，使用所述方法鉴别的抗原(或其片段)和/或针对它们的抗体可用于诊断哺乳动物中的钩端螺旋体病和/或用于适于诊断哺乳动物中的钩端螺旋体病的诊断装置或诊断系统。在类似实施方案中，使用所述方法鉴别的抗原(或其片段)和/或针对它们的抗体可用于诊断哺乳动物中的钩端螺旋体病的方法中。可个别地使用此类抗原。在优选实施方案中，2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种或超过20种此类抗原或针对此类抗原的抗体可用作用于测试目的的小组。此类蛋白质或肽抗原可以是重组的并且可以是至少部分纯化的。所用蛋白质或肽抗原的纯度可以w/w计为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或大于99％。诊断装置或诊断方法可针对钩端螺旋体病的鉴别、钩端螺旋体病的分期或两者。诊断装置或诊断方法可使用任何合适的免疫测定形式，包括凝集、比浊法、放射免疫测定、酶免疫测定、荧光各向异性和免疫荧光。可使用直接、间接或“夹心式(sandwich)”测定方法或形式。合适的诊断装置和诊断方法包括流动测定、微孔板测定和侧向流测定。在此类测定中，一种或多种组分与载体结合或连接，所述载体例如固体或不溶相(例如塑料表面、玻璃表面、纸或纤维表面、或粒子表面)。在利用多种抗原的测定中，此类抗原或针对此类抗原的抗体可分布于一个或多个测试表面上以便可彼此区别。例如，各抗原或抗体可被固定到微孔板的不同孔或被固定到平面测试表面上的可区别位点和/或离散位点。可选择地，各抗原或针对各抗原的抗体可与可通过色彩、大小和/或荧光发射区别的不同粒子群连接。在本发明构思的其它实施方案中，诊断装置是流动测试或条测试(strip test)，其中流体流动经过包括用于流动的通路、开孔或通道的支撑件(例如多孔膜或纤维片)，使测试组分移动通过反应性位点。在此类实施方案中，各抗原或针对各抗原的抗体的鉴别可通过支撑件上的特征性位置处出现指示物(例如，着色带或着色斑纹)来确定。

在另一实施方案中，预测患者患钩端螺旋体病的可能性的方法可包括在从患者获得的血清样品中确定针对一种或多种抗原、或它们的变体的自身抗体反应性。然后可从源自诊断为患有钩端螺旋体病的患者的血清的参考样品预测患者患所述疾病的可能性，由此针对所选抗原的增加或降低的自身抗体反应性可与所述患者中的所述疾病的增加的可能性正相关。

本发明构思的另一实施方案是疫苗制剂，其包含免疫原性量的一种或多种使用来自患有钩端螺旋体病的个体的血清鉴别的抗原(或其片段)与载体(例如生理上可接受的媒介物)的组合。在类似实施方案中，本发明构思的一种或多种抗原(或其片段)可用于通过用于疫苗中治疗和/或预防钩端螺旋体病的方法中。此类疫苗可以是预防性的和/或治疗性的。在优选实施方案中，疫苗制剂包含2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种或超过20种钩端螺旋体属抗原，其中至少一些是免疫显性抗原。此类蛋白质或肽抗原可以是重组的并且可以是至少部分纯化的。所用蛋白质或肽抗原的纯度可以w/w计为40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或大于99％。此类疫苗还可包含有效量的已知增强免疫反应的免疫佐剂。为了使受试者免疫，可在胃肠外施用免疫原性蛋白质或肽，通常通过肌内或皮下注射施用。然而，其它施用方式也是可接受的。例如，所述疫苗可经口或经由粘膜途径(例如鼻、胃肠或生殖部位)施用。合适的疫苗制剂含有有效量的于媒介物中的活性成分。预防性疫苗中的有效量是足以防止、减轻、降低目标哺乳动物中的钩端螺旋体属感染发生的量。治疗性疫苗中的有效量是足以降低目标哺乳动物中的钩端螺旋体属感染的细菌负载、减少钩端螺旋体属感染的症状和或缩短钩端螺旋体属感染的进程的量。本领域技术人员容易确定有效量。所述活性成分通常可在组合物的约1％到约95％(w/w)的范围，或如果适当的话，甚至更高或更低。待施用的量取决于例如以下的因素：疫苗接种受试者的年龄、体重和身体状况。本发明主题的疫苗可根据期望有效性的需要以单剂量或以多剂量施用。

如所述被鉴别用于疫苗中的蛋白质或肽抗原可在疫苗制备前被分离、冻干和稳定化。然后可将疫苗调节到适当浓度，任选地与合适的疫苗佐剂组合，并且包装以供使用。典型的佐剂包括表面活性剂(例如十六烷基胺、十八烷基胺、溶血卵磷脂、二甲基二(十八烷基)溴化铵、N,N-二(十八烷基)-N'-N-双(2-羟乙基-丙二胺)、甲氧基十六烷基-甘油和复合多元醇(pluronic polyol))、聚阴离子(例如，吡喃、硫酸葡聚糖、聚IC、聚丙烯酸、卡波普(carbopol))、肽(例如，胞壁酰二肽、MPL、二甲基甘氨酸(aimethylglycine))、促吞噬肽(tuftsin)、油乳液、明矾和它们的混合物。所述免疫产品可封装到用于疫苗制剂的脂质体中，或可与例如钥孔戚血蓝素(KLH)或人血清白蛋白(HSA)的蛋白或其它聚合物缀合。

