CN104936586A

CN104936586A - 用于治疗实体肿瘤的氯硝柳胺及其衍生物

Info

Publication number: CN104936586A
Application number: CN201380046667.9A
Authority: CN
Inventors: 比约恩·舍夫勒; 马丁·格拉斯
Original assignee: Rheinische Friedrich Wilhelms Universitaet Bonn; Life and Brain GmbH
Current assignee: Rheinische Friedrich Wilhelms Universitaet Bonn; Life and Brain GmbH
Priority date: 2012-08-06
Filing date: 2013-08-06
Publication date: 2015-09-23
Also published as: WO2014023329A1; JP2015528437A; PH12015500252A1; US9844522B2; WO2014023732A1; AU2013301542A1; US20150174086A1; MX2015001716A; BR112015002706A8; IL237125A0; CL2015000289A1; JP6272861B2; BR112015002706A2; PE20150764A1; SG11201500912XA; EP2879671A1; RU2015107753A; CA2880916A1

Abstract

本发明涉及氯硝柳胺用于治疗癌症的新治疗用途。特别地，提供了氯硝柳胺或其衍生物之一与烷化剂之组合用于治疗实体肿瘤。此外，氯硝柳胺或其衍生物之一可用于治疗以NFKBIA低表达为特征的实体肿瘤。最后，本发明涉及用于确定单独用氯硝柳胺治疗或氯硝柳胺与烷化剂组合治疗是否适用于癌症患者的诊断方法。

Description

用于治疗实体肿瘤的氯硝柳胺及其衍生物

发明背景

化疗已经发展为对抗癌症越来越有效的防线(1)。在成胶质细胞瘤(glioblastoma，GBM)中，烷化剂替莫唑胺(temozolomide，TMZ)已成为与手术切除和放疗组合的标准方案。然而，仍非常需要开发替代治疗选择，因为GBM仍然是致命疾病，其中位总生存期只有15个月(2，3)。对于抗癌药物的发现，传统上采用两种主要策略(4)。一种是靶向方法，其中在可针对不同干扰和抑制设计特定化合物之前需要暴露癌症相关的分子和/或信号传导级联。或者，可对成百上千种化合物进行经验筛选以鉴定以其他方式不可预测的抗肿瘤作用。然而，这两种策略均背负着临床转化过程中的高消耗率(5，6)。这可部分地由使用早期开发阶段用于药物评价的不适当的细胞模型系统所引起(7)，例如，患者间和患者内肿瘤异质性很少在这些系统中反映。本发明人已经开发了体外细胞系统，其密切反映体内GBM并因此特别适用于鉴定化合物及化合物组合，当所述化合物或化合物组合用于体内时，其还很可能提供GBM特异性抗癌活性。使用该体外细胞系统，本发明人能够鉴定用于改善成胶质细胞瘤化疗的化合物和化合物组合。

发明概述

在第一个方面，本发明涉及根据式I、II或III的第一细胞抑制化合物或其盐与烷化化合物(alkylating compound)的组合，其用于治疗实体肿瘤：

其中

A是羰基、亚甲基、羟基次甲基、烷氧基次甲基、氨基次甲基、肟、腙、芳基腙或缩氨基脲(semicarbazone)；

B如果存在的话，则为CR₂₅R₂₆、O、S或NR₂₇；

R₁、R₃、R₄、R₈、R₁₀和R₁₁独立地为氢、羟基、烷氧基、卤素或C₁至C₆烷基；

R₂和R₇独立地为卤素、羟基或氢，

R₅如果存在的话，则为羟基、磷酸酯/盐(phosphate)、氢、卤素、烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、烷氧基、烷硫基或氨基；

R₆如果存在的话，则为氢或C₁至C₆烷基；

R₉是硝基、氢、羟基、氨基、卤素、烷基、烯基、炔基或芳基；并且

R₂₁、R₂₂、R₂₃和R₂₄如果存在的话，则独立地为氢、羟基、卤素、烷基、烯基、炔基、环烷基或芳基；

R₂₅和R₂₆如果存在的话，则独立地为氢、羟基、卤素、烷基、烯基、炔基、环烷基或芳基；并且

R₂₇如果存在的话，则为氢或C₁至C₆烷基。

在本发明的一个方面，所述烷化化合物具有根据式IV的结构或其盐

其中

X和Y独立地为羰基、亚甲基、羟基次甲基、烷氧基次甲基、氨基次甲基、肟、腙、芳基腙或缩氨基脲，

R₃₁是氢、烷基、烷氧基、烯基、炔基、环烷基或芳基；并且

R₃₂是氨基、氢、羟基或卤素。

在另一个方面，本发明涉及包含根据式I、II或III的化合物、烷化剂和可药用赋形剂的药物组合物，其中A、B、R₁至R₁₁和R₂₁至R₂₄的含义如上所定义，所述药物组合物用于治疗实体肿瘤。

在另一个方面，本发明涉及根据式I、II或III的化合物，其中A、B、R₁至R₁₁和R₂₁至R₂₄的含义如上所定义，所述化合物用于治疗以NFKBIA的表达水平降低为特征的实体肿瘤。

在另一个方面，本发明涉及用于确定使用如上文中所定义的根据式I、II或III的所述细胞抑制化合物治疗是否适用于治疗患有实体肿瘤之患者的方法，其包括以下步骤：

a)确定所述患者的肿瘤细胞或肿瘤组织的样品中NFKBIA的表达水平；

b)将所确定的表达水平与参考值进行比较；

c)基于步骤b)的比较结果确定用氯硝柳胺治疗是否适用于所述患者，其中NFKBIA的低表达或缺失表明所述组合治疗适用于所述患者。

在另一个方面，本发明涉及用于确定要向患有实体肿瘤的患者施用的氯硝柳胺与替莫唑胺之摩尔比的方法，其包括以下步骤：

b)将所确定的表达水平与参考值进行比较；

c)基于步骤b)的比较结果确定氯硝柳胺与替莫唑胺的摩尔比，其中

(i)表达高于所述参考值表明所述摩尔比应低于40％的氯硝柳胺；以及

(ii)表达水平低于所述参考值表明所述摩尔比应大于或等于40％的氯硝柳胺。

发明详述

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同含义。

优选地，本文中所用术语如在″A multilingual glossary ofbiotechnological terms：(IUPAC Recommendations)″，Leuenberger，H.G.W，Nagel，B.and Klbl，H.eds.(1995)，Helvetica Chimica Acta，CH-4010Basel，Switzerland)中所述进行定义。

除非上下文另有要求，否则贯穿该说明书和所附权利要求书的词语“包括”以及变体例如“包含”和“含有”应理解为意指包含所述的整数或步骤或者整数或步骤的组，但是不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤的组。

在本说明书全文中引用了一些文献。本文中所引用的每个文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、指南等)，无论是在上文或是在下文，其均通过引用以其整体并入本文。这不应理解为承认本发明无权作为在先发明而先于这些公开内容。

为了鉴定适用于治疗实体肿瘤(特别是成胶质细胞瘤)的新化合物，将已知保留体外患者和疾病特定性状的原代人GBM细胞(pGBM)(8-10)应用于经验筛选方法。针对代表疾病的多个方面的pGBM库(portfolio)进行药物的发现和验证。将三个单独的人非恶性神经细胞群(hnNC)以及五个常用的胶质瘤细胞系用作实验的对照。小分子氯硝柳胺作为pGBM选择性、促凋亡和抗增殖化合物从这些研究中应运而生。氯硝柳胺的多效性作用方式有效地耗尽了具有和不具有干细胞特质的GBM细胞，并且其显著提高了在异种移植模型中的存活时间。与TMZ组合的协同抗癌活性以及这些作用的相关生物标记还针对临床开发氯硝柳胺作为除GBM初次治疗中的现行标准之外的补充提出了独到见解。

因此，本发明的问题通过提供根据式I、II或III的第一细胞抑制化合物或其盐与烷化化合物的组合得到了解决，所述组合用于治疗实体肿瘤：

其中

A是羰基、亚甲基、羟基次甲基、烷氧基次甲基、氨基次甲基、肟、腙、芳基腙或缩氨基脲，优选为羰基；

B如果存在的话，则为CR₂₅R₂₆、O、S或NR₂₇；

R₁、R₃、R₄、R₈、R₁₀和R₁₁独立地为氢；羟基；烷氧基，优选为C₁至C₆烷氧基；卤素，优选为氟、氯或溴；或者C₁至C₆烷基，即C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烷基，在每种情况下优选为氢；

R₂和R₇独立地为卤素、羟基或氢，在每种情况下优选为卤素；

R₅是羟基、磷酸酯/盐、氢；卤素，优选氟、氯或溴；烷基，优选为C₁至C₆烷基，即C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烷基；烯基，优选为C₂至C₆烯基；炔基，优选为C₂至C₆炔基；环烷基，优选为C₃至C₈环烷基，特别是环戊基、环己基、环庚基和环辛基；或者芳基，优选为C₆至C₁₄芳基，特别是苯基；烷氧基，优选为C₁至C₆烷氧基；烷硫基，优选C₁至C₆烷硫基或氨基；最优选为羟基或磷酸酯/盐；

R₆如果存在的话，则为氢或C₁至C₆烷基；

R₉是硝基、氢、羟基、氨基；卤素，优选为氟、氯或溴；烷基，优选为C₁至C₆烷基，即C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烷基；烯基，优选为C₂至C₆烯基；炔基，优选C₂至C₆炔基；或芳基，优选C₆至C₁₄芳基，优选苯基；最优选为硝基；并且

R₂₁、R₂₂、R₂₃和R₂₄如果存在的话，则独立地为氢；羟基；卤素，优选氟、氯或溴；烷基，优选为C₁至C₆烷基，即C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烷基；烯基，优选为C₂至C₆烯基；炔基，优选C₂至C₆炔基；环烷基，优选为C₃至C₈环烷基，特别是环戊基、环己基、环庚基和环辛基；或芳基，优选为C₆至C₁₄芳基，特别是苯基；

R₂₅和R₂₆如果存在的话，则独立地为氢；羟基；卤素，优选氟、氯或溴；烷基，优选为C₁至C₆烷基，即C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烷基；烯基，优选为C₂至C₆烯基；炔基，优选C₂至C₆炔基；环烷基，优选为C₃至C₈环烷基，特别是环戊基、环己基、环庚基和环辛基；或芳基，优选为C₆至C₁₄芳基，特别是苯基；并且

R₂₇如果存在的话，则为氢或C₁至C₆烷基。

如果化合物能够抑制肿瘤细胞的增殖，则化合物为如本申请所提及的“细胞抑制化合物”。优选地，细胞抑制化合物还是细胞毒性的，即，其实际上杀伤肿瘤细胞。优选地，给定浓度的细胞抑制化合物的上述作用对肿瘤细胞的作用大于非肿瘤细胞，以使得与肿瘤组织相比，所述化合物对健康组织没有损伤或很少损伤。确定化合物的细胞毒性作用强度的优选方法是确定将细胞群的代谢活性降低到对照活性的50％的浓度(ICM₅₀)。这可例如通过向细胞培养物施加刃天青(resazurin)来进行。在健康细胞中，刃天青被转化为荧光产物试卤灵(resorufin)。转化速率可用于测量细胞的代谢活性。优选地，根据本发明的细胞抑制化合物的ICM₅₀浓度不大于在相同条件下的氯硝柳胺或氯硝柳胺和烷化剂的ICM₅₀浓度的2倍、5倍、10倍、20倍或50倍。

在本发明的一个优选的实施方案中，所述化合物由式I定义，其中

A是羰基；

R₁、R₃、R₄、R₈、R₁₀和R₁₁独立地为氢、羟基、卤素或C₁至C₆烷基，在每种情况下优选为氢；

R₂和R₇独立地为卤素、羟基或氢，在每一种情况下优选为卤素，更优选为氟、氯或溴，最优选为氯；

R₅是羟基、磷酸酯/盐；氢；卤素，优选氟、氯或溴；烷基，优选为C₁至C₆烷基，即C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烷基；烯基，优选为C₂至C₆烯基，即，C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烯基；炔基，优选为C₂至C₆炔基，即，C₂、C₃、C₄、C₅或C₆炔基；环烷基，优选为C₃至C₈环烷基，特别是环戊基、环己基、环庚基和环辛基；或者芳基，优选为C₆至C₁₄芳基，特别是苯基；烷氧基，优选为C₁至C₆烷氧基；烷硫基，优选C₁至C₆烷硫基或氨基；最优选为羟基或磷酸酯/盐；并且

R₉是硝基、氢、羟基、氨基、卤素、烷基、烯基、炔基或芳基，优选为硝基。

A是羰基；

R₁、R₃、R₄、R₈、R₁₀和R₁₁独立地为氢；羟基；卤素，优选为氟、氯或溴；或C₁至C₆烷基，即C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烷基；在每种情况下优选为氢；

R₂和R₇独立地为卤素，优选为氟、氯或溴；羟基或氢；最优选为氯；

R₅是羟基；磷酸酯/盐；氢；卤素，优选氟、氯或溴；烷基，优选为C₁至C₆烷基，即C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烷基；烯基，优选为C₂至C₆烯基，即，C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烯基；炔基，优选为C₂至C₆炔基，即，C₂、C₃、C₄、C₅或C₆炔基；环烷基，优选为C₃至C₈环烷基，特别是环戊基、环己基、环庚基和环辛基；或者芳基，优选为C₆至C₁₄芳基，特别是苯基；烷氧基，优选为C₁至C₆烷氧基，即C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烷氧基；烷硫基，优选C₁至C₆烷硫基，即C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烷硫基；或氨基；最优选为羟基或磷酸酯/盐；并且

R₉是硝基。

甚至更优选地，在由式I定义的所述化合物中：

A是羰基；

R₁、R₃、R₄、R₆、R₈、R₁₀和R₁₁是氢；

R₂和R₇是氯，

R₅是羟基；并且R₉是硝基。

在本发明的另一个优选的实施方案中，所述化合物由式I定义，其中：

A是羰基；

R₁、R₃、R₄、R₈、R₁₀和R₁₁是氢；

R₂和R₇是氯，

R₅是磷酸酯/盐；并且R₉是硝基。

在最优选的实施方案中，所述细胞抑制化合物是氯硝柳胺。

已经示出，磷酸酯/盐基团显著地提高式I化合物的吸收(Pan等，2012，Niclosamide，an old antihelminthic agent，demonstrates antitumor activityby blocking multiple signalling pathways of cancer stem cells，第31卷：178-184)，由此改善该化合物的生物利用度。

