CN104926944B - 多靶点复合抗原负载cd8+细胞毒性t淋巴细胞的制备方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种多靶点复合抗原，即组合的CTL抗原表位肽，一种对肿瘤细胞表面多靶位的多价疫苗，一种多靶点复合抗原负载CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞、其制备方法、以及在制备用于治疗癌症的药物中的应用。本发明还提供了一种表位诱导的特异性CTL效应细胞。

Description

多靶点复合抗原负载CD8+细胞毒性T淋巴细胞的制备方法及其 用途

技术领域：本发明涉及生物学和医学领域，更具体地涉及多靶点复合抗原负载CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞的制备方法及其应用。

背景技术：

恶性肿瘤是威胁人类健康的重大疾病之一，近年来，免疫系统在肿瘤预防和治疗中的重要作用已经得到广泛认同，基于抗肿瘤特异性免疫重建的免疫治疗是目前国际上公认的继手术、放疗和化疗之后最有希望完全消灭体内肿瘤细胞得以根治肿瘤的重要手段，将成为未来肿瘤治疗的一个主要方向。免疫治疗主要通过体外补充、诱导与活化机体固有的生物应答调节系统来活化调动具有细胞毒活性生物活性细胞及细胞因子，提高病人自身免疫系统的功能，增强特异性肿瘤杀伤细胞的分化能力，在细胞水平上杀伤肿瘤细胞，有效抑制肿瘤细胞的转移、扩散和复发，且副反应轻微，具有良好的临床治疗效果，克服了肿瘤传统治疗方式的“不彻底、易转移、副作用大”等弊端。随着从细胞和分子水平上对肿瘤免疫研究的深入，荷载肿瘤抗原的树突状细胞(DCs)致敏的肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)作为免疫治疗的重要部分，可特异性识别肿瘤，呈克隆化扩增并在体内形成免疫记忆，介导持久抗肿瘤特异性免疫效应。而CTL细胞的激活需要肿瘤抗原致敏和抗原递呈细胞(APC)所提供的共刺激信号以及由细胞因子提供的第三类信号分子的共同作用。肿瘤相关和特异性抗原的存在为特异性免疫治疗奠定了理论和物质基础。只有免疫原性强、特异性高的肿瘤抗原才能有效激活肿瘤特异性的T淋巴细胞。近年来，针对肿瘤表达的肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异抗原(TSA)发展起来的肿瘤多肽治疗性疫苗，以其特异性强、安全、廉价、易于保存和应用等特点，有望克服上述疗法的缺点，达到有效治疗肿瘤的目的。

肿瘤抗原必须在抗原递呈细胞(antigen presenting cell，APC)内降解为短肽并形成肽-MHC-TCR复合物才能为T细胞所识别，激发相应的细胞毒性T淋巴细胞反应。而多肽疫苗的目的就在于把高剂量的肿瘤抗原多肽输送给APC表面的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)分子，因此合适而有效的肿瘤抗原多肽对肿瘤疫苗的制备非常重要。且肿瘤抗原多肽是受MHC限制的，只有MHC I类分子相同的患者才能使用同一种肽，并且由于肿瘤的不均一性，某些肿瘤抗原肽可能会诱导免疫耐受而不是激活免疫应答。此外，免疫原性弱是多肽疫苗的另一大弱点，通过对表位多肽进行修饰(单个氨基酸的替换、多肽的PMRI修饰和脂肽等)或采用多价疫苗则可有效提高其免疫原性，诱导更强的CTL活性。

本发明是基于申请号为200810037440.9的中国发明专利的后续研究。本发明所引述的文献如下，下述文献通过引用结合到本专利申请中。专利文献1：公开号：CN101302537A；专利文献2：公开号：CN 101854945A；专利文献3：公开号：CN 102625832A。

发明内容：

本发明提供一种多靶点复合抗原(Multiple Target complex antigen，MTCA)，即由多个表位组合的方式，该组合方式是根据遗传基因结构和功能差异，从一系列候选多肽中选出至少四种与人类白细胞抗原相匹配的多肽组合，制作成肿瘤疫苗，从而激发患者机体对肿瘤的特异性免疫应答，延长其生存时间，MTCA较其他肿瘤疫苗，具有绕过免疫多样性和肿瘤不均一性的独特优势，可以有效诱导更强的CTL杀伤活性。

