CN104962565A - 一种红紫芽茶树R2R3-MYB基因CsMYB2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种红紫芽茶树R2R3-MYB基因CsMYB2及其应用，属于生物基因领域。本发明通过设计CsMYB2片段、RACE片段和全长引物，扩增并测序获得CsMYB2基因的核苷酸序列如SED NO ID：1所示，通过翻译为氨基酸序列并分析基因的结构。从CsMYB2的氨基酸结构上分析CsMYB2可能具有调控红紫芽茶树芽叶花色素苷生物合成的功能，然后通过转化拟南芥证实CsMYB2具有调控花色素苷生物合成的功能。为CsMYB2在改进植物色素积累方面应用奠定了基础。

Description

一种红紫芽茶树R2R3-MYB基因CsMYB2及其应用

技术领域

本发明属于生物基因领域，特别涉及一种红紫芽茶树R2R3-MYB基因CsMYB2及其应用。

背景技术

花青素又称为花色素(anthocyanidin)，是类黄酮生物合成途径中最主要的代谢产物之一，是自然界中重要的水溶性黄酮类色素。植物中的花青素不稳定，常与糖结合以配糖体的形式存在，形成花色素苷(anthocyanin)。其中糖基供体除了葡萄糖外，还可以被半乳糖、鼠李糖和阿拉伯糖及木糖等不同的糖所取代(Panagiotis Arapitsas，2008)。由于花色素发生糖苷化的位点和数目的差异及其甲基化、酰化程度的不同，从而在自然界植物中形成了各种各样的花色素苷，以糖苷的形式积累在植物细胞的液泡中。花色素苷属于黄酮类化合物，其基本结构有双键存在，在波长范围分别为465～560nm和270～280nm有最大光吸收，赋予了植物的花、果实、茎、叶和根等组织产生红色、粉色、蓝色及紫色甚至黑色等五彩缤纷的色彩(Koes,R.,2005；Winkel-Shirley,B.，2001)。

在植物中，花青素的生物合成通常受几个不同家族的调节基因调控，如MYB家族、MYC家族(编码Bhlh蛋白)和WD40类蛋白家族，这三类转录因子在调控其它黄酮类代谢产物(原花青素与黄酮醇)的合成也起关键作用(He,F.，2008；Dixon,R.A.，2005)。目前，通过模式植物拟南芥突变体的研究，已经分离鉴定出大部分的调节基因，如MYB家族的PAP1与PAP2、MYC家族的GL3与EGL3以及WD40家族的TTG1等转录因子。这三类转录调节蛋白形成一个三元复合体调节黄酮类途径中结构基因(Chi,Chs,F3h,与Dfr等)的表达进而调节拟南芥花青素的生物合成(He,F.，2008；Gonzalez,A.，2008；Ramsay,N.A.，2003；PAYNE CT.，2000)。然而，也有一系列的Myb和Myc转录因子如MYBL2、MYB4与BHLH32在拟南芥花青素的生物合成途径中起着负调控的作用(Dubos C.,2008；Chen,Z.-H.,2007；Jin,H.,2000)。在单子叶植物玉米的花青素合成途径中，其关键结构酶基因(CHS、CHI、F3H、DFR、ANS、LDOX和UFGT)主要受MYB与MYC家族相关转录因子的调节，进而调控花青素的生物合成。

红紫芽茶树是一种稀有的特色茶树资源，其芽叶呈紫色、红色或红紫色，具有较高含量的花青素。茶叶作为一种天然的健康饮品，在世界饮料史上具有举足轻重的地位。研究表明，花青素具有抗氧化剂(Bae&Suh,2007)，抗癌(Leeet al.,2009)，抗血管生成(Bagchi,Sen,Bagchi,&Atalay,2004)，抗菌(Viskeliset al.,2009)，抗凋亡(Elisia&Kitts,2008)与促凋亡(Lo et al.,2007)等功能特性。

