CN104911130B

CN104911130B - 一株具有脱氮能力的盐单胞菌及其应用

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Publication number: CN104911130B
Application number: CN201510315663.7A
Authority: CN
Inventors: 邵宗泽; 王丽萍; 李小义
Original assignee: Third Institute of Oceanography SOA
Current assignee: Third Institute of Oceanography SOA
Priority date: 2015-06-10
Filing date: 2015-06-10
Publication date: 2018-05-15
Anticipated expiration: 2035-06-10
Also published as: CN104911130A

Abstract

一株具有脱氮能力的盐单胞菌及其应用，属于微生物应用技术领域。盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1‑6‑1，保藏编号为CCTCC NO:M 2015266。盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1‑6‑1能快速高效去除水体中的硝酸盐和亚硝酸盐，且对高浓度亚硝酸盐具有很强的耐受性及去除能力。盐单胞菌为(Halomonas sp.)CYQ1‑6‑1在处理高浓度亚硝酸盐废水、含氮废水生物脱氮、水产养殖亚硝酸盐去除等中应用。所述含氮废水包括但不限于硝酸盐废水、亚硝酸盐废水、氨氮废水等。盐单胞菌为(Halomonas sp.)CYQ1‑6‑1能够耐受亚硝酸盐氮达4000mg/L。

Description

一株具有脱氮能力的盐单胞菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物应用技术领域，具体是涉及一株具有脱氮能力的盐单胞菌及其应用。

背景技术

天然水体中，氮以-3至+5九种不同价态形式存在，在生物及非生物因素的共同作用下，它们在水体内不断地迁移转化，构成一个复杂的动态循环。其中氨氮、亚硝酸盐等可以导致对湖泊、河流、近海海洋等的酸化和富营养化，同时作为具有潜在毒性的无机氮化合物，也对养殖生物具有毒害作用。如何经济、高效地去除水体中的氮素污染，已成为水污染控制领域的重点研究内容。

目前应用于水体脱氮的方法主要包括物理法、化学法及生物脱氮法。其中，物理、化学法操作复杂，需要增加设备投资额，运行成本高。同时该方法对有机物去除效率低，会造成二次污染，因此在实际运用中存在一定的局限性。近年来，人们开始尝试利用微生物、植物或其他生物自身具有的功能消除或改变污染物存在形态，达到降低污染物毒性的目的。与物理、化学脱氮相比，生物脱氮在系统内仅靠生物自身的能量循环和物质循环起作用，不引入其他外来物质。由于生物脱氮技术具有成本低、易操作、无二次污染、脱氮彻底等优点，逐渐应用于工业废水脱氮处理。

参与生物脱氮的微生物主要包括硝化细菌和反硝化细菌。传统理论认为，细菌的反硝化作用是一个严格的厌氧过程，反硝化细菌会优先利用氧气作为最终电子受体。好氧反硝化细菌的发现，突破了传统的认识，同时也为人们研究新的生物脱氮技术提供了新的思路。好氧反硝化，是指在有氧条件下能以NO₃ ^--N、NO₂ ^--N作为最终电子受体，进行反硝化过程。目前已发现的好氧反硝化菌主要集中在假单胞菌属(Pseudomonas)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、副球菌属(Paracoccus)和芽孢杆菌属(Bacillus)。尽管国内外对于好氧反硝化菌的分离、筛选以及机理研究较多，但优良菌种较少，仍无法满足目前工业生产的需求。分离筛选高效好氧反硝化细菌，并对其好氧反硝化特性进行研究，对含氮废水的生物脱氮具有重要的理论价值和实际意义。

中国专利CN 201410138167.4公开一株具有好氧反硝化能力的海洋盐单胞菌菌株HGMN521及其应用。具体涉及一种具有好氧反硝化能力的海洋盐单胞菌菌株HGMN521，该菌株的保藏名称：盐单胞菌HGMN521，分类命名：Halomonas sp.HGMN521，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2009年8月28日，保藏号：CCTCC NO：M209187，保藏地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心；还公开了该菌株HGMN521在处理受无机氮污染海水中的应用。该菌株在好氧条件下具有高效反硝化能力，能快速有效的去除受无机氮污染海水中的亚硝酸盐氮(NO₂ ^--N)及硝酸盐氮(NO₃ ^--N)，且对海水养殖生物没有毒害致病作用，具有安全、环保、高效的特点。