在本发明主题的一个方面，应用所述基因组方法来构建现场护理测试以诊断钩端螺旋体病。因此，研发包含问号钩端螺旋体Copenhageni血清变型Fiocruz LI-130株61％基因组的蛋白质微阵列芯片。芯片制造涉及3步方法：(1)每一所选ORF的PCR扩增；(2)体内重组克隆和(3)体外转录-翻译反应、之后是微阵列芯片打印。表达具有聚组氨酸(His)标签和血凝素(HA)标签两者的蛋白质，其允许使用针对这些标签的抗体来评估微阵列芯片质量。如图2中所示，96％的打印测试位点对任一标签为阳性。

使用比从对照(即在没有DNA的情况下进行的)反应产物产生的测试位点的平均强度高出大于2.5标准偏差的信号强度作为显著抗体复合物形成的截止值来评价来自所述微阵列的结果。针对与IgG的复合物形成来探测在萨尔瓦多(Salvador)/巴西经实验室确认的钩端螺旋体病病例的血清以及不同的阴性对照组。当与对照比较时，在康复样品(n＝80)中鉴别出23种差异反应性(p≤10-4)免疫显性抗原的组，其中16种还在急性样品(n＝50)中具有差异反应性(p<0.02)。对于这16种中的8种以及对于该组中剩余7种抗原中的3种来说，从急性期到康复期均检测到增加的反应性(p<0.04)，表明这些抗原可能与保护性免疫性相关。值得注意的是，这些蛋白质中的一些(例如LipL32以及钩端螺旋体属免疫球蛋白样蛋白LigA和LigB的独特结构域)先前已被描述为血清反应性抗原，从而提供了对于该方法的验证。

通过此类实施方案鉴别的钩端螺旋体属抗原列于表1中。

表1

DR＝差异反应；CR＝当与来自高地方流行区组的健康个体比较时的交叉反应。空白对应于对于一组来说具有差异反应性或交叉反应性、但对于另一组来说平均信号强度低于截止值的抗原。

与个别抗原相关的产品示于表2中。

表2

利用本文所述的蛋白质组阵列方法并且用来自问号钩端螺旋体的自然人感染的样品询问蛋白质组阵列，已将以下抗原(列于表3中)显示为免疫显性抗原。

表3

应当了解，本文所述的蛋白质组方法将许多迄今未知的蛋白质鉴别为与针对钩端螺旋体病的剧烈免疫反应相关的免疫显性抗原。令人惊讶地，鉴别出不在生物体的表面上表达且使用常规方法不被视为潜在抗原位点的许多钩端螺旋体属蛋白。

如上文所述的，本发明构思的一个实施方案是具有钩端螺旋体病问号钩端螺旋体种的蛋白质的部分纯化的和/或重组的蛋白质的组合物，其用于例如多种不同形式的诊断测试的方法中，所述诊断测试用于针对数种抗原的抗体，其中所述抗原是单独的或与一种或多种其它重组蛋白质组合。所述诊断测定可用于针对问号钩端螺旋体或可选择地另一钩端螺旋体病钩端螺旋体属种的抗体。虽然此类组合物、装置或方法可用于诊断钩端螺旋体病的实验室支持，但它还可用于对感染进行分期和/或用于评估抗生素疗法的结果。如表4中所示，使用蛋白质组微阵列鉴别的单一抗原可例如用于区分患有钩端螺旋体病的急性期患者和康复期患者。虽然显示了使用单一抗原的结果，但预期使用2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种或超过20种钩端螺旋体属抗原的结果可提供更精确和/或更灵敏的结果。

表4

Se＝灵敏度；Spe＝特异性；AUC＝曲线下面积。*以斜体/粗体表示的抗原被认为对于该组来说没有血清反应性(平均信号强度低于截止值，斜体)或有交叉反应性(BHp<0.05，粗体)、但对于另一组来说在差别反应性的组中。

所涵盖的方法还包括用于选择抗原的富集分析。使用本文所述的系统和方法，预期可鉴别出来自问号钩端螺旋体1/3基因组的超过90％的血清学诊断抗原。

实施例

方法

人研究方案：方案经耶鲁大学和奥斯瓦尔多·克鲁兹基金会的机构审查委员会(the institutional review board committees of Yale University andOswaldo Cruz Foundation)批准。从生活在具有钩端螺旋体病高地方流行性传播的社区的受感染患者和健康个体获得样品并且为参与者提供了书面知情同意书。来自萨尔瓦多(Salvador)市的供血者是匿名的。从加利福尼亚大学欧文分校的一般临床研究中心(the General Clinical Research Center atthe University of California,Irvine)的匿名志愿者获得来自美国健康个体的血清。收集后，对每位患者指定代号，使得所有样品在使用前均被匿名化。