褚世林调查发现，在茶树地方有性群体品种中，红紫色芽叶占很大比例，但不同季节有很大差异，如普通群体品种春季有30％左右的芽叶呈现微红紫色或红紫色，在夏季则有88.7％；刘富知等在湖南农业大学种植的安化有性群体品种茶树中，发现有76％的植株上出现深浅不一的红紫色芽叶，82.6％的植株嫩梢中不同程度地含有花青素；周志高等也发现，紫笋茶株抽出的嫩梢呈亮紫色或紫铜色且性状可遗传，并不是由于温度和土壤条件的缘故；萧力争等根据紫色芽叶的色差计测色值和芽叶花青素的含量水平将茶树芽叶分成绿色、浅紫色、中紫色、深紫色和特紫色5个等级，包括特紫色的自选9803和浅紫色的自选9809；Kerio等^[10]、Rashid等则分别对肯尼亚紫芽茶树花青素的提取与鉴定、茶树花青素的生理功能进行了相关研究报道。刘富知根据群体品种茶树中浓红紫芽叶和酸性乙醇反应指数达4的材料占4.35％这一比例，推论在某些地方有性群体品种中可以筛选出花青素含量高的茶树类型，但以上研究都没有进一步的品种选育报道。2005年，云南省茶叶研究所选育的遗传特性稳定、品种性状纯一、无变异的具有紫芽、紫叶、紫茎的“紫娟”茶树，获得国家林业局授予的植物新品种保护权。“紫娟”由云南大叶群体国家级茶树良种——勐海大叶茶单株培育而成，新梢芽叶为紫芽、紫叶、紫茎的嫩梢，且所制干茶和茶汤皆为紫色，花青素含量约为一般红芽茶的3倍^[1-2]。广东省农科院饮用植物研究所(原茶叶研究所)于2003年从云南大叶和凤凰水仙群体品种中选出约20个红紫芽品种优良品系，新品系新梢2～4片叶为红紫色，随着叶片的生长与成熟，叶片的红紫色褪去，转变为绿色。除丹凤和红叶4号等少数品系外，其他红紫芽品系芽叶的红紫色都在夏季最深，说明芽叶色泽同时受外界环境和遗传因子的控制。茶树红紫化芽叶的形成与花青素的合成代谢及积累密切相关，花青素含量决定芽叶紫色深浅。相比绿色芽叶，红紫芽中花青素含量显著增加，如云南“紫娟”品种新梢一芽二叶中花青素含量可高达29mg/g，远高于对照；而广东红紫芽茶花青素含量是对照云大淡绿品种的3.6～12.8倍，芽叶红紫色的深浅与花青素的含量呈正相关。

茶树花青素功能基因分离克隆起步比较晚，相比茶树花青素合成结构酶基因的进展，相关调节基因的研究更少。陈林波等通过对“紫娟”嫩叶和成熟叶的基因表达进行分析，筛选到59个差异表达基因，其中在紫色幼嫩叶片中获得26个上调片段，包括含有AP2结构的转录因子、代谢相关蛋白、信号蛋白等，并指出这些基因可能参与茶树叶色的调控。王弘雪克隆了3个MYB基因，分别命名为CsMYB4-5、CsMYB4-6和CsMYB4-7，并转化拟南芥papl-D突变体植株。马春雷等利用基因芯片技术对紫芽和绿芽进行分析，筛选到差异表达基因43个，包括2个可能与花青素合成有关的转录因子MYB蛋白和WD40蛋白基因，MYB基因分别为CsMYB1和CsMYB2，全长分别为1 132和1 020bp，在GenBank的登录号分别为HQ660373和HQ660374。定量分析发现CsMYB2在叶片中的相对表达量是根的100多倍，并指出遮荫处理能明显降低叶片中的花青素含量，提高CsMYB1的表达，但对转录因子CsMYB2的影响不大,其与茶树花青素合成的相关性有待进一步研究。

发明内容

为克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种红紫芽茶树R2R3-MYB基因CsMYB2的核苷酸序列。

本发明的另一目的在于提供上述红紫芽茶树R2R3-MYB基因CsMYB2的氨基酸序列。

本发明的再一目的在于提供上述的红紫芽茶树R2R3-MYB基因CsMYB2的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种红紫芽茶树R2R3-MYB基因CsMYB2，其核苷酸序列如下所示：

