CN104961811A

CN104961811A - 嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白及其应用

Info

Publication number: CN104961811A
Application number: CN201510367203.9A
Authority: CN
Inventors: 郑宗林; 黄朝芳; 王广军
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-06-29
Filing date: 2015-06-29
Publication date: 2015-10-07

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白及其应用，所述蛋白将外膜蛋白基因片段克隆入原核表达载体pET-30a得到重组表达载体，将重组表达载体转化大肠杆菌获得重组大肠杆菌，将所述重组大肠杆菌接种于Amp抗性的LB平板培养至OD₆₀₀达0.6时，加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L进行诱导表达，经纯化后获得嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白。本发明方法成功构建了嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白，使其可作为对鱼具有保护作用的疫苗，比较研究了嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白pompA在不同FIA作用下对斑点叉尾鮰的免疫效果。为进一步研究ompA及其能否作为基因工程亚单位疫苗的候选成分奠定基础。

Description

嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白及其应用。

背景技术

嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)广泛存在于自然界的淡水、污水和土壤中，通过污染的水和相关产品感染人类。临床症状表现为胃肠炎，皮肤和软组织感染，也是淡水养殖较为严重的病原菌之一。会导致鱼类的出血性败血症、积水、溃疡、无症状败血症和眼球突出等。此菌存在有多种血清型，随地域和宿主的不同而有所差异，限制了灭活疫苗的使用范围。解决此问题的关键在于找出嗜水气单胞菌的共同保护性抗原，以制备对不同血清型菌株均有保护作用的疫苗。外膜蛋白(outer membrane protein，OMP)是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分。它镶嵌于细菌外膜的中间，在维持细菌外膜结构、物质转运方面发挥着重要作用。有许多研究结果表明，细菌的主要外膜蛋白的免疫原性很强，是重要的保护性抗原，ompA蛋白族是革兰氏阴性菌外膜中的主要成分并且是保守的，其主要作用是维持外膜的完整。缺少ompA和胞壁脂蛋白的细菌变异株其形态为球形，细胞膜也不稳定。健康的动物具有抵抗病原微生物的侵袭和感染的能力，机体可依靠皮肤、粘膜、血脑等屏障结构阻止病原微生物的进入，还可通过组织和体液中的抗微生物物质如补体、溶菌酶、干扰素等进行抑菌、杀菌或溶菌，机体这一系列的免疫反应限制或抵制了细菌的复制。因此，病原菌的致病作用必须能够逃避或适应宿主的防御，许多研究已证实，某些细菌的OMP在细菌致病过程中起着重要的作用。用SDS-PAGE分析了致禽败血症的大肠埃希氏菌OMP，发现禽大肠埃希氏菌非致病或表现很髙LD₅₀的菌株都缺乏仅在致病菌株中才有的40.7和28.8KD的2种主要蛋白亚单位，说明这2种蛋白可能在禽败血症的致病过程中起作用，因此，利用致病菌的OMP做免疫原可使鱼免受产生对不同血清型菌株感染的交叉保护力。

鱼类的非特异性防御机制可以分为体液防御和细胞防御两种方式，并且这两种方式都是先天形成的，没有特异性能，作用于所有的外来病原微生物、也无遗传性和记忆性。其中溶菌酶、补体和巨噬细胞呼吸暴发活性是评价鱼类非特异性免疫防御的重要指标。

由此可见，能否利用嗜水气单胞菌外膜蛋白基因进行原核表达从而制备一种蛋白，使其可作为对鱼具有保护作用的疫苗，成为本领域技术人员亟待解决的技术难题。

发明内容

本发明为了解决上述技术问题，提供一种嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白及其应用。

本发明的技术方案包括：

一种嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白，所述蛋白将外膜蛋白基因片段克隆入原核表达载体pET-30a得到重组表达载体，将重组表达载体转化大肠杆菌获得重组大肠杆菌，将所述重组大肠杆菌接种于Amp抗性的LB平板培养至OD₆₀₀达0.6时，加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L进行诱导表达，经纯化后获得嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白，所述的嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.1，所述的嗜水气单胞菌外膜蛋白基因核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

