CN104950111A - 一种定量检测样本中髓过氧化物酶浓度的液态芯片试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于体外免疫检测技术领域，具体涉及一种检测样本中髓过氧化物酶(MPO)浓度的试剂盒及其制备方法。本试剂盒包括包被有抗髓过氧化物酶的单克隆抗体的微球、平台载体、髓过氧化物酶的浓度梯度标准品、髓过氧化物酶质控品、荧光标记试剂标记的髓过氧化物酶抗体、样本缓冲液、洗液。本发明所用的检测仪器为Luminex的MAGPIX，能够准确地进行多个人份的髓过氧化物酶浓度的测定，同时能够增加检测标记物的种类，实现心血管疾病的准确诊断，有重要的应用前景。

Description

一种定量检测样本中髓过氧化物酶浓度的液态芯片试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明属于体外免疫检测技术领域，具体涉及一种检测样本中髓过氧化物酶浓度测定的试剂盒及其制备方法。

背景技术

根据世界心脏联盟统计，心血管疾病引起的死亡人数约占世界总死亡人数的1/3，心脑血管疾病的患病率、发病率和死亡率呈逐年上升趋势，已经成为人类健康的“头号杀手”，严重威胁人类的生命。对于心血管疾病的准确诊断预测有着重要的意义。

髓过氧化物酶(MPO)是一种相对分子质量为144KD的白细胞酶，是糖基化的血红素蛋白。在特定条件下,它能诱导氧化应激和组织损伤,作为系统炎症和氧化应激的标志物。大量流行病学研究显示MPO浓度的增高与冠心病密切相关，因此检测病人血浆中MPO的浓度对于冠心病患者具有十分重要的参考价值。

目前对于心血管疾病的免疫诊断方法，只能对一种单一的指标进行检测，由于不同指标存在的灵敏度、精确度以及特异性的差别，在临床诊断中经常出现高的假阴性率。

发明内容

本发明相对于传统的免疫测定法，旨在提供高通量、快速、准确的可同时检测多种心血管标志物的技术平台和试剂盒，该试剂盒同时还能降低假阴性率。

一种定量检测样本中髓过氧化物酶浓度的液态芯片试剂盒，包括包被有抗髓过氧化物酶的单克隆抗体的微球、带孔的平台载体、髓过氧化物酶的浓度梯度标准品、髓过氧化物酶质控品、荧光标记试剂标记的髓过氧化物酶抗体、样本缓冲液、洗液。

作为优选方案，所述微球为表面带有荧光色的、可以实现荧光编码的聚苯乙烯磁微球，带孔的平台载体每孔里面包被有1000-5000个微球，而每个微球含有2*10^-6-5*10^-5g抗髓过氧化物酶的单克隆抗体。

作为优选方案，所述带孔的平台载体为微孔反应板。

作为优选方案，所述髓过氧化物酶的浓度梯度标准品和髓过氧化物酶质控品为冻干粉末，所述髓过氧化物酶的浓度梯度标准品是将6个、浓度分别为0、50、100、200、400、800ng/ml的髓过氧化物酶标准品制成冻干粉末；髓过氧化物酶质控品是将2个，浓度为80、500ng/ml的髓过氧化物酶质控品制成冻干粉末。

作为优选方案，所述髓过氧化物酶的浓度梯度标准品和髓过氧化物酶质控品都是用髓过氧化物酶纯品与自制的髓过氧化物酶标准品稀释液按照1:200000-1:1000稀释而成，所述髓过氧化物酶标准品不少于2个，所述髓过氧化物酶质控品和所述髓过氧化物酶标准品的浓度不同，所述髓过氧化物酶质控品的作用是在试剂盒使用过程中起到核准校对的作用，即通过髓过氧化物酶质控品测值是否在质控范围内来对髓过氧化物酶标准品拟合出来的曲线进行核准校对，若髓过氧化物酶质控品测值合格，则可以利用标准曲线来拟合出样本中的髓过氧化物酶的浓度值。

作为优选方案，所述的髓过氧化物酶标准品稀释液，是在PH7.0-7.4、浓度为10-100mM磷酸盐缓冲液中，分别加入1-10％质量分数的动物血清、0.01-0.5％质量分数的防腐剂、1-10％质量分数的蛋白保护剂、0.05-1％质量分数的表面活性剂混合而成。