术语“烷化剂”是指能够将鸟嘌呤转化为O⁶-烷基鸟嘌呤、O⁴-烷基鸟嘌呤或N⁷-烷基鸟嘌呤的任何药物化合物，即，O⁶-烷化剂、O⁴-烷化剂或N⁷-烷化剂。合适的烷化剂是技术人员已知的。通常，通过烷化剂添加的烷基是甲基。该转化损伤DNA并触发所涉及的细胞死亡。该作用主要影响快速分裂的细胞例如癌细胞。烷化鸟嘌呤可如Reh等(1999)“O⁶-methylguanine DNA adducts associated with occupationalnitrosamine exposure”，Carcinogenesis，21：29-33中所述进行检测。优选地，烷化剂是O⁶-烷化剂，即，其完全地或主要地烷化鸟嘌呤的C⁶-原子。

在本发明的一个方面，烷化化合物具有根据式IV的结构或其盐：

其中

X和Y独立地为羰基、亚甲基、羟基次甲基、烷氧基次甲基、氨基次甲基、肟、腙、芳基腙或缩氨基脲，优选为羰基，

R₃₁是烷基，优选为C₁至C₆烷基，即C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烷基；氢；烷氧基，优选为C₁至C₆烷氧基，即C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烷氧基，烯基，优选为C₂至C₆烯基，即C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烯基；炔基，优选为C₂至C₆炔基，例如C₂、C₃、C₄、C₅或C₆炔基；环烷基，优选为C₃至C₈环烷基，特别是环戊基、环己基、环庚基和环辛基；或芳基，优选C₆至C₁₄芳基，特别是苯基；优选为烷基；并且

R₃₂是氨基、氢、羟基或卤素，优选为氟、氯或溴。

在一个优选的实施方案中，烷化剂由式IV或其盐所定义，X是羰基并且Y是羰基、亚甲基、羟基次甲基、烷氧基次甲基、氨基次甲基、肟、腙、芳基腙或缩氨基脲，优选为羰基，

R₃₁是烷基，优选为C₁至C₆烷基，即C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烷基；氢；烷氧基，优选为C₁至C₆烷氧基，即C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烷氧基，烯基，优选为C₂至C₆烯基，即C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烯基；炔基，优选为C₂至C₆炔基，即C₂、C₃、C₄、C₅或C₆炔基；环烷基，优选为C₃至C₈环烷基，特别是环戊基、环己基、环庚基和环辛基；或芳基，优选C₆至C₁₄芳基，特别是苯基；优选为烷基；并且

R₃₂是氨基、氢、羟基或卤素，优选为氟、氯或溴。

在一个特别优选的实施方案中，所述烷化剂由式IV定义，其中

X和Y是羰基；

R₃₁是烷基，优选为C₁至C₆烷基，即C₁、C₂、C₃、C₄、C₅或C₆烷基，优选为甲基；并且

R₃₂是氨基。

在最优选的实施方案中，所述烷化剂是替莫唑胺。

上文所用术语具有以下优选的含义：

烷基优选为直链或支链C₁至C₁₀烷基，更优选为C₁至C₆烷基。含有不超过6个碳原子的烷基称为“低级烷基”。优选的烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、3-戊基、己基和辛基。

优选的环烷基是C₃至C₈环烷基，特别是环戊基、环己基、环庚基和环辛基。进一步优选的是相应的环烯基，特别是环戊烯基、环己烯基、环庚烯基和环辛烯基。

优选的烯基是C₂至C₁₀烯基，特别是乙烯基，1-丙烯基或2-丙烯基，1-丁烯基、2-丁烯基或3-丁烯基，1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基或4-戊烯基，1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基或5-己烯基，1-庚烯基、2-庚烯基、3-庚烯基、4-庚烯基、5-庚烯基或6-庚烯基，1-辛烯基、2-辛烯基、3-辛烯基、4-辛烯基、5-辛烯基、6-辛烯基或7-辛烯基，1-壬烯基、2-壬烯基、3-壬烯基、4-壬烯基、5-壬烯基、6-壬烯基、7-壬烯基或8-壬烯基或1-癸烯基、2-癸烯基、3-癸烯基、4-癸烯基、5-癸烯基、6-癸烯基、7-癸烯基、8-癸烯基或9-癸烯基。

优选的炔基是C₂至C₁₀炔基，特别是乙炔基，1-丙炔基或2-丙炔基，1-丁炔基、2-丁炔基或3-丁炔基，1-戊炔基、2-戊炔基、3-戊炔基或4-戊炔基，1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、4-己炔基或5-己炔基，1-庚炔基、2-庚炔基、3-庚炔基、4-庚炔基、5-庚炔基或6-庚炔基，1-辛炔基、2-辛炔基、3-辛炔基、4-辛炔基、5-辛炔基、6-辛炔基或7-辛炔基，1-壬炔基、2-壬炔基、3-壬炔基、4-壬炔基、5-壬炔基、6-壬炔基、7-壬炔基或8-壬炔基或1-癸炔基、2-癸炔基、3-癸炔基、4-癸炔基、5-癸炔基、6-癸炔基、7-癸炔基、8-癸炔基或9-癸炔基。

术语“烷基”、“环烷基”、“烯基”和“炔基”还指经取代的烷基、经取代的环烷基、经取代的烯基和经取代的炔基。所述基团的优选取代基包括至少一种卤素、羟基、羧基、烷氧基羰基、氨基、硝基、氰基、C₁至C₆酰氨基、C₁至C₆氨基酰基、C₁至C₆酰氧基、C₁至C₆烷氧基、芳氧基、烷硫基、C₆至C₁₀芳基、C₄至C₇的环烷基、C₂至C₆烯基和C₂至C₆炔基。

优选的烷氧基包含被上述烷基、烯基或炔基中的一种取代，优选地被甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、3-戊基、己基和辛基取代，更优选地被甲基取代的氧。

优选的烷硫基包含被上述烷基、烯基或炔基中的一种取代，优选地被甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、3-戊基、己基和辛基取代，更优选地被甲基取代的硫、亚砜和砜。

优选的氨基包含-NH₂、-NHR₅₁、-NR₅₁R₅₂，其中R₅₁和R₅₂是C₁至C₁₀烷基，优选地选自以下基团：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、3-戊基、己基和辛基，最优选为甲基，或者环烷基或R₅₁和R₅₂与N组合以形成环结构，优选为5元至7元环结构，例如哌啶或者R₅₁和R₅₂与N和其他杂原子组合以形成饱和的、经取代的或部分饱和的5元至7元杂环基团。优选的杂原子包括O、N和S。

优选的芳基包括C₆至C₁₄芳基，更特别地C₆至C₁₀芳基。更优选地，芳基基团是苯基、萘基、菲基、蒽基、茚基、薁基、联苯基(bephenyl)、亚联苯基或芴基。术语“芳基”还指如下定义的经取代的芳基。

芳基的优选取代基包括至少一种酰基、亚烷基二氧基(-OCH₂O-)、卤素、C₆至C₁₀芳基、C₄至C₇的环烷基、C₁至C₆烷基、C₂至C₆烯基、C₂至C₆炔基、C₁至C₆羟基烷基、硝基、氨基或C₁至C₆烷氧基。

优选的卤素包括氟、碘、氯和溴。

在另一个优选的实施方案中，所述烷化剂选自氮芥类、亚硝基脲类、烷基磺酸酯类、基于铂的化疗药物以及非典型烷化剂。

优选的氮芥类是环磷酰胺、氮芥、乌拉莫司汀、美法仑、苯丁酸氮芥、曲磷胺和异环磷酰胺。

优选的亚硝基脲类是卡莫司汀、洛莫司汀和链佐星。

优选的烷基磺酸酯类是白消安。

优选的基于铂的化疗药物是顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利铂、沙铂和四硝酸三铂。

优选的非经典烷化剂是丙卡巴肼、altetramine、达卡巴嗪、塞替派和米托唑胺。特别优选的是达卡巴嗪和米托唑胺。

最优选地，所述烷化剂是亚硝基脲，特别是卡莫司汀。

术语“实体肿瘤”是指瘤性细胞的任意固有群(inherent group)。根据本发明的“实体肿瘤”可以是良性、恶化前或恶性。优选地，其为恶化前或恶性并且，最优选为恶性。

优选的恶化前肿瘤选自：光化性角化病、皮角(cutaneaous horn)、光化性唇炎、焦油性角化病、砷角化病、X射线角化病、鲍温病(Bowen′sdisease)、鲍温样丘疹病、恶性雀斑样痣(1entigo maligna)、硬化性苔藓(1ichen sclerosus)和苔藓橡胶黏膜(1ichen rubber mucosae)；消化道癌前病变，特别是黏膜红斑病、白斑、Barrett食管、Plummer-Vinson综合征、脚溃疡(crural ulcer)、巨大肥厚性胃炎(gastropathia hypertrophicagigantea)、交界性癌、瘤性肠息肉、直肠息肉，瓷样胆囊(porcelaingallbladder)；妇科癌前病变、特别是原位导管癌(CDIS)、宫颈上皮内瘤样病变(CIN)、黏膜白斑病、子宫内膜增生(III级)，外阴营养不良改变、外阴上皮内瘤样病变(VIN)，葡萄胎；泌尿癌前病变，特别是膀胱乳头状瘤病，Queyrat增殖性红斑、睾丸上皮内瘤样病变(TIN)、白斑和原位癌(CIS)。

优选的恶性肿瘤选自：成胶质细胞瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、T细胞淋巴瘤(例如，皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、非皮肤外周T细胞淋巴瘤、与人T细胞嗜淋巴性病毒(HTLV)相关的淋巴瘤、成人T细胞淋巴瘤(ATLL)、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin′s lymphoma)、非霍奇金淋巴瘤(包括原发性中枢神经系统淋巴瘤)、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤、间皮瘤、儿童实体肿瘤、骨癌和软组织肉瘤、常见的成人实体肿瘤例如头颈癌(例如，口腔癌、喉癌和食管癌)、生殖泌尿癌(例如，前列腺癌、膀胱癌、肾癌(特别是恶性肾细胞癌(RCC))、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌)、结直肠癌、肺癌(例如，小细胞癌和非小细胞肺癌，包括鳞状细胞癌和腺癌)、乳腺癌、胰腺癌、黑素瘤和其他皮肤癌、基底细胞癌、转移性皮肤癌、溃疡性和乳突型两者的鳞状细胞癌、胃癌、脑癌、肝细胞癌、肾上腺癌、肾癌、甲状腺癌、髓样癌、骨肉瘤、软组织肉瘤、尤文肉瘤(Ewing′s sarcoma)、网状细胞肉瘤(veticulum cell sarcoma)和卡波西肉瘤(Kaposi′s sarcoma)、纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤(Wilm’s tumor)、小细胞肺癌、上皮癌、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、血管瘤、重链疾病和肿瘤转移。

在本发明的一个优选实施方案中，所述实体肿瘤选自：成胶质细胞瘤、霍奇金淋巴瘤、结直肠癌、黑素瘤、肝细胞癌、乳腺癌和多发性骨髓瘤。最优选地，所述实体肿瘤是成胶质细胞瘤。

术语“成胶质细胞瘤”或“多形性成胶质细胞瘤”是指涉及胶质细胞的原发性脑肿瘤。成胶质细胞瘤优选地基于增殖的胶质肿瘤细胞、血管增生以及优先地坏死组织区域的组织学存在来诊断(对于进一步分类：Louis，D.N.，Ohgaki，H.，Wiestler，O.D.，Cavenee，W.K.，Burger，P.C.，Jouvet，A.，Scheithauer，B.W.，and Kleihues，P.2007.The 2007WHO classification oftumours of the central nervous system.Acta Neuropathol 114：97-109.)。

在本发明的一个更优选的实施方案中，成胶质细胞瘤选自：原发性成胶质细胞瘤、继发性成胶质细胞瘤、新生性成胶质细胞瘤(de novoglioblastoma)、复发性成胶质细胞瘤、基因O6-甲基鸟嘌呤-甲基转移酶(MGMT)之启动子的甲基化提高的成胶质细胞瘤、MGMT之启动子的甲基化未提高的成胶质细胞瘤、具有突变之p53的成胶质细胞瘤、不具有突变之p53的成胶质细胞瘤、编码B细胞κ轻多肽基因增强子抑制因子(kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor，NFKBIA)的基因发生改变的成胶质细胞瘤、编码NFKBIA的基因未发生改变的成胶质细胞瘤、编码表皮生长因子受体(EGFR)的基因发生改变的成胶质细胞瘤、编码EGFR的基因未发生改变的成胶质细胞瘤、编码血小板衍生生长因子受体(PDGFRA)的基因发生改变的成胶质细胞瘤、编码PDGFRA的基因未发生改变的成胶质细胞瘤、编码异柠檬酸脱氢酶1(isocitrate dehydrogenase 1，IDHI)的基因发生改变的成胶质细胞瘤、编码IDHI的基因未发生改变的成胶质细胞瘤、编码1型神经纤维瘤病(neurofibromatosis type 1，NF1)的基因发生改变的成胶质细胞瘤以及编码NF1的基因未发生改变的成胶质细胞瘤。

术语“改变”是指所涉基因的突变、缺失和额外拷贝的存在。突变和缺失可以是纯合的或杂合的。此外，术语“成胶质细胞瘤”还指原发性以及复发性疾病。

特别优选的是用与烷化剂组合的由式I、II或III所定义的化合物治疗实体肿瘤，特别是选自以下的实体肿瘤：成胶质细胞瘤、霍奇金淋巴瘤、结直肠癌、黑素瘤、肝细胞癌、乳腺癌和多发性骨髓瘤，其中所述肿瘤的特征在于NFKBIA的低表达。优选地，所述NFKBIA的低表达由在14q13处的NFKBIA基因座(NFKBIA^+/-)的杂合缺失所引起。