所述的嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白可作为抗原在制备预防嗜水气单胞菌的疫苗制剂中使用。

所述预防嗜水气单胞菌的疫苗制剂还包括弗式不完全佐剂。

所述弗式不完全佐剂与所述嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白体积比为1:1。

所述的预防嗜水气单胞菌的疫苗制剂的制备方法包括以下步骤：在无菌注射器中加入制备好的嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白，用移液器向所述无菌注射器中加入等体积的弗式不完全佐剂，乳化5min后，用注射器反复推进，直至水相与油相完全融到一起乳化完全，形成油包水的乳白色液滴，即制成疫苗制剂。

一种嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：嗜水气单胞菌基因组DNA提取及嗜水气单胞菌外膜蛋白基因的克隆：从嗜水气单胞菌分离株提取基因组DNA，根据嗜水气单胞菌外膜蛋白基因序列设计特异性引物，进行PCR扩增反应，将得到的PCR扩增产物纯化后，以载体和插入片段物质的量之比1：3的比例克隆入pMD18-T载体，在含氨苄青霉素的LB平板上挑取阳性克隆，经双酶切和PCR鉴定后，获得阳性克隆提取质粒DNA；

步骤二：表达质粒构建：对测序正确的所述阳性克隆提取质粒DNA进行BamHI、HandⅢ酶切，同时用相同的内切酶对表达质粒pET-30a酶切，胶纯化回收酶切的目的基因片段和pET-30a载体片段，建立连接反应，得到重组质粒pET-32a(+)-pompA，将所述重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞，涂布LB平板，挑取单个菌落，接种于LB培养基中培养，抽提质粒，经酶切鉴定、PCR反应阳性鉴定后得到包含重组质粒pET-32a(+)-pompA的阳性重组大肠杆菌；

步骤三：嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白的诱导表达和纯化：将所述阳性重组大肠杆菌划线接种于Amp抗性的LB平板培养至OD₆₀₀达0.6时，加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L进行诱导表达，将诱导表达的菌液进行超声波破碎和鉴定，洗涤、溶解、过滤后即得嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白。

所述特异性引物为：上游引物：5’-CCATGGGCATGTGTTTAC-3’；下游引物：5’-GGATCCGACTGGTAGA-3’，上游引物序列为SEQ ID NO.3，下游引物序列为SEQ IDNO.4，采用NcoI酶切所述上游引物，采用BamH I酶切所述下游引物。

所述PCR扩增反应的体系为25μL：2×Taq Master Mix 12.5μl，DNA模板1μl，上游引物和下游引物各1.0μl，补加ddH₂O至25μl；所述PCR扩增反应的条件：95℃预变性5min，94℃50s，55℃30s，72℃50s，共30个循环，最后72℃延伸10min，取5μl反应产物以1％琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶成像系统检测扩增结果。

所述步骤二中抽提质粒的方法为碱裂解法。

所述步骤三中将所述阳性重组大肠杆菌划线接种于Amp抗性的LB平板培养的方法为：37℃培养过夜，次日挑取单菌落接种于10mL LB培养液中，200rpm振荡培养过夜，将过夜培养的菌液按1:50的比例接种于5mL LB培养液中，剧烈振荡培养至OD₆₀₀达0.6。

所述步骤三中诱导表达的过程为诱导4h后，取1mL菌液4℃、12000rpm离心1min，弃去上清；沉淀中加入40μl的Tris-HCl缓冲液和10μl的5×SDS上样缓冲液，100℃水浴加热变性10min，然后进行12％SDS-PAGE分析。

所述步骤三中洗涤、溶解、过滤的过程为：经超声波破碎和鉴定后的所述诱导表达的菌液的沉淀用含2M尿素的包涵体洗涤液洗涤，洗涤后8000r/min离心10min倒去上清，连续3次，每次约5min；最后用含6M盐酸胍的缓冲液溶解重组蛋白，溶解至清亮，将溶解后的溶液，用0.45μm孔径的滤膜过滤。