作为优选方案，所述荧光标记试剂标记的髓过氧化物酶抗体为单克隆抗体。

作为优选方案，所述荧光标记试剂为藻红蛋白。

作为优选方案，所述样本缓冲液为含有蛋白保护剂的磷酸盐缓冲液，是在10-100mM磷酸盐缓冲液中，分别加入1-10％质量分数的蛋白保护剂、0.01-0.5％质量分数的防腐剂混合而成。

作为优选方案，所述的表面活性剂为曲达通X-100、吐温20、布里杰-35、吐温40、吐温60、吐温80、十二烷基磺酸钠、斯盘20、烷基酚聚氧乙烯4醚、聚乙二醇2000、聚乙二醇4000。

作为优选方案，所述的防腐剂为Proclin 300、叠氮钠、硫柳汞、硫酸庆大霉素。

作为优选方案，所述的蛋白保护剂为牛血清白蛋白、牛γ蛋白、海藻糖、甘油、蔗糖。

制备所述试剂盒的方法，包括以下制备过程，所述制备过程不分先后：

包被有抗髓过氧化物酶的单克隆抗体的微球的制备：将未包被的微球中加入磷酸二氢钠缓冲液、N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液和碳二亚胺溶液进行活化；然后加入特异性的抗髓过氧化物酶的单克隆抗体1-125μg在4-8℃进行包被；洗涤；再加入含1-10％质量分数的动物血清蛋白的封闭液过夜封闭；最后在10-100mM磷酸盐缓冲液中避光、4-8℃存放；

髓过氧化物酶的浓度梯度标准品和髓过氧化物酶质控品的制备：先在PH 7.0-7.4、浓度为10-100mM磷酸盐缓冲液中，分别加入1-10％质量分数的动物血清、0.01-0.5％质量分数的防腐剂、1-10％质量分数的蛋白保护剂、0.05-1％质量分数的表面活性剂混合而成标准品稀释液；再将纯品与自制的标准品稀释液按照1:200000-1:1000稀释而成标示浓度为0-800ng/ml的浓度梯度标准品以及60-250ng/ml的髓过氧化物酶质控品；

荧光标记试剂标记的髓过氧化物酶抗体：将荧光标记试剂通过偶联剂进行衍生化，然后与髓过氧化物酶抗体进行共价交联，反应后用终止剂终止反应，即可获得荧光标记试剂标记的抗体，将荧光标记试剂标记的髓过氧化物酶抗体于含有保护剂的磷酸盐缓冲液中，4-8℃保存；

样本缓冲液的制备：在10-200mM磷酸盐缓冲液中，加入1-10％质量分数的蛋白保护剂，0.01-0.5％质量分数的防腐剂混合而成；

洗液的制备：在10-100mM磷酸盐缓冲液中，加入1％质量分数的表面活性剂混合而成。

作为优选方案，所述N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液和碳二亚胺溶液购买于Pierce公司，所述动物血清蛋白为牛血清白蛋白。

本发明基于Luminex xMAP技术平台，把直径为6.5um的聚苯乙烯小磁球用荧光染色的方法进行编码，通过调节两种荧光染料的不同配比获得最多可达100种具有不同特征荧光谱的微球，然后将每种编码微球共价交联上针对特定检测物的抗原、抗体或核酸探针等捕获分子。检测时微球被微量液体传送系统排成单列通过两束激光，一束判定颗粒的颜色从而决定被测物的特异性(定性测试)；另一束测定微粒上的荧光标记强度对被检测测物定量，所得的数据经电脑处理后可以直接用来判断结果。Luminex xMAP技术具有自由组合、高通量、高速度、低成本、准确性高、重复性好、灵敏度高、线性范围广、无需洗涤、操作简便的优点。在临床诊断中引进液态芯片技术和产品，将极大地提高检测效率和降低检测成本。

本发明是在Luminex xMAP技术平台上，通过双抗夹心法对MPO的浓度进行准确定量，同时能够与不同的标志物进行自由组合，达到多种标志物的同时检测，提高心血管疾病检测的准确性，降低临床检测中的假阴性率。