因此，本发明的一个目的是提供一种多靶点复合抗原，即组合的CTL抗原表位肽。本发明的另一个目的是提供对肿瘤细胞表面多靶位的多价疫苗。本发明的再一个目的是提供一种多靶点复合抗原负载CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞及其制备方法。本发明的再一个目的是提供一种表位诱导的特异性CTL效应细胞。

本发明提供的多个表位肽具有诱导多个HLA类型的HLA限制性CTL的能力，从而达到更有效的治疗效果。具有诱导HLA-A24、HLA-A2或HLA-A3超型的示例性的肿瘤抗原至少包括下述：例如具有诱导HLA-1101、HLA-A2402、HLA-A2601、 HLA-A3101、HLA-A3303的HLA限制性CTL的能力。其中多个表位肽选自PRAME、 MAGE A3、HER-2/neu、NY-ESO-1、Ras突变体、p53突变体、PSA、hTERT、AFP、SART、CEA、CA-125、EGFR-800、C35-44、β-tubuline-309、精液蛋白17、PSMA、 Survivin。

优选地，通过例如覆盖所述示例性肿瘤相关抗原肽PRAME、C35-44、Survivin、 NY-ESO-1(可使用其他肿瘤抗原肽和组合)等可诱导针对多种不同抗原表位的抗肿瘤免疫，这种对肿瘤细胞表面多靶位的多价疫苗比单一抗原刺激更有效。优选地，通过例如覆盖所述示例性肿瘤相关抗原肽HER-2/neu、SART和hTERT、CEA 可诱导针对多种不同抗原表位的抗肿瘤免疫，这种对肿瘤细胞表面多靶位的多价疫苗比单一抗原刺激更有效。

本发明通过以下技术手段来实现上述发明目的：选择下面不少于四条多肽进行组合：PRAME、MAGE A3、HER-2/neu、NY-ESO-1、Ras突变体、p53突变体、 PSA、hTERT、AFP、SART、CEA、CA-125、EGFR-800、C35-44、β-tubuline-309、精液蛋白17、PSMA、Survivin。优选地，将SEQ ID NO：1-4的氨基酸序列的多肽组合为CTL抗原表位肽SEQ ID NO：5。优选地，将SEQ IDNO：6-9的氨基酸序列的多肽组合为CTL抗原表位肽SEQ ID NO：10。采用该组合方式制备的多肽诱导出针对多种不同抗原表位的抗肿瘤免疫，这种对肿瘤细胞表面多靶位的多价疫苗比单一抗原刺激更有效，从而产生高免疫效应。可以选取相对应的肿瘤抗原，以此取得最佳治疗效果。

因此，一方面，本发明提供了一种多肽，其氨基酸序列是四个选自下面的肽的组合：PRAME、MAGE A3、HER-2/neu、NY-ESO-1、Ras突变体、p53突变体、 PSA、hTERT、AFP、SART、CEA、CA-125、EGFR-800、C35-44、β-tubuline-309、精液蛋白17、PSMA、Survivin。优选地，本发明多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：10所示。

另一方面，本发明提供一种多靶点复合抗原负载CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞，其特征在于其是通过下面方法制备的：

1)构建慢病毒载体；通过pacl限制性内切酶位点，将hGM-CSF基因定向克隆到慢病毒连接载体系统中构建重组载体，将重组载体和包膜质粒以及包装结构质粒混合，形成慢病毒载体；

2)制备DC疫苗：分离出单核细胞，经rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α诱导获得 DC细胞，将本发明的多肽(优选SEQ ID NO：5和10)和步骤1)构建的慢病毒同时感染DC细胞后获得DC疫苗；

3)制备抗原特异性CTL：将步骤2)获得的DC疫苗与T淋巴细胞共同孵育，得到致敏的多靶点复合抗原负载CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞。

本发明还提供了一种对肿瘤细胞表面多靶位的多价疫苗，其特征在于将本发明的多肽(优选SEQ ID NO：5或者SEQ ID NO：10)和慢病毒同时感染DC细胞后获得DC疫苗。优选地，所述慢病毒是Lenti-hGM-CSF。