GGAAGGGCTCCATGTTGTTCCAAGGTTGGGTTGCATAGAGGTCCATGGACTGCTAGAGAGGATGCATTGCTCACCAAGTATATTCAGCTTCATGGTGAAGGCAATTGGAGATCTTTGCCTAAAAAAGCTGGTCTACTAAGATGCGGAAAGAGTTGCAGGCTAAGATGGATGAACTATCTAAGACCTGATATCAAGAGAGGGAACATCTCCCCTGATGAGGATGACCTAATTATCAAAATGCATGCTCTTCTTGGCAACCGATGGTCTCTTATCGCAGGAAGACTACCGGGTCGAACTGATAACGAGATTAAGAACTATTGGAACACCCATCTCAGCAAAAGACTCTTAAGCCAAGGAACCGACCCGAATACCCACAAAAAAATATCAGATCCTCACCTAAAAGAACCAAAGAAGAGAAGGAGCAACAGCAAAAAGCAAAAAAACAAGTCCAAATCCAATGTTGTAGTGATTGAAAAGCTCAAAGTTCATAACCCAAAGCCCACTAGGATCAAGTCCTTGAGTTCCTTCTCAATGTCAAGGAATGGTAGTTTTGGTTGGACAATTAGTGGCGGTTCTTCATCAAGTCATGAGGGAGACCACAGAGGATCATTACTTGTTGGTACAGAAGTCGTGCATGTTCCATGGTCTGATTTCAAAGATGATGCGGATCATGAAAATAGGGTTGGCTTTCTTGTTGGTGATGATCATCAAGATCGCGATCTAGTCAACGGTTCGGACCTCGAATGTCATTCTCAATTGTTGCCAATGTCTGATCACACTCTAGAGAAGCTCTATGAGGAGTACCTACAACTACTCAAGGCAGAAGATGATGTCCAAGTTCAGTTTGATTCCTTTGCTGAATCTTTGCTGATA

其中，框中的ATG和TGA分别为CsMYB2核苷酸序列的起始密码子和终止密码子。

上述的红紫芽茶树R2R3-MYB基因CsMYB2，其氨基酸序列如下所示：

MGRAPCCSKVGLHRGPWTAREDALLTKYIQLHGEGNWRSLPKKAGLLRCGKSCRLRWMNYLRPDIKRGNISPDEDDLIIKMHALLGNRWSLIAGRLPGRTDNEIKNYWNTHLSKRLLSQGTDPNTHKKISDPHLKEPKKRRSNSKKQKNKSKSNVVVIEKLKVHNPKPTRIKSLSSFSMSRNGSFGWTISGGSSSSHEGDHRGSLLVGTEVVHVPWSDFKDDADHENRVGFLVGDDHQDRDLVNGSDLECHSQLLPMSDHTLEKLYEEYLQLLKAEDDVQVQFDSFAESLLI。

上述的红紫芽茶树R2R3-MYB基因CsMYB2的应用，主要在提高植物的花色素苷积累方面应用。

上述的红紫芽茶树R2R3-MYB基因CsMYB2的应用，主要在提高转基因植物的花色素苷积累方面应用。

所述的转基因植物优选为转入CsMYB2基因的植物，更优选为转入CsMYB2基因的拟南芥。

所述的转入CsMYB2基因，优选为通过置换反应将CsMYB2连接到pDONR221质粒与pB2GW7载体上，获得重组质粒，将重组质粒转化农杆菌EHA105菌株感受态细胞；完成转入CsMYB2基因。

所述的转化优选为冻融法转化方式。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1.本发明获得一种茶树R2R3-MYB基因CsMYB2的核苷酸序列，并对其氨基酸序列的结构特征和物种比对进行分析。

2.本发明从CsMYB2的氨基酸结构上分析CsMYB2可能具有调控红紫芽茶树芽叶花色素苷生物合成的功能，然后通过转化拟南芥证实CsMYB2具有调控花色素苷生物合成的功能。

附图说明

图1是CsMYB2克隆过程的电泳图；其中，M，DNA Marker(条带大小分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)；A中1泳道为CsMYB2的3’RACE片段；B中2泳道为CsMYB2的5’RACE片段；C中3、4泳道分别为CsMYB2的ORF及CsMYB2全长片段。

图2是CsMYB2推导的氨基酸序列的结构分析图；其中，图中所用到的序列基因名称和GenBank登录号为：DkMYB4(AB503701)、TcTT2_like_MYB(ADD51352)、VvMYBA1(BAD18977)，Vbputative MYB transcription factor(AFG28178)，VcR2R3_MYB(AEV21970)，AtTT2(AT5G35550)，AtMYB111(NP_199744)，LcMYB1，AtPAP2(AAG42002)，MdMYB10(ABB84753)，PmMBF1(AAA82943)，VvMybPA1(CAJ90831)，VvMYBPA2(EU919682)，VvMYBA2(AB097924)，ZmMYB31(AM156906)。

图3是CsMYB2的氨基酸序列与其他植物的MYB蛋白的进化分析。

图4是红茶芽茶树发育程度叶片(红紫色叶/绿叶)间及在红紫芽茶树品种与绿芽品种云大淡绿间CsMYB2的表达分析。

图5是野生型拟南芥(Col-0)中超表达CsMYB2的结果图；图中显示转基因拟南芥叶片积累花色素苷。

图6是转基因植株与野生型植株花青素含量的比较。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

1.红茶芽茶树选取

本发明的所用红紫芽茶树叶片取自广东省农业科学院饮用植物研究所“广东省茶树种质资源圃”中的红紫芽茶树品种。采好的样品迅速用液氮速冻，带回实验室冻存于-80℃冰箱，用于花色素苷含量测定、基因克隆及基因表达分析。