附图说明

图1为实施例4标准曲线图。

图2为实施例5标准曲线图。

图3为实施例6标准曲线图。

图4为实施例7标准曲线图。

图5为实施例8标准曲线图。

图6为实施例9标准曲线图。

图7为实施例10标准曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1：

通过以下方法制备该试剂盒中的荧光标记试剂标记的髓过氧化物酶抗体，其中所述的荧光标记试剂标记的髓过氧化物酶抗体为藻红蛋白标记的髓过氧化物酶单克隆抗体：

1)藻红蛋白的衍生化

取4.5mg藻红蛋白溶于1.0mL磷酸盐缓冲液中，加入10μL 3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)无水甲醇溶液(4mg/mL)，使得SPDP与藻红蛋白摩尔比约为10，常温反应50min，经葡聚糖凝胶层析脱盐，磷酸盐缓冲液平衡和洗脱，收集藻红蛋白溶液峰。

2)单克隆抗体的巯基化

取0.5mg的抗体，加入上述SPDP无水甲醇液，使得SPDP与抗体的摩尔比约为10，常温反应40min，加入二硫苏糖醇(DTT)使得其终浓度为25μM，常温反应25min，同上过葡聚糖凝胶层析，收集蛋白峰。

3)藻红蛋白与单克隆抗体的交联

取0.75mg/mL衍生化的荧光藻红蛋白与0.25mg/mL巯基化的单克隆抗体等量混合，摇床低速振荡，4℃反应过夜。藻红蛋白标记制品最后溶于磷酸盐缓冲液中，4℃保存。

实施例2：

通过以下方法制备该试剂盒中的荧光标记试剂标记的髓过氧化物酶抗体，其中所述的荧光标记试剂标记的髓过氧化物酶抗体为藻红蛋白标记的髓过氧化物酶单克隆抗体：

1)藻红蛋白的衍生化

取4.5mg藻红蛋白溶于1.0mL磷酸盐缓冲液中，加入5μL 3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)无水甲醇溶液(4mg/mL)，使得SPDP与藻红蛋白摩尔比约为5，常温反应50min，经葡聚糖凝胶层析脱盐，磷酸盐缓冲液平衡和洗脱，收集藻红蛋白溶液峰。

2)单克隆抗体的巯基化

取0.5mg的抗体，加入上述SPDP无水甲醇液，使得SPDP与抗体的摩尔比约为5，常温反应40min，加入二硫苏糖醇(DTT)使得其终浓度为25μM，常温反应25min，同上过葡聚糖凝胶层析，收集蛋白峰。

3)藻红蛋白与单克隆抗体的交联

取0.75mg/mL衍生化的荧光藻红蛋白与0.25mg/mL巯基化的单克隆抗体等量混合，摇床低速振荡，4℃反应过夜。藻红蛋白标记制品最后溶于磷酸盐缓冲液中，4℃保存。

实施例3：

本发明髓过氧化物酶(MPO)浓度液态芯片检测试剂盒的操作使用方法如下：

1.将标准品和质控品分别用去离子水复溶混匀，分别向微孔板中加入标准品50ul/孔、质控品10ul/孔、样本缓冲液40ul/孔；

2.将包被抗体的磁微球稀释25倍，然后分别向微孔板中加入50ul磁微球，常温振荡反应120min；

3.用洗板机洗板两次；

4.向微孔板中加入藻红蛋白标记的抗体100ul/孔，放在摇床上室温反应60min；

5.用洗板机洗板两次；

6.向微孔板中加入100ul/孔的鞘液，常温振荡10min；

7.利用Luminex MAGPIX读取各反应孔的荧光值；

8.将标准品的浓度值和荧光值进行二次曲线回归拟合出标准曲线，再将样本的荧光值带入标准曲线中，即可得出样本中MPO的浓度值。

实施例4：

通过以下方法制备该试剂盒：

分别包被有抗髓过氧化物酶的单克隆抗体的微球的制备：取未包被的微球5.0×10⁶个，加入60μL的pH值为6.2的100mM磷酸二氢钠缓冲液、20μL的25mg/mL N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液和20μL的25mg/mL碳二亚胺溶液进行活化，然后加入特异性的单克隆抗体25μg进行包被；再加入含1％质量分数的牛血清白蛋白的封闭液进行封闭；最后在10mM的磷酸盐缓冲液中避光、4℃存放；