人样品：利用114份对照人血清样品和160份经实验室确认的钩端螺旋体病病例血清的集合进行评价。对照样品是(i)来自不存在钩端螺旋体病地方流行性传播的美国加利福尼亚的健康志愿者的29份血清；(ii)来自具有钩端螺旋体病地方流行性传播的巴西萨尔瓦多市的供血者的35份血清和(ii)来自同一城市的高风险城市贫民窟社区招募于群组研究(cohortstudy)中的健康受试者的50份血清。从1996年4月到2010年8月，在处于相同状态的贫民窟社区中在基于医院的主动监测(active hospital-basedsurveillance)期间对病例进行鉴别，包括来自萨尔瓦多市和来自农村的患者。在这段时期中，鉴别出1529位经MAT确认的严重钩端螺旋体病病例，我们从其中选择了80份急性期血清和80份康复期血清来进行本研究。对血清样品进行随机选择，因此急性样品和康复样品未必是成对的。在患者住院时收集急性期样品并且从住院至少14天后且可能已接受或可能还未接受标准抗生素疗法的恢复期患者收集康复期样品。根据血清转化准则(MAT中效价的4倍上升或1:800的单效价)来界定实验室确认。

微阵列靶标选择：鉴于可在国立生物技术信息中心(NCBI)和约翰克雷格文特尔研究所(JCVI)数据库获得的问号钩端螺旋体Copenhageni血清变型Fiocruz L1-130株基因组注释，进行将构成所述阵列的开放阅读框(ORF)的选择。所用的准则包括具有潜在生物重要性以及潜在抗原特征的蛋白质。

PCR扩增和高通量重组克隆：通过PCR将所选开放阅读框(ORF)扩增并且使用高通量PCR重组克隆方法将其克隆到pXI载体中。简单地说，使用5ng的问号钩端螺旋体Copenhageni血清变型Fiocruz L1-130株利用Accuprime Taq DNA聚合酶系统(Invitrogen,Grand Island,NY,USA)根据制造商的方案将ORF扩增。环化条件如下：94℃2分钟，31个循环的94℃90秒、55℃15秒、50℃15秒、68℃2分钟和68℃10分钟的最终延伸。引物含有20bp ORF-特异性序列和独特的20bp接头序列，所述接头序列被并入作为被扩增基因侧翼的59末端和39末端中并且与线性化的pXI载体的克隆位点(分别为ACGACAAGCATATGCTCGAG和TCCGGAACATCGTATGGGTA)同源。大于3kb的基因作为较小区段被克隆，在所述序列之间维持至少150个核苷酸的重叠。这样区段化的ORF以基因ID、之后是字母“s”和区段数被命名，例如LIC10502-s4。ligA基因和ligB基因(分别为LIC10465和LIC10464)被片段化，所述片段化相关于存在于蛋白质结构中的重复Big结构域(LigB重复7-12、LigA重复7-13和LigA/B重复1-6)[20]，其已被描述为潜在的诊断标记物和/或疫苗候选物。对于失败，尝试最多另外三轮扩增，其通常通过调节PCR条件来恢复。所有PCR反应均在克隆前通过凝胶电泳确认正确的插入物大小。

pXI质粒编码N-末端6xHis-标签和C-末端血凝素(HA)标签。所述质粒通过用BamH1消化来线性化并且通过PCR来扩增以产生受体载体。将含有40ng线性化pXI载体、1μL ORF PCR反应物和10μL超感受态大肠杆菌(Escherichia coli)DH5-a细胞(McLab)的反应物在冰上孵育30分钟，在42℃热休克1分钟并且在冰上冷却1min。添加180μL S.O.C培养基并且将细胞在37℃培养1小时。将整个反应混合物添加到补充有卡那霉素(kanamycin)(50μg/mL)的1.1mL LB中并且在剧烈通气的同时在37℃温育过夜。在没有菌落选择的情况下利用QIAprep 96Turbo Kit(QIAprep 96Turbo试剂盒)(Qiagen,Valencia,CA USA)提取质粒并且通过凝胶电泳对其进行分析以确认插入物大小。进行最多另外2轮克隆以增加效率并且通过将用于转化的PCR体积加倍来继续克隆。带有小于500bp的插入物和一些随机选择的插入物的所有质粒通过PCR使用插入物特异性引物确认插入物的存在。在用血清样品探测微阵列后，鉴别血清反应性抗原并且对相应的质粒测序。在所有情况下确认插入物。

微阵列制造和询问：对于阵列制造来说，根据制造商说明书将纯化的DNA小量制备物用于在基于大肠杆菌的体外转录/翻译(IVTT)反应系统(RTS Kit,Roche Applied Science,Indianapolis,Indiana,USA)中表达。在384孔板中进行10μL反应并且在26℃在300rpm振荡下孵育16小时。在DNA不存在下进行对照反应(“无DNA”对照)以评估IVTT反应本身产生的背景。将蛋白酶抑制剂混合物(Complete,Roche Applied Science,Indianapolis,Indiana,USA)和至最终浓度为0.5％v/v的Tween-20添加到所述反应物中，然后将其混合并离心，以在打印之前，使任何沉淀物成团并且去除气泡。使用Omni Grid 100微阵列打印机(Genomic Solutions,Cambridgeshire,UK)将粗制上清液立即打印到硝酸纤维素包被的FAST载玻片(Whatman,Piscataway,New Jersey,USA)上。另外，阵列打印以多个阴性对照反应物、含有小鼠、大鼠和人IgG的IgG混合物(Jackson ImmunoResearch,WestGrove,Pennsylvania,USA)的阳性对照斑点(spot)和被大多数人识别的纯化的埃泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒核抗原1(EBNA1)蛋白质(允许其充当血清质量标记物)。

