CN104955818B

CN104955818B - 核苷激酶旁路组合物和方法

Info

Publication number: CN104955818B
Application number: CN201380072436.5A
Authority: CN
Inventors: G.布托拉
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 2012-12-06
Filing date: 2013-12-02
Publication date: 2017-08-04
Anticipated expiration: 2033-12-02
Also published as: EP2928876A4; AU2013356386A1; US20150315221A1; AU2013356386B2; EP2928876B1; US9624249B2; CA2892676A1; EP2928876A1; RU2015126795A; BR112015012455A2; JP2016509575A; KR20150092243A; CN104955818A; WO2014088923A1

Abstract

本发明涉及易于被还原剂（诸如谷胱甘肽）生物活化的、二硫化物掩蔽的前药化合物、组合物和方法。这样的基于二硫化物的化合物、组合物和方法可以用于例如提供用作治疗剂的新前药。所述化合物的特征在于用于掩蔽阴离子电荷的、构象上受限制的二硫化物磷酸三酯基团。所述化合物包括1,2‑二噻烷(1,2‑dithigne)基团。

Description

核苷激酶旁路组合物和方法

优先权要求

本申请要求2012年12月6日提交的美国临时申请号61/734,049和2013年3月15日提交的美国临时申请号61/787,377的优先权。

技术领域

本发明涉及易于被还原剂（诸如谷胱甘肽）生物活化的、二硫化物掩蔽的前药化合物、组合物和方法。这样的基于二硫化物的化合物、组合物和方法可以用于例如提供用作治疗剂的新前药。

背景技术

下面是关于某些前药组合物的相关技术的讨论。所述讨论仅仅为了理解下面的发明而提供。该概要并非承认下面描述的任何工作是要求保护的发明的现有技术。

药物化学和生物技术领域已经产生了许多具有充分证实的体外活性的生物活性化合物。但是，需要将这些化合物有效地递送至感兴趣的靶细胞和组织，以便用作研究工具或体内治疗剂。许多生物活性分子具有由于它们的净负(阴离子)电荷、它们的大小或阴离子电荷和大小二者的组合而受损的体内活性谱。在克服这些屏障的尝试中，已经开发了多种策略。在寡核苷酸递送的情况下，病毒的和非病毒的递送策略已经产生了混合的结果，其中大多数具有剂量限制毒性或其它安全性问题。这样的安全性问题是给感兴趣的细胞和组织有效地递送其它带电荷的分子所面临的挑战的代表。这些挑战已经驱动前药的差异方案中的创新。

前药是以无活性形式或显著更少活性形式施用的药理学物质。一旦施用，前药在被称作生物活化的过程中在体内代谢成活性代谢物。在前药应用背后的基本原理通常是关于吸收、分布、代谢和排泄(ADME)优化。阴离子掩蔽前药代表一个新的化合物平台，其会提供通过多种机制改善ADME性能的优点。首先，阴离子掩蔽前药会中和阴离子电荷，且因此克服细胞吸附和组织分布的屏障。其次，因为某些核酸酶依赖于阴离子电荷来鉴别它们的底物，所以阴离子掩蔽前药可以绕过代谢。此外，前药的电荷掩蔽基团还可以充当多种化学实体的支架，所述化学实体可以赋予改善的靶向、免疫抑制或可溶性谱。所有这些因素可以导致感兴趣的化合物或分子的改善的药代动力学和药效动力学性能。

已经公开了阴离子掩蔽磷酸三酯保护基的例子，参见例如Lebleu等人, (2000),Russ. J. Bioorg. Chem., 26, 174-182。但是，该方案利用紫外辐射进行去保护，因而不适合体内应用。Beaucage等人(2007), J. Org. Chem., 72, 805-815描述了某些磷酸三酯寡核苷酸前药的体内生物活化。但是，该方案产生THF作为生物转化后的副产物。WO 2010/039543描述了某些阴离子掩蔽二硫化物磷酸三酯寡核苷酸前药。尽管如此，这些二硫化物前药的环脱酯化会导致反应性的硫杂丙环物质的释放，这可以由于剂量限制毒性而限制这样的前药的应用。

谷胱甘肽(GSH)是含有半胱氨酸（其通过正常肽键连接至甘氨酸）的胺基和谷氨酸盐侧链的羧基之间的不寻常肽键的三肽。谷胱甘肽是一种重要的抗氧化剂，会阻止由活性氧诸如自由基和过氧化物造成的对细胞组分的损伤。谷胱甘肽硫醇基团是还原剂，以大约5mM的浓度存在于细胞中。谷胱甘肽通过充当电子供体而将在细胞质蛋白内形成的二硫键还原为半胱氨酸。在该过程中，谷胱甘肽转化成它的氧化形式谷胱甘肽二硫化物(GSSG)，它也被称为L(-)-谷胱甘肽。谷胱甘肽一旦被氧化，使用NADPH作为电子供体，通过谷胱甘肽还原酶可以将所述谷胱甘肽还原回去。因此，谷胱甘肽是前药的有吸引力的生物转化还原剂。

谷胱甘肽活化的前药的某些例子公开在，例如，Gunnarsdottir等人, (2003),Drug Metabolism and Disposition, 32, 321-327和Tirouvanziam等人, (2006), PNAS,103, 12, 4628-4633。但是，这些谷胱甘肽活化的前药不会提供任何阴离子电荷掩蔽能力。因此，需要易于在体内生物转化的改善的阴离子掩蔽前药。

发明内容

本发明提供了关于提供谷胱甘肽活化的前药组合物和方法的问题的解决方案，所述前药组合物和方法能够掩蔽阴离子电荷且不会导致生物转化后反应性物质的形成。

本文中公开了前药化合物和组合物以及制备和使用它们的方法。本发明的前药化合物、组合物和方法的特征在于用于掩蔽阴离子电荷的、构象上受限制的二硫化物磷酸三酯基团。所述构象上受限制的二硫化物磷酸三酯基团还可以充当用于连接辅助分子（诸如靶向基团、免疫抑制基团、可溶性增强基团等）的支架。在生物转化过程中，所述构象上受限制的二硫化物磷酸三酯基团会经由谷胱甘肽介导的还原/生物转化而经历电荷耗散驱动的环脱酯化，以释放有活性的感兴趣的阴离子分子和排出任何辅助基团。在生物转化过程中，反应性的硫杂丙环物质经由分子内1,5-exo-tet环闭合而在内部被淬灭以产生稳定的四氢噻吩类化合物。本发明的二硫化物磷酸三酯基团可以提供本领域已知的核酸、多核苷酸、寡核苷酸、肽、多肽、蛋白、抗体、激素、小分子、抗病毒剂和其它生物活性的分子的电荷掩蔽的前药类似物。

附图说明

图1显示了提议的机制的一个非限制性实施例，所述机制包含本发明的二硫化物掩蔽的前药的非酶促的、化学驱动的释放。尽管不希望受理论约束，该机制包括：(1) pH-依赖性的二硫化物还原，随后是(2)电荷-耗散驱动的环脱酯化，随后是(3)分子内硫杂丙环重排。靶向基团(TG)可以是本领域普遍已知的任意靶向基团或部分(例如，配体、肽、抗体等)，且任选地存在。离去基团优选地是本领域普遍已知的五价磷离去基团，但是可以包括本领域技术人员容易理解的其它合适的离去基团(例如，三氟甲基磺酸酯、氟磺酸酯、甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、carbonylates、硝酸酯、磷酸酯等)。净荷是优选地要施用给对象的化合物，诸如本领域普遍已知的任何治疗或预防化合物，包括核酸、核苷酸、核苷、多核苷酸、寡核苷酸、肽、多肽、蛋白、抗体、激素、小分子、抗病毒剂和其它生物活性的分子。

图2显示了通过LCMS监测的、当在pH 7.3和40℃暴露于谷胱甘肽(50mM)时单-酯从化合物16-1和16-2的释放。

具体实施方式

术语和定义

如在本申请中使用的，适用以下术语和定义。

在本说明书和所附权利要求中使用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物，除非所述内容另外清楚地指示。因而，例如，对“一个细胞”的提及包括两个或更多个细胞的组合等。

任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应当理解为包括在列举的范围内的任意整数值，且当适当时，包括其分数(诸如整数的1/10和1/100)，除非另外指出。

本文中关于数字使用的“约”或“大约”通常意图包括落在该数字的任一个方向(大于或小于)的5%范围内的数字，除非另有说明或另外从上下文中显而易见(这样的数字会超过可能值的100%的情况除外)。在阐述范围的情况下，在该范围内包括端点，除非另有说明或另外从上下文中显而易见。

本文中使用的术语“烃基（alkyl）”表示本领域中普遍接受的它的含义。该术语通常表示饱和或不饱和烃，包括直链、支链、烯基、炔基和环状基团，但是不包括芳族基团。尽管如此，烃基也表示非芳族杂环基团。优选地，烃基具有1-12个碳。更优选地，它是1-4个碳的低级烃基，更优选1-4个碳。烃基可以是被取代的或未被取代的。当被取代时，取代基团（一个或多个）优选地是羟基、卤素、氰基、C1-C4烷氧基、=O、=S、NO₂、SH、NH₂或NR₁R₂，其中R₁和R₂独立地是H或C1-C4烷基。

本文中使用的术语“芳基”表示本领域中普遍接受的它的含义。该术语通常表示具有至少一个含共轭π电子系统的环的芳族基团，且包括碳环芳基、杂环芳基和联芳基，所有这些可以被任选地取代。芳基的优选取代基（一个或多个）是卤素、三卤甲基、羟基、SH、OH、氰基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷基、C2-C4烯基、C2-C4炔基、NH₂和NR₁R₂基团，其中R₁和R₂独立地是H或C1-C4烷基。

本文中使用的术语“烃基芳基”表示本领域中普遍接受的它的含义。该术语通常表示与芳基（如上所述）共价连接的烃基（如上所述）。碳环芳基是其中芳族环上的环原子都是碳原子的基团。碳原子是任选取代的。杂环芳基是在芳族环中具有1-3个杂原子作为环原子且剩余环原子是碳原子的基团。合适的杂原子包括氧、硫和氮，且具有此类杂原子的杂环芳基的例子包括呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、N-低级烷基吡咯并、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基等，全部任选地取代。优选地，烃基是C1-C4烷基。

本文中使用的术语“酰胺”表示本领域中普遍接受的它的含义。该术语通常表示-C(O)-NH-R，其中R是烃基、芳基、烃基芳基或氢。

本文中使用的短语“生物系统”表示本领域中普遍接受的它的含义。该术语通常表示得自生物学来源的纯化或未纯化形式的材料，所述生物学来源包括、但不限于人或动物，其中所述系统包括RNAi活性所需的组分。因此，该短语包括例如，细胞、组织、对象或生物体、或其提取物。该术语还包括重构的得自生物学来源的材料。