藻红蛋白(PE)标记的特异抗髓过氧化物酶单克隆抗体的制备方法跟实施例1完全相同；

髓过氧化物酶的浓度梯度标准品和髓过氧化物酶质控品的制备：用含有1％质量分数的新生牛血清、0.01％质量分数的Proclin300、1％质量分数的牛血清白蛋白、0.05％质量分数的Triton X-100的10mM磷酸钠缓冲溶液(PH7.0)分别将标志物的纯品配制成标示浓度为0、50、100、200、400、800ng/ml的浓度梯度标准品以及60、250ng/ml的质控品；然后制成冻干粉，4℃保存；

样本缓冲液的制备：向10mM磷酸盐缓冲液(PH7.4)中分别添加：1％质量分数的牛血清白蛋白和0.01％质量分数的Proclin 300，充分混匀；

洗液的制备：在10mM磷酸盐缓冲液中，加入1％质量分数的Tween-20混合而成。

如附图1所示为本实施例的标准曲线图，表1为采用实施例3所述的方法检测本实施例质控品、样本的检测结果，其中样本1、2来源于人体血浆，从表1可以看出质控品1和质控品2的检测值在对应的靶值范围内，所以可以确定质控品可控，结果可信；而样本1、2的检测值偏差与其对应的靶值相比，偏差小于10％，说明该试剂盒检测准确率高。

表1质控品、样本检测结果

实施例5：

通过以下方法制备该试剂盒：

分别包被有抗髓过氧化物酶的单克隆抗体的微球的制备：取未包被的微球5.0×10⁶个，加入60μL的pH值为6.2的100mM磷酸二氢钠缓冲液、20μL的25mg/mL N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液和20μL的25mg/mL碳二亚胺溶液进行活化，然后加入特异性的单克隆抗体25μg进行包被；再加入含10％质量分数的牛血清白蛋白的封闭液进行封闭；最后在100mM的磷酸盐缓冲液中避光、8℃存放；

髓过氧化物酶的浓度梯度标准品和髓过氧化物酶质控品的制备：用含有10％质量分数的新生牛血清、0.5％质量分数的Proclin300、10％质量分数的牛血清白蛋白、1％质量分数的Triton X-100的100mM磷酸钠缓冲溶液(PH8.0)分别将标志物的纯品配制成标示浓度为0、50、100、200、400、800ng/ml的浓度梯度标准品以及60、250ng/ml的质控品；然后制成冻干粉，4℃保存；

藻红蛋白(PE)标记的特异抗髓过氧化物酶单克隆抗体的制备方法跟实施例2完全相同；

样本缓冲液的制备：向100mM磷酸缓冲液(PH7.4)中分别添加：10％质量分数的牛血清白蛋白和0.5％质量分数的Proclin 300，充分混匀；

洗液的制备：在100mM磷酸盐缓冲液(PH8.0)中，加入10％质量分数的Tween-20混合而成。

如附图2所示为本实施例的标准曲线图，表2为采用实施例3所述的方法检测本实施例质控品、样本的检测结果，其中样本1、2来源于人体血浆，从表2可以看出质控品1和质控品2的检测值在对应的靶值范围内，所以可以确定质控品可控，结果可信；而样本1、2的检测值偏差与其对应的靶值相比，偏差小于10％，说明该试剂盒检测准确率高。

表2质控品、样本检测结果

实施例6：

与实施例4基本相同，不同的是：

髓过氧化物酶的浓度梯度标准品和髓过氧化物酶质控品的制备：用含有2％质量分数的新生牛血清、0.05％质量分数的Proclin300、5％质量分数的牛血清白蛋白、0.15％质量分数的Triton X-100的20mM磷酸钠缓冲溶液(PH7.4)分别将标志物的纯品配制成标示浓度为0、50、100、200、400、800ng/ml的一浓度梯度标准品以及60、250ng/ml的质控品；然后制成冻干粉，4℃保存；