通过用针对相应标签的单克隆抗聚组氨酸标签(Sigma Aldrich,St.Louis,Missouri,USA)和抗血凝素标签(Roche Applied Science,Indianapolis,Indiana,USA)探测所述阵列来验证蛋白质表达。首先用蛋白质阵列封闭缓冲液(Whatman,Piscataway,New Jersey,USA)将阵列封闭30分钟并且用在封闭缓冲液中以1:400稀释的抗标签抗体探测过夜。然后将阵列在于封闭缓冲液中以1:1000稀释的生物素化的二级抗体(Jackson ImmunoResearch,West Grove,Pennsylvania,USA)中孵育1小时，之后与抗生蛋白链菌素缀合的SureLight P3(Columbia Biosciences,Frederick,Maryland,USA)孵育1小时。在每次孵育后，用含有0.05％v/v Tween-20的Tris缓冲盐水(TTBS)将载玻片洗涤3次。用Tris缓冲盐水(TBS)和蒸馏水进行另外洗涤并且在扫描前通过短暂离心将载玻片风干。在Perkin Elmer ScanArray共聚焦激光器(Perkin Elmer,Waltham,Massachusetts,USA)中扫描载玻片并且使用QuantArray软件(Packard Biochip Technologies,Billerica,Massachusetts,USA)对强度进行定量。

为了利用人血清进行询问，将样品在含有最终浓度为10％v/v的10mg/mL大肠杆菌裂解物(McLab,San Francisco,CA,USA)的蛋白阵列封闭缓冲液中以1:100稀释，并且将其在室温下在恒定混合下孵育30分钟以去除与IVTT反应中大肠杆菌蛋白质的背景反应性。在添加到微阵列中之前，经由离心从样品稀释混合物去除大肠杆菌蛋白质-抗体复合物。用蛋白质阵列封闭缓冲液将阵列封闭30分钟，然后在轻轻摇动的同时与稀释样品在4℃孵育过夜。

将生物素化的抗-人免疫球蛋白G(Fc-c片段特异性的，JacksonImmunoResearch,West Grove,Pennsylvania,USA)在封闭缓冲液中以1:2000稀释并且在环境温度下与所述阵列孵育1小时。在每次孵育后用TTBS将载玻片洗涤3次并且通过与抗生蛋白链菌素缀合的SureLight P3孵育1小时来检测结合的抗体，如上文所述。在与SureLight P3孵育后，通过扫描荧光强度对微阵列结果进行定量。

微阵列数据分析：使用QuantArray软件(Packard Biochip Technologies,Billerica,Massachusetts,USA)对斑点强度进行定量。作为每个斑点的平均像素信号强度获得原始数据并且针对斑点特异性背景自动地校正所有强度。对于每个阵列来说，从斑点信号强度减去对照IVTT反应(即无DNA对照)的平均值以将背景反应性最小化。当任一标签的信号强度均大于无DNA对照反应平均值+2.5标准偏差时，认为蛋白质被表达。应用相同的截止值来鉴别使用所收集的血清样品询问的反应性蛋白质。使用公开可用的R统计软件(于http://www.r-project.org获得)进行数据分析。为了使方差稳定，对原始数据应用VSN归一化并且通过贝叶斯调节性t检验(Bayesregularized t test)比较各组。使用Benjamini和Hochberg(BH)方法来控制假发现率，使得小于0.05的p值被视为显著并且相应的蛋白质被视为差异反应性的。对于直方图，将小于IE-14的BH校正的p值分配为IE-16。使用线性和非线性支持向量机(SVM)利用“e1071”R统计软件产生多路分类器(Multiplex classifier)。利用“ROCR”R统计软件制得接受者操作特征(ROC)曲线图。从所得ROC曲线确定灵敏度和特异性。使用频率和中位数以及四分位(IQR)距描述钩端螺旋体病患者的临床特征，所述钩端螺旋体病患者的急性血清样品和/或康复血清样品被选择用于本研究。使用卡方检验或曼-惠特尼/维尔克松检验(Mann-Whitney/Wilcoxon test)来比较急性期钩端螺旋体病患者与康复期患者的临床表现。通过克鲁斯卡尔-沃利斯检验(Kruskal-Wallis test)评价针对在蛋白质微阵列中呈现最佳性能的三种抗原的急性血清信号强度和患者的临床特征之间的关联。