本文中使用的术语“细胞”表示本领域中普遍接受的它的含义。参考本发明的示例性核酸分子，该术语以其通常的生物学含义使用，并且不表示完整多细胞生物，例如具体地不表示人类。细胞可以存在于生物体内，例如禽类、植物和哺乳动物，例如人类、奶牛、羊、猿、猴、猪、狗和猫。细胞可以是原核的（例如，细菌细胞）或真核的（例如，哺乳动物或植物细胞）。细胞可以具有体细胞或种系起源，是全能的或多能的，在分裂中或非分裂中。细胞还可以衍生自或可以包含配子或胚胎、干细胞、或完全分化的细胞。

本文中使用的术语“组合物”或“制剂”表示在本领域中普遍接受的它们的含义。这些术语通常表示这样的组合物或制剂，诸如在药学上可接受的载体或稀释剂中：其呈适合于施用（例如，全身或局部施用）进细胞或对象内的形式，所述对象包括例如人。合适的形式部分地依赖于用途或进入途径，例如口服、透皮、吸入或通过注射。此类形式不应阻止组合物或制剂到达靶细胞。例如，注射进血流中的组合物应当是可溶的。其它因素是本领域已知的，且包括考虑因素诸如毒性和阻止组合物或制剂发挥其作用的形式。本文中使用的药物制剂包括用于人和兽医学应用的制剂。

本文中使用的术语“叶酸基团”表示本领域中普遍接受的它的含义。该术语通常表示包含下述化学基团的基团：

。

术语“包括”(及其任意形式，诸如“包含”和“含有”)、“包含”(及其任意形式，诸如“具有”或“有”)或“含有”(及其任意形式，诸如“含”或“包含”)是包含性的和开放式的，且不排除额外的、未列举的要素或方法步骤。

术语“配体”表示本领域普遍已知的这样的化合物和组合物。在本文中（包括在具体地通过引用并入本文的文件中）描述了这样的配体的非限制性例子。这样的配体的非限制性例子描述在美国公开号US2008/0152661 A1和US 2004/0162260 A1 (例如，CDM-LBA、CDM-Pip-LBA、CDM-PEG、CDM-NAG等)和美国专利申请号10/427,160 10/201,394、61/322,422、61/378,609和61/315,223以及美国专利号6,528,631、6,335,434、6,235,886、6,153,737、5,214,136和5,138,045中。也参见Manoharan, ANTISENSE & NUCLEIC ACID DRUGDEVELOPMENT 12:103-128 (2002)。本发明的前药分子可以与如本文中所述的或本领域以其它方式已知的任何共价连接的配体一起配制或施用。

本文中使用的术语“连接基”表示本领域普遍已知的它的含义。在本文中（例如在表1中，且包括在具体地通过引用并入本文的文件中）描述了连接基的非限制性例子。

表1

本文中使用的术语“哺乳动物的”或“哺乳动物”表示本领域中普遍接受的它的含义。该术语通常表示任何温血脊椎动物物种，诸如人、小鼠、大鼠、狗、猫、仓鼠、豚鼠、兔、家畜等。

本文中使用的术语“N-乙酰基半乳糖胺基团”表示本领域中普遍接受的它的含义。该术语通常表示包含下述化学基团的基团：

本文中使用的术语“核苷”表示本领域中普遍接受的它的含义，且包括本领域技术人员普遍已知的其核苷类似物或核碱基类似物。可能适用于本发明的前药应用的基于核苷的治疗性化合物(和对应的适应症)的非限制性例子包括在下面表2中描述的那些，参见例如Errasti-Murugarren和Pastor-Anglada (2010), Pharmacogenomics, 11(6), 809-841。

表2

本文中使用的术语“肽基团”表示本领域中普遍接受的它的含义。该术语通常表示具有一种或多种肽功能性的基团。

术语“聚合物”表示本领域普遍已知的聚合的化合物、组合物和制剂。在本文中（包括在具体地通过引用并入本文的文件中）描述了这样的聚合物（包括聚合的递送系统）的非限制性例子。本发明的分子或化合物可以与如本文中所述的或本领域以其它方式已知的任何聚合物一起配制或施用。

本文中使用的术语“类固醇基团”表示本领域中普遍接受的它的含义。该术语通常表示具有一种或多种类固醇功能性的基团，诸如胆固醇。

本文中使用的术语”对象”表示本领域中普遍接受的它的含义。该术语通常表示可以给其施用本发明的核酸分子的生物。对象可以是哺乳动物或哺乳动物细胞，包括人或人细胞。该术语还表示这样的生物：其是外植细胞的供体或受体或所述细胞自身。

本文中使用的短语“全身施用”表示本领域中普遍接受的它的含义。该短语通常表示药物在血流中的体内全身性吸收或积累，随后遍及整个身体分布。

本文中使用的术语“靶向试剂”表示本领域中普遍接受的它的含义。该术语通常表示这样的基团：其给一个或多个细胞、组织或器官（诸如在对象或生物体中）赋予某种程度的靶标特异性，并从而赋予用感兴趣的化合物或组合物靶向这样的细胞、组织或器官的能力。

本文中使用的短语“治疗有效量”表示本领域中普遍接受的它的含义。该术语通常表示这样的化合物或组合物的量：其将在细胞、组织、系统、动物或人中引起研究人员、兽医、医生或其它临床医师寻求的生物学或医学应答。例如，如果给定的临床治疗被视作有效的（此时至少存在与疾病或障碍有关的可测量参数的25%下降），用于治疗该疾病或障碍的药物的治疗有效量是实现该参数的至少25%下降所需的量。

本文中使用的术语“维生素基团”表示本领域中普遍接受的它的含义。该术语通常表示具有一种或多种维生素功能性的基团，诸如叶酸、维生素C、维生素E、维生素D、维生素B5、维生素B12等。

B. 化合物

本文提供了具有式I的化合物：

其中，

R¹是H、OH、C_1-6烷基、被一个或多个羟基取代的C_1-6烷基、被一个或多个卤素基团取代的C_1-6烷基、C_1-6烯基、被一个或多个羟基取代的C_1-6烯基、被一个或多个卤素基团取代的C_1-6烯基、C_1-6炔基、被一个或多个羟基取代的C_1-6炔基、被一个或多个卤素基团取代的C_1-6炔基、C_1-6烷氧基、被一个或多个羟基取代的C_1-6烷氧基、被一个或多个卤素基团取代的C_1-6烷氧基、芳基、杂芳基、杂环基、-NHC_1-6烷基、芳基C_1-6烷基、杂芳基C_1-6烷基、杂环基C_1-6烷基、胍基、C_1-6烷基C(O)O-、芳基C(O)O-、杂环基C(O)O-、O-炔丙基、S-炔丙基、O-烯丙基、S-烯丙基或X-L-Y；

其中X是O、S、NH、C(O)、S(O)、C_1-6烷基、被一个或多个羟基取代的C_1-6烷基、被一个或多个卤素基团取代的C_1-6烷基、C_1-6烯基、被一个或多个羟基取代的C_1-6烯基、被一个或多个卤素基团取代的C_1-6烯基、C_1-6炔基、被一个或多个羟基取代的C_1-6炔基、被一个或多个卤素基团取代的C_1-6炔基、C_1-6烷氧基、被一个或多个羟基取代的C_1-6烷氧基、被一个或多个卤素基团取代的C_1-6烷氧基、芳基、杂芳基、杂环基、-NHC_1-6烷基、芳基C_1-6烷基、杂芳基C_1-6烷基、杂环基C_1-6烷基、胍基、C_1-6烷基C(O)O-、芳基C(O)O-、杂环基C(O)O-、O-炔丙基、S-炔丙基、O-烯丙基、S-烯丙基；

L是任选地存在的连接基；且

Y是任选地存在的靶向试剂、配体和/或聚合物；

R⁴是S或O；

每个R²、R³、R⁵、R⁶、R⁷和R⁸独立地是卤素或如上的R¹；

R⁹是O-芳基、O-苯基、O-萘基、O-烷基-芳基或O-苄基，其中的任一个可以被一个或多个卤素基团取代；或胺、被取代的胺、NH-苄基、NHR¹²或N(R¹²)₂，其中每个R¹²独立地是H、C_1-10烷基、或被一个或多个卤素基团取代的C_1-10烷基；

R¹⁰是S或O；且

NUC是核苷、核苷类似物、核苷酸、核苷酸类似物、或其核碱基类似物。

在某些实施方案中，参考具有式I的化合物，R⁹是：

。

在某些实施方案中，参考具有式I的化合物，R⁹是：

。

在某些实施方案中，参考具有式I的化合物，R⁹是：

。

在某些实施方案中，参考具有式I的化合物，R⁹是：

。

在某些实施方案中，参考具有式I的化合物，R⁹是：

。

在某些实施方案中，具有式I的化合物是：

。

在某些实施方案中，具有式I的化合物是：

。

在某些实施方案中，具有式I的化合物是：

。

在某些实施方案中，具有式I的化合物是：

。

其中L是任选地存在的连接基；且Y是配体和/或聚合物。

在某些实施方案中，具有式I的化合物是：

。

在某些实施方案中，参考具有式I的化合物，NUC是：

。

在某些实施方案中，具有式I的化合物是：

。

在一个实施方案中，具有式I的化合物是：

。

在某些实施方案中，参考任意具有以上式I的化合物，R⁹是：

。

在某些实施方案中，参考任意具有以上式I的化合物，R¹⁰是O。

在某些实施方案中，参考任意具有以上式I的化合物，R¹⁰是S。

在某些实施方案中，参考任意具有以上式I的化合物，R¹是X-L-Y；其中X是O、S、NH、C(O)、S(O)、C_1-6烷基、被一个或多个羟基取代的C_1-6烷基、被一个或多个卤素基团取代的C_1-6烷基、C_1-6烯基、被一个或多个羟基取代的C_1-6烯基、被一个或多个卤素基团取代的C_1-6烯基、C_1-6炔基、被一个或多个羟基取代的C_1-6炔基、被一个或多个卤素基团取代的C_1-6炔基、C_1-6烷氧基、被一个或多个羟基取代的C_1-6烷氧基、被一个或多个卤素基团取代的C_1-6烷氧基、芳基、杂芳基、杂环基、-NHC_1-6烷基、芳基C_1-6烷基、杂芳基C_1-6烷基、杂环基C_1-6烷基、胍基、C_1-6烷基C(O)O-、芳基C(O)O-、杂环基C(O)O-、O-炔丙基、S-炔丙基、O-烯丙基、S-烯丙基；L是任选地存在的连接基；且Y是任选地存在的靶向试剂、配体和/或聚合物。