本发明的有益效果包括：本发明选取嗜水气单胞菌外膜蛋白ompA基因在大肠杆菌中进行表达并分析其免疫原性，并与弗式不完全佐剂(FIA)结合，比较研究了嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白pompA在不同FIA作用下对斑点叉尾鮰的免疫效果。为进一步研究ompA及其能否作为基因工程亚单位疫苗的候选成分奠定基础。

附图说明

图1所示为本发明PCR扩增结果图。

图2所示为本发明T克隆质粒pMD19-T-pompA酶切鉴定和PCR鉴定图。

图3所示为本发明重组表达质粒pET-32a(+)-pompA酶切鉴定和PCR鉴定图。

图4所示为本发明重组pompA的表达分析图。

图5所示为本发明预防嗜水气单胞菌的疫苗制剂对血清溶菌酶活力的影响比较图。

图6所示为本发明预防嗜水气单胞菌的疫苗制剂对血清ACH50活力影响比较图。

图7所示为本发明不同温度处理血清杀菌活性比较图。

图8所示为本发明预防嗜水气单胞菌的疫苗制剂对头肾巨噬细胞呼吸暴发活性。

图9所示为本发明预防嗜水气单胞菌的疫苗制剂对血清调理吞噬作用比较图。

图10所示为本发明预防嗜水气单胞菌的疫苗制剂对斑点叉尾鮰抗体水平的影响比较图。

图11所示为本发明嗜水气单胞菌攻毒斑点叉尾鮰的累计死亡数量图。

图12所示为本发明嗜水气单胞菌攻毒后斑点叉尾鮰的组织细菌计数图。

图13所示为本发明对照组组织病理学观察图；图13A对照组肾间质40倍放大图；图13B免疫组肾间质40倍放大图；图13C对照组肝细胞40倍放大图；图13D免疫组肝细胞40倍放大图；图13E对照组脑膜组织40倍放大图；图13F免疫组脑膜组织40倍放大图。

具体实施方式

下文将结合具体附图详细描述本发明具体实施例。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。

下文内容中所述的pompA+FIA即为本发明的预防嗜水气单胞菌的疫苗制剂，所述的pompA即为本发明的嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白。

本发明所使用的嗜水气单胞菌分离株可通过遗传工程操作，分离出本发明中的嗜水气单胞菌株可以重复操作分离。

嗜水气单胞菌分离株的分离方法包括：取一感染有嗜水气单胞菌的病鱼，无菌条件下取病鱼肝、肾组织划线种于普通营养琼脂平板和兔血营养琼脂平板上，37℃培养18hr，分离出病原菌。

嗜水气单胞菌分离株的鉴定方法：根据分离菌株的形态学特征和生理生化特性，参考《伯杰氏系统细菌鉴定手册》中气单胞菌的特性进行鉴定。

1、形态学观察：观察取病鱼肝组织印片及纯培养物涂片、固定，革兰氏染色后镜检。

分离菌株的形态特征：分离菌株为革兰氏阴性短杆菌，两端钝圆，无芽胞，散在或成对排列，大小0.4～0.6μm X 1.0～2.2μm，与濒死病鱼肝组织印片革兰氏染色镜检结果相一致。在普通营养琼脂平板上呈光滑、圆形、湿润、隆起、边缘整齐的淡黄色菌落。在兔血营养琼脂平板上呈强β型溶血。在营养肉汤中生长良好，均匀一致。

2、生理生化鉴定：将保存于普通营养琼脂斜面的纯培养物分别接种于不同的细菌生化微量鉴定管(杭州天和微生物试剂有限公司出品)，进行生化特性鉴定；根据分离菌株的特性，即有动力，氧化酶、按触酶阳性，呼吸发酵代谢，发酵萄糖、果糖，不发酵肌醇、侧金盏花醇、卫茅醇、木糖和棉子糖，水解淀粉、七叶灵，液化明胶，不分解尿素，还原硝酸盐各项目，符合嗜水气单胞菌的特性。