样本缓冲液的制备：向100mM磷酸缓冲液(PH7.4)中分别添加：1％质量分数的牛血清白蛋白和0.05％质量分数的Proclin 300，充分混匀。

如附图3所示为本实施例的标准曲线图，表3为本实施例质控品、样本检测结果，从表3可以看出，质控品1和质控品2的检测值在对应的靶值范围内，所以可以确定质控品可控，结果可信；而样本1、2的检测值偏差与其对应的靶值相比，偏差小于10％，说明该试剂盒检测准确率高，其中样本1、2来自于人体血浆。

表3质控品、样本检测结果

实施例7：

本实施例与实施例5基本相同，不同的是：

通过以下方法制备该试剂盒中的抗髓过氧化物酶的单克隆抗体的微球：

取未包被的微球5.0×10⁶个，加入60μL的pH值为6.2的100mM磷酸二氢钠缓冲液、20μL的25mg/mL N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液和20μL的125mg/mL碳二亚胺溶液进行活化，然后加入特异性的单克隆抗体50μg进行包被；再加入含1％牛血清白蛋白的封闭液进行封闭；最后在磷酸盐缓冲液中避光、4℃存放；

髓过氧化物酶的浓度梯度标准品和质控品的制备：用含有10％新生牛血清、0.5％Proclin300、10％牛血清白蛋白、1％Triton X-100的20mM磷酸钠缓冲溶液(PH7.4)分别将标志物的纯品配制成标示浓度为0、50、100、200、400、800ng/ml的一系列浓度梯度标准品以及60、250ng/ml的质控品；然后制成冻干粉，4℃保存；

样本缓冲液的制备：向100mM磷酸缓冲液(PH7.4)中分别添加：10％牛血清白蛋白和1％Proclin 300，充分混匀。

如附图4所示为本实施例的标准曲线图，表4为本实施例质控品、样本检测结果，从表4可以看出，质控品1和质控品2的检测值在对应的靶值范围内，所以可以确定质控品可控，结果可信；而样本1、2的检测值偏差与其对应的靶值相比，偏差小于10％，说明该试剂盒检测准确率高，其中样本1、2来自于人体血浆。

表4质控品、样本检测结果

实施例8：

与实施例6基本相同，不同的是：

通过以下方法制备该试剂盒中的抗髓过氧化物酶的单克隆抗体的微球：

取未包被的微球5.0×10⁶个，加入60μL的pH值为6.2的100mM磷酸二氢钠缓冲液、20μL的25mg/mL N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液和20μL的125mg/mL碳二亚胺溶液进行活化，然后加入特异性的单克隆抗体50μg进行包被；再加入含1％牛血清白蛋白的封闭液进行封闭；最后在磷酸盐缓冲液中避光、4℃存放；

如附图5所示为本实施例的标准曲线图，表5为本实施例质控品、样本检测结果。

表5质控品、样本检测结果

实施例9：

与实施例6基本相同，不同的是：

通过以下方法制备该试剂盒中的抗髓过氧化物酶的单克隆抗体的微球：

取未包被的微球5.0×10⁶个，加入60μL的pH值为6.2的100mM磷酸二氢钠缓冲液、20μL的25mg/mL N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液和20μL的125mg/mL碳二亚胺溶液进行活化，然后加入特异性的单克隆抗体100μg进行包被；再加入含1％牛血清白蛋白的封闭液进行封闭；最后在磷酸盐缓冲液中避光、4℃存放；

如附图6所示为本实施例的标准曲线图，表6为本实施例质控品、样本检测结果。

表6质控品、样本检测结果

实施例10：

与实施例6基本相同，不同的是：

通过以下方法制备该试剂盒中的抗髓过氧化物酶的单克隆抗体的微球：

取未包被的微球5.0×10⁶个，加入60μL的pH值为6.2的100mM磷酸二氢钠缓冲液、20μL的25mg/mL N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液和20μL的125mg/mL碳二亚胺溶液进行活化，然后加入特异性的单克隆抗体125μg进行包被；再加入含1％牛血清白蛋白的封闭液进行封闭；最后在磷酸盐缓冲液中避光、4℃存放；