本文还提供了具有式II的化合物：

其中，

R¹是H、OH、C_1-6烷基、被一个或多个羟基取代的C_1-6烷基、被一个或多个卤素基团取代的C_1-6烷基、C_1-6烯基、被一个或多个羟基取代的C_1-6烯基、被一个或多个卤素基团取代的C_1-6烯基、C_1-6炔基、被一个或多个羟基取代的C_1-6炔基、被一个或多个卤素基团取代的C_1-6炔基、C_1-6烷氧基、被一个或多个羟基取代的C_1-6烷氧基、被一个或多个卤素基团取代的C_1-6烷氧基、芳基、杂芳基、杂环基、-NHC_1-6烷基、芳基C_1-6烷基、杂芳基C_1-6烷基、杂环基C_1-6烷基、胍基、C_1-6烷基C(O)O-、芳基C(O)O-、杂环基C(O)O-、O-炔丙基、S-炔丙基、O-烯丙基、S-烯丙基或X-L-Y；其中X是O、S、NH、C(O)、S(O)、C_1-6烷基、被一个或多个羟基取代的C_1-6烷基、被一个或多个卤素基团取代的C_1-6烷基、C_1-6烯基、被一个或多个羟基取代的C_1-6烯基、被一个或多个卤素基团取代的C_1-6烯基、C_1-6炔基、被一个或多个羟基取代的C_1-6炔基、被一个或多个卤素基团取代的C_1-6炔基、C_1-6烷氧基、被一个或多个羟基取代的C_1-6烷氧基、被一个或多个卤素基团取代的C_1-6烷氧基、芳基、杂芳基、杂环基、-NHC_1-6烷基、芳基C_1-6烷基、杂芳基C_1-6烷基、杂环基C_1-6烷基、胍基、C_1-6烷基C(O)O-、芳基C(O)O-、杂环基C(O)O-、O-炔丙基、S-炔丙基、O-烯丙基、S-烯丙基；L是任选地存在的连接基；且Y是任选地存在的靶向试剂、配体和/或聚合物；

R⁴是S或O；

每个R²、R³、R⁵、R⁶、R⁷和R⁸独立地是卤素或如上的R¹；

R¹⁰是S或O；且

在某些实施方案中，具有式II的化合物是：

。

在某些实施方案中，具有式II的化合物是：

。

在某些实施方案中，具有式II的化合物是：

。

在某些实施方案中，具有式II的化合物是：

其中L是任选地存在的连接基；且Y是配体和/或聚合物。

在某些实施方案中，具有式II的化合物是：

。

在某些实施方案中，参考具有式II的化合物，是：

。

在某些实施方案中，具有式II的化合物是：

。

在某些实施方案中，参考任意具有以上式II的化合物，R¹⁰是O。

在某些实施方案中，参考任意具有以上式II的化合物，R¹⁰是S。

在某些实施方案中，参考任意具有以上式I或II的化合物，R¹是X-L-Y；其中X是O、S、NH、C(O)、S(O)、C_1-6烷基、被一个或多个羟基取代的C_1-6烷基、被一个或多个卤素基团取代的C_1-6烷基、C_1-6烯基、被一个或多个羟基取代的C_1-6烯基、被一个或多个卤素基团取代的C_1-6烯基、C_1-6炔基、被一个或多个羟基取代的C_1-6炔基、被一个或多个卤素基团取代的C_1-6炔基、C_1-6烷氧基、被一个或多个羟基取代的C_1-6烷氧基、被一个或多个卤素基团取代的C_1-6烷氧基、芳基、杂芳基、杂环基、-NHC_1-6烷基、芳基C_1-6烷基、杂芳基C_1-6烷基、杂环基C_1-6烷基、胍基、C_1-6烷基C(O)O-、芳基C(O)O-、杂环基C(O)O-、O-炔丙基、S-炔丙基、O-烯丙基、S-烯丙基；L是任选地存在的连接基；且Y是任选地存在的靶向试剂、配体和/或聚合物。

在某些实施方案中，参考任意具有以上式I或II的化合物，Y包含一个或多个N-乙酰基半乳糖胺基团。

在某些实施方案中，参考任意具有以上式I或II的化合物，Y包含一个或多个叶酸基团。

在某些实施方案中，参考任意具有以上式I或II的化合物，Y包含一个或多个肽基团。

在某些实施方案中，参考任意具有以上式I或II的化合物，Y包含一个或多个类固醇基团。

在某些实施方案中，参考任意具有以上式I或II的化合物，Y包含一个或多个维生素或辅因子基团。

在某些实施方案中，参考任意具有以上式I或II的化合物，Y包含：

其中n是1-100之间的整数。

其中每个n独立地是1-20的整数。

其中X是-O-、-S-、-CR¹¹R¹²-或-NR¹¹-，其中R¹¹和R¹²各自独立地选自氢和C1-C6烷基；n是1、2、3或4。

。

在某些实施方案中，参考任意具有以上式I或II的化合物，L是连接基，其包含烷基、羰基、酰胺、磷酸酯、磷酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫化物或聚亚烷基二醇连接。

在某些实施方案中，本发明的特征在于一种组合物，其包含任意具有以上式I或II的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物、酯或前药。

在某些实施方案中，本发明的特征在于一种组合物，其包含任意具有以上式I或II的化合物和药学上可接受的载体或稀释剂。

C. 治疗用途

在某些应用中，将本发明的化合物和组合物用于治疗用途。

因而，本发明的一个方面包括治疗对象的方法，所述对象包括、但不限于遭受疾病或病症的人，所述方法包括给所述对象施用有效量的本发明的化合物或组合物。在该方面的一个实施方案中，所述化合物包含本文中式I或II中的任一种。

在某些实施方案中，本发明的特征在于治疗有效量的至少一种具有以上式I或II的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物、酯或前药用于制备药物的用途，所述药物用于治疗有此需要的患者。

在某些实施方案中，本发明的特征在于治疗有效量的至少一种具有以上式I或II的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物、酯或前药用于治疗有此需要的患者的用途。

在某些实施方案中，本发明的特征在于治疗有效量的至少一种具有以上式I或II的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物、酯或前药用于治疗有此需要的患者中的病毒感染的用途。这样的病毒感染的非限制性例子包括HCV、HBV、HPV、HSV或HIV感染。

在某些实施方案中，本发明的特征在于治疗有效量的至少一种具有以上式I或II的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物、酯或前药用于治疗有此需要的患者中的癌症的用途。这样的癌症的非限制性例子包括胆道癌、膀胱癌、移行细胞癌、泌尿道上皮癌、脑癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、乳腺癌、化生性癌、宫颈癌、宫颈鳞状细胞癌、直肠癌、结肠直肠癌、结肠癌、遗传性非息肉性结直肠癌、结肠直肠腺癌、胃肠道间质瘤(GIST)、子宫内膜癌、子宫内膜间质肉瘤、食管癌、食管鳞状细胞癌、食管腺癌、眼黑素瘤、葡萄膜黑素瘤、胆囊癌、胆囊腺癌、肾细胞癌、透明细胞肾细胞癌、移行细胞癌、泌尿道上皮癌、肾母细胞瘤、白血病、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓样白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓样白血病(CML)、慢性粒单核细胞白血病(CMML)、肝癌、肝癌、肝细胞瘤、肝细胞癌、胆管上皮癌、肝胚细胞瘤、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、间皮瘤、B-细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、T-细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、前驱T-成淋巴细胞性淋巴瘤/白血病、周围T-细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌(NPC)、神经母细胞瘤、口咽癌、口腔鳞状细胞癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、假乳头状肿瘤、腺泡细胞癌、前列腺癌、前列腺腺癌、皮肤癌、黑素瘤、恶性黑素瘤、皮肤黑素瘤、小肠癌、胃癌、胃癌、胃肠道间质瘤(GIST)、子宫癌或子宫肉瘤。

在该方面的某些实施方案中，治疗用途是用于治疗疾病或病症。所述疾病或病症可以是如本文中所述的或本领域以其它方式已知的癌症、增生性疾病、炎症性疾病、自身免疫性疾病、神经学疾病、眼疾病、呼吸疾病、代谢疾病、皮肤病学疾病、听觉疾病、肝疾病、肾疾病或传染性疾病。因而，在某些实施方案中，本发明的化合物和组合物可以用于治疗癌症、增生性疾病、炎症性疾病、自身免疫性疾病、神经学疾病、眼疾病、呼吸疾病、代谢疾病、皮肤病学疾病、听觉疾病、肝疾病、肾疾病或传染性疾病的方法中。

在某些实施方案中，化合物或组合物的施用可以是经由局部施用或全身施用。在其它实施方案中，本发明的特征在于例如经由肺递送经由给相关组织或细胞（诸如肺细胞和组织）的局部施用，使对象或生物体与本发明的化合物或组合物接触。在其它实施方案中，本发明的特征在于经由给对象或生物体中的相关组织或细胞的全身施用（例如经由静脉内或皮下施用）使对象或生物体与本发明的化合物或组合物接触。

本发明的化合物和组合物也可以用作离体应用中的试剂。例如，为了治疗效果，可以将所述化合物或组合物引入移植到对象内的组织或细胞中。所述细胞和/或组织可以源自随后接受外植体的生物体或对象，或可以在移植前源自另一个生物体或对象。所述化合物或组合物可以用于调节细胞或组织中的一个或多个基因的表达，使得所述细胞或组织获得期望的表型或当在体内移植时能够执行功能。在一个实施方案中，从患者提取某些靶细胞。在适合于这些细胞摄取化合物的条件下（例如，使用递送试剂诸如阳离子脂质、脂质体等，或使用技术诸如电穿孔以促进化合物向细胞内的递送），使这些提取的细胞与靶向细胞内的特定核苷酸序列的本发明化合物接触。然后将所述细胞再引回到相同患者或其它患者中。

对于治疗用途，将药学有效剂量的本发明的化合物或药物组合物施用给对象。药学有效剂量是预防疾病状态、抑制疾病状态的发生、或治疗（在某种程度上减轻症状，优选所有症状）疾病状态所需的那种剂量。本领域技术人员通过考虑诸如下述因素，可以容易地确定要施用给给定对象的本发明的化合物或组合物的治疗有效剂量：对象的大小和重量，疾病进展或渗透的程度，对象的年龄、健康和性别，施用途径，和施用是局部的还是全身性的。通常，取决于本公开内容的化合物的效力，施用每天0.1µg/kg体重至140 mg/kg体重之间的量的活性成分。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量随治疗的宿主和特定施用模式而变化。最佳给药方案可以通过测量患者体内的药物蓄积来计算。可以在单次剂量或多次剂量中施用本发明的化合物和组合物。

本发明的化合物或组合物可以每月1次、每周1次、每天1次(QD)施用，或分成多个每月、每周或每日剂量，例如但不限于每天两次（BID）、每天三次（TID）、每两周一次。基于测量的药物在体液或组织中的停留时间和浓度，本领域的普通技术人员可以容易地估计给药的重复率。

此外，施用可以是连续的，即每天，或间歇地。例如，本发明的化合物的间歇施用可以是每周1-6天施用，或它可以意指循环施用（例如每天施用持续2-8个连续周，随后是至多1周的无施用的休息期），或它可以意指隔日施用。

D. 施用

本发明的组合物或制剂可以以多种方式施用。本发明的施用方法的非限制性例子包括口服、含服、舌下、胃肠外(即，关节内地、静脉内地、腹膜内地、皮下地或肌肉内地)、局部直肠施用或其它局部施用。在一个实施方案中，本发明的组合物可以通过吹入法和吸入法施用。施用可以经由单剂量或分份剂量完成。在某些实施方案中，通过快速浓注静脉内地或腹膜内地施用药物组合物(参见，例如，美国专利号5,286,634)。