再一方面，本发明提供一种表位诱导的特异性CTL效应细胞，其特征在于向本发明多靶点复合抗原负载CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞的培养基中加入GM-CSF、 IL-4、IL-2继续培养，收集细胞，得到表位诱导的特异性CTL效应细胞。

本发明的多靶点复合抗原负载CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞在制备用于治疗癌症的药物中的应用，以及包含本发明的多靶点复合抗原负载CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞的用于治疗癌症的药物组合物都是本发明要求保护的范围。

本发明的实施方式中，提供了肿瘤抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞CTL，所述组合的CTL抗原肽是在肿瘤细胞上高度表达的多肽聚合物。优选地，本发明所述组合的CTL抗原肽是在肿瘤细胞上高度表达PRAME、C35-44、Survivin、 NY-ESO-1的多肽聚合物以及HER-2/neu、SART和hTERT、CEA的多肽聚合物。

在本发明的一个优选的实施方案中，多个表位组合的方式具体为所述的组合的CTL抗原表位，由PRAME、C35-44和Survivin、NY-ESO-1四条多肽连接，其中所述PRAME的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示，所述C35-44的氨基酸序列为SEQ ID NO： 2所示，所述Survivin的氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示，所述NY-ESO-1的氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示。连接的方式为现有技术，包括接头连接法、粘性末端互补法、同尾酶法、串联法等。更优选的连接方式为串联法。

本发明所述CTL复合抗原表位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示：

N-ALYVDSLFFL-TLLPAAGPAL-ELTLGEFLKL-SLLMFITQC-C

PRAME：

SEQ ID NO：1

ALYVDSLFFL

C35-44：

SEQ ID NO：2

TLLPAAGPAL

Survivin：

SEQ ID NO：3

ELTLGEFLKL

NY-ESO-1：

SEQ ID NO：4

SLLMFITQC

在本发明另一个优选的实施方案中，组合的CTL抗原肽是在肿瘤细胞上高度表达HER-2/neu、SART、hTERT和CEA的多肽聚合物。本发明的多个表位组合的方式具体为所述的组合的CTL抗原表位，由HER-2/neu、SART和hTERT、CEA四条多肽连接，其中所述HER-2/neu的氨基酸序列为SEQ ID NO：6所示，所述SART 的氨基酸序列为SEQ ID NO：7所示，所述hTERT的氨基酸序列为SEQ ID NO：8 所示，所述CEA的氨基酸序列为SEQ ID NO：9所示。连接的方式为现有技术，包括接头连接法、粘性末端互补法、同尾酶法、串联法等。更优选的连接方式为串联法。本发明所述CTL复合抗原表位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示： N-YLEEITGYL-DYSARWNEI-YLQVNSLQTV-YLSGADLNL-C

HER-2/neu：

SEQ ID NO：6

YLEEITGYL

SART

SEQ ID NO：7

DYSARWNEI

hTFRT

SEQ ID NO：8

YLQVNSLQTV

CEA

SEQ ID NO：9

YLSGADLNL

在本发明的实施方式中，提供用于多种肿瘤抗原的CTL及其制备方法。本发明可用于任何肿瘤，包括但不限于：肺癌、乳腺癌、肾癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、肝癌、宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌、黑色素瘤和头颈部肿瘤等，还可应用于有关血液和骨髓的癌症。

在本发明优选的具体实施方式中，本发明CTL产物以特异对应所述肿瘤所展现的抗原表达。因此，将组合的多抗原表位多肽联合慢病毒Lenti-hGM-CSF同时感染DC细胞提供了一种生成单CTL产品的途径，所述产品具有特定肿瘤独立抗原特征。

本发明的重要意义体现在：提出了一种全新的细胞免疫治疗理念，即“打破肿瘤免疫耐受基础上的自体免疫细胞治疗”技术，建立了一种在打破肿瘤“免疫耐受”基础上实施高效特异性肿瘤杀伤的新技术、新方法。本技术解决了目前肿瘤免疫治疗中效应细胞在体内存留时间短，肿瘤杀伤效率低，临床疗效差等瓶颈问题，大幅提高了细胞免疫治疗的临床疗效，具有非常广阔的应用前景。