如附图7所示为本实施例的标准曲线图，表7为本实施例质控品、样本检测结果。

表7质控品、样本检测结果

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种定量检测样本中髓过氧化物酶浓度的液态芯片试剂盒，包括包被有抗髓过氧化物酶的单克隆抗体的微球、带孔的平台载体、髓过氧化物酶的浓度梯度标准品、髓过氧化物酶质控品、荧光标记试剂标记的髓过氧化物酶抗体、样本缓冲液、洗液。

2.所述微球为表面带有荧光色的、可以实现荧光编码的聚苯乙烯磁微球，带孔的平台载体每孔里面包被有1000-5000个微球，而每个微球含有2*10^-6-5*10^-5g的抗髓过氧化物酶的单克隆抗体。

3.所述带孔的平台载体为微孔反应板。

4.所述髓过氧化物酶的浓度梯度标准品和髓过氧化物酶质控品都是用髓过氧化物酶纯品与自制的髓过氧化物酶标准品稀释液按照1:200000-1:1000稀释而成，所述髓过氧化物酶标准品不少于2个，所述髓过氧化物酶质控品和所述髓过氧化物酶标准品的浓度不同，所述髓过氧化物酶质控品的作用是在试剂盒使用过程中起到核准校对的作用，即通过髓过氧化物酶质控品测值是否在质控范围内来对髓过氧化物酶标准品拟合出来的曲线进行核准校对，若髓过氧化物酶质控品测值合格，则可以利用标准曲线来拟合出样本中的髓过氧化物酶的浓度值。

5.所述的髓过氧化物酶标准品稀释液，是在PH 7.0-7.4、浓度为10-100mM磷酸盐缓冲液中，分别加入1-10％质量分数的动物血清、0.01-0.5％质量分数的防腐剂、1-10％质量分数的蛋白保护剂、0.05-1％质量分数的表面活性剂混合而成。

6.所述荧光标记试剂标记的髓过氧化物酶抗体为单克隆抗体。

7.所述荧光标记试剂为藻红蛋白。

8.所述样本缓冲液为含有蛋白保护剂的磷酸盐缓冲液，是在10-100mM磷酸盐缓冲液中，加入1-10％质量分数的蛋白保护剂，0.01-0.5％质量分数的防腐剂混合而成。

9.制备所述试剂盒的方法，包括以下制备过程，所述制备过程 不分先后：

包被有抗髓过氧化物酶的单克隆抗体的微球的制备：将未包被的微球中加入磷酸二氢钠缓冲液、N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液和碳二亚胺溶液进行活化；然后加入特异性的抗髓过氧化物酶的单克隆抗体1-125μg在4-8℃进行包被；洗涤；再加入含1-10％质量分数的动物血清蛋白的封闭液过夜封闭；最后在10-100mM磷酸盐缓冲液中避光、4-8℃存放；

髓过氧化物酶的浓度梯度标准品和髓过氧化物酶质控品的制备：先在PH 7.0-7.4、浓度为10-100mM磷酸盐缓冲液中，分别加入1-10％质量分数的动物血清、0.01-0.5％质量分数的防腐剂、1-10％质量分数的蛋白保护剂、0.05-1％质量分数的表面活性剂混合而成标准品稀释液；再将纯品与自制的标准品稀释液按照1:200000-1:1000稀释而成标示浓度为0-800ng/ml的浓度梯度标准品以及60-250ng/ml的髓过氧化物酶质控品；

荧光标记试剂标记的髓过氧化物酶抗体：将荧光标记试剂通过偶联剂进行衍生化，然后与髓过氧化物酶抗体进行共价交联，反应后用终止剂终止反应，即可获得荧光标记试剂标记的抗体，将荧光标记试剂标记的髓过氧化物酶抗体于含有保护剂的磷酸盐缓冲液中，4-8℃保存；

样本缓冲液的制备：在10-200mM磷酸盐缓冲液中，加入1-10％质量分数的蛋白保护剂，0.01-0.5％质量分数的防腐剂混合而成；

洗液的制备：在10-100mM磷酸盐缓冲液中，加入1％质量分数的表面活性剂混合而成。

10.所述N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液和碳二亚胺溶液购买于Pierce公司，所述动物血清蛋白为牛血清白蛋白。