优选地，同时或相继施用根据式I、II或III的化合物和烷化剂。

术语“同时”是指两种化合物剂量的施用间隔不超过5分钟，不超过10分钟或不超过20分钟。更优选地，两种化合物是由向患者施用的单个药物组合物所包含之组分。

术语“相继施用”是指其中选择两种化合物的施用间隔以能够产生组合的协同效应或更优选地使其最大化的施用方案。优选地，选择根据式I、II或III的化合物与烷化剂的施用间隔以同时达到两种物质的峰值血浆水平。还优选地，根据式I、II或III的化合物与烷化剂的施用间隔不超过1天、3天、6天或9天。

优选地，选择化合物的施用量以便达到肿瘤位置处的活性化合物的定义比值。本领域技术人员已知的是，在肿瘤位置处的药物化合物的有效浓度取决于施用途径、在不同隔室(例如，血液和组织)中的化合物分布、前药的酶促激活和/或活性化合物的酶促失活以及化合物从身体排泄的速率。因此，合适剂量的决策取决于前述参数。然而，本领域技术人员很清楚该问题并且药代动力学分析有助于确定在肿瘤位置处达到活性化合物的期望浓度的化合物剂量。

优选的施用途径为经口、静脉内、鞘内、实质内(intraparenchymal)施用。

优选地，在肿瘤位置处，氯硝柳胺的摩尔比(表示为氯硝柳胺与替莫唑胺的添加摩尔浓度的mol％)为10mol％、20mol％、30mol％、40mol％、50mol％、60mol％、70mol％、80mol％或90mol％。更优选地，两个化合物的摩尔比取决于NFKBIA的表达状态。

如果所涉及的肿瘤以NFKBIA的表达降低为特征，那么氯硝柳胺的摩尔比优选为等于或大于40％的氯硝柳胺与替莫唑胺的添加摩尔浓度。更优选地，浓度大于50mol％、大于60mol％、大于70mol％、大于80mol％或大于90mol％，最优选地其为50mol％。

如果所涉及的肿瘤不以NFKBIA的表达降低为特征，那么氯硝柳胺的摩尔比优选为小于40％的氯硝柳胺与替莫唑胺的添加摩尔浓度。更优选地，浓度小于40mol％、小于30mol％、小于20mol％或小于10mol％，最优选地其为10mol％。

术语“治疗”是指将本发明的化合物施用给患者，其目的在于针对实体肿瘤来恢复或保持患者健康。

在本发明的一个优选的实施方案中，所述治疗是治愈性的。优选地，治愈性治疗旨在从患者身体中完全根除所有肿瘤细胞。应理解，治愈性治疗并不能在接受治疗的所有患者中都成功。通常几乎没有医学治疗，并且特别是几乎没有癌症治疗对每位患者均起作用。然而，治愈性治疗是指与未接受治疗或仅接受安慰剂的患者组相比可治愈明显大部分的患者。优选地，未接受治疗或仅接受安慰剂的患者组(“对照组”)具有与接受治疗的组相同的特征，例如年龄、疾病类型和严重程度、性别或体重。用于确定患者的一个组的成功率是否比另一个组高的统计学方法是本领域技术人员公知的。

在本发明的另一个优选的实施方案中，所述治疗是姑息治疗。姑息治疗不旨在从患者身体中完全根除所有肿瘤细胞，但这样的结果并不被术语“姑息治疗”排除在外。优选地，姑息治疗旨在减少患者中肿瘤相关的症状，例如疼痛或神经缺陷。还优选地，姑息治疗旨在降低肿瘤体积以及与其相关的症状，延长肿瘤进展前的时间或提高存活的时间。此外，“姑息治疗”优选是保持肿瘤稳定，即，防止肿瘤块增大和形成新的肿瘤转移。

优选的亚类是辅助治疗或新辅助治疗方案。辅助治疗或新辅助治疗两者的特征在于与手术切除一个或更多个实体肿瘤组合施用本发明的化合物。

术语“新辅助治疗”优选地是指在外科手术之前施用本发明的化合物。这样的施用方案可用于在外科手术之前降低肿瘤的大小从而提高完全手术切除的机会或者从而减少在外科手术期间必须切除的组织的量以使得外科手术对于患者造成的负担较小。

优选地，术语“辅助治疗”是指在外科手术之后施用本发明的化合物。辅助治疗还可与放疗结合。在许多情况下，外科手术不会导致从患者身体中完全切除肿瘤或所有肿瘤。远端肿瘤转移可能已经存在但是太小而无法通过成像方法检测到。类似地，肿瘤细胞可能已经局部扩散超出肿瘤的表观边界(apparent margin)。在这两种情况下，使用本发明的化合物的辅助治疗提供了杀伤那些没有通过外科手术(以及当适用时放疗)所移除之肿瘤细胞的机会，由此提高完全治愈的机会。

辅助治疗以及新辅助治疗两者均可作为治愈性治疗以及姑息治疗施用。

在一些情况下，肿瘤不适合外科手术因为病人太虚弱使得认为手术具有不可接受的风险或者因为肿瘤不易进行不损害患者重要解剖结构的手术。这两种情形在患有转移的肿瘤的患者中频繁出现。在这样的情况下，癌症疾病的晚期阶段极大地削弱了患者，同时，存在于体内的许多肿瘤将需要大量的手术。在这些情况下，优选的是作为不用外科手术的全身治疗单独施用根据式I、II或III的化合物或与烷化剂组合组合施用。本领域技术人员已知肿瘤的药物治疗通常依赖于2种、3种或甚至更多种药物化合物的组合。因此，可用其他细胞抑制化合物和/或细胞毒性化合物来补充单独的根据式I、II或III的化合物或根据式I、II或III的化合物与烷化剂的组合。

在本发明的另一个优选的实施方案中，本发明的化合物的治疗旨在防止显然成功治疗的肿瘤的复发。通常，通过外科手术、放疗、化疗或任意上述治疗的组合治疗肿瘤引起肿瘤的缓解。肿瘤的缓解是其中没有临床上可检测的(例如通过成像方法、目测或实验室参数)肿瘤痕迹的状态。然而，在许多情况下，在明显成功治疗后几年内，肿瘤在与原始肿瘤相同的位置或远距离的身体部分复发。因此，肿瘤的缓解不等于成功治愈。可施用本发明的化合物从而不依赖于原始治疗选择来防止明显成功治疗的肿瘤的复发。

患者优选为脊椎动物，更优选为哺乳动物。甚至更优选地，患者是猫、狗、猴、绵羊、山羊、猪、小鼠、大鼠或人。最优选地，患者是人。

在本发明的一个实施方案中，上文列出的化合物作为可药用盐存在。术语“可药用盐”是指本发明化合物的盐。本发明化合物的合适的可药用盐包括酸加成盐，其可以是例如通过将本发明的化合物溶液与可药用酸的溶液混合来形成，所述可药用酸例如盐酸、硫酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、乙酸、苯甲酸、柠檬酸、酒石酸、碳酸或磷酸。此外，当本发明的化合物携带酸性部分时，其合适的可药用盐可包括碱金属盐(例如，钠盐或钾盐)；碱土金属盐(例如，钙盐或镁盐)；以及与合适的有机配体形成的盐(例如使用反阴离子例如卤素离子、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、烷基磺酸根和芳基磺酸根形成的铵、季铵以及胺阳离子)。可药用盐的示例性实例包括但不限于：乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、溴化物、丁酸盐、乙二胺四乙酸钙、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、右旋樟脑磺酸盐(camsylate)、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、克拉维酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、二盐酸盐、十二烷基硫酸盐、乙二胺四乙酸盐、乙二磺酸盐、依托酸盐(estolate)、乙磺酸盐(esylate)、乙烷磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐(gluceptate)、葡庚糖酸盐(glucoheptonate)、葡糖酸盐、谷氨酸盐、甘油磷酸盐、羟乙酰氨基苯胂酸盐(glycolylarsanilate)、半硫酸盐(hemisulfate)、庚酸盐、己酸盐、己基间苯二酚盐、海巴明(hydrabaimine)、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙烷磺酸盐、羟基萘甲酸盐、碘化物、异硫氰酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲烷磺酸盐、甲基硫酸盐、黏酸盐(mucate)、2-萘磺酸盐、萘磺酸盐(napsylate)、烟酸盐、硝酸盐、N-甲基葡糖胺铵盐、油酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐(恩波酸盐(embonate))、棕榈酸盐、泛酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、硫酸盐、次醋酸盐(subacetate)、琥珀酸盐、鞣酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐(teoclate)、甲苯磺酸盐、三乙基碘、十一烷酸盐、戊酸盐等(参见例如Berge，S.M.等，“Pharmaceutical Salts”，Journal of Pharmaceutical Science，1977，66，1-19)。本发明的某些特定化合物包含碱性官能性和酸性官能性二者，其允许化合物转化为碱加成盐或酸加成盐。

可以通过以常规方式使盐与碱或酸接触并分离母体化合物来再生所述化合物的中性形式。所述化合物的母体形式在某些物理性质方面(例如，在极性溶剂中的溶解度)不同于多种盐形式，但在其他方面所述盐出于本发明的目的而等同于所述化合物的母体形式。

除盐形式之外，本发明还提供前药形式的化合物。本文所述化合物的前药是在生理条件下易于经历化学变化以提供通式(I)至(III)的化合物的那些化合物。前药是药理学活性的或失活的化合物，在向患者施用前药之后前药通过体内生理作用(例如，水解、代谢等)化学修饰成本发明化合物。此外，可以在离体环境中通过化学或生化方法将前药转化为本发明的化合物。例如，当与合适的酶一起置于透皮贴剂储库(reservoir)中时，前药可以缓慢地转化为本发明的化合物。涉及制备和使用前药的合适性和技术是本领域技术人员所公知的。对于涉及酯的前药的一般性讨论，参见Svensson和Tunek，Drug Metabolism Reviews 16.5(1988)以及Bundgaard，Design of Prodrugs，Elsevier(1985)。遮蔽的(masked)酸性阴离子的实例包括多种酯，例如烷基(例如甲基、乙基)酯、环烷基(例如，环己基)酯、芳烷基(例如，苄基、对甲氧基苄基)酯和烷基羰基氧基烷基(例如，新戊酰基氧基甲基)酯。已将胺遮蔽为经芳基羰基氧基甲基取代的衍生物，其在体内被酯酶切割，释放游离药物和甲醛(BungaardJ.Med.Chem.2503(1989))。此外，已用N-酰氧基甲基基团遮蔽含酸性NH基团(例如咪唑、酰亚胺、吲哚等)的药物(Bundgaard Design ofProdrugs，Elsevier(1985))。已将羟基遮蔽为酯和醚。EP 0 039 051(Sloanand Little，Apr.11，1981)公开了曼尼希碱(Mannich-base)异羟肟酸前药、其制备及用途。

本发明化合物以及根据本发明用于其制备的起始原料可如本文中所示来合成，或者在本领域技术人员已知并且适用于所述反应的反应条件下，通过本领域技术人员已知的方法和标准操作来合成，即，如文献(例如，标准工作例如Houben-Weyl，Methoden der organischen Chemie[Methods of Organic Chemistry]，Georg-Thieme-Verlag，Stuttgart中的)中所述。

如果期望的话，还可以通过以下所述来原位形成起始原料：不将起始原料与反应混合物分离，而是立即将其进一步转化为本发明的化合物。另一方面，可以逐步进行反应。应注意，当涉及具有非特异性立体化学之化合物的制备时，示出一般操作。但是，这样的操作一般适用于具有特定立体化学的那些化合物，例如，其中立体中心处的立体化学为(S)或(R)。此外，具有一种立体化学(例如，(R))的化合物可以常常用于使用公知方法(例如，通过反转(inversion))产生具有相反立体化学(即，(S))的那些化合物。

本发明的某些化合物可以以未溶剂化形式以及溶剂化形式(包括水化形式)存在。一般来说，溶剂化形式等同于未溶剂化形式，并且旨在被涵盖在本发明的范围内。本发明的某些化合物可以以多晶型或无定形形式存在。一般来说，对于本发明所包括的用途而言，所有物理形式均是等同的，并且旨在被包括在本发明的范围内。

本发明的某些化合物具有不对称碳原子(光学中心)或双键。外消旋体、对映体、非对映体、几何异构体以及单个异构体均旨在被涵盖在本发明的范围内。因此，本发明的化合物包括立体异构体的混合物，尤其是对映体的混合物，以及经纯化的立体异构体，尤其是经纯化的对映体，或者富含立体异构体的混合物，尤其是富含对映体的混合物。由下式(I)至(IV)所示的化合物的单个异构体及其任何完全或部分平衡的混合物也包括在本发明的范围内。本发明还包括由下式所表示的化合物的单个异构体及其异构体(其中一个或更多个手性中心是反转的)的混合物。此外，应理解的是，式(I)至(IV)的化合物的所有互变异构体和互变异构体的混合物包括在式(I)至(IV)(并且优选与其相应的式和子式)之化合物的范围内。

可以通过本身已知的方法机械地或化学地将所得外消旋体拆分为异构体。非对映体优选地通过与光学活性拆分剂反应而从外消旋混合物形成。

合适的拆分剂的实例是光学活性酸，例如酒石酸、二乙酰基酒石酸、二苯甲酰基酒石酸、扁桃酸、苹果酸、乳酸或多种光学活性樟脑磺酸(例如，-樟脑磺酸)的D和L形式。同样有利的是借助于填充有光学活性拆分剂(例如二硝基苯甲酰基苯基甘氨酸)的柱的对映体拆分；合适的洗脱剂的实例是己烷/异丙醇/乙腈混合物。

还可以通过标准纯化方法(例如，色谱或分级结晶)来进行非对映体拆分。

还可以使用已为光学活性的起始原料通过上述方法获得式(I)至(IV)的光学活性化合物。

在另一方面，本发明涉及包含根据式I、II或III(其中A和R₁至R₁₁具有上述含义和优选的含义)之化合物和可药用赋形剂的药物组合物，其用于治疗实体肿瘤。在一个优选的实施方案中，药物组合物还包含烷化剂，其优选地由式IV所定义，其中X、Y、R₃₁和R₃₂具有上述含义和优选的含义。