2.红紫芽茶树芽叶RNA的提取及检测

红紫芽茶树芽叶RNA的提取采用RNA提取试剂盒(Aidlab EASYspin Plus)，具体方法参照说明书。用DNase I(QIAGEN RNeasy Mini kit)消化DNA，具体方法参照说明书。RNA的浓度测定和纯度分析：取1.0μl RNA溶液稀释至100.0μL，用核酸蛋白检测仪测定260、280和320nm的光吸收值，并计算260nm/280nm比值。当OD260/OD280的比值介于1.80～2.00时，RNA样品可用于下一步试验。总RNA样品浓度按下列公式计算：RNA浓度＝OD260*40ngμL-1*100。为进一步评价总RNA的完整性，取2.0μL总RNA进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。

3.cDNA第一链的合成和初始模板均一化

利用SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)合成cDNA用于RACE片段克隆。用于表达的每个样品均取2.0μg总RNA，利用MLV-ReverseTranscriptase Kit(Invitrogen公司)合成cDNA第一链，具体操作均按试剂盒说明书进行。

4.引物设计

根据引物设计的基本原则，用DNAMAN设计出引物，委托深圳华大基因科技服务有限公司合成。RACE片段、全长和Rea-time PCR扩增所用引物见表1。

表1 RACE片段、全长和Real-time PCR引物

5.CsMYB1基因的分离及序列分析：

根据高通量Solexa测序获得的转录组的EST序列为基础，CsMYB2基因对应的EST序列经NCBI数据库BLAST分析，证实为MYB基因的同源分子，因此命名为CsMYB2。然后根据片段设计了RCAE引物，经过扩增，得到3＇RACE片段为490bp左右，5＇RACE片段900bp，RACE步骤参见Clontech公司的SmartRACE说明书。将测序所得的5’RACE序列和3’RACE序列进行拼接设计引物得到全长分别为1280bp，CDS编码序列900bp，编码292个氨基酸。所述的CsMYB2的ORF框的核苷酸序列和氨基酸序列见如下。具体的克隆过程电泳图如图1。如图2所示，将CsMYB2全长核苷酸序列进行翻译，得到的氨基酸序列中含有R2和R3两个不完全重复序列；一个典的结构域[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R，被称为bHLH Motif，它是能与bHLH一类蛋白相互作用的区域(Zimmermann et al.2004)；以上结果表明CsMYB2是R2R3-MYB基因家族的一个成员。

利用DNAman软件构建了包括CsMYB2在内的16个调控原花青素及花色素苷生物合成的R2R3-MYB转录因子的系统进化树，如图3所示。CsMYB2与已经证实调控原花色素苷生物合成的转录因子同源性较高，如柿树(DkMYB4)(Akagi et al.2009)、高丛越橘(VcR2R3MYB transcription factor)(Zifkin etal.2011)、可可(TcTT2like MYB transcription factor)(Liu et al.2009)等。

6.CsMYB2在红紫芽茶树中的表达分析

CsMYB2在红紫芽茶树中的表达分析采用Real-Time PCR反应，采用480II荧光定量PCR仪(Roche)和PremixEx TaqTM(Perfect Real Time,Takara)试剂盒进行。具体步骤参照仪器的操作手册以及试剂盒的使用说明。在冰上配制PCR反应液，反应体积为20.0μL；反应条件如下：50℃，60s；95℃，60s，95℃，15s，56℃，20s，72℃，35s，40个循环；之后进行55-95℃熔解曲线分析。每个样品设3个重复。反应结束后通过熔解曲线鉴定产物的特异性。实验所选用的内参基因参照已经报道稳定性好的ACTIN(HQ615689)。基因相对表达量分析运用2^-△△CT法进行数据处理(Livak andSchmittgen2001)，计算CsMYB2的表达水平。以上所有实验均设3次重复，实验用ddH₂O为阴性对照。

CsMYB2在红紫芽茶树同一植株不同发育程度叶片(红紫色叶/绿叶)间表达的结果如图4。结果表明，CsMYB2在花青素积累的红紫色芽叶中的表达水平显著高于绿叶。这说明CsMYB2的表达具有特异性。