通过直接注射或通过使用输液泵，可以局部地递送本发明的组合物（其含有或不含媒介物）。使用标准的针头和注射器方法，或通过无针技术，诸如在Conroy等人(1999,Clin. Cancer Res. 5:2330)和PCT公开号WO 99/31262中描述的那些，可以进行本公开内容的化合物和组合物的直接注射（皮下的、肌肉内的、或真皮内的）。例如，但不限于，通过直接注射在疾病部位或通过注射在远离疾病部位的部位，可以施用包含本发明的化合物的脂质颗粒(参见，例如，Culver, HUMAN GENE THERAPY, MaryAnn Liebert, Inc.,Publishers, New York. 第70-71页(1994))。在一个实施方案中，将本发明的化合物和其制剂或组合物施用给如本文描述的且如本领域普遍已知的细胞、对象或生物体。

体内施用

在本发明的任何治疗方法中，如本文中所述的或本领域以其它方式已知的，可以将所述化合物全身性地施用给对象，无论是单独作为单一疗法，还是与本文描述的或本领域已知的其它疗法组合。如本领域普遍已知的，全身施用可以包括例如，肺(吸入、喷雾等)、静脉内、皮下、肌肉内、导管插入、鼻咽、透皮或口服/胃肠施用。

在本发明的任何治疗或预防方法中，如本文中所述的或本领域以其它方式已知的，可以将所述化合物局部地施用于对象或施用于局部组织，无论是单独作为单一疗法，还是与本领域已知的其它疗法组合。如本领域普遍已知的，局部施用可以包括例如，吸入、喷雾、导管插入、植入、直接注射、真皮/透皮应用、贴剂、支架、滴耳剂/滴眼剂、或门静脉施用于相关组织，或任意其它局部施用技术、方法或操作。

在一个实施方案中，如本领域普遍已知的，将本发明的化合物和其制剂或组合物施用于肝(参见例如Wen等人, 2004, World J Gastroenterol., 10, 244-9; Murao等人,2002, Pharm Res., 19, 1808-14; Liu等人, 2003, gene Ther., 10, 180-7; Hong等人, 2003, J Pharm Pharmacol., 54, 51-8; Herrmann等人, 2004, Arch Virol., 149,1611-7；和Matsuno等人, 2003, gene Ther., 10, 1559-66)。

在一个实施方案中，本发明的特征在于将本发明的化合物递送给造血细胞（包括单核细胞和淋巴细胞）的方法的用途。这些方法详细描述在Hartmann等人, 1998, J.Phamacol. Exp. Ther., 285(2), 920-928; Kronenwett等人, 1998, Blood, 91(3),852-862; Filion和Phillips, 1997, Biochim. Biophys. Acta., 1329(2), 345-356;Ma和Wei, 1996, Leuk. Res., 20(11/12), 925-930；和Bongartz等人, 1994, NucleicAcids Research, 22(22), 4681-8。

在一个实施方案中，如本领域普遍已知的，将本发明的化合物和其制剂或组合物直接地或局部地（例如，区域性地）施用于真皮或滤泡(参见例如Brand, 2001, Curr.Opin. Mol. Ther., 3, 244-8; Regnier等人, 1998, J. Drug Target, 5, 275-89;Kanikkannan, 2002, BioDrugs, 16, 339-47; Wraight等人, 2001, Pharmacol. Ther.,90, 89-104；和Preat和Dujardin, 2001, STP PharmaSciences, 11, 57-68)。在一个实施方案中，使用包含醇(例如，乙醇或异丙醇)、水且任选地包括另外试剂诸如肉豆蔻酸异丙酯和卡波姆980的水醇凝胶制剂，直接地或局部地施用本发明的化合物和其制剂或组合物。在其它实施方案中，将所述化合物配制为局部施用于鼻腔。局部制剂可以通过每天一次或多次应用施用于受影响的区域；在皮肤区域上，可以有利地使用封闭敷料。通过粘附性储库系统可以实现连续的或延长的递送。

在一个实施方案中，通过离子电渗疗法将本发明的化合物施用于例如特定器官或隔室（例如，眼、眼后、心脏、肝、肾、膀胱、前列腺、肿瘤、CNS等）。离子电渗疗法递送的非限制性例子描述在例如WO 03/043689和WO 03/030989中，它们通过引用以其整体并入本文。

在一个实施方案中，如本文描述的和如本领域普遍已知的，将本发明的化合物和其制剂或组合物施用于肺。在另一个实施方案中，如在美国专利公开号2006/0062758、2006/0014289和2004/0077540中所述，将本发明的siNA分子及其制剂或组合物施用于肺组织和细胞。

气雾剂和递送装置

气雾剂制剂

单独或与其它合适组分组合的本发明化合物可以制备成气雾剂制剂（即，它们可以“喷雾化”），以经由吸入(例如，鼻内地或气管内地)施用(参见，Brigham等人, Am. J.Sci., 298:278 (1989))。气雾剂制剂可以放置在增压的可接受的推进剂（诸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等）内。

在一个实施方案中，经由肺递送而施用本发明的化合物及其制剂，诸如通过经由吸入装置或喷雾器施用的气雾剂或喷雾干燥制剂的吸入，从而提供核酸分子向相关肺组织内的快速局部摄取。可以如下制备含有微粉化的化合物的可吸入干燥颗粒的固体微粒组合物：碾磨干燥的或低压冻干的组合物，然后使微粉化的组合物穿过例如400目筛以破碎或分离出大的附聚物。包含本发明的化合物的固体微粒组合物可以任选地含有分散剂，所述分散剂用于促进气雾剂以及其它治疗化合物的形成。合适的分散剂是乳糖，其可以与所述化合物以任何合适的比率（例如按重量计的1:1比率）掺合。

包含本发明的化合物或组合物的喷雾组合物可以例如配制为水溶液或混悬液，或配制为从增压包装（诸如计量剂量吸入器）递送的气雾剂（使用合适的液化推进剂）。在一个实施方案中，适合于吸入的本发明的气雾剂组合物可以是混悬液或溶液，并且通常含有本发明的化合物和合适的推进剂例如碳氟化合物或含氢的含氯氟烃或其混合物，尤其是氢氟烷烃，特别是1,1,1,2-四氟乙烷、1,1,1,2,3,3,3-七氟-正丙烷或其混合物。气雾剂组合物可以任选地含有本领域众所周知的另外制剂赋形剂，诸如表面活性剂。非限制性例子包括油酸、卵磷脂或寡聚乳酸或衍生物（诸如在WO94/21229和WO98/34596中所述的那些）和共溶剂例如乙醇。在一个实施方案中，本发明的药物气雾剂制剂包含本发明的化合物和碳氟化合物或含氢的含氯氟烃或其混合物作为推进剂，任选地与表面活性剂和/或共溶剂组合。

通过加入合适的缓冲剂，可以缓冲本发明的气雾剂制剂。

如果制剂未制成无菌的，那么气雾剂制剂可以包括任选的添加剂，包括防腐剂。非限制性例子包括羟基苯甲酸甲酯、抗氧化剂、调味剂、挥发油、缓冲剂和乳化剂和其它制剂表面活性剂。在一个实施方案中，使用碳氟化合物或全氟化碳载体来减少降解且提供本发明的更安全的生物相容的非液体微粒混悬组合物。在另一个实施方案中，包含喷雾器的装置递送包含含氟化合物的本发明的组合物，所述含氟化合物是抑制细菌的，从而减少在相容装置中的微生物生长的可能性。

可以配制用于吸入器或吹入器（例如由明胶制成）中的包含本发明组合物的胶囊和药筒，其含有用于吸入本发明的化合物和合适粉末基质（诸如乳糖或淀粉）的粉末混合物。在一个实施方案中，每个胶囊或药筒含有本发明的化合物和一种或多种赋形剂。在另一个实施方案中，本发明的化合物可以在没有赋形剂（诸如乳糖）的情况下存在。

可以将本发明的气雾剂组合物作为包括可吸入大小的颗粒（例如具有足够小的尺寸的颗粒，以在吸入后穿过鼻、口和喉以及穿过肺的支气管和肺泡）的制剂施用进呼吸系统内。一般而言，可吸入颗粒的大小范围为约0.5-10微米。在一个实施方案中，所述微粒范围可以是1-5微米。在另一个实施方案中，所述微粒范围可以是2-3微米。被包括在气雾剂中的不可吸入大小的颗粒倾向于沉积在咽喉中且被吞咽，并且气雾剂中不可吸入颗粒的量因此降到最低。对于鼻施用，在10 - 500 um的范围内的粒度是优选的，以确保保留在鼻腔中。

在某些实施方案中，经由增压的气雾剂制剂、通过增压泵或通过喷雾化施用于鼻的水性制剂，将本发明的化合物局部施用于鼻，例如用于治疗鼻炎。合适的制剂可以含有水作为用于该目的的稀释剂或载体。在某些实施方案中，可以给用于将本发明的组合物施用于肺或鼻的水性制剂提供常规赋形剂诸如缓冲剂、张度调节剂等。

装置

本发明的化合物可以作为如上面讨论的颗粒和/或气雾剂进行配制和递送，并且通过本领域技术人员已知的多种气雾化装置进行分配。

通过任何合适的方法，例如用包括喷雾器的装置(参见例如美国专利4,501,729)诸如超声或空气喷射喷雾器，可以生产包含本发明的化合物或制剂的液体或非液体颗粒的气雾剂。

用任何固体微粒气雾剂发生器，可以生产包含本发明的化合物或制剂和表面活性剂的固体颗粒气雾剂。与本发明的化合物一起使用的一类固体颗粒气雾剂发生器是吹入器。第二类示例性的气雾剂发生器包含计量剂量吸入器(“MDI”)。通过本领域的方法可以制备含有本文中教导的化合物或制剂的MDI (例如，参见Byron, 上文，和WO96/32099)。

所述化合物也可以配制为用于从流体分配器递送的流体制剂，诸如在WO05/044354中描述和举例说明的那些。

在本发明的某些实施方案中，在用于有意识的、自主呼吸的对象和用于所有年龄的受控换气（ventilated）的对象的应用中使用喷雾器装置。喷雾器装置可以用于对肺的靶向局部和全身性药物递送。在一个实施方案中，使用包括喷雾器的装置将本发明的化合物或制剂局部地递送至肺或肺组织。在另一个实施方案中，使用包括喷雾器的装置全身地递送本发明的化合物或制剂。

E. 实施例

现在将用下述非限制性实施例举例说明本发明。本领域技术人员会容易地认识到可以改变或修改以产生基本上相同的结果的多种非关键参数。

化学

谷胱甘肽(1-1, GSH, 方案1)是一种天然存在的水溶性三肽，其由氨基酸甘氨酸、半胱氨酸和不寻常地连接的(γ-)谷氨酸组成。它可以经历容易的氧化以形成二聚体(1-2,谷胱甘肽二硫化物, GSSG, 方案1)，且因此它是一种强效还原剂。以它的还原形式存在的游离硫醇基团是一种活跃的亲核体，因此GSH也可有效地淬灭反应性的亲电体。这两种性质较好地预示它在保护细胞免于受到通过自由基、过氧化物和其它毒素呈现的氧化性应激的损伤中的主要作用(参见Anderson, M.E., “Glutathione: an overview ofbiosynthesis and Modulation”, Chemico-Biological Interactions 111-112, 1-14,1998)。