免疫条印迹(Immunostrip Blotting)：根据制造商说明书使所选克隆进行5小时的IVTT反应(RTS Kit,Roche Applied Science,Indianapolis,Indiana,USA)，所选克隆对应于针对急性样品组或康复样品组的差异反应性抗原。添加蛋白酶抑制剂混合物(Complete,Roche Applied Science,Indianapolis,Indiana,USA)、Tween-20和甲醇，分别至0.5％v/v和10％v/v的最终浓度。将反应物混合并且离心以去除气泡。使用BioJet分配器(BioDot,Irvine,California,USA)将未纯化的上清液以1μL/cm打印到Hi-Flow Plus HF240膜(Millipore,Billerica,Massachusetts,USA)上并且切割成3mm膜条。然后将各个膜条在TTBS 5％脱脂乳中封闭30min。将血清样品在含有20％v/v终浓度的大肠杆菌裂解物的TTBS 5％脱脂乳中以1:250稀释，并且将其在室温下在搅动下孵育30分钟。然后将被封闭的条与稀释血清孵育1小时并且用TTBS洗涤6次。将碱性磷酸酶缀合的抗人IgG(JacksonImmunoResearch,West Grove,Pennsylvania,USA)在TTBS 5％脱脂乳中以1:5000稀释并且在室温下在搅动下施加至每个条1小时。在用TTBS洗涤6次后，用TBS进行另外3次洗涤并且通过在室温下与1步式氯化硝基四氮唑蓝/5-溴-4-氯-39-吲哚基磷酸酯对甲苯胺盐(NBT/BCIP)显色缓冲液(Thermo Fisher Scientific,Waltham,Massachusetts,USA)孵育2分钟使反应带显现。通过使膜条暴露于流动自来水终止酶促反应并且将膜条风干，然后使用商用台式扫描器(Hewlett-Packard,Palo Alto,Calfiomia,USA)以2,400dpi扫描。将图像转化成灰度并且使用ImageJ软件包(可在http://rsbweb.nih.gov/ij/获得)对带强度进行定量。

示例性结果

抗原选择：用于选择蛋白质以纳入阵列的准则提供了2,241个ORF，其对应于61％的问号钩端螺旋体蛋白质组。总之，所述阵列含有2,361种抗原，包括全长蛋白质和蛋白质区段。通过用抗-His和抗-HA探测阵列来评价蛋白质表达，确认超过97％的蛋白质斑点对His标签或HA标签为阳性。

人IgG抗体谱：用于本研究中的血清被分类成5组，汇总于表1中且描述于方法部分中。从男性受试者获得大多数血清(88％)并且中值年龄为34(IQR:24-45)岁。住院前症状的中值持续时间为6(IQR:5-8)天。黄疸和急性呼吸窘迫综合征分别发生在87％的患者和13％的患者中。肾损害频繁(中值肌酸酐：4.0[IQR:2.0-6.4]mg/dL)并且30％的患者接受腹膜透析或血液透析。向20％的患者提供重症监护并且3％死亡。

汇总阵列结果的热图示于图3中，并且给出了42种反应性抗原对239份个体样品中每一份的反应性的概述。个体样本在列中并且按来自美国的健康对照、来自高地方流行区组的健康对照、急性期患者和康复期患者分组。行中的抗原根据病例中的反应性显著大于健康对照中的那些加以组织。这些抗原被称为“差异反应性的”(DR)并且被划分为3部分：鉴别为对急性期患者和康复期患者两者均差异反应性的抗原、鉴别为仅对急性患者差异反应性的抗原和仅对康复患者差异反应性的抗原。第二组抗原被鉴别在健康对照中和病例中的反应性等同，并且被称为“交叉反应的”(CR)。从交叉反应性抗原见到的背景反应性在所有三组之间是类似的。

在鉴别可区分阳性钩端螺旋体病病例和阴性钩端螺旋体病病例的抗原即将结束时，可基于对急性期患者和康复期患者与来自具有高地方流行性传播的区域的健康个体的比较进行分析。所述比较的结果可见于图4A和图4B中。由于生活在所述区域的健康个体可显示对钩端螺旋体脂多糖和蛋白质的一些背景反应性，因此对在钩端螺旋体病患者中有血清反应性但在那些健康个体中没有血清反应性的抗原的鉴别可用于辨别当前钩端螺旋体病病例。用于此样品组中的所有高地方流行性对照均对钩端螺旋体病为MAT阴性。为了避免分析偏差，对来自从生活在收集区的10位MAT阳性健康个体和10位MAT阴性健康个体获得的样品的、在微阵列上检测的IgG反应性进行了比较。对于两个组观察到的总体反应性均较低并且针对受感染患者(如下文所述)所检测到的多数反应性抗原对于MAT阳性健康个体或MAT阴性健康个体均没有反应性。因此，将MAT阴性高地方流行性对照用于分析。

此样品组鉴别出30种抗原(占所有打印于阵列上的抗原的约1.3％)为反应性抗原。在这些抗原中，18种抗原相比于来自高地方流行区组的对照个体显著更多地结合来自康复样品的IgG抗体。在急性期样品中，IgG抗体反应鉴别出35种血清反应性抗原或所述阵列的1.5％，其中16种区分急性病例和阴性病例。LipL32抗原、LigA重复7-13抗原和LigB重复7-12抗原是对于康复期组和急性期组来说平均最具反应性的三种靶标。10种差异反应性抗原被鉴别为在急性组与康复组之间重叠(即共有)。

为了对生活在具有钩端螺旋体病地方流行性传播的区域的健康个体中的背景反应性进行表征，对来自美国(其中钩端螺旋体病不是地方流行性的)的对照组、巴西供血者和来自高地方流行区的健康个体的累积抗原反应性进行比较。典型结果的热图示于图5A中，其展示了平均信号强度高于任何对照组的截止值的所有抗原的反应性。相比于美国对照和巴西供血者，在高地方流行区组中观察到更高的总体反应性。对针对阵列上所有抗原的累积信号强度的分析(图5B)显示，未有过钩端螺旋体病暴露的美国健康受试者显示最低的总反应性，之后是来自萨尔瓦多的供血者，然后是来自高地方流行区的健康个体。生活在地方流行区的供血者具有略高于美国未染病受试者的反应性，但对于示例性样品组观察到的差异不是统计学显著的。然而，居住在具有高地方流行性传播的区域的健康个体中的总背景反应性显著大于(p<0.05)来自巴西或美国对照的供血者。

