CN104911146B - Sirt1蛋白及其组合物在成骨转化中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药生物领域，具体涉及SIRT1蛋白及其组合物在成骨转化中的应用。所述组合物可以作为成骨分化诱导剂应用于现有技术，所述组合物由Sirt1蛋白和β‑甘油磷酸钠组成。所述Sirt1蛋白和β‑甘油磷酸钠的重量比为1～3：10，优选为2：10。所述组合物也可由Sirt1蛋白、β‑甘油磷酸钠和芒果苷组成，Sirt1蛋白、β‑甘油磷酸钠和芒果苷的重量比为：1～3：10：2～6；优选为2：10：3。
Description
技术领域
本发明属于医药生物领域，具体涉及SIRT1蛋白及其组合物在成骨转化中的应用。
背景技术
中国社会逐步步入老龄化社会，中老年性骨科疾病发生率也将大幅度上升，因此中国也将面临人工骨移植材料的极大需求。据统计，中国有肢体不自由患者1500万，由于缺乏重建技术和材料已有300万人截肢，全国每年骨缺损和骨损伤患者近350万，按年手术40万例计算，整个中国骨移植材料的市场规模也将达到24亿人民币以上的规模，这还不包括大量牙科矫形手术中需要的骨移植材料。在美国，每年实施45万例骨移植手术，骨移植材料市场高达80亿美元。对于欧洲市场，骨替代产品35％为合成材料，并且以每年41.7％的速率增长，2000年骨移植手术145775例，骨移植材料市场价值达35亿美元。上述数据尚未包括牙科用骨移植材料。牙科用骨移植材料估计有骨科用骨移植材料的1/4。作为生物医学材料中一个重要的组成部分，人工骨移植材料的市场销售额在以每年50％的速率增长，由此可见人工骨材料的市场规模与潜力将十分巨大。目前市场上的人工骨修复材料大都缺少诱导成骨活性因子，这些材料植入人体后成骨的时间和数量受限，一定程度上限制了新骨的形成。骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)是目前唯一能应用的能够单独诱导成骨的生长因子，骨形成蛋白(bone morphogenetic protein BMP)作为最有效的成骨诱导活性物质，已被广泛应用在骨缺修复损及骨折愈合的研究中。其中以BMP-2的成骨能力最强。但天然的BMP2半衰期短，局部应用时很快被稀释和代谢，不仅数量有限，活性不稳定,远远不能满足临床需要，而且混入载体中有许多副作用。
此外，移植能够进行骨生成分化的干细胞或者定向于骨生成分化的细胞也是治疗骨相关疾病(特别是当所述治疗需要新骨产生时)的有前景的途径。先前已使用骨髓干细胞(BMSC)和间充质干细胞(MSC)治疗骨疾病(Gangji等，2005，Expert Opin Biol Ther(5)：437-42)。然而，尽管可以将这些相对未分化的干细胞进行移植，但是它们并不定向分化为骨生成谱系，因此这样移植的干细胞中有相当大的比例最终可能不会形成期望的骨组织。因此在干细胞相关的骨相关疾病的治疗中，同样需要成骨诱导剂的参与。
在各种物种中发现的SIR2的同源蛋白质统称为Sirtuins家族(Michishita，Park等人，2005)。哺乳动物中Sirtuins家族有7个成员(Sirt1-Sirt7)，其中Sirt1与Sir2的同源性最高。Sirt1通过与不同的组蛋白(Vaquero，Scher等人，2004)和非组蛋白底物相互作用(Luo，Nikolaev等人，2001；Vaziri，Dessain等人，2001；Langley，Pearson等人，2002；Smith2002；Yeung，Hoberg等人，2004；Nemoto，Fergusson等人，2005)，对细胞的生存、凋亡、代谢等都发挥重要作用。人Sirt1基因位于10q22.1，长约33kb，翻译后的蛋白质分子量大小约为60ku，不存在剪切变异体，具有NAD依赖的脱乙酰基酶活性。该蛋白广泛存在于机体的各种体细胞及生殖细胞中。
发明内容
本发明的一个目的是提供Sirt1蛋白作为成骨分化诱导剂的应用。
具体的，Sirt1蛋白可作为成骨分化诱导剂添加到骨移植材料上，也可以添加到体外细胞培养基中诱导骨髓间充质干细胞或脂肪间质干细胞向成骨方向转化，从而使上述干细胞作为种子细胞应用到骨组织工程或骨移植材料当中。
本发明的另一个目的是提供Sirt1蛋白在制备治疗骨质疏松症药物中的应用。
在本发明中，Sirt1蛋白可以为纯化的重组Sirt1蛋白或适于在人体内表达的重组Sirt1表达载体。
优选地，所述纯化的重组Sirt1蛋白利用常规的原核表达系统或真核表达系统获得。例如，在专利CN201010512043公开的方法来进行制备而获得的重组Sirt1蛋白。当然也可以通过商业渠道购买获得。
本发明的另一个目的是提供一种包含Sirt1蛋白的组合物，所述组合物可以作为成骨分化诱导剂应用于现有技术，所述组合物由Sirt1蛋白和β-甘油磷酸钠组成。
在本发明的一个实施方案中，所述Sirt1蛋白和β-甘油磷酸钠的重量比为1～3：10，优选为2：10。
在本发明进一步地实施方案中，所述组合物由Sirt1蛋白、β-甘油磷酸钠和芒果苷组成，Sirt1蛋白、β-甘油磷酸钠和芒果苷的重量比为：1～3：10：2～6；优选为2：10：3。
本发明的所述组合物可以作为成骨分化诱导剂添加到骨移植材料上，也可以添加到体外细胞培养基中诱导骨髓间充质干细胞或脂肪间质干细胞向成骨方向转化，从而使上述干细胞作为种子细胞应用到骨组织工程或骨移植材料当中。