方案1

大多数谷胱甘肽以还原的单体1-1的形式存在于细胞的细胞质中，且二聚体的量通常不会超过1%。通过NADPH依赖性的谷胱甘肽二硫化物还原酶的作用，维持该高还原性的细胞内环境。谷胱甘肽本身仅在细胞内通过ATP依赖性的谷氨酸-半胱氨酸连接酶和谷胱甘肽合酶从它的组分合成。不寻常的γ-谷氨酸键的存在使得GSH耐受大多数分解代谢肽酶，从而产生高细胞内稳定性。它的降解由在细胞外空间中运行的γ-谷氨酰基转肽酶(γ-GT)介导。这最终导致谷胱甘肽的遍在的细胞内存在和相当低的细胞外浓度(Townsend, D.M.,等人, “The Importance of Glutathione in Human Disease”, Biomedicine &Pharmacology, 57, 145-155, 2003)。不足令人惊奇的是，在肿瘤细胞中检测到谷胱甘肽的升高的细胞内浓度，并且该增量调节被视作导致对辐射和化学疗法的抗性的细胞转化的一个重要组成部分(Singh, S. 等人, “Role of Glutathion in CancerPathophysiology and Therapeutic Interventions”, Journal of ExperimentalTherapeutics and Oncology, 9, 303-316, 2012)。

谷胱甘肽的普遍细胞内存在和细胞外缺乏提出了一种可能有用的化学触发器，其可以被开发用于活性药物组分从它们的无活性前药形式的细胞内释放。另外，将该化学的、非酶促的释放触发器与靶向配体连接，会提供一个有吸引力的方案，从而以组织特异性的方式接合治疗上有关的细胞内靶标。这样的方案的一个例子是Vintafolide，其中靶向配体(叶酸)通过连接的、经还原切割的二硫化物连接至化疗活性的净荷(长春碱)，参见Dosio,F., 等人, “EC-145, a folate-targeted Vinca alkaloid conjugate for thepotential treatment of folate receptor-expressing cancers”, Current Opinionin Investigational Drugs, 11(12):1424-33, 2010。

直链二硫键已经在不同的缀合技术中用作可生物还原的连接基(Saito, G., 等人, “Drug Delivery Strategy Utilizing Coinjugation via Reversible DisulfideLinkages: Role and Site of Cellular Reducing Activities”, Advanced DrugDelivery Reviews, 55, 199-215, 2003)。例如，Traversa Therapeutics在WO2010039543 A2 (2010)中描述了前药化的寡核苷酸的基于直链二硫化物的释放机制。据此，经由乙氧基乙基连接基与离去基团(在该情况下，为磷酸二酯)连接的二硫键可以用硫吗啉(2-3)的伴随释放而还原地暴露，方案2。但是，直链二硫化物的高反应性使得该方案当应用于小分子时不实用。

方案2

Standring, N.D等人, (Idenix Pharmaceuticals)描述了(Global Antivir.J., Suppl. 1:22, 2009)一种与小分子有关的类似的环脱酯化驱动的释放机制。据此，在核苷前药3-1的酶促酯切割以后，进行3-2的自发环脱酯化，并释放硫杂丙环(3-3)。方案3。

方案3

E. Gunic等人(Bioorg. Med. Chem. Lett., 17, 2452 - 2455, 2007)也报道了类似的脱酯化。再次，酶介导的核苷4-1的酯切割产生了不稳定的磷酸三酯4-2，其自发地释放环状3'-5'-磷酸二酯4-3，伴随形成反应性的硫杂丙环3-3。一个额外的酶介导的磷酸二酯切割产生了单磷酸酯4-4, 方案4。

这两种操作都提示，不论方法如何，产生了存在于实施例3-2和4-2中的硫基乙氧基，如果连接至离去基团(在该情况下，磷酸酯)，它将经历自发排出，且将会产生反应性的、可能有毒的硫杂丙环(3-3)。另外，最初的脱酯化由普遍存在的酯酶介导，且组织-选择性的释放难以实现。

方案4

与已知前药（诸如上面讨论的那些）相比，本文中公开的前药具有巨大优点。如在图1中所示，带负电荷的含硫的物质，诸如通过谷胱甘肽介导的还原从5-1产生的物质，将类似地表现，且经历电荷-耗散驱动的环脱酯化。这将导致治疗上有关的药物(“净荷”, 5-4)的排出，且反应性的硫杂丙环将经由1,5-exo-tet环闭合而自淬灭以产生稳定的四氢噻吩衍生物诸如5-3。

与直链二硫化物不同，在二硫苏糖醇衍生物5-1内所含的环状二硫化物是化学上稳定的，且该前药方案可以在需要细胞内递送的情况下应用于治疗上有关的分子。细胞质的还原环境和细胞外空间的中性环境之间的尖锐差异较好地预示仅在穿过细胞膜以后的位点特异性的药物释放。

磷酸酯前药

我们已经选择使用具有非常确定的抗病毒(HCV)性能的核苷: 2'-C-甲基-7-脱氮腺苷(6-1a，方案6，参见Olsen, D. B. 等人, Antimicrobial Agents and Chemotherapy“A 7-Deaza-Adenosine Analog Is a Potent and Selective Inhibitor of HepatitisC Virus Replication with Excellent Pharmacokinetic Properties”, 48(10), 3944,2004和Eldrup, A. B.；等人, “Structure-activity relationship of purineribonucleosides for inhibition of hepatitis C virus RNA-dependent RNApolymerase”, Journal of Medicinal Chemistry, 47(21), 5284, 2004)以及2’-C-甲基-尿苷(6-1b, 方案6)来证实本技术在应用于磷酸酯离去基团时的实用性。2’-C-甲基-尿苷的优点在于它的减小的经历激酶介导的向各种单磷酸酯的转化的能力(A. Cho等人.“Synthesis and characterization of 2’-C-Me branched C-nucleosides as HCVPolymerase Inhibitors”, Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 22 (2012)4127-4132, 参见表1，2’-C-Me-U GT1b EC₅₀ = 15.2µM，而各种三磷酸酯2’-C-Me-U GT1bEC₅₀ = 1.32µM)。它的三磷酸核苷介导的抗病毒效能因此是前药的递送单磷酸酯从而绕过第一激酶的能力的更可靠的指标。据此，将商购可得的二硫苏糖醇二硫化物(6-6)在相转移条件下用合适的烷基卤化物（诸如炔丙基溴或苄基溴）烷基化，以产生单取代的二硫苏糖醇二硫化物(6-7c,d)。它与双(二异丙基氨基)氯膦的反应会产生中间体6-8c,d，其又在不经分离的情况下与核苷6-1a或6-1b反应。将纯化的磷中间体6-2在乙腈水溶液中暴露于硫基乙基四唑，以产生H-膦酸酯6-4a,b。如在方案6中所示，将其使用Todd-Atherton反应(参见Georgiev, E.M., 等人“An ab Initio Study of the Mechanism of the Atherton-ToddReaction between Dimethyl Phosphonate and Chloro- and Fluoro-SubstitutedMethanes”, Journal of the American Chemical Society,115, 10964-10973, 1993)转化成终产物6-5a或6-5b。相关地指出，产生中间体6-7的相转移反应不限于炔丙基溴和被取代的或未被取代的二硫苏糖醇，或二硫赤藓醇类似物可以用作底物。类似地，6-4的Todd-Atherton反应决不限于苄胺，且替代性的伯胺或仲胺可以替代苄胺。

方案6

如在方案7中所示，合成了3',5'-环状磷酸三酯前药。据此，将P(III)中间体6-2（其制备描述在方案6中）在高温内部环化以产生环状中间体7-1。将该中间体用叔丁基过氧化氢氧化以产生最终的前药7-2，或可以可替代地用双-苯基乙酰基二硫化物氧化以产生各种硫类似物7-3。再次，该反应不限于方案7中所示的实施例，且可以用6-2的类似物成功地进行，如上面讨论的。

方案7

也可以按照在方案8上描述的操作制备化合物诸如7-1。据此，使未保护的核苷诸如6-1a,b与双-二异丙基磷氯化物在合适的溶剂（诸如二氯甲烷）中在环境温度反应，并用DMAP诱导中间体8-1的环化。可以分离环状氨基亚磷酸酯8-2并用作合成中间体以更容易地得到最终的化合物7-2。该合成顺序成功地应用于制备其它环状5’-3’-核苷前药，诸如从2’-氟-2’-甲基取代的核糖衍生出的那些，诸如8-3和8-4和2-二氟衍生物8-5和8-6。

方案8

存在于前药6-5a（方案6）或7-2和7-3 (R = 炔丙基, 方案7)中的乙炔基团可以充当方便的工具以引入基团（例如靶向配体）从而进一步增强这些前药的治疗潜力。可以使用N-乙酰基半乳糖胺（其可以结合无唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)，即存在于肝细胞中的膜蛋白）介导治疗上有关的分子向肝细胞的摄取。有关的化学法显示在方案9中。将N-乙酰基半乳糖胺衍生物9-1在环境温度暴露于二甲基胺以诱导乙酰基保护基的除去。然后，不经额外纯化，用含有炔丙基的前药7-2a,b对它进行Huisgen环加成(“点击反应”)，以得到最终的含有靶向基团的核苷9-2a,b。

方案9

膦酸酯前药

替诺福韦(10-1, TFV, 方案10)是一种能够抑制许多病毒的病毒逆转录酶(RT)的截短的核苷衍生物，所述病毒在它们的生命周期中依赖于RT将病毒RNA转录成DNA。重要的例子包括人免疫缺陷病毒(HIV)和引起乙型肝炎的病毒(HBV)等等。该化合物首先在Antonin Holy的实验室(Institute of Organic Chemistry and Biochemistry,Czechoslovak Academy of Sciences)中合成，它的抗病毒性能由Erik De Clercq (RegaInstitute for Medicinal Research, University of Leaven, 比利时)进行了识别(DeClercq, E., Holy, A., Rosenberg, I., Sakuma, T., Balzarini, J., Maudghal, P.,“A Novel Selective Broad-Spectrum anti-DNA Virus Agent”, Nature, 第323卷, 第464页, 1986)。

方案10

从化学观点看，替诺福韦是一种含有不可水解的膦酸酯基的腺苷衍生物。它模仿存在于核苷单磷酸中的磷酸酯基团，且可以通过核苷激酶的作用而转化成各种磷酸酯(TFV-P, 10-2)和二磷酸酯(TFV-PP, 10-3)类似物，方案10。二磷酸替诺福韦(TFV-PP, 10-3)类似于天然存在的核苷三磷酸，且可以在转录过程中掺入新生的病毒DNA链，这随后导致链终止和病毒生命周期的中断。