3、动物试验：将纯培养物接种于普通肉汤37℃培养18hr，取肉汤菌液0.2ml腹腔注射18～20克小白鼠4只，另设2只对照注射无菌肉汤，用最小致死剂量检测分离菌株的毒力。动物试验小白鼠接种肉汤菌液后48hr以内全部死亡，对照组观察至15日仍正常。分离菌株对小白鼠的MLD为2.0亿个细菌。

4、分离菌株对抗菌药物的敏感性：采用常规纸片法进行，置37℃培养18hr，抑菌圈大小取平均数。药敏纸片购自北京天坛药物生物技术开发公司。

分离菌株对抗菌药物的敏感性测定结果见表1。

表1分离菌株对抗菌药物的敏感性

根据分离菌株的形态学特征和生理生化特性，参考《伯杰氏系统细菌鉴定手册》中气单胞菌的特性，将分离菌定为嗜水气单胞菌。尽管分离菌株的某些生化特性有些区别，但其主要特性表现一致，这并不影响本菌的鉴定结果。

实施例1

一种嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白，所述的嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.1，所述的嗜水气单胞菌外膜蛋白基因核苷酸序列为SEQID NO.2。所述的嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白可作为抗原在制备预防嗜水气单胞菌的疫苗制剂中使用。所述预防嗜水气单胞菌的疫苗制剂还包括弗式不完全佐剂。所述弗式不完全佐剂同所述嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白体积比为1:1。

步骤一：嗜水气单胞菌基因组DNA提取及嗜水气单胞菌外膜蛋白基因的克隆；从嗜水气单胞菌分离株提取基因组DNA，根据嗜水气单胞菌外膜蛋白基因序列设计特异性引物，所述特异性引物为：上游引物：5’-CCATGGGCATGTGTTTAC-3’；下游引物：5’-GGATCCGACTGGTAGA-3’，上游引物序列为SEQ ID NO.3，下游引物序列为SEQ IDNO.4，采用NcoI酶切所述上游引物，采用BamH I酶切所述下游引物。进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应的体系为25μL：2×Taq Master Mix 12.5μl，DNA模板1μl，上游引物和下游引物各1.0μl，补加ddH₂O至25μl；所述PCR扩增反应的条件：95℃预变性5min，94℃50s，55℃30s，72℃50s，共30个循环，最后72℃延伸10min，取5μl反应产物以1％琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶成像系统检测扩增结果。将得到的PCR扩增产物纯化后，以载体和插入片段物质的量之比1：3的比例克隆入pMD18-T载体，在含氨苄青霉素的LB平板上挑取阳性克隆，经双酶切和PCR鉴定后，获得阳性克隆提取质粒DNA；

步骤二：表达质粒构建：对测序正确的所述阳性克隆提取质粒DNA进行BamHI、HandⅢ酶切，同时用相同的内切酶对表达质粒pET-30a酶切，胶纯化回收酶切的目的基因片段和pET-30a载体片段，建立连接反应，得到重组质粒pET-32a(+)-pompA，将所述重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞，涂布LB平板，挑取单个菌落，接种于LB培养基中培养，碱裂解法抽提质粒，经酶切鉴定、PCR反应阳性鉴定后得到包含重组质粒pET-32a(+)-pompA的阳性重组大肠杆菌；

步骤三：嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白的诱导表达和纯化：将所述阳性重组大肠杆菌划线接种于Amp抗性的LB平板培养，即37℃培养过夜，次日挑取单菌落接种于10mL LB培养液中，200rpm振荡培养过夜，将过夜培养的菌液按1:50的比例接种于5mL LB培养液中，剧烈振荡培养至OD₆₀₀达0.6。加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L进行诱导表达，诱导表达的过程为诱导4h后，取1mL菌液4℃、12000rpm离心1min，弃去上清；沉淀中加入40μl的Tris-HCl缓冲液和10μl的5×SDS上样缓冲液，100℃水浴加热变性10min，然后进行12％SDS-PAGE分析。将诱导表达的菌液进行超声波破碎和鉴定，经超声波破碎和鉴定后的所述诱导表达的菌液的沉淀用含2M尿素的包涵体洗涤液洗涤，洗涤后8000r/min离心10min倒去上清，连续3次，每次约5min；最后用含6M盐酸胍的缓冲液溶解重组蛋白，溶解至清亮，将溶解后的溶液，用0.45μm孔径的滤膜过滤后即得嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白。