本申请所提及的“药物组合物”包含至少一种本发明的化合物和至少一种可药用载体。

就从本发明的化合物制备药物组合物而言，可药用载体可以是固体或液体。固体形式制剂包括散剂、片剂、丸剂、胶囊剂、扁囊剂(cachet)、栓剂和可分散颗粒剂。固体载体可以是一种或更多种物质，其还可以作为稀释剂、矫味剂、黏合剂、防腐剂、片剂崩解剂或包封材料。

在散剂中，载体是细粒状的固体，其处于与细粒状的活性组分的混合物中。在片剂中，活性组分与具有必要黏合性质的载体以合适的比例混合并且以期望的形状和大小来压制。

所述散剂和片剂优选地包含5％至80％、更优选20％至70％的活性化合物。合适的载体是碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可豆脂等。

术语“制备”旨在包括配制活性化合物与作为载体的包封材料以提供胶囊剂，其中载体包围活性组分(具有或不具有其他载体)并且因此与其缔合。类似地，包括扁囊剂和锭剂(lozenge)。可以将片剂、散剂、胶囊剂、丸剂、扁囊剂和锭剂用作适用于经口施用的固体剂型。

就制备栓剂而言，首先熔化低熔点蜡(例如脂肪酸甘油酯或可可豆脂的混合物)，并使活性成分在其中均匀分散(例如通过搅拌)。然后，将熔融的均匀混合物倒入合适大小的模件中使其冷却，从而固化。

液体形式制剂包括溶液剂、混悬剂和乳剂，例如水或水/丙二醇溶液。液体形式特别优选的用于局部施用于眼。就肠胃外注射而言，液体制剂可以在溶液中配制为聚乙二醇水溶液。

适用于经口使用的水溶液可以通过以下来制备：将活性组分溶解于水中，并根据需要来添加合适的着色剂、矫味剂、稳定剂和增稠剂。适用于经口使用的水性混悬剂可通过以下来制备：将细粒状的活性组分与黏性材料一起分散于水中，所述黏性材料例如天然的或合成的树胶、树脂、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、以及其他公知的助悬剂。

还包括固体形式制剂，其旨在在使用之前不久将其转化为液体形式制剂以用于经口施用。这样的液体形式包括溶液剂、混悬剂和乳剂。除活性组分外，这些制剂还可包含着色剂、矫味剂、稳定剂、缓冲剂、人工的和天然的甜味剂、分散剂、增稠剂、增溶剂等。

药物制剂优选地为单位剂型。在这样的形式中，将制剂细粒化为含有适量活性组分的单位剂量。单位剂型可以是包装制剂，所述包装含有离散量的制剂，例如小瓶中或安瓿中的包装片剂、胶囊剂和散剂。此外，单位剂型可以是胶囊剂、片剂、扁囊剂或锭剂本身，或者其可以是适当数目的任意的这些包装形式。

在本发明的一个优选实施方案中，所述药物组合物还包含至少一种其他的细胞抑制化合物或细胞毒性化合物。所述其他化合物选自：替莫唑胺、柔红霉素、藤黄酸酰胺、藤黄酸、硫柳汞、盐酸米托蒽醌、醋酸苯汞、放线菌素D、扁蒴藤素(Pristimerin)、盐酸表柔比星、硫酸长春新碱、吐根碱、紫杉醇、10-羟基喜树碱、多柔比星、秋水仙碱、喜树碱、替尼泊苷、硫酸长春碱、丝裂霉素C、氟尿苷、哇巴因、盐酸安西他滨、盐酸奎纳克林、氯硝柳胺、安吖啶、硫鸟嘌呤、鱼藤酮、盐酸阿克拉菌素(aklavinehydrocloride)、阿糖胞苷、甲氨蝶呤以及苦鬼臼毒素(picropodophyllotoxin)。

另一些优选的其他细胞抑制化合物或细胞毒性化合物包括：抗雌激素类，例如氟维司群、他莫昔芬或雷洛昔芬；拓扑异构酶I或II的任何抑制剂，例如喜树碱(拓扑I)或依托泊苷(拓扑II)；通过抑制芳香化酶活性起作用的任何化合物，例如阿那曲唑或来曲唑；干扰HER2信号传导的任何制剂，例如赫赛汀；与DNA相互螯合的任何化合物，例如多柔比星。特别优选的细胞抑制药物或细胞毒性药物(其可与本发明化合物组合)是烷化物质、抗代谢物、抗生素、埃博霉素、核受体激动剂和拮抗剂、抗雄激素类、抗雌激素类、铂化合物、激素和抗激素、干扰素和细胞周期依赖性蛋白激酶(cell cycle-dependent protein kinase，CDK)抑制剂、环氧合酶和/或脂氧合酶的抑制剂、生物源的脂肪酸和脂肪酸衍生物(包括前列腺素类和白三烯)、蛋白激酶抑制剂、蛋白质磷酸酶抑制剂、脂质激酶抑制剂、铂配合物、乙撑亚胺类(ethyleneimenes)、甲基蜜胺类(methylmelamines)、三嗪类(trazines)、长春花生物碱、嘧啶类似物、嘌呤类似物、烷基磺酸酯类、叶酸类似物、蒽二酮类、经取代的脲、甲基肼衍生物(特别是醋地砜(acediasulfone))、阿克拉霉素(aclarubicine)、安巴腙(ambazone)、氨鲁米特、L-天冬酰胺酶、硫唑嘌呤、博来霉素、白消安、亚叶酸钙、卡铂、卡培他滨、卡莫司汀、塞来昔布、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D、氨苯砜、柔红霉素、双溴丙脒、二乙基己烯雌酚(diethylstilbestrole)、多西他赛、多柔比星、烯二炔类、表柔比星、埃坡霉素B、埃坡霉素D、磷酸雌莫司汀(estramucin phosphate)、雌激素、乙炔雌二醇、依托泊苷、夫拉平度、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟甲睾酮、氟他胺、磷雌酚(fosfestrol)、呋喃唑酮、吉西他滨、促性腺激素释放激素类似物、六甲密胺、羟基碳酰胺(hydroxycarbamide)、羟甲基硝基呋喃妥因、己酸羟孕酮(hydroxyprogesteronecaproat)、羟基脲、伊达比星、碘苷、异环磷酰胺、干扰素γ、伊立替康、亮丙瑞林(leuprolide)、洛莫司汀、勒托替康(lurtotecan)、硫酸磺胺米隆醇酰胺(olamide)、氮芥、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮(megastrolacetate)、美法仑、米帕林、巯嘌呤、甲氨蝶呤、甲硝唑、丝裂霉素C、米托鬼臼肼(mitopodozide)、米托坦、米托蒽醌、光神霉素、萘啶酸、硝呋太尔(nifuratel)、硝呋齐特、呋喃拉嗪(nifuralazine)、硝呋替莫、尼莫司汀、尼莫拉唑(ninorazole)、硝基呋喃妥因、氮芥类、卵黏蛋白(oleomucin)、喹酸(oxolinic acid)、喷他脒、喷司他丁、非那吡啶、酞磺胺噻唑、哌泊溴烷、泼尼莫司汀、泼尼松、preussin、丙卡巴肼、乙胺嘧啶、雷替曲塞、雷帕霉素、罗非昔布(rofecoxib)、罗格列酮、柳氮磺胺吡啶、氯化scriflavinium、司莫司汀、链脲霉素、磺胺脲、磺胺醋酰、磺胺氯达嗪(sulfachlopyridazine)、磺胺嘧啶、磺胺戊烯、磺胺地索辛、磺胺乙二唑、磺胺异唑、磺胺胍、磺胺胍诺、磺胺甲二唑、磺胺甲基异唑、复方新诺明(cotrimoxazole)、磺胺甲氧二嗪、磺胺甲氧嗪、磺胺唑、磺胺、磺胺培林、磺胺苯吡唑、磺胺噻唑、磺胺索嘧啶、星形孢菌素、他莫昔芬、泰素、替尼泊苷、特替泊苷(tertiposide)、睾内酯、丙酸睾酮、硫鸟嘌呤、塞替派、替硝唑、拓扑替康、三亚胺醌(triaziquone)、曲奥舒凡(treosulfan)、甲氧苄啶、曲磷胺(trofosfamide)、UCN-01、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春碱、长春瑞滨以及佐柔比星，或其各自的衍生物或类似物。

在本发明的一个特别优选的实施方案中，所述其他细胞抑制化合物或细胞毒性化合物是替莫唑胺。

盐/酯

根据本发明的组合物中的化合物或可以使用的化合物可以作为盐或酯存在，特别是可药用盐或酯。本发明化合物的可药用盐包括其合适的酸加成盐或碱盐。合适的可药用盐的综述可见于Berge等，J Pharm Sci，66，1-19(1977)中。例如，与以下酸形成盐：强无机酸，例如矿物酸，例如硫酸、磷酸或氢卤酸；强有机羧酸，例如具有1至4个碳原子的烷烃羧酸(例如，乙酸)，其未被取代或者被取代(例如，被卤素取代)；饱和的或不饱和的二元羧酸，例如草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、邻苯二甲酸或四邻苯二甲酸；羟基羧酸，例如抗坏血酸、乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸；氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸；苯甲酸；或有机磺酸，例如(C₁-C₄)-烷基-磺酸或芳基-磺酸，其未被取代或者被取代(例如被卤素取代)，例如甲磺酸或对甲苯磺酸。

根据被酯化的官能团，使用有机酸或醇/氢氧化物形成酯。有机酸包括羧酸，例如具有1至12个碳原子的烷烃羧酸，其未被取代或者被取代(例如，被卤素取代)，例如乙酸；饱和的或不饱和的二元羧酸，例如草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、邻苯二甲酸或四邻苯二甲酸；羟基羧酸，例如抗坏血酸、乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸；氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸；苯甲酸；或有机磺酸，例如(C₁-C₄)-烷基-磺酸或芳基-磺酸，其未被取代或者被取代(例如被卤素取代)，例如甲磺酸或对甲苯磺酸。合适的氢氧化物包括无机氢氧化物，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铝。醇包括具有1至12个碳原子的烷烃醇，其可以是未被取代的或被取代的，例如，被卤素取代。

同位素

本发明的化合物还可在构成这样的化合物之一个或更多个原子处包含非天然比例的原子同位素。本发明试剂或其可药用盐的同位素变化定义如下：其中至少一个原子被具有相同原子序数但原子质量不同于天然常见之原子质量的原子所替代。可并入所述试剂及其可药用盐的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，分别例如²H、³H、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁷O、¹⁸O、³¹P、³²P、³⁵S、¹⁸F以及³⁶Cl。所述试剂及其可药用盐的某些同位素变化(例如，其中并入放射性同位素例如³H或¹⁴C的那些)可用于药物和/或底物组织分布研究。特别优选氚化的(即，³H)和碳-14(即，¹⁴C)同位素，这是因为其易于制备性和可检测性。此外，用同位素(例如，氘，即³H)取代可以提供由较大代谢稳定性导致的某些治疗优点，例如，体内半衰期提高或剂量需求降低，因此在某些情形下可以是优选的。本发明试剂和本发明的其可药用盐的同位素变化一般可以通过常规方法使用合适试剂的适当同位素变化来制备。

本发明化合物和组合物的所有同位素变化(无论是否为放射性的)均旨在被涵盖在本发明范围内。

溶剂合物

本发明还包括根据本发明可使用的组合物中的化合物或任意通式(I)至(III)的化合物的溶剂合物形式。权利要求中使用的术语包括这些形式。

多晶型物

本发明还涉及本发明组合物中的化合物或者根据本发明可以使用之式(I)的化合物的多种结晶形式、多晶型形式和(无水)含水形式。在制药工业中众所周知的是，可通过稍微改变这些化合物合成制备中所用溶剂的纯化和/或分离形式的方法以任意这些形式分离化合物。

施用

根据本发明的化合物可以通过多种公知途径来施用，包括经口施用、直肠施用、胃内施用、颅内施用和肠胃外施用，例如静脉内、肌内、鼻内、皮内、皮下以及类似的施用途径。优选肠胃外施用，特别是静脉内施用，优选地通过积存注射(depot injection)。根据施用途径，需要不同药物制剂，并且其中一些可能需要将保护性包衣施用于药物制剂以防止本发明化合物在例如消化道中降解。

因此，优选地，本发明化合物被配制为糖浆剂、输液或注射溶液、片剂、胶囊剂、囊片剂(capslet)、锭剂、脂质体、栓剂、硬膏剂(plaster)、创可贴(band-aid)、延迟胶囊剂(retard capsule)、散剂或缓慢释放制剂。优选地，稀释剂是水、缓冲剂、缓冲盐溶液或盐溶液，载体优选地选自可可豆脂和vitebesole。

用于施用本发明化合物的特别优选的药物形式是适合于可注射使用的形式并且包括用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌水溶液或分散体和无菌粉末。在所有情况下，最终的溶液或分散体形式必须是无菌的并且是流体。通常，这样的溶液或分散体将包含溶剂或分散介质，其包括例如水缓冲的水溶液，例如生物可相容的缓冲剂；乙醇；多元醇，例如甘油、丙二醇、聚乙二醇、其合适的混合物；表面活性剂或植物油。还可以将本发明化合物配制为脂质体，特别地用于肠胃外施用。如果与游离药物相比，则脂质体提供如下优点：提高的循环半衰期和延长的所封闭药物的更均匀释放。

可以通过任何数量的本领域公认技术来完成输液或注射溶液的灭菌，所述技术包括但不限于添加防腐剂例如抗细菌剂或抗真菌剂，例如尼泊金类(parabene)、氯丁醇、酚类、山梨酸或硫柳汞。此外，可以在输液或注射溶液中加入等张剂，例如糖或盐，特别是氯化钠。

含有一种或若干种本发明化合物的无菌注射溶液的生产通过以下来完成：在合适的溶剂中根据需要加入所需量的各种化合物和上文列举的多种成分，之后灭菌。为了获得无菌粉末，上述溶液必要时经真空干燥或冷冻干燥。本发明的优选稀释剂是水、生理上可接受的缓冲液、生理上可接受的缓冲盐溶液或盐溶液。优选的载体是可可豆脂和vitebesole。除上文已提到的优选赋形剂外，还与本发明化合物的多种药物形式一起使用的赋形剂可非限制性地选自：

a)黏合剂，例如乳糖、甘露醇、结晶山梨醇、二碱式磷酸盐(dibasicphosphate)、磷酸钙、糖、微晶纤维素、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等；

b)润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酸、氢化植物油、亮氨酸、甘油酯和硬脂酰富马酸钠；

c)崩解剂，例如淀粉、交联羧甲纤维素(croscaramellose)、甲基纤维素钠、琼脂、膨润土、藻酸、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。

其他合适的赋形剂可见于American Pharmaceutical Association出版的Handbook of Pharmaceutical Excipients，其通过引用并入本文。

应理解，根据疾病的严重程度和可以使用本发明化合物之一治疗的特定类型以及待治疗的各个患者(例如患者的一般健康状态)等，需要各种化合物的不同剂量来引起治疗或预防作用。适当剂量的确定在主治医生的判断范围内。

如本领域已知的，给定组合物的药物有效量还将取决于施用途径。一般来说，如果通过胃肠道施用，则所需量将会较高；例如通过栓剂、直肠或者通过胃内探针(intragastric probe)，但如果施用途径为肠胃外(例如，静脉内)，则所需量较低。

在本发明的含义内，只要取代基或变量的组合导致稳定的或化学可行的化合物，就可允许这样的组合。稳定的化合物或化学可行的化合物是在不存在水分或其他化学反应性的条件下，在40℃或更低的温度下保持至少一周而基本上不改变的化合物。本发明还考虑本文公开的化合物的任何含碱性氮之基团的季铵化。可以通过这样的季铵化获得水溶性或油溶性或可分散性产物。

优选地，将化合物配制成用于经口、静脉内、鞘内、实质内施用。由于由式I、II和III所定义的化合物和替莫唑胺两者均可经口施用，所以特别优选的是将这两种化合物配制成用于经口施用。在这种情况下，可容易地将适当量的两种化合物组合来同时施用以使得在肿瘤位置处同时达到最有效的浓度。

在本发明的最优选的实施方案中，将式(I)至(IV)的化合物配制成吸收到中枢神经系统。

在另一个方面，本发明涉及根据式I、II或III的化合物，其中R₁至R₁₁和R₂₁至R₂₇的含义如上所定义，所述化合物用于治疗实体肿瘤，所述实体肿瘤以NFKBIA的表达水平降低为特征。

除非另有说明，上面给出的所有定义也适用于本发明的这一方面。

认为NF-κB途径在肿瘤发生和肿瘤细胞对化疗剂的抗性中发挥重要作用。如上所述，NFKBIA与胞质溶胶中的核因子κB结合，从而抑制NF-κB向细胞核的转移。在本发明的研究中，已经出乎意料地发现氯硝柳胺不提高具有基因的两个完整拷贝之肿瘤细胞中NFKBIA的表达，但其明显地提高具有编码NFKBIA的基因的杂合缺失之细胞中NFKBIA的表达。

因此，氯硝柳胺特别适用于治疗实体肿瘤，所述实体肿瘤以NFKBIA的表达降低为特征，特别是由编码NFKBIA的基因的杂合缺失所引起的表达降低。肿瘤可以是上述的任意肿瘤，只要其展示出NFKBIA的表达降低。优选地，肿瘤选自：成胶质细胞瘤、霍奇金淋巴瘤、结直肠癌、黑素瘤、肝细胞癌、乳腺癌和多发性骨髓瘤。最优选地，所述实体肿瘤是成胶质细胞瘤。

在本发明的这一方面的一个优选的实施方案中，根据式(I)、(II)或(III)的化合物与本申请中上述任何细胞抑制化合物或细胞毒性化合物组合。所述组合不限于烷化剂。

本发明的这一方面的一个优选的实施方案涉及包含根据式I、II或III的化合物(其中R₁至R₁₁和R₂₁至R₂₇的含义如上所定义)和可药用赋形剂的药物组合物，所述药物组合物用于治疗实体肿瘤，所述实体肿瘤的特征在于NFKBIA的表达降低。

在另一个方面，本发明涉及用于确定使用根据式I、II或III的细胞抑制化合物和烷化剂的组合治疗是否适用于治疗患有实体肿瘤的患者的方法，所述方法包括以下步骤：

b)将所确定的表达水平与参考值进行比较；

c)基于步骤b)的比较结果确定用氯硝柳胺与烷化剂的组合治疗是否适用于所述患者，其中NFKBIA的低表达或缺失表明所述组合治疗适用于所述患者。

在另一个方面，本发明涉及用于确定使用如上定义的根据式I、II或III的细胞抑制化合物治疗是否适用于治疗患有实体肿瘤的患者的方法，所述方法包括以下步骤：

b)将所确定的表达水平与参考值进行比较；

c)基于步骤b)的比较结果确定使用氯硝柳胺的治疗是否适用于所述患者，其中NFKBIA的低表达或缺失表明所述组合治疗适用于所述患者。

优选地，本发明的方法是在体外进行的。优选地，患者患有如上所定义的实体肿瘤。更优选地，患者患有成胶质细胞瘤。

所述样品优选为取自所涉患者中的样品，其包含肿瘤细胞或由肿瘤细胞组成。这样的样品可例如通过活检取得。可对包含除了肿瘤细胞之外的其他细胞的样品进行预处理以提高样品中肿瘤细胞级分。

用于确定基因表达水平的方法对于本领域技术人员而言是公知的。可以通过测量所讨论之基因的mRNA-转录物的量来确定基因表达，并且其还可以通过测量由所述基因编码之蛋白质的量来确定。基于所产生的mRNA-转录物之量的测量的优选方法包括实时定量PCR和基于杂交的技术例如微阵列。用于测量特定蛋白质之量的优选方法包括免疫方法，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)。

低表达优选地通过将用特定方法在所涉样品中确定的表达水平与用相同方法在参考样品或参考样品的组中确定的表达水平进行比较来定义。优选的参考样品是具有编码NFKBIA的基因之两个完整拷贝的实体肿瘤。优选地，在所述肿瘤中的基因的两个拷贝的启动子区不包含任何突变。

在本发明的一个优选的实施方案中，NFKBIA的低表达由在14q13处的NFKBIA基因座(NFκBIA^+/-)的杂合缺失所引起。

在本发明的另一个优选的实施方案中，存在编码NFKBIA的基因的两个拷贝，但是这些拷贝中的至少一个的功能受损。如本申请所理解，如果不编码与由野生型编码的基因产物具有相同功能和活性的基因产物，那么拷贝具有“受损功能”。NFKBIA能够与胞质溶胶中的核因子κB(NF-κB)结合。只要其与NF-κB结合，那么NF-κB不能进入细胞核并作为转录调节子。因此，在本发明的上下文中最重要的NFKBIA的活性是其与NF-κB的结合。因此，如本申请所理解的“受损功能”最优选地是NFKBIA与NF-κB的结合受损。这可由将对于NFKBIA结合特性至关重要的氨基酸交换为其他氨基酸所引起或者其可由编码NFKBIA的基因部分的缺失所引起，所述缺失导致缩短的基因产物。

NFKBIA的无功能拷贝可导致引入终止密码子或部分缺失。在这种情况下，产生缩短的基因产物，其(如果缺乏重要功能结构域的话)具有降低的活性。

无功能拷贝可由点突变产生，所述点突变引起基因产物中氨基酸的交换。如果所述交换影响基因产物中对于其功能而言重要的部分，那么其活性会降低或者甚至消失。

a)确定所述患者的肿瘤细胞或肿瘤组织的样品中NFκBIA的表达水平；

b)将所确定的表达水平与参考值进行比较；

(i)表达超过所述参考值表明所述摩尔比应低于40％的氯硝柳胺；以及

(ii)表达水平低于所述参考值表明所述摩尔比应等于或大于40％的氯硝柳胺。

在本申请的上文中给出的所有定义也适用于本发明的这一方面。

附图说明

图1：氯硝柳胺有效地抑制了pGBM细胞活力。(A)在氯硝柳胺暴露(所示浓度)之后第5天的21个pGBM(#所示)的药效学分析。数据为一式三份的平均值±SD。(B)表示将代谢活性降低至50％对照水平的浓度的IC50值谱。数据收集自三个人非肿瘤神经细胞群(hnNC，参见方法)、五个市售可得的胶质瘤/GBM细胞系(参见方法)和21个pGBM(参见(A)；表3)。插图描绘来自以下之pGBM上另外的成对比较实验(符号编码的)的IC50数据：肿瘤中心相对于周围，原发性疾病相对于复发性疾病，超甲基化MGMT启动子相对于未甲基化样品，以及具有NFKBIA^+/+相对于杂合NFKBIA缺失的基因型(NFKBIA^+/-)的样品。使用单因素ANOVA和Tukey事后检验(Tukey′s post hoc tests)，通过将hnNC和GBM细胞系数据分别与pGBM进行比较来计算P值(＊＊＊p＜0.001)。

图2：氯硝柳胺具有细胞抑制和细胞毒性作用。(A)在施用后24小时的细胞周期分析显示出在经氯硝柳胺(niclo)处理的样品中强烈提高的G1峰。(B)在该时间点获取的细胞提取物的CYCLIN D1(CCND1)-western印迹。(C)在单独暴露于氯硝柳胺(1.5μM；方形)或DMSO(0.01％；菱形)之后的细胞生长动力学(pGBM#046、078、106；平均数据±SD)。(D)描绘了在施用氯硝柳胺(黑色条)或0.01％DMSO(白色条)之后5天的非活(avital)(即膜联蛋白V⁺和/或Hoechst 33258⁺)细胞的频率图。插图：平均数据(n＝5pGBM；＊＊p＜0.01)。注意：在非恶性人细胞样品#155中缺乏促凋亡作用。右边插图：代表性散点图(#046)。(E)在125nM氯硝柳胺(虚线)或0.0025％DMSO(实线)暴露之后第二天进行划痕测定(n＝2pGBM)。该图体现了病例#046的划伤闭合的时间过程(平均值±SD；三次分析)。

图3：氯硝柳胺降低了pGBM的肿瘤起始潜力。(A)神经球测定(n＝4pGBM；平均值±SD)。该图描述了来自氯硝柳胺预处理的pGBM(单独暴露)的一级(1°)、二级(2°)和三级(3°)神经球的相对频率。数据示出球形成细胞(sphere-forming cell，SFC)的持久性降低。(B)在单独施用1.5μM氯硝柳胺(niclo；虚线)对比0.01％DMSO(实线)之后的长期细胞生长数据(一式三份分析的平均值±SD)。(C)异种移植的Kaplan-Meier存活曲线。对于实验，用氯硝柳胺(虚线)或DMSO(实线)预处理pGBM#046细胞。在第5天收集10⁶个活细胞并立体定位地注射到免疫缺陷小鼠的纹状体中。对痛苦的动物实施安乐死。有一个除外(氯硝柳胺；红点)，动物示出脑内肿瘤表现。

图4：氯硝柳胺同时影响若干个癌症调节信号传导途径。在单剂量施用之后5天进行切割的-NOTCH1(A)和磷酸-S6-蛋白质(B)的Western印迹分析。(C)数据定量显示出核磷酸-CTNNB1(Ser552)⁺细胞的明显降低(＊＊＊p＜0.001，一式三份，平均值±SD)。(D)WNT/CTNNB1靶基因的qRT-PCR分析(＊＊＊p＜0.001，一式三份，平均值±SD)。相对于DMSO对照的表达水平。使用具有Bonferroni事后检验的单因素ANOVA分析计算P值。注意，用pGBM#046、078、106和118进行所有实验。

图5：NFKBIA的缺失和表达水平预测氯硝柳胺和TMZ的协同活性。(A)具有NFKBIA^+/-基因型(紫色)相对于NFKBIA^+/+样品(绿色)的pGBM的Western印迹分析。在氯硝柳胺暴露之后3天测定表明途径活性的磷酸-RELA(p65-NF-κB)水平。(B)响应于氯硝柳胺(亮色)或DMSO(暗色)暴露的NFKBIA^+/+(046、078、138)相对于NFKBIA^+/-(081、106、066)pGBM中的mRNA水平的定量。数据表示为相对于DMSO对照。插图描绘了NFKBIA的基线mRNA表达水平。(C)在NFKBIA^+/+(n＝4)相对于NFKBIA^+/-(n＝3)pGBM中的TMZ与氯硝柳胺的组合药效学。以与50μM TMZ组合或作为对照与0.05％DMSO组合来供给提高浓度的氯硝柳胺。由#046(NFKBIA^+/-，方形和三角形)和106(NFKBIA^+/+，倒三角形和菱形)示例性说明数据并且表示为一式三份的平均值±SD。箭头突出了NFKBIA^+/-样品的协同活性。注意，在表2中列出了对于其他所研究pGBM的数据。

图6：氯硝柳胺剂量-响应曲线。在化合物暴露之后5天测定作为细胞活力量度的代谢活性(平均数据±SD，一式三份分析)。数据相对于对照(DMSO)水平。IC50定义为将代谢活性降低到50％对照水平的氯硝柳胺浓度。(A)市售可得的人胶质瘤/GBM细胞系LN229、T89G、U87、U138和U272(灰色)对比21个pGBM(黑色；平均值±SD，与图2A比较)的数据比较。(B)人非恶性神经(对照)细胞样品PKI-3、#155和H9.2(灰色)相对于21个pGBM(黑色；平均值±SD，与图2A比较)的数据比较。(C)来自pGBM#046、066和078的肿瘤核心(方形)相比于肿瘤周围(三角形)的成对样品的评价。(D)来自pGBM#091、118和132的原发性疾病(方形)相比于复发性疾病(三角形)的成对样品的评价。(E)超甲基化MGMT启动子pGBM样品#023和#025(三角形)相比于未甲基化MGMT启动子pGBM样品#046、106和138(方形)的数据比较。(F)NFKBIA^+/+pGBM样品#066、081和106(方形)相比于NFKBIA^+/-pGBM样品#046、078和118(三角形)的数据比较。

图7：氯硝柳胺诱导的pGBM中的瞬态G1期阻滞。对于病例#046和#106(PI，碘化丙啶)细胞周期分析显示出类似结果。示出的是#046于(A)6小时、(B)12小时、(C)24小时、(D)48小时、(E)72小时和(F)5天暴露于1.5μM氯硝柳胺相比于0.01％DMSO。

图8：氯硝柳胺耗尽pGBM#GNV019的肿瘤起始潜力。(A)在单剂量氯硝柳胺施用(1μM，虚线)相比于DMSO(0.01％，实线)之后的长期细胞生长数据。(B)除了将新生小鼠用作受体之外，与图4C所述方法类似地进行异种移植实验。Kaplan-Meier存活曲线描绘了DMSO预处理的(实线)相比于氯硝柳胺(虚线)预处理的细胞移植物的过程。在8/9的来自DMSO对照组的动物中注意到脑内肿瘤表现。相反地，接受氯硝柳胺预处理移植物的动物未示出肿瘤形成的迹象(经审查的事件)。p值的计算基于对数秩检验。

图9：该图描绘来自pGBM相比于“标准”成胶质细胞瘤(GBM)细胞系的药效学分析之IC50数据。经氯硝柳胺处理的、保持在确定成分培养基(dm；n＝5；平均值±SD)中的“标准”细胞系示出对于氯硝柳胺的pGBM-样敏感度。通过使用单因素ANOVA和Tukey事后检验将“标准”成胶质细胞瘤细胞系数据与pGBM进行比较来计算P值。n.s.，不显著。(sm；标准的培养基条件)。

图10：氯硝柳胺剂量-响应曲线(A至E)，比较从以下获得的结果：保持在标准培养基条件下(sm；实线)相比于确定成分培养基条件下(dm；虚线)的“标准”GBM细胞系。明显的是，氯硝柳胺的作用在dm条件下更加突出(pGBM样)。(F)总结各自IC50值的表格。

图11：将hnNC病例#155与多种pGBM组合的共培养实验。(A)对共培养物的基于CellaVista的分析。在施用氯硝柳胺(1μM)之后的指定时间点获得数据。一式三份分析(＊＊＊，p＜0.001；＊＊，p＜0.01)。(B)在向各自的共培养物施用氯硝柳胺(1μM)之后5天获得的FACS数据。插图描绘了散点图的代表组。应注意，pGBM病例#046和#078是NFKBIA+/-；病例#035和#106是NFKBIA+/+基因型。LT，慢病毒转导的；CT，CellTracker标记的群体。

图12：氯硝柳胺抑制不依赖于细胞NFKBIA状态(#046＝NFKBIA+/-；#106＝NFKBIA+/+)的NOTCH和mTOR信号传导(此处通过降低单剂量施用ND之后5天的磷酸化S6蛋白质的水平来示出；n＝4所分析的pGBM)。

图13：氯硝柳胺抑制pGBM(NFKBIA+/-基因型)的恶性潜力。(A)神经球测定(n＝2pGBM一式三份；平均值±SD)。该图描绘了来自氯硝柳胺预暴露的pGBM(单独暴露)的一级(1°)、二级(2°)和三级(3°)神经球的相对频率。注意球形成细胞(SFC)的持续降低，＊＊p＜0.01。(B)Kaplan-Meier存活曲线(类似于另外的证据，图4)。在所有动物中均有脑内肿瘤表现，但是有一只动物除外(氯硝柳胺；红点)。

图14：NFKBIA的缺失和表达水平预测pGBM中的氯硝柳胺(Niclo)和替莫唑胺(TMZ)的协同活性。(A)改变响应于氯硝柳胺(相对于DMSO对照)的NFKBIA+/+(灰色)相比于NFKBIA+/-(黑色/白色)pGBM中的mRNA水平。插图，NFKBIA的基线mRNA表达水平。(B)在pGBM中施用氯硝柳胺+替莫唑胺的组合指数(combinatorial index，CI)评价。CI表示为所观察到的细胞活力相比于期望的细胞活力的比值。根据参考文献(Chou TC，2010)，作为在用(仅)1μM氯硝柳胺处理之后活细胞的比例乘以用(仅)替莫唑胺处理之后的细胞比例来计算期望的结果。(CI＜1：协同，CI＝1：相加；CI＜1：拮抗)。(C)在NFKBIA+/-(左边)相比于NFKBIA+/+(右边)pGBM中替莫唑胺与氯硝柳胺的代表组合药效学。以与50μM替莫唑胺组合或作为对照与0.05％DMSO组合来供给提高浓度的氯硝柳胺。数据表示为一式三份的平均值±SD。

图15：NFKBIA的缺失和表达水平预测保持在确定成分培养基条件下(dm)的标准成胶质细胞瘤(GBM)细胞系中氯硝柳胺(niclo)与替莫唑胺(TMZ)的协同活性。(A)改变响应于于niclo(相对于DMSO对照)的NFKBIA+/+(灰色)相比于NFKBIA+/-(黑色/白色)中的mRNA水平。插图，NFKBIA的基线mRNA表达水平。(B)施用niclo+TMZ的CI评价。CI表示为所观察到的细胞活力相比于期望的细胞活力的比值。期望的结果作为在用(仅)1μM niclo处理之后活细胞的比例乘以用(仅)TMZ处理之后的细胞比例来计算。(CI＜1：协同，CI＝1：相加；CI＞1：拮抗)。(C)在NFKBIA+/-(左边)相比于NFKBIA+/+(右边)标准GBM细胞系中TMZ与niclo的代表性组合药效学。以与50μM TMZ组合或作为对照与0.05％DMSO组合来供给提高浓度的niclo。数据表示为一式三份的平均值±SD。明显的是，niclo作用在dm条件下是pGBM样的(相比于图15)。

图16：在NFKBIA+/-pGBM中的TNF-a拮抗协同活性。图表示来自在化合物施用(niclo，1μM；替莫唑胺，50μM；TNF-a，50ng/ml)之后3天在NFKBIA+/-(黑色)相比于NFKBIA+/+(灰色)pGBM中的组合治疗模式的数据。插图，pRELA的Western印记分析，表明在暴露于TNF-a(Ta；50ng/ml)或0.002％牛血清白蛋白(C；对照)之后24小时的NF-kB途径活性。＊＊＊p＜0.001；＊＊p＜0.01；＊p＜0.05(一式三份；平均值±SD；单因素ANOVA和Tukey事后检验)。

图17：用于该研究中的多种实验模式的pGBM及其各自传代数的列表(Pharma，药效学分析；CT/LT，共培养实验；WB，Western印迹)。

实施例

试剂

以下所列实验的试剂可自由购买，特别是：从Life Technologies购买碘化丙啶和Hoechst33258；从Sigma-Aldrich购买氯硝柳胺和替莫唑胺；从BD Bioscience购买FITC细胞凋亡检测试剂盒I。

小鼠

波恩大学医学中心的伦理委员会批准了全部涉及动物的研究。Rag1^-/-Il2rg^-/-小鼠获自Taconic Farm Inc.，其为国家过敏症与传染病研究所的立契约方(42)。从Jackson实验室购买SCID/Beige小鼠。

组织样品

肿瘤组织获自波恩大学医学中心神经外科系的GBM手术而海马组织(病例#155)获自癫痫手术。患者特征详细地描述于表3中。pGBM病例GNV019来自在佛罗里达大学神经外科的一个9岁男孩的外科手术。在两个地点的当地伦理委员会批准了这些研究；所有患者(或其监护人)都提供了知情同意书。基于世界卫生组织目前的分类(43)对组织进行诊断和分级，并且由波恩大学医学中心(国家脑癌参考中心)神经外科系的两名独立的神经病理学家确认。

表3

A：患者拒绝进一步治疗；B：手术后并发症；C：由于临床恶化的治疗中止；D：两个pGBM样品来自该患者，一个来自肿瘤核心(中心)并且第二个来自肿瘤周围(参见(10))；E：两个pGBM样品来自该患者，一个在原发性疾病的时间并且第二个在疾病复发的时间；R：肿瘤切除；RT：标准放疗；RT/TMZ：RT加上每日连续替莫唑胺(伴随)；TMZ：替莫唑胺(5/28：28天周期中的第1天至第5天)；PET：无进展存活；OS：总存活数；meth：甲基化的MGMT启动子；unmet：未甲基化的MGMT启动子。

组织处理和原代细胞培养

按照最近所述进行新鲜活检样品的处理和pGBM(10)和来自海马组织的AHNP(#155)(11)的获取。在(44)中详述了用于#GNV019细胞的培养基条件。在(8)中描述了用于所有其他pGBM和AHNP样品的培养基条件。数据从第7代至第13代培养产生。

建立的胶质瘤/GBM细胞系的培养

在基于DMEM/F12的10％胎牛血清(Hyclone)-补充的贴壁条件下保持并分析LN229、T98G、U87(MG)、U138和U373(MG)细胞。这些条件也称为“sm条件”。

来自人ES和iPS细胞的神经干细胞的培养

将两个长期自我更新的人神经干细胞培养物(lt-NES)与原代AHNP(参见上文)一起用于本研究中，作为非恶性神经对照细胞。lt-NES最初来自人胚胎干细胞系H9.2(45)和人诱导的多能干细胞系PKa(46)。最近描述了用于保持lt-NES的条件(45，47)。

对于一些研究，在开始实验之前，将确定的培养基(dm)应用于GBM模型细胞系10天。将类似于“dm”的培养基组分用于pGBM和hnNC/AHNP的培养，即，改自(Lee J，Kotliarova S，Kotliarov Y，Li A，SuQ，Donin NM，et al.Tumor stem cells derived from glioblastomas culturedin bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype ofprimary tumors than do serum-cultured cell lines.Cancer Cell 2006；9(5)：391-403)：补充N2/B27的Neurobasal^TM，其中每隔一天添加生长因子(EGF，bFGF；每次10ng/ml)。如最近所述处理组织并获取pGBM4、来自海马的AHNP(#155)(Walton NM，Sutter BM，Chen HX，Chang LJ，Roper SN，Scheffler B等.Derivation and large-scale expansion ofmultipotent astroglial neural progenitors from adult human brain.Development 2006；133(18)：3671-81.)以及#GNV019细胞(Scheffler B，Walton NM，Lin DD，Goetz AK，Enikolopov G，Roper SN等.Phenotypicand functional characterization of adult brain neuropoiesis.Proc NatlAcad Sci U S A 2005；102(26)：9353-8.)。本文所示数据获得自短期扩展的pGBM和AHNP(第5代至第12代；图18)。除了神经球测定之外，将所有细胞贴壁培养在层黏连蛋白/聚-L-鸟氨酸包被的塑料上。除了AHNP之外，将两个长期自我更新的神经干细胞培养物(lt-NES)用作非恶性神经对照。lt-NES来自人胚胎干细胞系H9.218和人诱导的多能干细胞系PKa19。

共培养实验

按照制造商(Life Technologies)的建议使用包含GFP编码序列的pLenti6.2/VS-DEST Getaway载体来进行慢病毒转导和pGBM的选择。荧光计数法(Fluorocytometry)确认了稳定的细胞表达。或者，根据制造商的指南用CellTrackerTM(-CFSE绿色荧光染料或红色CMTPX；Life Technologies)来标记pGBM和hnNC。为了开始各自的共培养，在进行实验模式之前，将细胞以1∶1比率混合并保持24小时。为了区别地监测细胞生长，使用可用荧光的系统分析器(RocheDiagnostics)。使用FACS calibur流式细胞仪(BD Bioscience)来获得用于终点分析的FACS数据。

初始药物筛选和药效学分析

将受试化合物供给线性指数期中增殖的细胞。对于所有使用的细胞样品，在分析之前进行各自的滴定实验。在将2×10³个至3×10³个细胞/孔接种到在层黏连蛋白/聚-L-鸟氨酸包被的96孔板中之后24小时，用1μM的各化合物(在DMSO中10mM的储备溶液)处理细胞。用0.01％至0.1％的DMSO处理对照细胞。在施用之后五天，根据制造商(LifeTechnologies)建议使用测定来确定作为细胞活力之量度的代谢活性。使用Infinite200微孔板读数器(Tecan)在λ_ex＝540nm和λ_em＝590nm处测量荧光。对于每个样品，实验一式三份地进行。

就药效学分析而言，将5×10⁴个细胞平板接种在12孔板中，24小时后分别施用化合物系列和化合物组合。在处理后3天至5天进行基于的分析。实验一式三份地进行。IMC50被定义为与对照条件相比将代谢活性降低50％的化合物浓度，并且通过数据分析在GraphPadPrism 4.0中测定。

增殖动力学

在处理之后五天，将4.7×10⁴个活细胞平板接种到3.5cm层黏连蛋白/聚-L-鸟氨酸包被的塑料培养皿中，并且四天至六天之后，进行胰蛋白酶化、收集、计数并以4.7×10⁴的密度再次进行平板接种。将该过程重复4至5次。为了长期监测氯硝柳胺诱导的细胞生长的改变，根据制造商的指南使用系统分析器(Roche Diagnostics)测定细胞汇合度(confluence)。

细胞迁移分析

将5×10⁴个细胞平板接种到包被有层黏连蛋白/聚-L-鸟氨酸的12孔板中。每24小时用125nM氯硝柳胺处理细胞，进行4天。在平板接种(以70％的细胞密度)之后三天，用无菌吸管尖加以划伤/创伤。此后，更换培养基以移除非贴壁细胞。根据制造商的指南使用系统(RocheDiagnostics)的噬菌斑测定应用来监测随时间的划伤/创伤大小。一式三份分析数据±SEM。

细胞周期分析

将细胞(5×10⁴个每孔)在12孔板中培养，并在处理后的所示时间进行收集。将细胞重悬于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，用冰冷的甲醇固定并在4℃下孵育最少24小时。通过离心收集细胞沉淀并重悬于PBS溶液(含有50μg/ml碘化丙啶和50μg/ml RNase)中。在37℃孵育30分钟之后，使用FACS calibur流式细胞仪(BD Bioscience)分析细胞的DNA含量。

基于膜联蛋白V的FACS分析

在化合物施用之后5天收集1×10⁵个细胞，通过离心沉降，重悬于100μl膜联蛋白V缓冲液中，并用5μl膜联蛋白V-FITC在室温下孵育1小时。为了区分活细胞和死细胞，使用1.2μg/ml Hoechst 33258进行标记。在装配有FACSDiva软件的LSRII(BD Bioscience)中采用标准条件测定膜联蛋白V的存在。在每次测量中对2×10⁴个细胞进行计数。将术语“非活细胞”用于膜联蛋白(Annexin)V⁺-、膜联蛋白V⁺/H33258⁺和H33258⁺细胞。

神经球测定

根据建立的方案(10，44)进行神经球测定以评估自我更新的克隆源性细胞的频率。在培养的第21天对神经球进行定量，吹吸成单细胞悬液，再次进行平板接种以分析二级和三级神经球。通过以下来测定多能性：将3°神经球的代表性部分平板接种到层黏连蛋白/聚-L-鸟氨酸包被的玻璃盖玻片上，分化2至3周，然后在4％多聚甲醛(PFA)中固定。

荧光分析

根据标准方案(44，48)使用抗βIII微管蛋白(Promega；单克隆小鼠，1∶1000)、GFAP(DAKO；多克隆兔，1∶600)、β-连环蛋白和磷酸-β-连环蛋白(Ser552)(二者均为Cell signaling，1∶400)的抗体对PFA固定的样品进行免疫荧光分析。用DAPI(Sigma)来使细胞核可视化。

Western印迹分析

在化合物施用24小时至144小时之后制备细胞提取物并按照(49)所述进行处理。将印迹膜分别与抗Cyclin-D1(1∶1000；BD Pharmingen)、经切割的Notch 1(1∶1000)或磷酸-S6蛋白(1∶1000；均为Cell signaling)的抗体在4℃孵育过夜。洗涤，然后添加过氧化物酶偶联的二抗(SantaCruz)，保持1小时。洗涤，然后使用ECL系统(Millipore)将印迹显影。为了确认等量加载，用β-肌动蛋白抗体(Sigma；1∶5000)再次探查印迹。

定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)

根据制造商的指南使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)来分离总RNA。用Nanodrop(Peqlab)进行RNA浓度定量并且在反应混合物中(1xRT-Puffer，10mM DTT，500μM汇集的dNTP，1U/μl RNA酶抑制剂，2.5U/μl扩展的逆转录酶，所有均来自Roche Diagnostics)用oligo-dT引物来逆转录400ng总RNA。反应在42℃下发生，保持1小时。在10μl总体积的96孔板中使用realplex 4Mastercylcer Epp梯度S(Eppendorf)和以下PCR条件来扩增cDNA产物：95℃下保持2分钟，跟随着95℃保持15秒、60℃保持20秒和72℃保持30秒的40个循环。对于定量而言，使用以下引物：

S100A4正向：5′-CTCAGCGCTTCTTCTTTC-3′(SEQ ID NO：1)；

S100A4反向：5′-GGGTCAGCAGCTCCTTTA-3′(SEQ ID NO：2)；

c-Myc正向：5′-TTCGGGTAGTGGAA-AACCAG-3′(SEQ ID NO：3)；

c-Myc反向：5′-CAGCAGCTCGAATTTCTTCC-3′(SEQ ID NO：4)；

细胞周期蛋白D1正向：5′-CCGTCCATGCGGAAGATC-3′(SEQ ID NO：5)；

细胞周期蛋白D1反向：5′-ATGGCCAGCGGGAAGAC-3′(SEQ ID NO：6)；

NFKBIA正向：5′-ACACCAGGTCAGGATTTTGC-3′(SEQ ID NO：7)；

NFKBIA反向：5′-GCTGATGTCAATGCTCAGGA-3(SEQ ID NO：8)。

对于管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的cDNA定量而言，使用以下引物：正向：5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3(SEQ ID NO：9)；反向：5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′(SEQ ID NO：10)。使用Mastercycler Epp Realplex软件(Eppendorf)进行数据分析。从一式三份的qRT-PCR反应来计算平均值。将所表达的基因的每个平均值归一化为GAPDH cDNA的各自平均量。

单核苷酸多态性阵列分析(SNP)

为了评价NFKBIA基因座，进行全基因组基因分型分析。根据制造商的Infinium HD测定(Illumina，San Diego，USA)使用IlluminaHUMANCytoSNP-12v2.1进行299,140个SNP的基因分型。用包含Genotyping和GenomeViewer模块的Illumina GenomeStudio(2011.1)软件分析数据。通过检查LogR比值和B-等位基因频率来鉴定染色体畸变。

MGMT启动子甲基化状态

如最近所述(50)由焦磷酸测序(pyrosequencing)来确定MGMT基因的甲基化状态。简而言之，根据制造商的建议使用EpiTect亚硫酸氢盐试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)用亚硫酸氢钠来处理0.5μg基因组DNA。对于焦磷酸测序而言。使用引物MGMT-Py正向，5，-生物素-GGATATGTTGGGATAGTT-3’(SEQ ID NO：11)(GenBank登记号AL355531，第46891至46908位核苷酸)和MGMT-Bis反向，5’-AAACTAAACAACACCTAAA-3’(SEQ ID NO：12)(GenBank登记号AL355531，第47138至47156位核苷酸)(其中生物素与正向引物的5，-端连接)从亚硫酸氢盐修饰的基因组DNA来扩增265bp区。用于延伸反应的引物是5’-CCCAAACACTCACCAAA-3’(SEQ ID NO：13)，其允许包含12个CpG位点的63bp片段的测序。设计焦磷酸测序测定以靶向在GBM中具有强甲基化的CpG位点。根据制造商的指南在Pyromark Q24仪器(Biotage，Uppsala，Sweden)上使用PyroGold试剂(Qiagen，Hilden，Germany)进行焦磷酸测序。通过PyroMark Q24软件(Biotage，Uppsala，Sweden)分析焦磷酸序列图(Pyrogram)输出，使用CpG定量软件根据百分比相对峰高度来确定甲基化相比于未甲基化等位基因的百分比。在单个位置测量CpG甲基化并且与从年龄匹配的正常脑组织获得的甲基化数据进行比较之后对肿瘤样品的甲基化或未甲基化进行评分。将通过SssI甲基化酶进行体外甲基化的人参考DNA用作甲基化的阳性对照。

肿瘤异种移植实验

收集细胞、计数并重悬于0.1％DNase/PBS中。通过台盼蓝排除法(trypan blue exclusion)来确认细胞活力。对于病例#046而言，将10⁶个DMSO-对照(n＝5)或氯硝柳胺(n＝5)预处理的pGBM立体定位地注射到12-周龄Rag2Il2rg^-/-小鼠的纹状体(0.8mm前，2mm横向，3mm深)。对于病例#GNV019而言，将2.5×10⁴个假对照(Killer化合物2F05；n＝9)或经氯硝柳胺(n＝6)预处理的pGBM颅内注射到P2至P3龄的Scid Beige小鼠中。每天监测小鼠并根据其表现的痛苦/神经症状或明显的体重减轻的迹象对其进行安乐死。在第169天终止#019GNV实验，其中剩余一只动物未出现痛苦。对于后续的组织学分析，移除大脑、冷冻保存并在低温恒温器(Leica)上连续地切割成20μm厚度。对每第五个切片进行常规H&E染色以用于肿瘤形成的组织学分析。

统计学分析

使用GraphPad Prism 4.0软件进行统计学分析。除非另有说明，否则用表示来自一式三份实验的平均值±SD的误差条表示数据。对于药效学分析，使用单因素ANOVA和Tukey’s事后检验计算p-值(图1)。对于多重比较，使用具有Bonferroni事后检验的单因素ANOVA计算p值。如果适用的话，使用双侧Student′s t检验来确定统计显著性。认为p值＜0.05是显著的。

结果

氯硝柳胺是之前没有认识到的候选GBM治疗。

将包含160个合成和天然毒性物质的文库用于筛选方法。将之前示出保持患者特异性和GBM特异性特征(signature)并且示出包含具有和不具有干细胞性质的肿瘤细胞亚群的四个pGBM用作发现平台(#023、035、046、106；参见(10))。基于测定来进行初次筛选，在单独施用文库的化合物之后第5天确定作为细胞活力度量的代谢活性。在实验中，认为将4种pGBM的平均代谢活性降低到低于50％对照水平的各个化合物是“目标化合物(hit)”。31种化合物达到了该标准，其中有氯硝柳胺。此外，氯硝柳胺通过有效地影响所有四种所测试的pGBM(表1)表明对解决患者间的异质性具有足够的潜力并且其证明了癌症特异性潜力，因为其对hnNC样品#155(非恶性原发性成人神经祖细胞(AHNP；(11)，表1)的对照病例)没有表现出类似作用。氯硝柳胺显示出选择性pGBM-抗癌潜力，其尚未被建议用于治疗脑肿瘤。氯硝柳胺是近几十年已知的并被多家管理机构批准为抗蠕虫剂。神经外科的最近工作(例如临床前结直肠癌模型)表明了该药的一些活性(12，13)。然而，鉴于治疗成胶质细胞瘤的有效细胞抑制化合物的缺乏，其在该肿瘤实体中的有效性是出乎意料的。

表1

氯硝柳胺有效地和选择性地抑制pGBM细胞活力

为了验证从文库的初次筛选中获得的结果，使用从Sigma-Aldrich获得的氯硝柳胺制剂进行药效学分析。对总共21种pGBM进行了研究，包括已经用于筛选实验的四个病例。所获得的剂量-响应曲线示出所有样品的一致过程(图1A)。氯硝柳胺导致相对代谢活性的50％降低的浓度(IC50)范围为300nM至1.2μM。这比在参考和对照细胞样品中观察到的更具抗性性能。此处用作参考的五个通常研究的胶质瘤/GBM细胞系(LN229、T98G、U87、U138和U373，参见方法)的IC50值在2.4至4.2倍的更高浓度下计算(图1B；图6)。胶质瘤/GBM细胞系对氯硝柳胺暴露的较低敏感性可能是由于其保持的标准条件(即含有血清，不含促细胞分裂剂)，其是在过去可干扰早期开发阶段的药物筛选的许多结果的主要因素(7)。进一步的实验显示了该假设是正确的。当将“标准的GBM模型”细胞系(即，LN229、T98G、U87(MG)、U138、U373(MG))保持在“dm条件”下时，即，用于保持pGBM的培养条件，ND作用高度类似于从pGBM获得的发现。

然而，值得注意的是，保持在与pGBM相似的确定培养条件的三种非恶性hnNC的分析也显示了明显更低水平的敏感性(参见方法；图1B；图6)。这表明氯硝柳胺的pGBM特异性活性。当pGBM和非恶性hnNC在dm条件下共培养时，可确认hnNC的较低敏感性。这些数据表明非恶性神经细胞上的低水平ND毒性和针对pGBM的选择性活性。

考虑到表征GBM的细胞和遗传多样性，我们接下来研究了氯硝柳胺在代表主要临床群体(constellation)的pGBM中的药理作用(10，14至16)。因此用来自以下的样品进行了比较实验：(i)相同GBM患者的肿瘤核心(中心)相比于周围区域，(ii)相同GBM患者的原发性疾病相比于复发性疾病，(iii)MGMT启动子超甲基化相比于未甲基化的组织以及(iv)具有杂合缺失的NFKBIA的GBM相比于未缺失的NFKBIA基因型(参见下面)。可在所有这些pGBM样品中类似地证明氯硝柳胺的强抑制活性(插图1B；图6)。总之，这些数据证实和验证了我们的初次筛选结果，将氯硝柳胺描述为pGBM的高度有效和选择性的抑制剂。

氯硝柳胺在pGBM中具有细胞抑制、细胞毒性和抗迁移作用。

为了进一步将氯硝柳胺在pGBM中的抑制活性分类，随后进行了对单独暴露于化合物的细胞周期、活力和迁移功能的研究。基于碘化丙啶(PI)的流式细胞术分析显示了pGBM的瞬态G1期阻滞的峰出现在24小时至48小时处(图2A；图7)。这正好与细胞周期蛋白D1(细胞周期从G1到S期过渡的调节子)表达的较强降低一致(图2B)。即时和瞬态细胞抑制活性的证据与基于pGBM生长动力学的检查所显示的相似(图2C)。随着5天的生长延迟的获得，另外的细胞毒性反应变得明显。此时，氯硝柳胺的促凋亡作用引起的活细胞的强且pGBM选择性的降低-如通过相差显微镜(未示出)观察的以及由Hoechst/膜联蛋白V流式细胞术分析所定量的(图2D)。有趣的是，在亚毒性浓度下施用氯硝柳胺还引起对pGBM的抗迁移作用，类似于所描述的对结肠癌细胞的最近发现(12)(图2E)。因此，氯硝柳胺诱导pGBM中的组合细胞毒性、细胞抑制和抗迁移作用。

氯硝柳胺抑制pGBM肿瘤起始活性。

接下来的一系列实验旨在确定氯硝柳胺对肿瘤起始细胞(tumorinitiating cell，TIC)活性的影响。TIC体现出如至少在人GBM中肿瘤内异质性的严重功能后果，可预期的是，其由干样的小亚群表示，即，自我更新的和多能细胞(例如(17至19))。然而，其精确表型特征仍然难以捉摸(20)。因此我们应用测定组合来测量其对氯硝柳胺的间接响应。首先，使用神经球测定(neurosphere assay，NSA)来评估对自我更新和多能细胞的集合之潜力变化。在之前的研究中，我们在第5代至第10代pGBM培养中0.25％至1％的范围内建立了其频率(参见(10))。在本研究中，将这些异质性pGBM样品中的三个(#046、078、106)暴露于氯硝柳胺，并且在第5天收集活细胞以在NSA中处理(参见方法)。来自DMSO相比于氯硝柳胺预处理的细胞的一级、二级和三级球的定量表明单独施用氯硝柳胺强烈地降低了pGBM中自我更新的、多能细胞的频率(图3A)。因为氯硝柳胺没有取消在1.5μM的施用浓度下的剩余自我更新pGBM中的多能的潜力(图3A，插图)，使得可推测，该设置可以用于类似地证明在体内的致瘤性细胞频率的可测量的降低。pGBM的平行的长期生长分析(基于细胞汇合度，参见方法)表明在该浓度下，已经预期活细胞从细胞抑制的氯硝柳胺作用的恢复具有14至23天的延迟(图3B)。然而，原位异种移植研究证明，植入氯硝柳胺预处理的活细胞的动物比预期存活显著更长的时间(图3C；图8)。这些结果的统计学显著性与在氯硝柳胺预处理的细胞移植物中观察到肿瘤形成具有较低程度的匹配。在一个移植系列(#GNV019)中，单独暴露于氯硝柳胺完全消灭了pGBM的肿瘤形成能力(图8)。在第二个实验系列(#046)中，可观察到强烈的降低。此处，单侧植入纹状体的DMSO预处理的#046pGBM在88±5d(n＝5)之后引起接受体动物中的严重痛苦迹象。随后的组织学分析显示在每个这些病例中大量脑内肿瘤的形成和移植细胞的沿着白质束进入对侧半球的强侵袭能力。相反地，在移植之后153±23d，4/5来自氯硝柳胺预处理的#046pGBM的动物中发生的肿瘤之大小是较小的，其中细胞累积在相邻于纹状体移植位置的区域。发现增殖的pGBM聚集在脑室下区并分散在整个胼胝体(图3E，插图)，具有到达对侧半球的单个细胞。这对应于DMSO预处理的#046细胞的早期移植后阶段。显然地，在长期实验期间，pGBM的广泛侵袭性足够在动物中诱导神经机能障碍/痛苦，甚至在扩大的肿瘤块表现出来之前需要对所述动物进行安乐死。无论如何，我们的实验之组合数据强烈地表明氯硝柳胺的单独暴露已经确实导致pGBM中肿瘤起始活性的有效降低。