膦酸酯基向TFV中的截短腺苷残基的永久连接会减轻第一个、经常限速的、激酶依赖性的磷酸化步骤的必要性。另一方面，膦酸酯基在生理pH携带负电荷，且它会减小TFV的穿过细胞膜的倾向。由于该原因，替诺福韦的口服生物利用度是非常有限的，且它的体外效力是极低的(EC₅₀ = 1.2µM, HIV-1, PBMCs)。与此同时，活性物质二磷酸替诺福韦(10-3,方案10)具有高病毒持久性，因为它在外周血单核细胞(PBMC)中的半衰期超过100小时。

为了将替诺福韦递送至体循环，合成了多种替诺福韦-衍生物，它们被设计成在口服吸收以后再转化回有活性的替诺福韦。这些前药通常是被设计成在酶促地诱导的最初步骤以后释放有活性的替诺福韦的膦酸酯。该方案的一个例子是替诺福韦的disoproxyl衍生物(Tenofovir Disoproxyl Fumarate, TDF, 11-1, 方案11)，其由Gilead作为每天1次的抗HIV逆转录酶抑制剂(Viread)销售。TDF的活化顺序描述在方案11中。据此，用天然存在的水解酶水解TDF的异丙基酯基之一，以产生不稳定的半碳酸酯(11-2)，其依次排出二氧化碳和甲醛。与此平行地，第二个酯基经历相同的分解。系统性地释放的替诺福韦(10-1)然后可以穿透PBMC的细胞膜，且依次转化成各种二磷酸酯(10-3)。可替换地，膦酸酯二酯11-1可以完整地穿透PBMC的细胞膜，且该酯介导的替诺福韦释放在细胞内发生。后一事件可以导致较高的TFV-PP水平，因为TFV单酯或二酯可以比替诺福韦本身更容易地穿透PBMC的细胞膜。

方案11

替诺福韦的替代前药显示在方案12中。还设计了膦酰基酰胺化物(phosphonoamidate)前药12-1 (Tenofovir Alafenamid Fumarate, TAF, Gilead)以引发通过酯酶介导的异丙基酯水解实现的替诺福韦释放。该步骤也通过组织蛋白酶-A（在细胞的溶酶体隔室中运行的丝氨酸-蛋白酶）的作用有效地进行。由于该原因，大多数替诺福韦在细胞内释放，从而产生比TDF低得多的每日剂量(Birkus, G., Kutty, N., He, G.H.,Mulato, A., Lee, W., McDermott, M., Cihlar, T., “Activation of 9-[(R)-2-[[(S)-1-(Isopropyloxycarbonyl)ethtyl]amino]phenoxyphosphinyl]-methoxy]adenine(GS-7340) and Other Tenofovir Phosphonoamidate Prodrugs by Human Proteases.”,Molecular Pharmacology, 74: 92-100, 2008)。还设计了磷脂类似物12-2 (CMX157, 方案12)以在细胞内释放替诺福韦(Hostetler, K., “Alkoxyalkyl Prodrugs of AcyclicNucleoside Phosphonates Enhance Oral Antiviral Activity and Reduce Toxicity:Current State of the Art.”, Antiviral Research, 82, A84-A98, 2009)。用作抗病毒剂的其它核苷膦酸酯前药的例子可以参见Pertusati, F., Serpi, M., McGuigan, C.,“Medicinal Chemistry of Nucleoside Phosphonate Prodrugs for AntiviralTherapy.”, Antiviral Chemistry and Chemotherapy, 22: 181-203 (2012)的综述。

方案12

细胞质的普遍还原性环境可以用作非酶促的释放触发器，其可以用于引发细胞内的净荷释放。被取代的环状二硫化物（诸如二硫苏糖醇）与替诺福韦中的膦酸酯基的连接将产生膦酸酯，其具有还原地脱偶联的潜力，伴随地在细胞内释放替诺福韦。据此，最初的谷胱甘肽介导的、13-1中的二硫苏糖醇的环状二硫化物还原将导致电荷-耗散驱动的环脱酯化以产生单-膦酸13-4，伴随地形成被取代的硫杂丙环13-2。这将自发地自淬灭(1,5-exo-tet环闭合)以产生稳定的四氢噻吩13-3。由于离去基团的稳定电荷的能力反映在它们的酸性中，人们可以预见到，排出过程对于更酸性的基团将是更有效的。因此，替诺福韦的膦酸酯基（其酸性低于存在于典型核苷单磷酸中的磷酸酯基团）将更缓慢地释放净荷。也将需要第二电荷屏蔽基团(RX, 13-1, 方案3)，其在还原地释放环状二硫化物单酯以后必须切掉。

方案13

特定实施例显示在方案14中。据此，预期苯基酯14-1会经历谷胱甘肽介导的、环状二硫化物基团的还原排出，继之以磷酸酶催化的苯基酯水解。预期该第二步骤在还原性的引发以后发生，因为酶(磷酸酶)对苯基酯的识别理想地需要在生理pH存在于膦酸酯单酯14-2上的负电荷的存在。类似地，还原地引发的二硫苏糖醇从膦酰基酰胺化物14-3的排出以后是酰胺酶介导的14-4的水解。设计了膦酰基酰胺化物14-6以增加在从14-5最初排出以后4-6中的氮的亲核性，和自发的随后水解(Caren L. Freel Meyers and Richard F.Borch: “Activation Mechanisms of Nucleoside Phosphoramidate Prodrugs.”, J. Med. Chem. 2000, 43, 4319-4327)。

方案14

在方案15中描述了苯基酯15-2的制备的一个代表性实施例。据此，使用DCC用苯酚将替诺福韦10-1酯化以产生单酯15-1，将其在标准的PyBOP介导的酯化中转化成最终的二酯15-2。

方案15

在某些实施方案中，在pH 7.3和40℃将化合物16-1和16-2暴露于谷胱甘肽(50mM), 方案16。通过LCMS监测单-酯的释放，并将数据总结在图2中。

方案16

实施例

中间体

除非另外指出，否则所有非水解反应在购自Aldrich的干燥溶剂中进行。除了amidite以外，使用Agilent Zorbax Eclipse Plus C18, 2.1 x 50mm, 1.8微米柱，在0.8mL/min流速，在60℃进行HPLC分析，用乙腈和水(用甲酸(0.1%)作为改性剂)的梯度(5-95%)洗脱。在其它方面相同的条件下，使用Supelco Ascentis C18, 100 x 4.6mm, 2.7微米柱和作为改性剂的甲酸铵(3mM)分析amidite。在220 nm记录紫外迹线，并使用AgilentTechnologies 6140 Quadrupole LC/MS质谱仪以阳和阴离子模式得到质谱图。使用预填充柱在Teledyne Isco CombiFlash Rf上通过梯度色谱法进行制备型纯化。在Varian Unity600、500或400谱仪上记录NMR谱。

中间体1

(4S/R, 5R/S)-5-(丙-2-炔-1-基氧基)-1,2-二噻烷-4-醇。给250 mL三颈烧瓶（配有冷凝器和顶置式搅拌器）装入5N KOH (100mL, 500mmol)，继之以80mL 2-甲基四氢呋喃、(4S/R, 5R/S)-1,2-二噻烷-4-醇(10g, 65.7mmol)和四丁基硫酸氢铵(4.46g,13.14mmol)。向该剧烈搅拌的混合物中，经由注射泵历时12h的时段加入炔丙基溴(9.38g,79mmol)在2-甲基四氢呋喃(20mL)中的溶液。继续在环境温度搅拌另外12h。将有机层分离，并将水层用乙酸乙酯(3 x 100mL)萃取。将合并的有机萃取物用水(1 x 100mL)、盐水(1 x100mL)洗涤，并经无水硫酸钠干燥。过滤并在真空中除去溶剂，得到10.4g粗产物，将其通过柱色谱法(硅胶, 220g, 甲醇-二氯甲烷: 0%至5%的甲醇)进一步纯化，得到5.25g (42%)作为无色固体的纯产物。¹H NMR (600 MHz, CD₃CN) δ : 4.27 (d, J = 2.3 Hz, 2H), 3.42(ddd, J = 11.9, 8.5, 3.7Hz, 1H), 3.23 (dd, J = 13.6, 3.6Hz, 1H), 3.07 (bd, J= 13.0Hz, 1H), 2.88 (dd, J = 13.0, 10.3Hz, 1H), 2.80 (dd, J = 13.5, 10.2Hz,1H), 2.73 (t, J = 2.5Hz, 1H)。¹³C NMR (600 MHz, CD₃CN) δ : 81.5(br), 80.3,75.1, 73.4(br), 57.2, 40.6(br), 37.6(br)。

中间体2

(4S/R, 5S/R)-5-(丙-2-炔-1-基氧基)-1,2-二噻烷-4-醇。使用与关于中间体1描述的操作类似的操作，从二硫代赤藓醇二硫化物和炔丙基溴制备该化合物。¹H NMR (600MHz, DMSO-D₆) δ : (bs, 1H), 4.25 (s, 2H), 3.7 (bm, 3H), 3.37 (t, J = 2.40Hz,1H), 3.13 (m, 1H), 2.96 (dd, J = 13.2, 8.1Hz, 1H)。¹³C NMR (600 MHz, DMSO-D₆) δ: 81.23, 77.64, 75.92(br), 70.43(br), 65.48(br), 56.33(br.)