一种嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白的应用，所述的预防嗜水气单胞菌的疫苗制剂的制备方法包括以下步骤：在无菌注射器中加入制备好的嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白，用移液器向所述无菌注射器中加入等体积的弗式不完全佐剂，乳化5min后，用注射器反复推进，直至水相与油相完全融到一起乳化完全，形成油包水的乳白色液滴，即制成疫苗制剂。

实施例2嗜水气单胞菌ompA基因的扩增、T克隆和鉴定

以嗜水气单胞菌PDK06株基因组DNA为模板，根据所设计的PCR引物，如图1所示，经PCR扩增出一条位于1000bp-1100bp区间的目的片断。PCR产物经胶回收纯化后，与pMD19-T载体连接获得重组质粒pMD19-T-ompA，对重组质粒pMD19-T-ompA测序结果表明，嗜水气单胞菌PDK06株的ompA基因是由1035个碱基组成的完整开放性阅读框(ORF)，编码一个长度为275个氨基酸的蛋白，重组质粒经酶切和PCR鉴定均正确。

实施例3嗜水气单胞菌ompA基因的PCR扩增、T克隆及表达载体的构建

经胶回收后克隆至pMD19-T载体，然后进行单双酶切鉴定和测序鉴定。单双酶切鉴定结果显示如图2所示：M1为DNA marker DL2000，1为pompA基因PCR扩增产物，2为pMD19-T-pompA经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切产物，3为pMD19-T-pompA经BamH Ⅰ单酶切产物，M2为DNA marker 10000；单酶切线性化重组载体约3600bp左右，双酶切出现两个条带，分别约1000bp和2500bp，测序结果与引物设计参考序列同区段相似性为100％。如图3所示：M1，DNA Marker(DL2,000)；1，PCR扩增产物；2，pET-32a(+)-pompA经BamHI和HindIII酶切；3，pET-32a(+)-pompA经BamHI酶切；4，pET-32a(+)经BamHI和Hind III酶切；5，pET-32a(+)经BamHI酶切；由图3可知，将酶切目的片段胶回收后连接至表达载体pET-32a(+)，经单双酶切显示与预期结果一致。

实施例4重组质粒pET-32a(+)-pompA诱导表达及纯化

将鉴定正确的重组质粒pET-32a(+)-pompA转化至BL21(DE3)中，将过夜培养的菌液按1:50的比例接种于5mLLB培养液中，加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L，诱导后进行SDS-PAGE检验，出现约41.4KDa大小的条带。诱导后的菌体经反复冻融，超声波破碎后分离上清和沉淀，发现表达重组蛋白以包涵体形式存在。如图4所示：M，蛋白质marker；1，未诱导的BL21-pET-32a(+)；2，IPTG诱导后的BL21-pET-32a(+)；3，IPTG诱导后的BL21-pET-32a(+)-pompA上清；4，IPTG诱导后的BL21-pET-32a(+)-pompA沉淀；5，纯化后的pompA；由图4可知，纯化蛋白经梯度脲素复性后进行浓缩，浓缩蛋白用核酸蛋白仪测定浓度达2.5mg/mL。

实施例5非特异性免疫指标检测

1、血清溶菌酶活力检测

本发明的预防嗜水气单胞菌的疫苗制剂对斑点叉尾鮰溶菌酶活性的影响见5。如图5所示可知，FIA疫苗组溶菌酶活力均极显著高于对照组和无佐剂疫苗组溶菌酶活力(p<0.01)，无佐剂疫苗组溶菌酶活力均显著高于对照组溶菌酶活力(p<0.05)。第4周到第8周免疫组溶菌酶活力差异不显著(p>0.05)，这个结果与FIA能将包裹的抗原缓慢释放刺激机体持续产生免疫应答的结果一致。根据以上结果得知，本发明的预防嗜水气单胞菌的疫苗制剂组能持续刺激斑点叉尾鮰产生较高水平的溶菌酶活力；而单纯的亚单位疫苗pompA与对照组相比也能明显够提高斑点叉尾鮰的溶菌酶活力。