中国专利CN 20120458579公开一株具有异养硝化好氧反硝化功能的盐田盐单胞菌及其应用。该发明的盐田盐单胞菌BMEN3(Halomonas campisalis BMEN3)，具有异养硝化好氧反硝化功能，其保藏编号为：CGMCC NO.6536。该发明筛选出的菌株Halomonascampisalis BMEN3在高盐高碱条件下仍具有异养硝化和好氧反硝化能力，而且菌株能在有氧异养条件下生长，这大大提高了菌体的生长速率，提高挂膜速度，缩短反应器启动时间，提高了脱硝效率。

发明内容

本发明的目的在于提供一株具有脱氮能力的盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1，该菌株在好氧条件下，能快速高效去除硝酸盐和亚硝酸盐，且对亚硝酸盐具有很强的耐受性和去除能力。

本发明的第二个目的在于提供所述盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1在含氮废水生物脱氮以及在水产养殖亚硝酸盐去除中的应用。

所述盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1，已于2015年04月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学；保藏编号为CCTCC NO:M 2015266。

所述盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1是从污水处理厂初沉池污泥中定向富集分离获得。所述盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1也保藏于中国海洋微生物菌种保藏管理中心(MCCC)，保藏编号为：MCCC 1A10904。

所述盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1具有以下特征：

1、形态特征：盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1，革兰氏阴性，在Marine Agar固体培养基上28℃培养24h，菌落呈米白色、表面光滑、微凸起、边缘规则、不透明，菌落直径大小约为0.5～1mm。

2、生理生化特征：菌株生长盐度为0～6％，7％以上不生长，最适为1～3％；生长pH为6.5～10.5，最适为7.5～9.5。生长温度为10～45℃，最适为30～40℃。氧化酶(+)，接触酶(-)，硝酸盐还原(+)，吲哚试验(-)，能发酵D-葡萄糖产酸，明胶液化(-)，尿素酶(+)，β-葡萄糖苷酶(-)，β-半乳糖苷酶(-)，能利用D-葡萄糖、D-甘露醇、N-乙酰-葡萄糖胺、麦芽糖、葡萄糖酸盐、苹果酸、柠檬酸、苯乙酸，不能利用癸酸、己二酸、、L-阿拉伯糖、D-甘露糖。

API ZYM结果显示，盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1具有碱性磷酸酶、酯酶、类脂酯酶、亮氨酸氨肽酶、缬氨酸氨肽酶、酸性磷酸酶、β-葡(萄)糖苷酶，不具有胱氨酸氨肽酶、胰蛋白酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-胰凝乳蛋白酶、β-葡(萄)糖苷酸酶、α-葡(萄)糖苷酶、N-乙酰-葡萄糖胺酶、α-甘露糖苷酶、α-岩藻糖苷酶等酶活性。

3、16S rRNA基因序列分析：按照常规方法抽提盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1的基因组DNA，并对16S rRNA基因序列进行测定，盐单胞菌CYQ1-6-1的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。

经BLAST比对分析，盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1的16S rRNA基因与Halomonas daqingensis DQD2-30(T)EF121854相似性最高，分别为98.99％，其次为H.kenyensis AIR-2(T)AY962237和H.desiderata FB2(T)X92417，分别为98.39％和98.38％。

综合菌株的形态特征、生理生化特性以及16S rDNA基因序列分析结果，本发明的盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1属于盐单胞菌属，为该属的一个潜在新种，具体为盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1。

本发明的盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1能快速高效去除水体中的硝酸盐和亚硝酸盐，且对高浓度亚硝酸盐具有很强的耐受性及去除能力。

所述脱氮作用在含氮模拟废水中进行，所述含氮模拟废水溶解氧浓度为0～7ppm。

所述含氮模拟废水的碳源为甲酸钠、葡萄糖、柠檬酸钠、乙酸钠、酒石酸钾钠及琥珀酸钠，优选碳源为柠檬酸钠。

所述含氮模拟废水的C/N为3～24，优选C/N为6～24。

所述含氮模拟废水的pH值为5.5～10.5，优选pH值为7.5～9.5。

所述含氮模拟废水的盐度为0～60g/L，优选为10～30g/L。

所述含氮模拟废水的温度为15～45℃，优选为30～45℃。

在优选条件下，盐单胞菌为(Halomonas sp.)CYQ1-6-1分别能在12h、16h和16h内将模拟废水中的100mg/L NO₃ ^—N、NH₄ ⁺-N和NO₂ ^--N完全去除，分别在36h、48h、60h和72h将500mg/L、600mg/L、700mg/L和1000mg/L NO₂ ^--N完全脱除，具有高效脱氮能力。

由此可见，盐单胞菌为(Halomonas sp.)CYQ1-6-1在处理高浓度亚硝酸盐废水、含氮废水生物脱氮、水产养殖亚硝酸盐去除等中应用。

所述含氮废水包括但不限于硝酸盐废水、亚硝酸盐废水、氨氮废水等。

所述盐单胞菌为(Halomonas sp.)CYQ1-6-1能够耐受亚硝酸盐氮达4000mg/L。

本发明与现有技术相比有如下突出效果：

1.本发明的盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1以铵盐、硝酸盐或亚硝酸盐为唯一氮源均能正常生长及脱氮，可适用于各种含氮废水的生物脱氮处理，是一株新发现的具有高效脱氮性能的好氧反硝化菌株。该菌在有氧、无氧情况下均可进行无机氮素的去除，突破了传统反硝化菌受氧气抑制的限制。

2.本发明的盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1能利用低浓度碳源(C/N＝3)进行反硝化，脱氮效率高，在实际废水脱氮中可以节省碳源使用，该特性大大增加了盐单胞菌为(Halomonassp.)CYQ1-6-1的实用性能。

3.本发明的盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1对高浓度的亚硝酸盐耐受性强，脱氮效率高，能在72h内将1000mg/L NO₂ ^--N完全去除。

附图说明

图1为不同碳源对盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1去除硝酸盐的影响(右侧纵坐标对应NO₂ ^--N的含量及菌体浓度OD₆₀₀两个值)。

图2为不同C/N对盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1去除硝酸盐的影响(右侧纵坐标对应NO₂ ^--N的含量及菌体浓度OD₆₀₀两个值)。

图3为不同pH对盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1去除硝酸盐的影响(右侧纵坐标对应NO₂ ^--N的含量及菌体浓度OD₆₀₀两个值)。

图4为不同盐度对盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1去除硝酸盐的影响(右侧纵坐标对应NO₂ ^--N的含量及菌体浓度OD₆₀₀两个值)。

图5为不同温度对盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1去除硝酸盐的影响(右侧纵坐标对应NO₂ ^--N的含量及菌体浓度OD₆₀₀两个值)。

图6为盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1在最适条件下对模拟废水中硝酸盐的去除效果(右侧纵坐标对应NO₂ ^--N的含量及菌体浓度OD₆₀₀两个值)。

图7为盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1在最适条件下对模拟废水中亚硝酸盐的去除效果。

图8为盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1对含高浓度亚硝酸盐的模拟废水的脱氮效果(以500、600、700、1000mg/l NO₂ ^--N)。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步的说明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下述的实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1的富集、分离和鉴定

1菌株的富集和分离：取厦门前埔污水处理厂初沉池污泥样品10g，加入90ml富集培养基(乙酸钠1g/L，柠檬酸钠2.5g/L，NaCl 20g/L，KH₂PO₄2g/L，Na₂HPO₄3g/L，MgSO₄·7H₂O0.05g/L、FeSO₄·7H₂O 0.02g/L、CaCl₂0.02g/L，蒸馏水1000mL，pH 7.6～8.2，121℃灭菌20min)，以0.5g/L NO₂ ^--N作为唯一氮源，28℃，160rpm/min震荡培养，进行好氧反硝化细菌的第一次富集。15天后，从初次富集培养液中取10mL样品液，转接到新鲜富集培养液中，以1.0g/L NO₂ ^--N作为唯一氮源，28℃，160rpm/min震荡培养，进行第二次富集。15d后，从二次富集培养液中取10mL样品液，转接到新鲜的富集培养液中，添加1.5g/L NO₂ ^--N作为唯一氮源，28℃，160r/min震荡培养，进行第三次富集。完成三次富集培养后，采用梯度稀释涂布平板法，分别用Marine Agar固体培养基涂板分离纯化得到盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1的单菌。该菌也保藏在中国海洋微生物菌种保藏管理中心(MCCC)，保藏编号为：MCCC 1A10904。

2菌株的生理生化特征和分子鉴定

形态特征：盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1，革兰氏阴性，在Marine Agar固体培养基上28℃培养24h，菌落呈米白色、表面光滑、微凸起、边缘规则、不透明，菌落直径大小约为0.5～1mm。

生理生化特征：菌株生长盐度范围为0～6％，7％以上不生长，最适为1％～3％；生长pH为6.5～10.5，最适为7.5～9.5。生长温度为10～45℃，最适为30～45℃。氧化酶(+)，接触酶(-)，硝酸盐还原(+)，吲哚试验(-)，能发酵D-葡萄糖产酸，明胶液化(-)，尿素酶(+)，β-葡萄糖苷酶(-)，β-半乳糖苷酶(-)，能利用D-葡萄糖、D-甘露醇、N-乙酰-葡萄糖胺、麦芽糖、葡萄糖酸盐、苹果酸、柠檬酸、苯乙酸，不能利用癸酸、己二酸、L-阿拉伯糖、D-甘露糖。

分子鉴定：按照常规方法抽提盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1的基因组DNA，并对16S rRNA基因序列进行测定。经BLAST比对分析，盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1的16S rRNA基因与Halomonas daqingensis DQD2-30(T)EF121854相似性最高，为98.99％，其次为H.kenyensis AIR-2(T)AY962237和H.desiderata FB2(T)X92417，分别为98.39％和98.38％。

综合菌株的形态特征、生理生化特性以及16S rRNA基因序列分析结果，本发明的盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1属于盐单胞菌属，为该属的一个潜在新种，具体为盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1。盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1在模拟废水中脱氮条件优化

从MA平板上刮取新鲜的菌体，用无菌海水重悬，菌种浓度调至10⁹cfu/mL，按照0.2％的接种量接种到含有一定浓度的NO₃ ^--N或者NO₂ ^--N的模拟废水中，测定菌株在不同碳源，pH值，温度，盐度，C/N比时的脱氮情况，进行反硝化条件的优化。

模拟废水：KH₂PO₄2g/L，Na₂HPO₄3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.05g/L、FeSO₄·7H₂O 0.02g/L、CaCL₂0.02g/L，蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min。

实验测定方法：硝酸盐氮测定采用GB T12763锌镉还原法测定；亚硝酸盐氮测定采用GB 7493-87一盐酸萘乙二胺分光光度法。

1.不同碳源对盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1反硝化性能的影响：以100mg/LNO₃ ^--N为唯一氮源，分别以甲酸钠、葡萄糖、柠檬酸钠、乙酸钠、酒石酸钾钠、琥珀酸钠作为唯一碳源，在C/N＝15，pH＝7.6，盐度2％，28℃，160r/min条件下震荡培养16h，测定菌浊度(OD₆₀₀)及硝酸盐及亚硝酸盐含量。实验结果如图1所示，盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1在以琥珀酸钠为唯一碳源时，生长好且脱氮效率最高，能在24h内能将100mg/L NO₃ ^--N完全去除且无亚硝酸盐积累。

2.不同C/N比对盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1反硝化性能的影响：以100mg/L NO₃ ^--N为唯一氮源，琥珀酸钠为碳源，pH＝7.6，盐度2％，设置不同C/N比(3、6、9、12、15、18、21、24)，28℃，160r/min震荡培养24h，测定菌浊度(OD₆₀₀)及硝酸盐和亚硝酸盐含量。结果见图2，结果表明盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1在C/N为3～24时均能生长，且在24h内盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1能将100mg/L NO₃ ^--N去除完全，说明菌株在C/N比较低时就表现出高的脱氮效率，在实际废水脱氮处理中可以减少碳源投加。

3.不同pH值对盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1反硝化性能的影响：以100mg/LNO₃ ^--N为唯一氮源，琥珀酸钠为碳源，C/N＝12，盐度2％，设置不同的pH值(5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5)，28℃，160r/min震荡培养24h，测定菌浊度(OD₆₀₀)及硝酸盐和亚硝酸盐含量。结果见图3，结果表明盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1适合在偏碱条件下(pH＝7.5～9.5)进行脱氮，此时盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1对硝酸盐的去除率均达到100％，无亚硝酸盐残留。

4.不同盐度对盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1反硝化性能的影响：以100mg/LNO₃ ^--N为唯一氮源，琥珀酸钠为碳源，C/N＝12，pH＝7.8，设置不同盐度(0、10、20、30、40、50、60g/L)，28℃，160r/min震荡培养24h，测定菌浊度(OD₆₀₀)及硝酸盐和亚硝酸盐含量。结果见图4，结果表明盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1最适的脱氮盐度为1～3％，菌体生长快且脱氮效果高，24h内脱氮效率均达到100％，并且无亚硝酸盐累积。

5.不同温度对盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1反硝化性能的影响：以100mg/LNO₃ ^--N为唯一氮源，琥珀酸钠为碳源，C/N＝12，pH＝7.8，盐度为3％，设置不同温度(15℃、25℃、35℃、40℃、45℃)，160r/min震荡培养24h，测定菌浊度(OD₆₀₀)及硝酸盐和亚硝酸盐含量。结果见图5，结果表明30-45℃时，盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1生长快，硝酸盐去除效率达到100％且无亚硝酸积累。

实施例3最优条件下盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1在模拟废水中的脱氮效果

挑取盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1的单菌落划线至Marine Agar固体平板上，28℃培养24h后取出，刮取新鲜菌体，用无氮培养基制成菌悬液,菌种浓度调至10⁹cfu/mL，按照0.2％的接种量分别接种到以100mg/L NO₃ ^--N或NO₂ ^--N为唯一氮源的模拟废水中(琥珀酸钠3.37g/L，NaCl 20g/L，KH₂PO₄2g/L，Na₂HPO₄3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.05g/L、FeSO₄·7H₂O 0.02g/L、CaCl₂0.02g/L，蒸馏水1000mL，pH 7.6，121℃灭菌20min)，于30℃，160r/min摇床中培养，每隔4h取样检测废水中亚硝酸盐和硝酸盐的浓度、菌体浓度OD₆₀₀。结果见图6-7，结果表明盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1在该最优条件下，分别在12h和16h时可将废水中的硝酸盐和亚硝酸盐完全脱除，脱氮速率分别为8.33mg-N/L·h和6.25mg-N/L·h。此外，在以100mg/L NH₄ ⁺-N为唯一氮源时，菌株CYQ1-6-1能在16h脱氮完全，脱氮速率为6.25mg-N/L·h。

实施例4盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1对含高浓度亚硝酸盐的模拟废水的脱氮效果

培养方法同实施例3。在以500mg/L、600mg/L、700mg/L、1000mg/L NO₂ ^--N为唯一氮源的模拟废水中，对盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1生长情况及脱氮性能进行测定。结果见图8，结果表明盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1对高浓度亚硝酸盐具有很好的耐受性和去除能力，分别能在36h、48h、60h和72h内将模拟废水中的500mg/L、600mg/L、700mg/L和1000mg/L亚硝酸盐完全脱除，脱氮速率分别为：13.89mg-N/L·h、12.5mg-N/L·h、10mg-N/L·h、13.89mg-N/L·h。此外，菌株CYQ1-6-1可耐受高达4g/LNO₂ ^--N，在72h内对4g/L的NO₂ ^--N去除率可达50％。

Claims

1.盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1，其特征在于已于2015年04月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2015266。

2.如权利要求1所述盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1在含氮废水生物脱氮中应用。

3.如权利要求2所述应用，其特征在于所述含氮废水为硝酸盐废水、亚硝酸盐废水、氨氮废水。

4.如权利要求1所述盐单胞菌(Halomonas sp.)CYQ1-6-1在水产养殖亚硝酸盐去除中应用。