中间体3

(4S/R,5R/S)-5-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}-1,2-二噻烷-4-醇。使用与关于中间体1描述的操作类似的操作，从二硫代赤藓醇二硫化物和4-甲基苯磺酸-2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酯制备该化合物。¹H NMR (600 MHz, CD₃CN) δ : 3.92(s, 1H), 3.79 (ddd, J = 11.3, 6.0, 2.7Hz, 1H), 3.60 (m, 2H), 3.54 (m, 8H),3.45 (m, 2H), 3.28 (s, 3H), 3.17 (dd, J = 8.5, 4.8Hz, 1H), 3.05 (dd, J =13.3, 3.6Hz, 1H), 2.87 (dd, J = 13.3, 10.4Hz, 1H), 2.77 (dd, J = 13.3,10.3Hz, 1H)。¹³C NMR (600 MHz, CD₃CN) δ : 83.5, 73.5, 71.8, 70.35, 70.33,70.30, 70.25, 58.2, 69.3, 40.8, 37.9。

中间体4

(4S,5R)-5-(苄氧基)-1,2-二噻烷-4-醇和(4R,5S)-5-(苄氧基)-1,2-二噻烷-4- 醇。将反式-4,5-二羟基-1,2-二噻烷(10 g, 65.7 mmol)和苄基溴(12.36 g, 72.3 mmol)在2-甲基-THF (100 ml)中在室温搅拌。加入KOH溶液(5 M的在水中的溶液) (100 ml, 500mmol)，随后加入四丁基硫酸氢铵(5.58 g, 16.4 mmol)。将反应混合物剧烈搅拌18 h。将得到的混合物在乙酸乙酯(200 mL)和水(200 mL)之间分配。将水层用乙酸乙酯(3x50 mL)洗涤。将合并的有机相干燥(Na₂SO₄)并在减压下浓缩。使用10%的乙酸乙酯在己烷中的溶液通过快速色谱法纯化残余物，得到9.0 g (37.1 mmol, 56%)产物的外消旋混合物。将它通过SFC-HPLC (Diacel Chiralpak AS, 30x250mm, 30%MeOH/CO₂,70 mL/min)进一步纯化，得到4.3 g (4R,5R)-5-(苄氧基)-1,2-二噻烷-4-醇(17.7 mmol, 27.0%)和4.2 g (4S,5S)-5-(苄氧基)-1,2-二噻烷-4-醇(17.3 mmol, 26%)。关于(4R,5R)-5-(苄氧基)-1,2-二噻烷-4-醇, LCMS: 关于C₁₁H₁₁O₂S₂，计算值为242.0，实测值为243.0 [M+H]⁺。¹H NMR (500 MHz,CD₃CN) δ : 7.35 (m, 5H), 4.68 (d, J=11.5 Hz, 1H), 4.59, (d, J = 11.6 Hz, 1H),3.63 (m, 1H), 3.52 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 3.39 (m, 1H), 3.27 (dd, J = 13.5, 3.5Hz, 1H), 3.10 (dd, J = 13.4, 2.9 Hz, 1H), 2.86 (m, 2H)。¹³C NMR (500 MHz,CD₃CN) δ : 138.66, 128.34, 127.97, 127.66, 71.30。关于(4S,5S)-5-(苄氧基)-1,2-二噻烷-4-醇, LCMS：关于C₁₁H₁₁O₂S₂，计算值为242.0，实测值为243.0 [M+H]⁺。¹H NMR (500MHz, CD₃CN) δ : 7.36 (m, 5H), 4.71 (d, J=11.7 Hz, 1H), 4.66, (d, J = 11.7 Hz,1H), 3.66 (m, 1H), 3.55 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 3.42 (m, 1H), 3.30 (dd, J =13.5, 3.6 Hz, 1H), 3.13 (dd, J = 13.3, 2.9 Hz, 1H), 2.89 (m, 2H)。¹³C NMR (500MHz, CD₃CN) δ : 138.66, 128.34, 127.97, 127.66, 71.30。

中间体5

使用在中间体2中描述的相同操作合成(4R/S,5R/S)-5-(吡啶-4-基甲氧基)-1,2- 二噻烷-4-醇。LCMS：关于C₁₀H₁₃NO₂S₂，计算值为243.0，实测值为244.0 [M+H]⁺。

中间体6

按照关于中间体2描述的操作，使用硫酸二甲酯作为烷化剂，以40%收率合成(4S/R,5S/R)-5-甲氧基-1,2-二噻烷-4-醇。终产物是两种对映异构体的混合物。化学式:C₅H₁₀O₂S₂。精确质量: 166.01。没有LCMS分析的UV和MS检测。¹H NMR (500 MHz, CD₃CN) δ :3.66 (m, 2H), 3.50 (s, 3H), 3.36 (dd, J = 13.4 Hz, 3.6Hz, 1H), 3.25 (m, 1H),3.17 (dd, J = 13.3 Hz, 3.3 Hz, 1H), 2.98 (dd, 13.4 Hz, 10.1 Hz), 2.86 (dd,13.3 Hz, 10.1 Hz, 1H)。¹³C NMR (500 MHz, CD₃CN) δ : 83.44, 72.51, 56.66, 40.15,36.62。

中间体7

1-((4aR,6R,7R,7aR)-2-(二异丙基氨基)-7-羟基-7-甲基四氢-4H-呋喃并[3,2- d][1,3,2]二氧杂磷杂环己烯(phosphinin)-6-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮。在N₂的保护下，将1-((2R,3R,4R,5R)-3,4-二羟基-5-(羟基甲基)-3-甲基四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(260 mg, 1.01 mmol)和N,N-二异丙基乙胺(390 mg, 3.02 mmol)溶解在10 mL含有3Å分子筛(2 g)的无水二氯甲烷中。将混合物冷却至0℃以后，加入双(二异丙基氨基)氯代膦(322 mg, 1.21 mmol)。将反应混合物在0℃搅拌30 min，并缓慢地温热至室温和搅拌3h。加入DMAP (61.5 mg, 0.50 mmol)以促进环化。将反应物在室温搅拌16 h。通过过滤除去固体。将滤液在减压下浓缩，并使用25%丙酮在己烷中的溶液通过快速色谱法纯化残余物，得到163 mg (0.42 mmol, 42%)纯产物。LCMS：关于C₁₆H₂₆N₃O₆P，计算值为387.2，实测值为388.0 [M+H]⁺。¹H NMR (500 MHz, CD₃CN) δ : 9.29 (s, br, 1H), 7.40 (m, 1H), 5.94(s, 1H), 5.68 (dd, J = 4.0, 4.0 Hz, 1H), 4.42 (m, 1H), 4.17 (dd, J = 10.0,10.0 Hz, 1H), 3.88 (m, 1H), 3.75 (m, 2H), 3.56 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 3.47 (s,br, 1H), 1.22 (m, 12H), 1.17 (s, 3H)。¹³C NMR (500 MHz, CD₃CN) δ : 140.16,102.29, 93.10, 66.61, 44.44, 44.34, 24.20, 24.15, 19.71, -5.11. ³¹P NMR (500MHz, CD₃CN) δ : 150.43。

中间体8

使用关于中间体1描述的操作，合成1-((4aR,6R,7R,7aR)-2-(二异丙基氨基)-7-氟-7-甲基四氢-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧杂磷杂环己烯-6-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮。LCMS：关于C₁₆H₂₅FN₃O₅P，计算值为389.2，实测值为390.0 [M+H]⁺。³¹P NMR (500 MHz,CD₃OD) δ : 150.42。

中间体9

使用关于中间体1描述的操作，合成4-氨基-1-((4aR,6R,7aR)-2-(二异丙基氨基)-7,7-二氟四氢-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧杂磷杂环己烯-6-基)嘧啶-2(1H)-酮。LCMS：关于C₁₅H₂₃F₂N₄O₄P，计算值为392.1，实测值为393.0 [M+H]⁺。³¹P NMR (500 MHz,CD₃OD) δ : 152.40。

实施例1

1-((4aR,6R,7R,7aR)-2-(((4R/S,5R/S)-5-(苄氧基)-1,2-二噻烷-4-基)氧基)- 7-羟基-7-甲基-2-氧代四氢-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧杂磷杂环己烯-6-基)嘧啶-2, 4-(1H,3H)-二酮。向在室温搅拌的1-((4aR,6R,7R,7aR)-2-(二异丙基氨基)-7-羟基-7-甲基四氢-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧杂磷杂环己烯-6-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(115mg, 0.30 mmol)在二氯甲烷(10 mL)中的溶液中，加入5-(吡啶-4-基甲氧基)-1,2-二噻烷-4-醇(108 mg, 0.45 mmol)和5-(乙基硫基)-1H-四唑(19.3 mg, 0.15 mmol)。将反应物在室温搅拌4 h，此时加入叔丁基氢过氧化物(40.1 mg, 0.45 mmol)。将反应物在室温搅拌另外30 min。在减压下除去溶剂，使用10%的MeOH在二氯甲烷中的溶液通过快速色谱法纯化残余物，得到17 mg (0.03 mmol, 11%)纯产物。LCMS：关于C₂₀H₂₄N₃O₉PS₂，计算值为545.1，实测值为546.0 [M+H]⁺。³¹P NMR (500 MHz, CD₃OD) δ : -1.49, -4.63, -5.00, -6.91。

实施例2

按照在实施例1中描述的操作，从中间体4和7合成1-((4aR,6R,7R,7aR)-2-(((4R/ S,5R/S)-5-(苄氧基)-1,2-二噻烷-4-基)氧基)-7-羟基-7-甲基-2-氧代四氢-4H-呋喃并 [3,2-d][1,3,2]二氧杂磷杂环己烯-6-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮。LCMS：关于C₂₁H₂₅N₂O₉PS₂，计算值为544.1，实测值为562.0 [M+H₂O]。³¹P NMR (500 MHz, CD₃OD) δ : -4.10, -4.49, -6.44, -6.62。

实施例3

除了用二苯基乙酰基二硫化物替代叔丁基氢过氧化物进行氧化以外，按照与在实施例1中描述的操作类似的操作，从中间体4和7合成1-((4aR,6R,7R,7aR)-2-(((4R/S,5R/ S)-5-(苄氧基)-1,2-二噻烷-4-基)氧基)-7-羟基-7-甲基-2-硫代四氢-4H-呋喃并[3,2-d] [1,3,2]二氧杂磷杂环己烯-6-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮。LCMS：关于C₂₁H₂₅N₂O₈PS₃，计算值为560.0，实测值为583.0 [M+Na]⁺。³¹P NMR (500 MHz, CD₃OD) δ : 65.79, 62.12,61.95。

实施例4

按照在实施例1中描述的操作，从中间体4和9合成4-氨基-1-((4aR,6R,7aR)-2- (((4R/S,5R/S)-5-(苄氧基)-1,2-二噻烷-4-基)氧基)-7,7-二氟-2-氧代四氢-4H-呋喃并 [3,2-d][1,3,2]二氧杂磷杂环己烯-6-基)嘧啶-2(1H)-酮。LCMS：关于C₂₀H₂₂F₂N₃O₇PS₂，计算值为549.1，实测值为550 [M+H]⁺。³¹P NMR (500 MHz, CD₃OD) δ : -5.14, -5.34, -7.76,-8.02。

实施例5

按照在实施例1中描述的操作，从中间体1和9合成4-氨基-1-((4aR,6R,7aR)-7,7- 二氟-2-氧代-2-(((4R/S,5R/S)-5-(丙-2-炔-1-基氧基)-1,2-二噻烷-4-基)氧基)四氢- 4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧杂磷杂环己烯-6-基)嘧啶-2(1H)-酮。LCMS：关于C₁₆H₁₈F₂N₃O₇PS₂，计算值为497.0，实测值为498.0 [M+H]⁺。³¹P NMR (500 MHz, CD₃OD) δ : -5.33, -5.68, -7.91。

实施例6

按照在实施例1中描述的操作，从中间体3和9合成4-氨基-1-((4aR,6R,7aR)-7,7- 二氟-2-(((4R/S,5R/S)-5-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-1,2-二噻烷-4-基) 氧基)-2-氧代四氢-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧杂磷杂环己烯-6-基)嘧啶-2(1H)-酮。LCMS：关于C₂₀H₃₀F₂N₃O₁₀PS₂，计算值为605.1，实测值为606.1 [M+H]⁺。³¹P NMR (500 MHz,CD₃OD) δ : -5.01, -5.42, -7.71, -7.93。

实施例7

按照在实施例1中描述的操作，从中间体4和8合成1-((4aR,6R,7R,7aR)-2-(((4R/ S,5R/S)-5-(苄氧基)-1,2-二噻烷-4-基)氧基)-7-氟-7-甲基-2-氧代四氢-4H-呋喃并[3, 2-d][1,3,2]二氧杂磷杂环己烯-6-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮。LCMS：关于C₂₁H₂₄FN₂O₈PS₂，计算值为546.1，实测值为545.0 [M-H]^-。³¹P NMR (500 MHz, CD₃OD) δ : -5.55, -5.67,-8.09, -8.36。

实施例8

使用在实施例1中描述的操作，从中间体6和7合成1-((4aR,6R,7R,7aR)-7-羟基- 2-(((4S/R,5S/R)-5-甲氧基-1,2-二噻烷-4-基)氧基)-7-甲基-2-氧代四氢-4H-呋喃并[3, 2-d][1,3,2]二氧杂磷杂环己烯-6-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮。终产物是4种非对映异构体的混合物。LCMS：关于C₁₅H₂₁N₂O₉PS₂，计算值为468.0，实测值为491.0 [M+Na]⁺。³¹P NMR (500MHz, CD₃CN) δ : -5.19, -5.68, -7.74, -7.67。

实施例9

使用在实施例1中描述的操作，从中间体6和8合成1-((4aR,6R,7R,7aR)-7-氟-2-(((4S/R,5S/R)-5-甲氧基-1,2-二噻烷-4-基)氧基)-7-甲基-2-氧代四氢-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧杂磷杂环己烯-6-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮。终产物是4种非对映异构体的混合物。LCMS：关于C₁₅H₂₀FN₂O₈PS₂，计算值为470，实测值为493.0 [M+Na]⁺。³¹P NMR (500MHz, CD3CN) δ : -5.54, -5.83, -8.17, -8.29。

实施例10

使用在实施例1中描述的操作，从中间体6和9合成1-((4aR,6R,7aR)-7,7-二氟-2- (((4S,5S)-5-甲氧基-1,2-二噻烷-4-基)氧基)-2-氧代四氢-4H-呋喃并[3,2-d][1,3,2]二氧杂磷杂环己烯-6-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮。终产物是4种非对映异构体的混合物。LCMS：关于C₁₄H₁₇F₂N₂O₈PS₂，计算值为474，实测值为475 [M+H]⁺。³¹P NMR (500 MHz, CD3CN)δ : -5.81, -6.18, -8.21。

实施例11

((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)膦酸氢苯酯。向100 ml3颈烧瓶中装入替诺福韦(1.25 g, 4.35 mmol)、苯酚(0.819 g, 8.70 mmol)和NMP (11mL)。将混合物加热至85℃，并加入TEA (0.789 mL, 5.66 mmol)。然后在100℃缓慢地加入DCC (1.437 g, 6.96 mmol)在NMP (2.4 mL)中的溶液。继续加热16 h。将反应物冷却至45℃，用水(10 mL)稀释并冷却至25℃。将固体通过过滤除去并用水(5 mL)冲洗。在减压下将合并的滤液和洗液浓缩成黄褐色浆。将它用水稀释。通过LC-MS (5-65%的ACN在水中的溶液)纯化得到的黄褐色溶液，产生作为白色固体的0329531-0138 (350 mg, 0.963 mmol,22.14%收率)。LCMS：关于C₁₅H₁₈N₅O₄P，计算值为363.11，实测值为364.20 [M+H]⁺。³¹P NMR(500 MHz, CD3CN) δ : 15.09。

实施例12

((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)膦酸-(4R,5R)-5-(苄氧基)-1,2-二噻烷-4-基苯基酯。向单苯基酯（其制备描述在实施例12中）(120 mg, 0.330mmol)、(4R,5R)-5-(苄氧基)-1,2-二噻烷-4-醇(120 mg, 0.495 mmol)、PyBOP (258 mg,0.495 mmol)和1 g分子筛在DMF (2 ml)中的混合物中加入DIEA (0.231 ml, 1.321mmol)。在室温搅拌18 h以后，将固体滤出。将滤液在真空中浓缩，得到橙色胶状物。将残余物溶解在ACN/水的1:1混合物中，并通过LC-MS (10-70%的ACN在水中的溶液)纯化，得到作为白色固体的0329531-0142 (60 mg, 0.102 mmol, 30.9%收率)。LCMS：关于C₂₆H₃₀N₅O₅PS₂，计算值为587.14，实测值为588.00 [M+H]⁺。³¹P NMR (500 MHz, CD3CN) δ : 18.88。

生物学

使用对丙型肝炎病毒(HCV)有活性的核苷，证实了本文中公开的前药的治疗潜力。表3和表4总结了针对基因型1a、1b和2a在亚基因组复制子测定(RHEPTAQ)中评估的、这些前药的测量的活性。

表3

表4

在多轮HIV-1感染测定中评估抗病毒效能

在如下进行的Viking测定中评估替诺福韦前药的抗病毒活性。使用MT4-gag-GFP克隆D3 (在下文中称作MT4-GFP)监测HIV-1复制，该MT4-GFP是被修饰成携带GFP报道基因的MT-4细胞，所述GFP报道基因的表达依赖于HIV-1表达的蛋白tat和rev。用HIV-1对MT4-GFP细胞的生产性感染导致感染后大约24h的GFP表达。

在补充了10%胎牛血清、100 U/ml青霉素/链霉素和400µg/ml G418的RPMI 1640中在37℃/5%CO₂/90%相对湿度维持MT4-GFP细胞，以维持报道基因。为了感染，将MT4-GFP细胞放在缺乏G418的相同培养基中，并在相同温育条件中在约0.01的感染复数用H9IIIB病毒感染过夜。然后将细胞洗涤，并以1.6 x 10⁵个细胞/mL再悬浮于含有10%正常人血清的RPMI1640中(10%NHS条件)，或以2 x 10⁵个细胞/mL再悬浮于100%正常人血清中(100%NHS条件)。如下制备化合物平板：使用ECHO声学分配器，将溶解在DMSO中的化合物分配进384孔聚D赖氨酸包被的平板的孔中(0.2µl/孔)。以10点连续3倍稀释度(典型终浓度: 4.2µM - 0.21nM)试验每种化合物。对照包括无抑制剂(仅DMSO)和3种抗病毒剂的组合(依法韦仑、茚地那韦和整合酶链转移抑制剂N1-乙基-N1-((7S,10R)-2-((4-氟苄基)-氨甲酰基)-3-羟基-7-甲氧基-4-氧代-4,6,7,8,9,10-六氢嘧啶并-[1,2-a]氮杂环庚三烯-10-基)-N2,N2-二甲基草酰胺，各自4µM的终浓度)。将细胞加入化合物平板(50µL/孔)，并将受感染的细胞维持在37℃/5%CO₂/90%相对湿度。

通过使用Acumen eX3扫描仪计数每个孔中的绿色细胞的数目，在2个时间点（感染后~48h和~ 72h）定量受感染的细胞。在~24h时段内绿色细胞的数目的增加会给出繁殖率R₀，其通常为5-15，且已经实验性地证实处于对数期(数据未显示)。计算每个孔的R₀的抑制，并通过非线性的4-参数曲线拟合来确定IC₅₀。数据总结在表5中。

表5

本领域技术人员会容易地认识到，本发明非常适合于执行所述目标且获得提及的结果和优点，以及其中固有的那些。作为优选实施方案的目前代表，本文描述的方法和组合物是示例性的且不意欲作为对本发明范围的限制。被包括在本发明的精神内的本领域技术人员将做出的其中的改变和其它用途由权利要求的范围限定。

Claims

1.具有式I的化合物：

其中，

R¹是O-炔丙基；

R⁴是O；

每个R²、R³、R⁵、R⁶、R⁷和R⁸独立地是H；

R⁹是O-苯基，其可以被一个或多个卤素基团取代；或NH-苄基；

R¹⁰是O；且

NUC是

2.具有下式的权利要求1所述的化合物：

3.具有以下的结构的权利要求1所述的化合物：

4.具有选自以下的结构的化合物：

5.具有式II的化合物：

其中，

R¹是O-炔丙基；

R⁴是O；

每个R²、R³、R⁵、R⁶、R⁷和R⁸独立地是H；

R¹⁰是O；且

NUC是

6.具有下式的权利要求5所述的化合物：

7.具有以下的结构的权利要求5所述的化合物：

8.具有选自以下的结构的化合物：

9.一种组合物，其包含权利要求1-8中的任一项所述的化合物、或其药学上可接受的盐、和药学上可接受的载体或稀释剂。

10.权利要求1-8中的任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐用于制备药物的用途，所述药物用于治疗有此需要的患者中的病毒感染，其中所述病毒感染是HCV、HBV、HPV、HSV或HIV感染。

11.权利要求1-8中的任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐用于制备药物的用途，所述药物用于治疗有此需要的患者中的癌症，其中所述癌症是胆道癌、膀胱癌、移行细胞癌、泌尿道上皮癌、骨肉瘤、脑癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、乳腺癌、化生性癌、宫颈癌、直肠癌、结肠癌、结肠直肠腺癌、胃肠道间质瘤(GIST)、子宫内膜癌、子宫内膜间质肉瘤、食管癌、食管鳞状细胞癌、食管腺癌、眼黑素瘤、胆囊癌、胆囊腺癌、肾细胞癌、白血病、肝癌、胆管上皮癌、肝胚细胞瘤、肺癌、间皮瘤、B-细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、T-细胞淋巴瘤、前驱T-成淋巴细胞性淋巴瘤/白血病、多发性骨髓瘤、鼻咽癌(NPC)、神经母细胞瘤、口咽癌、口腔鳞状细胞癌、卵巢癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、假乳头状肿瘤、腺泡细胞癌、前列腺癌、皮肤癌、小肠癌、胃癌、胃肠道间质瘤(GIST)、子宫癌或子宫肉瘤。

12.权利要求11的用途，其中所述癌症是宫颈鳞状细胞癌。

13.权利要求11的用途，其中所述癌症是结肠直肠癌。

14.权利要求11的用途，其中所述癌症是遗传性非息肉性结直肠癌。

15.权利要求11的用途，其中所述癌症是肝细胞癌。

16.权利要求11的用途，其中所述癌症是葡萄膜黑素瘤。

17.权利要求11的用途，其中所述癌症是透明细胞肾细胞癌。

18.权利要求11的用途，其中所述癌症是肾母细胞瘤。

19.权利要求11的用途，其中所述癌症是急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓样白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓样白血病(CML)或慢性粒单核细胞白血病(CMML)。

20.权利要求11的用途，其中所述癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。

21.权利要求11的用途，其中所述癌症是弥漫性大B细胞性淋巴瘤。

22.权利要求11的用途，其中所述癌症是周围T-细胞淋巴瘤。

23.权利要求11的用途，其中所述癌症是黑素瘤。

24.权利要求11的用途，其中所述癌症是恶性黑素瘤。

25.权利要求11的用途，其中所述癌症是皮肤黑素瘤。

26.权利要求11的用途，其中所述癌症是前列腺腺癌。