在本发明的实施方案中，用下述方法构建慢病毒载体：针对人外周血 hGM-CSF基因(GeneID：NM_000758.3)的CDS区序列提供PCR引物，通过PCR 扩增在上述基因的5′端和3′端均添加酶切位点，以质粒pORFhGM-CSF为模板，采用PCR方法扩增出hGM-CSF基因片段；通过pacl限制性内切酶位点，将 hGM-CSF基因定向克隆到慢病毒连接载体系统中构建重组载体。将重组载体和包膜质粒以及包装结构质粒混合，形成慢病毒载体系统。本发明所述慢病毒优选是 Lenti-hGM-CSF。

在本发明优选实施方案中，所述PCR引物为：

GM-CSF基因PCR引物：

F 5′-GTTAATTAACATGTGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCT-′3(SFQ ID NO：6)

R：5′-GTTAATTAACTCACTCCTGGACTGGCTCCCAGCAG-′3(SEQ ID NO：7)

上述引物中，下划线部分为酶切位点。

在本发明的实施方案中，通过下述方法制备DC疫苗：分离出单核细胞，优选从外周血中分离出单核细胞，经rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α诱导获得DC 细胞，将本发明联合的抗原表位多肽(优选SEQ ID NO：5)和本发明上述慢病毒同时感染DC细胞后获得DC疫苗。

在本发明的实施方案中，将本发明联合抗原表位多肽(优选SEQ ID NO：5) 和本发明上述慢病毒同时感染DC细胞后获得的DC疫苗然后与T淋巴细胞共同孵育，得到致敏的细胞毒性T淋巴细胞。优选地，MTCA-DC/APC-CTL免疫细胞治疗技术是以表达CD3⁺CD8⁺为主的细胞毒性T细胞为主要效应细胞。

在本发明的实施方案中，如下制备抗原特异性CTL：将本发明的如上获得的负载肿瘤相关抗原的DC细胞与T淋巴细胞混合后，在培养基中加入GM-CSF、 IL-4、IL-2继续培养后，收集细胞即得本发明表位诱导的特异性CTL效应细胞。

本发明特异性CTL具有明显提高的分泌IFN-γ的能力。在MTCA-多靶点复合抗原诱导抗原特异性CTL对特异性肿瘤细胞的杀伤效应的试验中，本发明 MTCA-多靶点复合抗原诱导产生的抗原特异性CTL在效靶细胞共培养过程中可以形成对靶细胞的特异性溶解，即本发明MTCA-多靶点复合抗原诱导的CTL可同时杀伤负载有对照肽的靶细胞，扩大了实验多肽的适用范围。