2、ACH50活性检测

预防嗜水气单胞菌的疫苗制剂对斑点叉尾鮰ACH50活力的影响见图6。由图6所示可知，疫苗组ACH50活力均极显著高于对照组ACH50活力(p<0.01)，FIA疫苗组ACH50活力也显著高于无佐剂疫苗组(p<0.05)，第4、6和8周，各组ACH50活力均较稳定，试验组略有提高，证明了FIA能将包裹的抗原缓慢释放刺激机体持续产生免疫应答。根据以上结果得知，预防嗜水气单胞菌的疫苗制剂组能持续刺激斑点叉尾鮰产生较高水平的ACH50活力，而单纯的亚单位疫苗pompA与对照组相比也可显著够提高斑点叉尾鮰的ACH50活力。

3、血清杀菌活行检测

为了测定血清杀菌中补体和抗体的作用，分别将免疫组和对照组第4周血清经过56℃处理、100℃处理和未处理，检测了不同组的血清杀菌活性。如图7所示可知，免疫组未处理血清的细菌存活率最低，其次为56℃处理血清和100℃处理血清细菌存活率，且各处理间差异极显著(p<0.01)，说明血清中的补体和抗体在血清杀菌中起重要作用。未处理血清FIA+pompA组杀菌活性最强，但与pompA组差异不显著(p>0.05)；56℃处理血清FIA+pompA组杀菌活性最强，与其他组差异极显著(p<0.01)，而pompA组血清细菌存活率高于FIA+pompA组，显著低于对照组(p>0.05)；100℃处理血清仍然是FIA+pompA组细菌存活率最低，显著低于对照组和pompA组，而pompA组细菌存活率接近对照组，说明pompA组中抗体介导杀菌起主要作用。

4、呼吸暴发活性检测

采用四唑氮蓝(NBT)法测定头肾巨噬细胞呼吸暴发活性。如图8所示可知，测定三个时间点的FIA亚单位疫苗组之间头肾巨噬细胞呼吸暴发活性差异不显著(p>0.05)，预防嗜水气单胞菌的疫苗制剂组与pompA组和对照组差异极显著(p<0.01)，pompA组与对照组差异显著(p<0.05)，说明FIA能增强斑点叉尾鮰头肾巨噬细胞呼吸暴发活力。

5、调理吞噬试验

第4周免疫组和对照组血清经56℃加热处理，以灭活补体，测定了特异性抗体对嗜水气单胞菌的调理吞噬作用。如图9所示可知，FIA+pompA组血清处理的嗜水气单胞菌被斑点叉尾鮰头肾巨噬细胞吞噬的数量最多，其次依次为AHA+pompA组、PA+pompA组、pompA组和PBS组，且各组间差异极显著(p<0.01)。

6、抗体水平检测

分别测定了免疫组和对照组第3周到第8周抗体水平。如图10所示可知，FIA疫苗组抗体水平第5周达到峰值，pompA组第4周抗体水平达到峰值。第3周到第8周FIA+pompA组抗体水平最高，极显著高于其余各组(p<0.01)；第3周到第6周pompA组抗体水平也极显著高于对照组(p<0.01)；第7、8周pompA组抗体水平与对照组没有显著差异(p>0.05)。说明FIA能提高亚单位疫苗pompA的抗体水平，且能在较长时间维持抗体水平。

7、死亡情况和相对免疫保护率

如图11所示可知，死亡率为纵坐标，时间为横坐标，试验鱼攻毒后第3d开始陆续死亡，FIA+pompA组第5d开始死亡，各组分别在第8d到第10d达到死亡高峰期。PBS、FIA、pompA和FIA+pompA组连续观察14d的累计死亡率分别为93.33％、93.33％、50.00％和13.33％。pompA和FIA+pompA组相对保护率分别为46.43％和85.71％。