还对每位患者的所有反应性抗原的平均信号强度与患者的MAT效价进行了比较。MAT结果主要取决于结合钩端螺旋体LPS的凝集抗体，并且不区分IgM免疫球蛋白亚型和IgG免疫球蛋白亚型。所有急性样品和康复样品均通过MAT经实验室确认感染，观察到康复样品的中值效价相比于来自急性组的样品的3倍增加(即，800到3,200)。观察到康复组的抗原信号强度相比于急性组的一般增加(参见图XXX1和XXX2)，使用此样品组不可能在这些两种方法之间得出相关性。虽然不希望受理论限制，但发明人认为这可能表明MAT抗原和蛋白质抗原在这些患者群体中鉴别出不同的抗体池(pool)。

血清学诊断抗原的ROC分析：为了确定差异反应性抗原在区别钩端螺旋体病病例中的准确度，产生各抗原ROC曲线并且确定每种抗原的AUC。针对高地方流行区对照组单独地分析急性期样品和康复期样品并且使用SVM计算方法来计算两个组的灵敏度和特异性。然后通过减小AUC对抗原分级并产生多条抗原ROC曲线。急性期组的示例性单抗原ROC示于图6A中；对于来自康复期组的样品进行类似计算。对于两个组，均使用来自高地方流行区健康对照组的数据计算假阳性率。

对于急性期患者，Lig蛋白的不同结构域(LigA重复7-13和LigB重复7—12)提供了最佳的灵敏度和特异性(AUC＝0.894-0.857)，之后是LipL32(LIC11352,AUC＝0.841，表2)。随着疾病进展到康复期，这些抗原的准确度增加，使得LipL32实现最佳性能(AUC＝0.986)，之后是LigA重复7-13(AUC＝0.965)和LigB重复7-12(AUC＝0.968)。当用急性血清样品测试时，具有提高的准确度的三种抗原(即LigA重复7-13、LigB重复7-12和LipL32)均未被发现具有高信号强度(作为相关的患者的临床特征)。GroEL家族的热休克蛋白(LIC11335)也被鉴别为血清反应性的，具有对急性期患者和康复期患者两者的高灵敏度(分别为90.0％和92.0％)，但具有低特异性(53.8％和62.5％)。DnaK(LIC10524)(另一种热休克蛋白)显示对康复组的血清反应性，尽管我们在急性组中不能检测到针对此抗原的显著IgG水平。毒力相关蛋白Loa22(LIC10191)显示对急性期患者的极低灵敏度(36.0％)并且被认为对康复组无血清反应性。类似地，仅在急性患者中检测到抗LipL31(LIC11456)的IgG反应，诊断准确度为82％灵敏度和68.8％特异性。

令人惊讶地，本发明人鉴别出先前未描述血清反应性的数种新颖抗原。假定蛋白LIC10215为区别健康个体与急性期患者或康复期患者分别提供了92.0％灵敏度和86.0％灵敏度以及67.5％特异性和83.8％特异性。LIC10215被发现是继Lig蛋白质结构域和LipL32之后对于区别急性病例与健康个体非常有用的。关于康复组，注释为外膜蛋白的抗原LIC20087继Lig蛋白质结构域和LipL32之后提供了最佳准确度，具有96.0％灵敏度和86.3％特异性。

本文所用的新颖阵列抗原方法还允许以下意外发现：11种差异反应性抗原的组合允许用于检测急性钩端螺旋体病病例的极佳灵敏度和特异性(分别为78.0％和87.5％)，而4种抗原的组合向康复病例提供了最佳准确度(98.0％灵敏度和94.0％特异性)(参见图6B)。

通过免疫印迹进行阵列验证：将对应于急性期组或康复期组的最显著抗原的11种差异反应性抗原打印到硝酸纤维素膜上并且切割成3mm条(免疫条)，利用随机选择的来自高度地方流行区的20位健康对照个体、20位急性钩端螺旋体病个体和20位康复钩端螺旋体病个体的血清询问所述免疫条。健康个体显示针对这些抗原的较低反应性，而钩端螺旋体病患者与大多数抗原强烈地反应(图7)。对抗原强度进行定量并且使用源自Cyber-T的贝叶斯调节性t检验对各组进行比较。对于急性期组和康复期组两者，Lig蛋白质的结构域均提供了最佳单抗原区分，之后是LipL32。抗原LIC10215、LIC10486、LIC11271、LIC20087和LIC11573显示对免疫条没有血清反应性。发明人假定，观察到的这些蛋白质抗原对免疫条的较低反应性可归因于免疫条与阵列平台之间的技术差异。