附图简要说明

图1是通过pacl限制性内切酶位点，将hGM-CSF基因定向克隆到慢病毒连接载体系统中构建重组载体FattbC31UGW-hGM-CSF的图示。

图2是包膜质粒VSVG。

图3是包装结构质粒CMVΔ8.9-D64N/D116N。

图4是本发明MTCA-多靶点复合抗原(SEQ ID NO：5)诱导抗原特异性CTL 产生IFN-γ的能力比较条形图。

图5是本发明MTCA-多靶点复合抗原(SEQ ID NO：5)诱导抗原特异性CTL 对特异性肿瘤细胞的杀伤效应比较条形图。

图6是本发明MTCA-多靶点复合抗原(SEQ ID NO：10)诱导抗原特异性CTL产生IFN-γ的能力比较条形图。

图7是本发明MTCA-多靶点复合抗原(SEQ ID NO：10)诱导抗原特异性 CTL对特异性肿瘤细胞的杀伤效应比较条形图。

具体实施方式

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 慢病毒LentihGM-CSF载体的构建

针对人外周血hGM-CSF基因(GeneID：NM_000758.3)的CDS区序列提供PCR 引物，通过PCR扩增在上述基因的5′端和3′端均添加酶切位点，以质粒 pORFhGM-CSF(购自Invivogen，货号：porf-hgmcsf)为模板，采用PCR方法扩增出hGM-CSF基因片段；通过pacl限制性内切酶位点，将hGM-CSF基因定向克隆到慢病毒连接载体系统(图1所示)中构建重组载体FattbC31UGW-hGM-CSF。将重组载体FattbC31UGW-hGM-CSF和包膜质粒VSVG(图2所示)以及包装结构质粒CMVΔ8.9-D64N/D116N(图3所示)混合，混合比例为1.5-10∶1-5∶1 形成慢病毒载体系统，利用脂质体LipofectamineTM在293T细胞上转染，24-48h 后再荧光显微镜下观察，72h后出现大量荧光后收集病毒上清，获得编码hGM-CSF 的慢病毒颗粒Lenti-hGM-CSF，收集的病毒上清液浓缩后分装备用或立即使用。

所述PCR引物为：

GM-CSF基因PCR引物：

F 5′-GTTAATTAACATGTGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCT-′3

R：5′-GTTAATTAACTCACTCCTGGACTGGCTCCCAGCAG-′3

上述引物中，下划线部分为酶切位点。

重组慢病毒活性测定时，将浓缩后的病毒储存液作不同比例稀释，感染细胞72h后再荧光显微镜下进行荧光计数，确定滴度。FUGW载体作为对照。结果显示，位点特异整合性慢病毒滴度为7.1X10^-7TU/ml。

实施例2 合成多靶点复合抗原肽

如SEQ ID NO：5所示的多肽，委托上海强耀生物科技有限公司采用标准Fmoc 方案进行合成，并采用高效液相色谱法进行纯化和纯度分析，质谱法进行鉴定和分子量测定。结果显示，所述多肽的纯度高于95％，分子量与理论值相符。

具体合成步骤：1.Fmoc保护的柱子和单体必须用碱性溶剂(如piperidine)去除氨基的保护集团；2.采用激活剂激活、溶解需要交联的氨基酸的羧基端，并将激活的单体与游离的氨基在交联剂的作用下进行交联，形成肽键；3.将前两步反复循环直到整条肽链合成完毕。

实施例3 合成多靶点复合抗原肽

如SEQ ID NO：10所示的多肽，委托上海强耀生物科技有限公司采用标准 Fmoc方案进行合成，并采用高效液相色谱法进行纯化和纯度分析，质谱法进行鉴定和分子量测定。结果显示，所述多肽的纯度高于95％，分子量与理论值相符。具体合成步骤：1.Fmoc保护的柱子和单体必须用碱性溶剂(如piperidine)去除氨基的保护集团；2.采用激活剂激活、溶解需要交联的氨基酸的羧基端，并将激活的单体与游离的氨基在交联剂的作用下进行交联，形成肽键；3.将前两步反复循环直到整条肽链合成完毕。

实施例4 DC疫苗的制备

从外周血中分离出单核细胞，经rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α诱导获得DC 细胞，通过相差显微镜和流式细胞仪鉴定后，将合成的多靶点复合抗原肽(SEQ ID NO：5)和实施例1制备的慢病毒Lenti-hGM-CSF同时感染DC细胞后获得的DC 疫苗后与T淋巴细胞共同孵育，得到致敏的细胞毒性T淋巴细胞。 MTCA-DC/APC-CTL免疫细胞治疗技术是以表达CD3⁺CD8⁺为主的细胞毒性T细胞为主要效应细胞。

实施例5 DC疫苗的制备

从外周血中分离出单核细胞，经rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α诱导获得DC 细胞，通过相差显微镜和流式细胞仪鉴定后，将合成的多靶点复合抗原肽(SEQ ID NO：10)和实施例1制备的慢病毒Lenti-hGM-CSF同时感染DC细胞后获得的 DC疫苗后与T淋巴细胞共同孵育，得到致敏的细胞毒性T淋巴细胞。 MTCA-DC/APC-CTL免疫细胞治疗技术是以表达CD3⁺CD8⁺为主的细胞毒性T细胞为主要效应细胞。