8、组织器官细菌计数

如图12所示可知，纵坐标为活菌数量，攻毒后48h肝脏、肾脏和脾脏组织细菌计数结果显示，各组脾脏和肾脏细菌数量均高于肝脏，说明嗜水气单胞菌感染斑点叉尾鮰后在肾脏和脾脏组织中增殖最快。FIA+pompA组肝脏组织中细菌含量最低，且这两组与其他组肝脏组织中细菌含量差异极显著(p<0.01)，pompA组肝脏组织中细菌含量与对照组差异不显著(p>0.05)；FIA+pompA组肾脏组织中细菌含量最低，且与其他各组差异显著(p<0.05)，而其他组之间肾脏组织中细菌含量差异均不显著(p>0.05)；FIA+pompA组脾脏组织中细菌含量最低。

9、组织病理学观察

攻毒后第3d试验鱼开始死亡，死亡鱼体表出现退色斑，个别鱼鳍条基部有出血现象。剖检后发现肝脏肿大，充血，质脆；肾脏肿大，有出血点；脾脏肿大、颜色变深；脑膜充血；其它内脏器官无明显病变。接种死亡鱼肝脏、肾脏、脾脏组织于BHI平板，生长出单一针尖状菌落，染色为革兰氏阴性菌，经鉴定为嗜水气单胞菌。

分别在第4周、6周和8周剖检各组试验鱼，观察发现，第8周FIA组和FIA+pompA组仍然在斑点叉尾鮰肠系膜周围附着有大量白色乳状佐剂液滴，但在注射部位未观察到肉芽肿瘤和组织损伤。

组织病理学观察发现：如图13A所示，对照组肾间质水肿，毛细血管充血，多处出现大小不等的坏死灶，内有炎性细胞浸润，肾小球毛细血管充血，肾小管上皮细胞变性坏死，管腔周围炎性细胞浸润；如图13C所示，肝索结构不清晰，中央静脉管腔内出现炎性细胞，管腔内皮细胞肿胀，部分细胞坏死，肝细胞肿胀、严重空泡变性，部分肝细胞坏死；如图13E所示，脑膜水肿增厚，毛细血管严重充血，并伴有炎性细胞浸润，神经元细胞变性坏死。而免疫组肾间质毛细血管充血，如图13B所示，肾小球毛细血管充血，内皮细胞肿胀，肾小管上皮细胞变性，基底层裸露；肝组织结构清晰，肝细胞轻度变性，部分细胞核浓缩，颜色加深，局部出现坏死灶；如图13D所示，肝细胞轻度变性，部分细胞胞浆内出现小空泡，灶性周围肝细胞空泡变性；如图13F所示，脑膜轻度水肿，局部毛细血管充盈，胶质细胞增生，出现嗜神经现象。

本发明测定了弗式不完全佐剂(FIA)等比混合亚单位疫苗pompA免疫斑点叉尾鮰后对其非特异性免疫应答的影响，结果显示FIA能显著增强斑点叉尾鮰的溶菌酶活性、ACH50活性和头肾巨噬细胞呼吸暴发活性。三个非特异性免疫指标在第4周、第6周和第8周各组内的变化差异不显著，其中FIA组的溶菌酶活性和呼吸暴发活性均高于PA组。

特异性免疫是指机体受到外来抗原性异物刺激后，体内的相关免疫细胞发生一系列免疫应答反应，以排除外来抗原性异物，保持机体内环境的相对稳定，具有后天性，特异性。免疫球蛋白(immune globulin，Ig)是鱼类特异性体液免疫应答中最主要的介质，主要以可溶性的抗体形式分泌于血液和其它体液中介导体液免疫。本发明实施例结果显示pompA组抗体水平峰值出现在第4周，与之前的研究结果一致，而FIA组抗体水平在第5周达到了峰值，与之前的研究存在差异，这可能与免疫程序和疫苗本身有关系。很多人以油佐剂进行了鱼类疫苗的研究，结果显示其能使抗原缓慢释放和持续作用，增加抗原对免疫系统的暴露时间，从而能更长时间的维持较高的抗体水平。本研究结果显示剖检免疫组斑点叉尾鮰发现，第8周仍然能在试验鱼腹腔内看到白色乳状液滴，而其他组未见疫苗或佐剂。