7.CsMYB2基因的功能鉴定

为了验证CsMYB2基因的功能，经Gateway技术构建了CsMYB2的过量表达载体。通过BP和LR两步反应，即可将目的基因克隆入目的表达载体。首先，根据基因CsMYB2的全长cDNA序列，设计一对加上适合的重组位点(attB)的特异性引物CsMYB2(attB)N与CsMYB2(attB)C，以红紫芽茶树红紫色叶的cDNA为模板，扩增出带有重组位点(attB)的ORF片段，按照Invitrogen.提供的BP Clonase^TM II Enzyme Mix与LR Clonase^TM II Enzyme Mix试剂盒进行BP和LR反应，详见说明书。

BP反应是利用一个带有两个attB位点的DNA片段和一个带有两个attP位点的供体载体pDONOR221之间进行重组反应，创建一个入门克隆，具体方法为：用试剂盒中的30％PEG 8000/30mM MgCl₂溶液对扩增得到带有重组位点(attB)目的基因的PCR产物进行纯化，再与带有attP位点的供体载体pDONR221在室温下进行重组反应(BP反应)，得到的连接产物即为该基因的入门克隆，产生两个attL位点。然后将此连接产物转入大肠杆菌DH5α，在卡那霉素的抗性培养基上筛选，挑取转化单克隆菌株，进行菌落PCR鉴定，对鉴定为阳性的菌落进行摇菌扩增，提取质粒送至测序，提质粒，室温下与带有两个attR位点的目的表达载体pB2WG7进行LR重组反应4h，CsMYB2连接到pB2WG7载体上，获得构建好的35S启动子驱动的CsMYB2基因的植物表达载体，命名为pB2WG7-CsMYB2，通过冻溶法将其转化农杆菌EHA105菌株感受态细胞。经过农杆菌侵染、共培养、筛选培养和生根筛选后，得到转CsMYB2基因抗性拟南芥植株。转基因拟南芥中的花青素的积累情况见图5和图6。结果显示转基因拟南芥的花青素含量明显比对照高。植物表达载体的构建引物如表2中所示。

表2 植物表达载体构建引物

MYB是调控植物次生代谢的重要转录因子家族，其中与花色素代谢相关的主要是R2R3-MYB一类。通过RT-PCR和RACE相结合的方法，我们从红紫芽茶树叶片上分离到一个R2R3-MYB基因，命名为CsMYB2。CsMYB2与其他物种的R2R3MYB氨基酸序列具有很高的同源性，并在N端均有R2R3-DNA结合结构域，因此推测CsMYB2基因可能参与红紫芽茶树花青素的合成。CsMYB2在红紫芽茶树不同发育程度叶片中的表达都具有明显的差异。CsMYB2在不积累花色素苷的成熟叶片(绿叶)几乎没有表达，而在红紫色的芽叶中表达的水平较高(见图4)。在拟南芥中超表达CsMYB2可以促使拟南芥叶片积累花色素苷，进一步明确了CsMYB2调控红紫芽茶树芽叶花色素苷的功能。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种红紫芽茶树R2R3-MYB基因CsMYB2，其特征在于：具体核苷酸序列如SED NO ID：1所示。

2.根据权利要求1所述的红紫芽茶树R2R3-MYB基因CsMYB2，其特征在于：CsMYB2的氨基酸序列如SED NO ID：2所示。

3.权利要求1或2所述的红紫芽茶树R2R3-MYB基因CsMYB2的应用，其特征在于：所述的红紫芽茶树R2R3-MYB基因CsMYB2在提高植物的花色素苷积累方面应用。

4.根据权利要求3所述的红紫芽茶树R2R3-MYB基因CsMYB2的应用，其特征在于：所述的红紫芽茶树R2R3-MYB基因CsMYB2在提高转基因植物的花色素苷积累方面应用。

5.根据权利要求4所述的红紫芽茶树R2R3-MYB基因CsMYB2的应用，其特征在于：所述的转基因植物为转入CsMYB2基因的植物。

6.根据权利要求4所述的红紫芽茶树R2R3-MYB基因CsMYB2的应用，其特征在于：所述的转基因植物为转入CsMYB2基因的拟南芥。

7.根据权利要求6所述的红紫芽茶树R2R3-MYB基因CsMYB2的应用，其特征在于：所述的转入CsMYB2基因为通过置换反应将CsMYB2连接到pDONR221质粒与pB2GW7载体上，获得重组质粒，将重组质粒转化农杆菌EHA105菌株感受态细胞；完成转入CsMYB2基因。

8.根据权利要求7所述的红紫芽茶树R2R3-MYB基因CsMYB2的应用，其特征在于：所述的转化为冻融法转化方式。