对于本领域技术人员应当显而易见的是，在不脱离本文的本发明构思的前提下，那些已经描述的以外的更多修改也是可能的。因此，除了所附权利要求的精神之外，本发明主题不受限制。此外，在解释说明书和权利要求时，所有术语均应以与上下文一致的最广义的可能方式解释。具体地说，术语“包含/包括”应解释为以非排他方式提及要素、组分或步骤，指示所提及的要素、组分或步骤可与未明确提及的其它要素、组分和步骤一起存在或利用或组合。当本说明书权利要求提及选自由A、B、C……和N组成的组的某物的至少一种时，原文应解释为仅需要来自该组的一个要素，而不是A加N、或B加N等。

Claims (42)

1.一种抗原组合物，其包含：

与载体缔合的多种抗体反应性抗原，其中至少两种所述抗原具有关于受钩端螺旋体病感染的群体的血清的、定量且已知的相对抗体反应性，并且其中所述至少两种所述抗原具有已知的与疾病参数的关联；

其中所述多种抗原选自由以下组成的组：LIC11352、LIC12544、LIC12631、LIC10464-s1、LIC11335、LIC20301、LIC10486、LIC10191、LIC11389、LIC11437、LIC20087、LIC10623、LIC10998、LIC10215、LIC11271、LIC10491-s1、LIC13050、LIC11210、LIC10524、LIC11456、LIC12476、LIC11570、LIC13244、LIC13238、LIC11885、LIC11008、LIC13242、LIC11336、LIC20250、LIC10525、LIC10464-s2.1、LIC20118、CopLigAU(独特的):重复A7’-13、CopLigBU(独特的):重复B7’-12和CopLigB:重复l-16,nt154-173或其片段。

2.根据权利要求1所述的抗原组合物，其中所述已知的反应性以与抗体的相互作用强度为特征。

3.根据权利要求1和权利要求2所述的抗原组合物，其中所述已知的反应性以钩端螺旋体病的活性状态为特征。

4.根据权利要求1-3所述的抗原组合物，其中所述疾病参数选自由以下组成的组：先前或目前对钩端螺旋体病的暴露、急性钩端螺旋体病感染、潜伏性钩端螺旋体病感染、复发性钩端螺旋体病感染、钩端螺旋体病病原携带状态和对钩端螺旋体病感染的至少部分免疫性。

5.根据权利要求1-4所述的抗原组合物，其中所述至少两种所述抗原存在于至少40％的暴露于钩端螺旋体病的群体中。

6.根据权利要求1-5所述的抗原组合物，其中所述已知的相对抗体反应性包含处于在钩端螺旋体病患者中产生的抗体的结合亲和力的较高三分位组中的平均抗体结合亲和力。

7.根据权利要求1-6所述的抗原组合物，其中钩端螺旋体病患者中产生的并且针对所述至少两种抗原的抗体的平均数量处于在所述钩端螺旋体病患者中产生的所述抗体的较高三分位组中。

8.根据权利要求1-7所述的抗原组合物，其中所述载体是药学上可接受的载体，并且其中所述抗原组合物被配制成疫苗。

9.根据权利要求8所述的抗原组合物，其中所述疫苗是治疗性疫苗。

10.根据权利要求8或9所述的抗原组合物，其包含至少4种抗原。

11.根据权利要求1-7所述的抗原组合物，其中所述载体是不溶性载体，并且其中所述多种抗原中的至少两种在布置于所述载体上时是可区别的。

12.根据权利要求11所述的抗原组合物，其中所述载体是固体载体，所述多种抗原中的所述至少两种的第一抗原被布置于所述固体载体的第一位置上，所述多种抗原中的所述至少两种的第二抗原被布置于所述固体载体的第二位置上，并且其中所述第一位置与所述第二位置可区别。

13.根据权利要求11所述的抗原组合物，其中所述载体包括可悬浮粒子，所述多种抗原中的所述至少两种的第一抗原被布置于第一可悬浮粒子上，所述多种抗原中的所述至少两种的第二抗原被布置于第二可悬浮粒子上，并且其中所述第一可悬浮粒子与所述第二可悬浮粒子可区别。

14.根据权利要求1-13所述的抗原组合物，其中至少一种所述抗原或其片段是至少部分纯化的。

15.根据权利要求1-14所述的抗原组合物，其中至少一种所述抗原或其片段是重组的。

16.根据权利要求1-15所述的抗原组合物，其中至少一种所述抗原或其片段以大于60％的纯度存在。

17.一种用于诊断哺乳动物中的钩端螺旋体病的抗原组合物，其包含：

与载体缔合的多种抗体反应性抗原，其中至少两种所述抗原具有关于受钩端螺旋体病感染的群体的血清的、定量且已知的相对抗体反应性，并且其中所述至少两种所述抗原具有已知的与疾病参数的关联；

其中所述多种抗原选自由以下组成的组：LIC11352、LIC12544、LIC12631、LIC10464-s1、LIC11335、LIC20301、LIC10486、LIC10191、LIC11389、LIC11437、LIC20087、LIC10623、LIC10998、LIC10215、LIC11271、LIC10491-s1、LIC13050、LIC11210、LIC10524、LIC11456、LIC12476、LIC11570、LIC13244、LIC13238、LIC11885、LIC11008、LIC13242、LIC11336、LIC20250、LIC10525、LIC10464-s2.1、LIC20118、CopLigAU(独特的):重复A7’-13、CopLigBU(独特的):重复B7’-12和CopLigB:重复l-16,nt154-173或其片段。