实施例6 抗原特异性CTL的制备

所述CTL细胞可衍生自外周血T淋巴细胞，外周血经淋巴细胞分离液 (Ficoll-Hypaque)进行密度梯度离心后，收集富含单个核细胞的界面细胞，重悬于RPMI-1640培养基中，置37℃、5％CO2孵箱培养2小时，收集非贴壁的悬浮细胞用含3％血清的RPMI-1640培养基重悬后，调节细胞密度为1×10⁶/ml，此悬液中富含T淋巴细胞。将实施例2制备的负载肿瘤相关抗原的DC细胞与T淋巴细胞按照1∶10的比例混合后，在RPMI-1640培养基中加入GM-CSF、IL-4、IL-2 继续培养1周，每3天半量换液，维持细胞浓度为1X10⁶/ml；培养1周后收集细胞即得表位诱导的特异性CTL效应细胞。

实施例7 抗原特异性CTL的制备

所述CTL细胞可衍生自外周血T淋巴细胞，外周血经淋巴细胞分离液 (Ficoll-Hypaque)进行密度梯度离心后，收集富含单个核细胞的界面细胞，重悬于RPMI-1640培养基中，置37℃、5％CO2孵箱培养2小时，收集非贴壁的悬浮细胞用含3％血清的RPMI-1640培养基重悬后，调节细胞密度为1×10⁶/ml，此悬液中富含T淋巴细胞。将实施例3制备的负载肿瘤相关抗原的DC细胞与T淋巴细胞按照1∶10的比例混合后，在RPMI-1640培养基中加入GM-CSF、IL-4、IL-2 继续培养1周，每3天半量换液，维持细胞浓度为1X10⁶/ml；培养1周后收集细胞即得表位诱导的特异性CTL效应细胞。

实施例8 本发明MTCA-多靶点复合抗原诱导抗原特异性CTL产生IFN-γ的能力测定与比较试验

酶联免疫法检测分泌IFN-γ的能力：采用ELISPOT检测试剂盒，在96孔板中加入用PBS按1∶100稀释的IFN-γ捕获抗体100ul，置于4℃孵育过夜，用PBS 洗涤后加入效应细胞100ul，和靶细胞(人肝癌细胞系HepG2)100ul，其中效应细胞和靶细胞的数量比(E/T)为10，在37℃，5％CO₂条件下孵育24h后，用含 0.1％吐温20的PBS洗涤后，加入含有1％BSA的PBS按1∶100稀释后的生物素标记的抗IFN-γ抗体，在37℃，5％CO₂条件下孵育2h，用含1％BSA的PBS按1∶5000 稀释后的联袂亲和素标记的碱性磷酸酶100ul，孵育1h，洗涤后拍干培养板后，用蒸馏水终止反应，干燥后读点。

实验一分组为：1、PRAME抗原对照组；2、C35-44抗原对照组；3、Survivin 抗原对照组；4、NY-ESO-1抗原对照组；5、MTCA-多靶点复合抗原组；6、空白对照组。

结果(图4)表明：实验组诱导特异性CTL分泌IFN-γ的能力明显高于其他 5组，其诱导分泌IFN-γ的能力最强，相对于对照组单一肽负载特异性CTL分泌 IFN-γ的能力提高了3倍以上。

实验二分组为：1、HER-2/neu抗原对照组；2、SART抗原对照组；3、hTERT 抗原对照组；4、CEA抗原对照组；5、MTCA-多靶点复合抗原组；6、空白对照组。

结果(图6)表明：实验组诱导特异性CTL分泌IFN-γ的能力明显高于其他 5组，其诱导分泌IFN-γ的能力最强，相对于对照组单一肽负载特异性CTL分泌 IFN-γ的能力提高了3倍以上。

实施例9 本发明MTCA-多靶点复合抗原诱导抗原特异性CTL对特异性肿瘤细胞的杀伤效应

采用时间分辨荧光细胞毒性实验进行分析。抗原肽诱导的CTL作为效应细胞 (E)，负载抗原肽的T2细胞为靶细胞(T)，检测CTL的特异性杀伤活性。在37℃， 5％CO₂条件下将效应细胞与靶细胞按照数量比为50∶1共同孵育4h，每个样本设 3个复孔，取平均值为检测结果。