还需要说明的是，本发明的所述组合物也可以作为药物用于骨质疏松症的治疗，并且也可联合骨髓间充质干细胞移植来防治一些骨疾病。
当作为药物进行使用时，优选将组合物制备成注射剂进行使用。更优选地，所述注射剂选自皮内注射剂、皮下注射剂、肌内注射剂或静脉注射剂。
具体实施方式
下面将进一步的详细说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
实施例1 Sirt1蛋白及其组合物诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外成骨分化的研究
骨髓间充质干细胞(BMSCs)的培养：将2月龄雄性大鼠脱颈处死后，在无菌取下双侧股骨和胫骨，暴露骨髓腔，反复冲洗骨髓腔至平皿中，收集平皿中的培养液至离心管中，1000rpm，3min离心，弃上清液，再用含10％FBS的α-MEM培养液重悬细胞，当细胞密度达80％时，进行传代培养，第4代细胞可用于实验。以5×104个·mL-1浓度接种于96孔细胞培养板，每孔200μL。试验分为以下各组：
对比例组：采用常规成骨诱导剂，具体为：终浓度为0.01M/L地塞米松，10mM/L的β-甘油磷酸钠和50mg/L的维生素C。对照组不添加任何成骨诱导剂，仅添加等量的培养基。
每组设置6个复孔，在加入诱导剂7天后，收集细胞，粉碎，离心取上清，采用常规试剂盒测定ALP活性和骨钙素含量，具体结果如下：
| ALP活性(U/L) | 骨钙素(ng/ml) | |
| 对照组 | 31.2±2.4 | 1.14±0.12 |
| 组1 | 121.8±6.9 | 1.54±0.14 |
| 组2 | 64.6±5.3 | 1.31±0.13 |
| 组3 | 71.4±5.5 | 1.26±0.08 |
| 组4 | 157.9±5.9 | 1.81±0.15 |
| 组5 | 198.4±6.3 | 2.49±0.17 |
| 组6 | 142.6±6.1 | 1.76±0.12 |
| 对比例组 | 137.6±5.2 | 1.77±0.14 |
在加入诱导剂孵育14天后，采用茜素红法测定钙结节数量，具体结果如下：
| 钙结节个数(个/孔) | |
| 对照组 | 0.8±0.5 |
| 组1 | 9.6±1.8 |
| 组2 | 2.1±1.1 |
| 组3 | 1.7±0.8 |
| 组4 | 13.7±2.4 |
| 组5 | 17.3±2.8 |
| 组6 | 11.4±2.3 |
| 对比例组 | 12.6±2.1 |
实施例2
将可吸收人工骨材料(北京益而康生物工程开发中心)切成直径7mm，厚约1.5mm的圆片，用Co60照射(2.5Mrad)消毒。无菌条件下将本发明的诱导成骨短肽用双蒸水溶解，将消毒后的材料浸泡在成骨诱导剂溶液(成骨诱导剂浓度为1mg/ml，各组诱导剂中成分重量比同实施例1中的组1-6)中30分钟，待溶液完全进入材料后取出材料密封，置于4℃保存。对照采用单纯人工骨材料。
取成年雄性SD大鼠18只，体重200g-250g，随机分组，每组9只。两组分别使用成骨诱导剂/人工骨材料和单纯人工骨材料。用2％戊巴比妥钠1.5m1/100g腹腔注射麻醉，背部消毒，切开皮肤，分离左侧肌间隙，植入材料。术后4周处死大鼠，取出植入材料及新长的骨头，称量骨鲜重，然后将新骨放入高温炉中煅烧6h，称量灰分重量。具体结果如下：
| 新骨鲜重(mg/只) | 骨灰分(mg/只) | |
| 对照组 | 65.6±9.9 | 27.8±3.7 |
| 组1 | 92.7±12.1 | 46.4±4.1 |
| 组2 | 72.5±10.7 | 35.8±5.1 |
| 组3 | 69.4±11.3 | 34.2±5.5 |
| 组4 | 101.4±13.3 | 53.7±6.7 |
| 组5 | 128.9±13.8 | 69.6±6.4 |
| 组6 | 103.6±12.4 | 52.9±5.7 |
本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。
Claims (2)
1.一种包含Sirt1蛋白的组合物，所述组合物由Sirt1蛋白、β-甘油磷酸钠和芒果苷组成，Sirt1蛋白、β-甘油磷酸钠和芒果苷的重量比为2：10：3。
2.权利要求1所述组合物在制备治疗骨质疏松症药物中的应用。
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| CN201510270768.5A CN104911146B (zh) | 2015-05-22 | 2015-05-22 | Sirt1蛋白及其组合物在成骨转化中的应用 |
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| CN102008718A (zh) * | 2009-09-07 | 2011-04-13 | 中国医学科学院基础医学研究所 | SIRT1在制备下调细胞周期蛋白如cyclin D1表达的药物中的用途 |
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| Sirt1与骨质疏松的研究进展;刘波 等;《中国药理学通报》;20130831;第29卷(第8期);1054-1056 * |
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