氯硝柳胺干扰癌症驱动的信号传导级联。

已知有限数量的转录因子及相关信号传导途径在人癌细胞中是过度活跃的(21)。来自之前研究的证据已经表明氯硝柳胺干扰这些在血癌、乳腺癌和结肠癌细胞中的若干个，特别地干扰Notch-、mTOR-、Wnt-/β-连环蛋白-和NF-κB-信号传导(12、13、22-24)。因此，研究集中于对于pGBM中作用分析模式的该途径排列。在单剂量暴露于氯硝柳胺之后第5天研究细胞(n＝4病例：#046、078、81、106)。Western印迹表明在pGBM中的Notch途径活性的浓度依赖性抑制，如由切割的Notch 1-蛋白质的降低水平所表明的(图4A、12A和12C)。类似地，可示出作为活性mTOR信号传导的主要指示物(25)之磷酸化S6-蛋白质的水平在所有样品中降低(图4B、12B和12D)。该作用与NFKBIA基因状态无关。多效活性还解释了基于疾病的动物模型中的原位移植之ND在预暴露的pGBM中的强烈抗肿瘤潜力(图13)。Wnt-/β-连环蛋白途径的探索进一步表明氯硝柳胺特异性干扰β-连环蛋白转录活性的非经典(作为替代的)Akt依赖性调节。已知对肿瘤侵袭起重要作用之该机理的活化状态的特征是在Ser⁵⁵²磷酸化的β-连环蛋白的增强的核积累(26)。在pGBM中的各个免疫细胞化学暴露和定量证明核磷酸-β-连环蛋白(Ser552)抗原响应于施用氯硝柳胺的强烈降低。因此，特征性β-连环蛋白靶基因的表达在pGBM中表现出明显降低(12、27、28)。因此，氯硝柳胺显示出在pGBM中作用的多效性模式，同时抑制主要的驱动癌症的信号传导级联。

NFKBIA预测氯硝柳胺与替莫唑胺的协同作用。

相比于在Notch-、mTOR-和Wnt-/β-连环蛋白介导的途径上的一致抑制影响，氯硝柳胺表现出在pGBM中的NF-κB-信号传导上的可变作用。在用于作用分析模式的四个病例中，只有两个(#046和#078)的Western印迹显示出途径抑制，如由磷酸-p65-NFκB蛋白质的降低水平所表明的(图5A)。随后的基因组分析(参见方法)证明了在这两种情况下，在14q13处NFKBIA基因座(NFKBIA^+/-)的杂合缺失，其编码细胞内NF-κB-信号传导的主要抑制物。因为最近的工作已表明，NFKBIA的缺失和低表达与在GBM患者中不利的临床结果相关(16)，所以从组群中鉴定了另外的NFKBIA^+/-和NFKBIA^+/+pGBM和标准GBM模型以用于进一步研究。这些样品(pGBM：对于每个组n＝3；GBM：对于每个组n＝2”)显示出与各自NFKBIA的基因组状态相一致的基线表达水平(插图图5B；图14A和图15A的插图)。然而，氯硝柳胺的暴露之后，在dm条件下的NFKBIA^+/-pGBM以及标准的GBM模型示出其NFKBIA表达的强烈上调(图5B、14A和15A)。因为在NFKBIA^+/+样品中未观察到类似响应，所以氯硝柳胺对在pGBM中NF-κB-信号传导的可变作用可由在NFKBIA^+/-样品中NFKBIA表达的不同刺激来解释。这种观察引起人们的兴趣，因为已知在GBM细胞中NFKBIA的下调与缺乏对烷化剂(例如标准GBM化疗TMZ)的响应相关(29)。另一方面，已知单独NF-κB的抑制不能严重地影响大多数实体肿瘤，而是其可有助于防止癌细胞对化疗的抗性(30、31)。因此，研究了可能具有该设置的氯硝柳胺与TMZ组合施用的潜在益处。

表2

氯硝柳胺和TMZ的组合指数(CI)表示为观察到的细胞活力相比于预期的细胞活力的比值。作为用(仅)1μM氯硝柳胺治疗之后的活细胞的比例乘以用(仅)TMZ治疗之后细胞的比例来计算预期的结果。(CI＜1：协同，CI＝1：相加；CI＞1：拮抗)。

NFKBIA状态+/-(杂合缺失)，+/+(未缺失)。

实验使用7个pGBM组群(n＝4，NFKBIA^+/-；n＝3NFKBIA^+/+；表2)和四种标准的GBM细胞系。所有这些样品均示出未甲基化MGMT启动子状态(表明对于标准的比率/TMZ化疗的不良临床反应的情况)(2，16)。在50μM TMZ存在下进行氯硝柳胺的组合指数分析。在图14B和15B中给出了pGBM和GBM的组合指数。基于患者中所报道的血浆峰水平选择TMZ的浓度(32)，其在许多之前的研究中已经示出对保持在体外的胶质瘤细胞的活力的影响很小(10、33、34)。类似地，我们在此观察到向pGBM施用50μM TMZ将pGBM的其代谢活性降低至对照水平的仅94±4％(n＝7，一式三份分析，数据未示出)并且将GBM的活性降低至仅89±8％。然而，与氯硝柳胺组合，TMZ示出对NFKBIA^+/-pGBM以及GBM样品的特别作用。其剂量-响应曲线示出显著的左移，表明相比于NFKBIA^+/+样品，组合的氯硝柳胺/TMZ施用的更强抑制活性(图5C、14C和15C)。组合指数的计算(CI；(35))表明对于NFKBIA^+/+pGBM的大致相加的效应(CI＝0.92±0.05)，以及在所有NFKBIA^+/-样品中的氯硝柳胺/TMZ的明显协同活性(CI＝0.61±0.11)(表1)。

对于标准的细胞系，获得了类似结果(参见图15)。

为了直接证明在所观察到的协同活性中NFκB的参与，我们进行了使用NFκB活化剂TNFα(Peprotech)的对照研究。在pGBM中应用TNFα活化的NFκB，并且根据我们的假设，抵消了在NFKBIA^+/-基因型中的协同作用(图16)。

这些数据表明氯硝柳胺提高了TMZ(当前的GBM标准化疗)的抗癌作用。基于确定GBM细胞中NFKBIA的基因组状态，可进一步预测氯硝柳胺与TMZ的协同作用。

讨论

该研究的组合数据表明氯硝柳胺的多效抗癌作用理想地适于抑制来自多种关键临床集群的pGBM。引发细胞抑制、细胞毒性和抗迁移作用，并且在pGBM中的干样/致瘤性细胞级分强烈降低。因此，患者间和患者内肿瘤异质性问题以及使GBM中的任何治疗方法变得复杂的胶质肿瘤细胞的侵袭性(36)可通过一种药物解决。然而，该化合物的若干独特特征保证转化到脑肿瘤治疗的未来调查。氯硝柳胺是常见的，由许多管理机构批准的抗蠕虫剂，尚未考虑其用于脑肿瘤的治疗。其是水杨酰苯胺，是由Bayer在1959年作为软体动物杀虫剂(molluscide)引入的水杨酸的化学衍生物。对于在动物和人中的医学用途，优选经口施用，仅引起很小的毒性。动物研究表明无致突变、致癌或胚胎毒性活性，并且没有累积效应。其从肠道的吸收速率估计为33％(对于积累综述，参见(37))。体外数据表明氯硝柳胺以仅轻微影响人非恶性神经(对照)细胞的浓度范围抑制来自原发性疾病、来自疾病复发性、来自甲基化和未甲基化MGMT启动子、以及来自NFKBIA^+/+和NFKBIA^+/-GBM样品的GBM核心和周围细胞。

对于作用模式分析，该研究最大地依赖于来自血液肿瘤、结肠癌和乳腺癌的研究领域的之前工作的证据(12、13、22至24)。本研究的这些发现已经确认了这些研究的结果，暴露了氯硝柳胺在Wnt-/B-连环蛋白-、Notch-和mTor-信号传导上的多效抑制作用，已知其还在恶性GBM中发挥关键作用(16、38至40)。对于将来的临床应用特别感兴趣的是氯硝柳胺是迄今未认识到的，原因是刺激在NFKBIA^+/-癌症基因型中的NFKBIA表达。而其发挥作用的机制仍尚不清楚，可将所得的NF-κB活性的抑制用于克服对于烷化剂(例如TMZ)的抗性(29)。此处证明的在NFKBIA^+/-pGBM中的氯硝柳胺与当前标准的GBM化疗TMZ的协同活性提供了对于该假设的证据。很有可能的是，其他癌症的实体呈现出特定的单核苷酸多态性与NFKBIA的单倍型，例如霍奇金氏淋巴瘤、结直肠癌、黑素瘤、肝细胞癌、乳腺癌和多发性骨髓瘤(对于集体参考，参见(16))可能会受益于氯硝柳胺与烷化化疗方案组合。

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Claims

1.根据式I、II或III的细胞抑制化合物或其盐以及烷化化合物，其用于治疗实体肿瘤：

其中

A是羰基、亚甲基、羟基次甲基、烷氧基次甲基、氨基次甲基、肟、腙、芳基腙或缩氨基脲；

B如果存在的话，则为CR₂₅R₂₆、O、S或NR₂₇；

R₂和R₇独立地为卤素、羟基或氢；

R₅如果存在的话，则为羟基、磷酸酯/盐、氢、卤素、烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、烷氧基、烷硫基或氨基；

R₆如果存在的话，则为氢或C₁至C₆烷基；

R₂₇如果存在的话，则为氢或C₁至C₆烷基。

2.权利要求1所述的化合物，其中烷化剂是O⁶-烷化剂。

3.权利要求1或2所述的化合物，其中所述烷化化合物具有根据式IV的结构或其盐：

其中

R₃₁是烷基、氢、烷氧基、烯基、炔基、环烷基或芳基；并且

R₃₂是氨基、氢、羟基或卤素。

4.权利要求1至3中任一项所述的化合物，其中所述细胞抑制化合物是氯硝柳胺。

5.权利要求1至4中任一项所述的化合物，其中所述烷化化合物是替莫唑胺。

6.权利要求4所述的化合物，其中氯硝柳胺与替莫唑胺的摩尔比范围为10％氯硝柳胺/90％替莫唑胺至90％氯硝柳胺/10％替莫唑胺。

7.权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中所述实体肿瘤是成胶质细胞瘤。

8.权利要求7所述的化合物，其中所述成胶质细胞瘤是原发性成胶质细胞瘤、新生性成胶质细胞瘤；继发性成胶质细胞瘤；复发性成胶质细胞瘤、基因O6-甲基鸟嘌呤-甲基转移酶(MGMT)之启动子的甲基化提高的成胶质细胞瘤、MGMT之启动子的甲基化未提高的成胶质细胞瘤、具有突变之p53的成胶质细胞瘤、不具有突变之p53的成胶质细胞瘤、编码B细胞κ轻多肽基因增强子抑制因子(NFκBIA)的基因发生改变的成胶质细胞瘤、编码NFκBIA的基因未发生改变的成胶质细胞瘤、编码表皮生长因子受体(EGFR)的基因发生改变的成胶质细胞瘤、编码EGFR的基因未发生改变的成胶质细胞瘤、编码血小板衍生生长因子受体(PDGFRA)的基因发生改变的成胶质细胞瘤、编码PDGFRA的基因未发生改变的成胶质细胞瘤、编码异柠檬酸脱氢酶1(IDHI)的基因发生改变的成胶质细胞瘤、编码IDHI的基因未发生改变的成胶质细胞瘤、编码1型神经纤维瘤病(NF1)的基因发生改变的成胶质细胞瘤以及编码NF1的基因未发生改变的成胶质细胞瘤。

9.权利要求1至8中任一项所述的化合物，其配制成用于同时或相继施用。

10.权利要求9所述的化合物，其中用于同时施用的制剂是所述两种化合物的混合物。

11.权利要求1至10中任一项所述的化合物，其中所述细胞抑制化合物配制成用于吸收到中枢神经系统中。

12.药物组合物，其包含权利要求1至11中任一项所述的化合物和可药用赋形剂，所述药物组合物用于治疗实体肿瘤。

13.根据式I、II或III的化合物，其中R₁至R₁₁和R₂₁至R₂₇具有如上所定义的含义，所述化合物用于治疗以NFKBIA表达水平降低为特征的实体肿瘤。

14.用于确定用如权利要求1中所限定的根据式I、II或III的细胞抑制化合物治疗是否适用于治疗患有实体肿瘤之患者的方法，其包括以下步骤：

b)将所确定的表达水平与参考值进行比较；

c)基于步骤b)的比较结果确定用氯硝柳胺治疗是否适用于所述患者，其中NFκBIA的低表达或缺失表明该组合治疗适用于所述患者。

15.用于确定要向患有实体肿瘤的患者施用的氯硝柳胺与替莫唑胺之摩尔比的方法，其包括以下步骤：

b)将所确定的表达水平与参考值进行比较；

(i)表达高于所述参考值表明所述摩尔比应低于40％的氯硝柳胺；并且