鱼类的免疫球蛋白主要为IgM，当外来抗原进入鱼体内部时，通过抗原的递呈作用，使B细胞增殖分化为浆细胞，合成并分泌特异性抗体，抗体的Fab片段能直接与抗原结合，而Fc片段能和吞噬细胞表面的Fc受体结合，促进吞噬细胞的吞噬。本研究将不同免疫组的血清通过56℃处理灭活补体后，测定了各组处理血清中抗体介导的调理吞噬作用，结果显示，FIA组的血清具有更强的调理吞噬能力，显著高于pompA组，说明佐剂能较高水平的诱导斑点叉尾鮰有效抗体的产生。

相对免疫保护率(RPS)是评价疫苗效果最具说服力的指标。本研究结果显示亚单位疫苗pompA只具有中等免疫保护效果，相对免疫保护率为46.43％，添加FIA后相对免疫保护率显著增加，FIA组相对免疫保护率分别为85.71％。

攻毒后细菌在各个组织器官数量和各组织器官的病理损伤程度也是评价疫苗免疫效果的重要指标之一。病原进入机体后，通过血液循环到达各组织器官，而在这个过程中，机体免疫系统被激发，各个免疫细胞和免疫因子共同参与对病原的清除。本发明实施例结果显示攻毒后48h，各组肝脏中的细菌数量明显低于脾脏和肾脏中细菌的数量，这可能是因为肾脏和脾脏是重要的造血和免疫器官，嗜水气单胞菌更容易通过吞噬细胞和血液循环进入这两个组织。FIA组肝脏、肾脏和脾脏中的细菌含量均低于其他组。同时组织病理学观察结果显示对照组肝脏、肾脏和脑均出现严重的变性、坏死和充血出血等症状，而FIA组相应组织的病理变化不明显，说明FIA能刺激斑点叉尾鮰免疫系统，产生免疫应答，增强对嗜水气单胞菌的抵抗能力。

本发明选取嗜水气单胞菌外膜蛋白ompA基因在大肠杆菌中进行表达并分析其免疫原性，并与弗式不完全佐剂(FIA)结合，比较研究了嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白pompA在不同FIA作用下对斑点叉尾鮰的免疫效果。为进一步研究ompA及其能否作为基因工程亚单位疫苗的候选成分奠定基础。

上述详细说明是针对发明的可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应当包含于本发明的专利范围内。

另外，本领域技术人员还可在本发明权利要求公开的范围和精神内做其它形式和细节上的各种修改、添加和替换。当然，这些依据本发明精神所做的各种修改、添加和替换等变化，都应包含在本发明所要求保护的范围之内。

Claims

1.一种嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白，其特征在于，所述蛋白将外膜蛋白基因片段克隆入原核表达载体pET-30a得到重组表达载体，将重组表达载体转化大肠杆菌获得重组大肠杆菌，将所述重组大肠杆菌接种于Amp抗性的LB平板培养至OD₆₀₀达0.6时，加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L进行诱导表达，经纯化后获得嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白，所述的嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.1，所述的嗜水气单胞菌外膜蛋白基因核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

2.一种权利要求1所述的嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白的应用，其特征在于，所述的嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白可作为抗原在制备预防嗜水气单胞菌的疫苗制剂中使用。

3.根据权利要求2所述的一种嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白的应用，其特征在于，所述预防嗜水气单胞菌的疫苗制剂还包括弗式不完全佐剂。

4.根据权利要求3所述的一种嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白的应用，其特征在于，所述弗式不完全佐剂与所述嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白体积比为1:1。

5.根据权利要求4所述的一种嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白的应用，其特征在于，所述的预防嗜水气单胞菌的疫苗制剂的制备方法包括以下步骤：在无菌注射器中加入制备好的嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白，用移液器向所述无菌注射器中加入等体积的弗式不完全佐剂，乳化5min后，用注射器反复推进，直至水相与油相完全融到一起乳化完全，形成油包水的乳白色液滴，即制成疫苗制剂。