18.根据权利要求17所述的抗原组合物，其中所述已知的反应性以与抗体的相互作用强度为特征。

19.根据权利要求17和权利要求18所述的抗原组合物，其中所述已知的反应性以钩端螺旋体病的活性状态为特征。

20.根据权利要求17-19所述的抗原组合物，其中所述疾病参数选自由以下组成的组：先前或目前对钩端螺旋体病的暴露、急性钩端螺旋体病感染、潜伏性钩端螺旋体病感染、复发性钩端螺旋体病感染、钩端螺旋体病病原携带状态和对钩端螺旋体病感染的至少部分免疫性。

21.根据权利要求17-20所述的抗原组合物，其中所述至少两种所述抗原存在于至少40％的暴露于钩端螺旋体病的群体中。

22.根据权利要求17-21所述的抗原组合物，其中所述已知的相对抗体反应性包含处于在钩端螺旋体病患者中产生的抗体的结合亲和力的较高三分位组中的平均抗体结合亲和力。

23.根据权利要求17-22所述的抗原组合物，其中钩端螺旋体病患者中产生的并且针对所述至少两种抗原的抗体的平均数量处于在所述钩端螺旋体病患者中产生的所述抗体的较高三分位组中。

24.根据权利要求17-23所述的抗原组合物，其中所述载体是不溶性载体，并且其中所述多种抗原中的至少两种在布置于所述载体上时是可区别的。

25.根据权利要求24所述的抗原组合物，其中所述载体是固体载体，所述多种抗原中的所述至少两种的第一抗原被布置于所述固体载体的第一位置上，所述多种抗原中的所述至少两种的第二抗原被布置于所述固体载体的第二位置上，并且其中所述第一位置与所述第二位置可区别。

26.根据权利要求24所述的抗原组合物，其中所述载体包括可悬浮粒子，所述多种抗原中的所述至少两种的第一抗原被布置于第一可悬浮粒子上，所述多种抗原中的所述至少两种的第二抗原被布置于第二可悬浮粒子上，并且其中所述第一可悬浮粒子与所述第二可悬浮粒子可区别。

27.根据权利要求24所述的抗原组合物，其中所述载体包括布置于基质上的可悬浮粒子，并且其中所述基质包含多个允许流体流过所述基质的开孔。

28.根据权利要求17-27所述的抗原组合物，其中至少一种所述抗原或其片段是至少部分纯化的。

29.根据权利要求17-28所述的抗原组合物，其中至少一种所述抗原或其片段是重组的。

30.根据权利要求17-29所述的抗原组合物，其中至少一种所述抗原或其片段以大于60％的纯度存在。

31.一种用作哺乳动物中的钩端螺旋体病疫苗的抗原组合物，其包含：

与载体缔合的多种抗体反应性抗原，其中至少两种所述抗原具有关于受钩端螺旋体病感染的群体的血清的、定量且已知的相对抗体反应性，并且其中所述至少两种所述抗原具有已知的与疾病参数的关联；

其中所述多种抗原选自由以下组成的组：LIC11352、LIC12544、LIC12631、LIC10464-s1、LIC11335、LIC20301、LIC10486、LIC10191、LIC11389、LIC11437、LIC20087、LIC10623、LIC10998、LIC10215、LIC11271、LIC10491-s1、LIC13050、LIC11210、LIC10524、LIC11456、LIC12476、LIC11570、LIC13244、LIC13238、LIC11885、LIC11008、LIC13242、LIC11336、LIC20250、LIC10525、LIC10464-s2.1、LIC20118、CopLigAU(独特的):重复A7’-13、CopLigBU(独特的):重复B7’-12和CopLigB:重复l-16,nt154-173或其片段。

32.根据权利要求31所述的抗原组合物，其中所述已知的反应性以与抗体的相互作用强度为特征。

33.根据权利要求31和权利要求32所述的抗原组合物，其中所述已知的反应性以钩端螺旋体病的活性状态为特征。

34.根据权利要求31-33所述的抗原组合物，其中所述疾病参数选自由以下组成的组：先前或目前对钩端螺旋体病的暴露、急性钩端螺旋体病感染、潜伏性钩端螺旋体病感染、复发性钩端螺旋体病感染、钩端螺旋体病病原携带状态和对钩端螺旋体病感染的至少部分免疫性。

35.根据权利要求31-34所述的抗原组合物，其中所述至少两种所述抗原存在于至少40％的暴露于钩端螺旋体病的群体中。

36.根据权利要求31-35所述的抗原组合物，其中所述已知的相对抗体反应性包含处于在钩端螺旋体病患者中产生的抗体的结合亲和力的较高三分位组中的平均抗体结合亲和力。

37.根据权利要求31-36所述的抗原组合物，其中钩端螺旋体病患者中产生的并且针对所述至少两种抗原的抗体的平均数量处于在所述钩端螺旋体病患者中产生的所述抗体的较高三分位组中。

38.根据权利要求31-37所述的抗原组合物，其中所述载体是药学上可接受的载体。

39.根据权利要求31-38所述的抗原组合物，其进一步包含佐剂。

40.根据权利要求31-39所述的抗原组合物，其中所述疫苗是治疗性疫苗。

41.根据权利要求31-40所述的抗原组合物，其包含至少4种抗原。

42.根据权利要求31-41所述的抗原组合物，其中至少一种所述抗原或其片段是至少部分纯化的。