细胞杀伤活性＝(待测孔荧光强度-自然释放孔荧光强度)/(最大释放孔荧光强度-自然释放孔荧光强度)X100％

实验一分组为：1、PRAME抗原对照组；2、C35-44抗原对照组；3、Survivin 抗原对照组；4、NY-ESO-1抗原对照组；5、MTCA-多靶点复合抗原组。

结果(图5)表明，MTCA-多靶点复合抗原诱导产生的抗原特异性CTL在效靶细胞共培养过程中可以形成对靶细胞的特异性溶解，而各对照组多肽所诱导的效应细胞仅能杀伤负载有相应肽的靶细胞，即MTCA-多靶点复合抗原诱导的CTL 可同时杀伤负载有上述四种对照肽的靶细胞，扩大了实验多肽的适用范围。

实验二分组为：1、HER-2/neu抗原对照组；2、SART抗原对照组；3、hTERT 抗原对照组；4、CEA抗原对照组；5、MTCA-多靶点复合抗原组。

结果(图7)表明，MTCA-多靶点复合抗原诱导产生的抗原特异性CTL在效靶细胞共培养过程中可以形成对靶细胞的特异性溶解，而各对照组多肽所诱导的效应细胞仅能杀伤负载有相应肽的靶细胞，即MTCA-多靶点复合抗原诱导的CTL 可同时杀伤负载有上述四种对照肽的靶细胞，扩大了实验多肽的适用范围。

Claims (9)

1.一种多肽，从N端到C端由HER-2/neu、SART、hTERT和CEA四条多肽依次连接而成，其中所述HER-2/neu的氨基酸序列为SEQ ID NO：6所示，所述SART的氨基酸序列为SEQ ID NO：7所示，所述hTERT的氨基酸序列为SEQ ID NO：8所示，所述CEA的氨基酸序列为SEQ ID NO：9所示。

2.根据权利要求1所述多肽，其氨基酸序列如或SEQ ID NO：10所示。

3.一种多靶点复合抗原负载CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞，其特征在于：其是通过下面方法制备的：

1)构建慢病毒；通过pacl限制性内切酶位点，将hGM-CSF基因定向克隆到慢病毒连接载体系统中构建重组载体，将重组载体和包膜质粒以及包装结构质粒混合，形成慢病毒；

2)制备DC疫苗：分离出单核细胞，经rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α诱导获得DC细胞，将权利要求1或2的多肽和步骤1)构建的慢病毒同时感染DC细胞后获得DC疫苗；

3)制备抗原特异性CTL：将步骤2)获得的DC疫苗与T淋巴细胞共同孵育，得到致敏的多靶点复合抗原负载CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞。

4.根据权利要求3所述多靶点复合抗原负载CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞，其特征在于：其中所述慢病毒是Lenti-hGM-CSF。

5.权利要求3或4所述多靶点复合抗原负载CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞的制备方法，包括以下步骤：

1)构建慢病毒；通过pacl限制性内切酶位点，将hGM-CSF基因定向克隆到慢病毒连接载体系统中构建重组载体，将重组载体和包膜质粒以及包装结构质粒混合，形成慢病毒；

2)制备DC疫苗：分离出单核细胞，经rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α诱导获得DC细胞，将权利要求1或2所述多肽和步骤1)构建的慢病毒同时感染DC细胞后获得DC疫苗；

3)制备抗原特异性CTL：将步骤2)获得的DC疫苗与T淋巴细胞共同孵育，得到致敏的多靶点复合抗原负载CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞。

6.一种对肿瘤细胞表面多靶位的多价疫苗，其特征在于：将权利要求1或2所述多肽与慢病毒Lenti-hGM-CSF同时感染DC细胞后获得DC疫苗。

7.一种表位诱导的特异性CTL效应细胞，其特征在于：向权利要求3或4所述多靶点复合抗原负载CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞的培养基中加入GM-CSF、IL-4、IL-2继续培养，收集细胞。

8.权利要求3或4所述多靶点复合抗原负载CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞在制备用于治疗癌症的药物中的应用。

9.一种用于治疗癌症的药物组合物，其特征在于：含有权利要求3或4所述多靶点复合抗原负载CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞。