CN104919054A

CN104919054A - 获得并检测待鉴定对象之标志物的方法、相关标志物、认证方法以及验证方法

Info

Publication number: CN104919054A
Application number: CN201280076183.4A
Authority: CN
Inventors: 胡安·卡洛斯·海梅; 鲁本·西莫内塔; 毛里西奥·纳兰霍; 若阿金·洛佩兹
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-07-31
Filing date: 2012-07-31
Publication date: 2015-09-16
Also published as: BR112015002287A2; WO2014019099A1; US20150240297A1; EP2894228A1; IL237024A0; CA2880678A1; EP2894228A4

Abstract

本发明涉及用于获得待鉴定对象之标志物的方法，所述标志物包含至少一个DNA片段并优选包含多个多态性DNA片段，例如微卫星和单碱基多态性，对其三维结构进行修饰，使其吸附到金属纳米颗粒上并进行微囊化，其在拉曼辐射下有活性。本发明还涉及所述标志物，涉及用于检测所述标志物的方法，涉及用于即时认证用所获得标志物标记之对象的方法，涉及用于验证用所获得标志物标记之对象的方法以及涉及用于将标志物添加至待鉴定之对象的方法。

Description

获得并检测待鉴定对象之标志物的方法、相关标志物、认证方法以及验证方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别地涉及分子生物学并且涉及获得标志物的方法，所述标志物用于鉴定包含至少一个DNA片段且优选多个多态性DNA片段(例如微卫星(STR)或单核苷酸多态性(SNP))的对象以用于司法目的等用途，对它们的三维结构进行修饰，吸附至对拉曼辐射有活性的金属纳米颗粒并进行微囊化。一种通过分子生物学技术进行检测/即时认证(autenticación instantánea)和后续鉴定的方法，其总体上涉及包括十个级别(niveles)的安全系统。

本文还保护所获得遗传标志物的检测方法，对用所述方法标记的对象进行即时认证的方法；以及验证(verificar)标记的对象的方法和将标志物并入到待鉴定对象的方法。

提及的组成(componente)可选自多种等同物，而不会偏离本文中阐述的本发明原理。

背景技术

长久以来一直试图找到可为日常交易提供更高安全性的新的要素、用品(disposiciones)和机制。

自古以来，人类已经尝试使用经改良为并入导致难以复制之要素的文件来防止盗窃、欺骗和伪造。用获自不同模具的特殊图形进行密封实现了早期的期望，但印刷方法很快就发生了改变。已经克服了并入新的技术进步的安全特征并出现的质量仪器。

当从银行支票擦去数值并重新填写更高的数值时，这对抗(opuesto)了纸的标记。

一般而言，伪造的纸币和文件已导致采用特殊的纸张和墨(tinta)(光学墨)，在纸张基体、半透明的保护膜等中并入安全要素。

本发明人意识到对每个人而言特定的要素。指纹是这种情况，而DNA也是这种情况。

事实上，每个个体均具有生物学痕迹，这是独特的并且当前的技术可以绝对确定性对其进行鉴定。

虽然这是正确的，但是本发明人清楚地知晓，为准确阳性鉴定向对象并入生物完整的DNA分子将很容易被伪造者利用；因为这将足够接近这样DNA的拥有者并从其获得生物样品。

事实上，头发、沉积在玻璃上的唾液、一滴血液甚至是一点皮肤将足以获得添加到伪造对象所需的DNA；然后，它将明显地看起来是真的。

发明人在文件200020102319 AR中已经预见到了这点，其导致US10/307012和EP 33801366的出现；它们被认为是本文件主题的最接近现有技术。

事实上，考虑到所述可能性，本发明人在上述文件中已公开了待鉴定对象应标记有至少一个特定的多态性DNA片段。

对于伪造者而言，仅使用一个多态性DNA片段不足以获得完整的DNA，因为他必须知道哪个是所使用DNA的选定片段(或片段的组合)。然而，这有数十亿种可能的组合，伪造者几乎不可能偶然地使用到用户选择的组合，因而得到了一种高效遗传标志物。

虽然所引用文件涵盖的标志物是高效的，但是本发明人发现计算机的处理能力允许每秒数百万次的操作，这增加了伪造者的机会。

如在引用文件中所公开的，本发明人知晓检测用作对象之标志物的DNA片段需要并不是在所有实验室均可得的高技术基础设施；所以对多态性DNA片段之检测方法的简化会扩展这种类型标志物的使用。此外，任何分子学科学家都应认识到，尽管想要进行伪造的实验室可能对于这些技术而言非常专业，但是除非预先知晓精确的核苷酸序列，否则无法复制本文中详述的这样的多态性片段(STR/SNP)；因为实验室检测所需的试剂(引物)是基于该知识而制备的。

鉴于对所公开内容这样的观察结果，本发明人已经确定本发明的一个目的是获得由存在于自然界的任何生物之多态性DNA片段形成的标志物。

这意味着，可以从人类以及动物、植物、微生物或病毒获得待使用的片段。

为获得本文件中所公开的标志物，使用从所有这些物种获得的不同多态性DNA片段的组合是很方便的。

为了通过拉曼光谱进行即时检测并且也为了提高标志物的复杂度(这有助于避免伪造)，本发明人已对此类多态性片段的三维结构进行了几何修饰，然后使其吸附到纳米金属颗粒上。

这种更高的复杂度防止伪造者披露标志物的结构，尤其是当其与所用的STR和SNP的相对浓度和绝对浓度整合在一起时。

本发明的第二目的是获得允许对标记的对象实时进行检测和即时认证的方法和装置。

本发明的第三目的是获得包括多个安全级别的方法；伪造者需跨过这些安全级别从而复制这样的遗传标志物。

脱氧核糖核酸(DNA)是存储特定个体遗传信息的大分子。

DNA的三维几何结构是双螺旋，可以观察到大沟和小沟。前者深且宽，而后者浅且窄。

本发明人知晓有分子(例如蛋白质)，通过称为氢键的特异性结合和称为范德华(Van der Waals)相互作用的非特异性结合以及其它静电相互作用与DNA沟的内部相结合。

在蛋白质的情况下，它们识别氢键和甲基(疏水的)的供体和接纳体，这些后者专用于大沟。

如图1所示，在大沟中有四种可能的识别模式，而在小沟中仅有两种。

我们知晓一些分子通过大沟与DNA结合，而另一些分子在小沟结合，然而另一些连接到大沟和小沟两者。

在该第三情况下，所述事件致使DNA分子去稳定。

同一物种的所有生物共有许多相同的DNA片段但也有不同的其他部分。这些不同的部分被称为“多态性片段(fragmentos polimórficos)”，其被定义为存在于特定染色体基因座中具有不同的核苷酸序列或具有可变数目的串联重复的两种或更多种形式(等位基因)。

多态性片段有数百万，从而使得存在于自然界的每个生物都是独特的。

这些多态性DNA位点可能最终被用于司法鉴定目的。

一些多态性DNA片段表现出串联长度的变化，例如小卫星(VNTR)和微卫星(STR)，这取决于存在于重复核心序列中的核苷酸数目；然而另一些则表现出序列组成的变化，例如单核苷酸(SNP)的不同。

任何多态性DNA片段都有两个等位基因变体，每个从一个亲本继承而来。

对于STR，等位基因变体以平均数字范围7至15存在；然而SNP在每个基因座只有两个等位基因变体。

然而，即使区分度低于STR，但SNP具有在基因组中以数百万的量存在的巨大优势；它们负责生物的表型特征以及其他功能。

总之，每一个生物都是独特的，因而与这个星球上任何其他的生物不同。在自然界中这种多样性取决于DNA的多态性位点，例如微卫星(STR)和单碱基多态性(SNP)。

在提到的文件和本文中使用了STR和SNP；首先是因为通过PCR扩增方法进行分析和检测的可行性，其次是因为在自然界存在的所有生物中有数百万可供选择。

已经陈述了本发明的一个目的是多态性片段的即时检测，为此本发明人使用拉曼光谱技术并且优选提供了最灵敏方法之一的SERS拉曼(表面增强拉曼光谱)，用定量和无损的材料分析定性分析。该应用是指通过SERS拉曼检测，0.9nM(纳摩尔)STR/SNP，最小检测体积100-150飞升的溶液，其含有至少60个分子的STR。

拉曼光谱类似于红外光谱且由对应于所分析样品之特定分子振动的带的波长分布组成。

因此，当分析发射拉曼光谱时，观察到的对应于波长的峰是每种分析物的分子化学结构和组成的表征；同时样品中由分子散射的拉曼光的强度取决于其浓度。

在实践中，拉曼分光镜包括光源，通常被聚焦在样品上产生非弹性散射辐射的激光(其被光学收集并引导到选择波长的分光光度计)，其中检测器将打印光子的能量转换成电信号强度。利用SERS技术，拉曼信号可以增加10⁶-10¹⁴倍，使得其有可能实现允许进行单分子检测的灵敏度。

对于最大的灵敏度，在选自金、银、铂和铜中至少一种金属的纳米颗粒中引起多态性STR片段和/或SNP的吸附，其中所述纳米颗粒尺寸在5至200nm的范围内变化。实现了这样的灵敏度增加是因为形成10纳米数量级的粗糙表面的金属颗粒，其与入射辐射的波长相比较小。小的颗粒尺寸(最好在50至100nm)使得能够激发金属并提高检测其表面吸附的DNA的灵敏度。

我们进行了几个文件的证明以确定文件号CN1302905涉及含有金属离子DNA的防伪造材料，其是通过混合具有高配位力的可溶性金属盐的水溶液以及DNA和醇的溶液而制备的，以获得添加有用于标记或印刷墨之明胶、糊精、可溶性淀粉的水溶液或树胶的M-DNA倾析水溶物。

文件No.US2008/0189066涉及用于认证已经标记有不同的片段SNP或STR的对象之拉曼分光镜的使用和修改。

对于上面提到的文件，应注意的是未加修改而获得了检测的片段；也就是说，选择是天然存在的。

文件No.US20030235836涉及多态性STR片段或微囊化SNP的用途，其用于标记在实验室中通过分子生物学技术检测的对象。

US专利20080189066涉及一种使用拉曼光谱用于认证的方法和装置，所述方法和装置用来认证具有安全标记的物品，所述标记含有使用拉曼分光镜以防止欺诈的DNA片段。检测拉曼光谱的峰以生成作为安全标记的数据拉曼峰。将数据安全性的拉曼峰与拉曼峰的文库进行比较以确定是否存在匹配。

这些技术使得即时鉴定可能被称为间接的，因为它是通过检测在传输介质中并入的多种化学物质而产生的。

至于在文件中对拉曼光谱的修改，未经任何修改而获得了所提及的多态性片段。

发明内容

所公开的发明是用于获得并检测待鉴定对象中遗传标志物的方法，用于所标记对象之即时认证的方法以及所述对象和所述标志物的验证方法。

本发明包括待检测对象的标志物，其公开了添加至少一个多态性DNA片段且优选并入多个DNA片段多态性微卫星类型(STR)和单碱基多态性(SNP)，在三维分子结构上进行修饰，吸收至待鉴定对象的纳米颗粒，用于通过分子生物学技术进行后续检测或即时认证和鉴定。

本发明还包括用于获得所述标志物的方法，其包括第一步骤：选择至少一个生物，从任何其细胞进行DNA提取；第二步骤：纯化所获得的DNA；第三步骤：扩增多态性微卫星片段和/或单碱基多态性；第四步骤：确定所选择的至少一个生物体的等位基因变体；第五步骤：修饰DNA多态性片段的几何结构；第六步骤：DNA的浓缩和微囊化；第七步骤：增溶(solubilización)含有DNA的微囊；第八步骤：确定和/或校正溶液的流动度(grado de fiuidez)和浓度以及第九步骤：通过合适的施用器将溶液并至期望的对象。

本发明还包括用于通过拉曼SERS技术即时检测遗传标志物的方法。

本发明还包括这样的方法，其包括通过比较所得到的光谱与存储在数据库中的光谱进行即时确认(validación)或认证的第一步骤，以及使用合适的引物对来扩增所采用的STR或SNP片段并确定它们的等位基因变体以鉴定分子生物学实验室中使用的多态性片段的第二步骤。

附图说明

图1给出了DNA三维结构的不同形式的概述。

图2对应于纳米标签DNA的概览。示出了与DNA键合的金属颗粒，形成通过拉曼SERS可对其进行检测的真正分子网络。

图3对应于DNA与形成具有特定拉曼光谱之三维结构的树状聚体结合的示意图。

图4对应于与形成具有特定拉曼光谱之三维结构的DNA分子结合的适配体(肽或寡核苷酸)的示意图。

图5对应于表示影响DNA的三维结构并引起拉曼光谱变化的DNA嵌入剂(例如溴化乙锭)。

图6对应于用嵌入剂溴化乙锭处理DNA的拉曼光谱。

图7是与DNA双螺旋的大沟和小沟结合的多种蛋白质的示意图，这破坏其三维结构并产生特定拉曼光谱。

图8对应于产生使拉曼光谱在1300-1400cm^-1之间变化之聚集体的二价金属-DNA复合物。

图9对应于发射拉曼光谱，其示出了对应于波长的峰，所述峰表征每种分析物的分子化学结构和组成，同时样品中由分子散射的拉曼光的强度取决于其浓度。

图10对应于使用种间DNA作为标签防伪的图。

图11对应于使用个人DNA作为标签DNA防伪的图。

图12对应于使用表型SNP来认证护照的图。

图13A，从人唾液提取的DNA样品并扩增了列出的6个SNP基因。

图13B，示出了用于根据这6个SNP的基因型变体确定假定的蓝色、棕色眼睛的可能方案。

图14表示在纸币中使用具有多态性DNA的微球作为标签防伪。

发明详述

在确定了本发明的组成并开发出步骤顺序以解释其性质之后，接下来对它们的功能和其操作关系以及它们所提供的结果进行描述。

为了获得构成保护贵重物品之安全方式的待鉴定对象的标志物，并即时检测，本发明提出了可用作标志物的化合物以及将该所获得的标志物并入到对象的方法，使得能够进行对象的鉴定和确认。

优选地，本发明人发现该标志物应该是可在随后检测到的化合物，但仅仅由知晓它们的结构并使用拉曼分光镜的人检测到，或者在忽视结构的情况下，由那些使用与其中多态性片段存储并加密的数据库结构相关联的拉曼分光镜的人检测到。

在所有可使用的并根据本文件中公开说明的化合物中，本发明人优选使用脱氧核糖核酸(DNA)作为标志物来鉴定对象。

优选地，所述用于鉴定对象的标志物由至少一个多态性DNA片段组成。

关于并入包含至少一个多态性DNA片段的标志物来鉴定对象的方法，本发明包括多个步骤，其中在第一步骤中选择至少一个生物进行DNA提取，其以后将进一步使用。

本发明人提倡将生物中至少一个多态性DNA片段用作标志物应在广义上去解读。这意味着，决策者执行标记对象，可选择自身作为DNA片段的供体，或者可选择任何生物，无论是动物还是植物均可；因此，这将进一步降低伪造标志物的可能性。

从通过常规技术(例如口腔拭子、血液穿刺、上皮收集样品、毛囊等)获得的细胞或体液进行DNA的提取。

在第二步骤中，在含10mM Tris-HCl、0.1mM EDTA、20％SDS(重量/体积)和蛋白酶K 10mg/mL的溶液中，DNA从有核细胞释放，然后用苯酚/氯仿10∶9(体积/体积)进行纯化。

在第三步骤中，如美国专利No.4683195、4683202和4800159中推荐，通过聚合酶链式反应扩增STR和/或SNP。将混合物放置在含有6至0.05pgr浓度的DNA样品、10×PCR缓冲溶液、10×dNTP、10×寡核苷酸侧翼多态性区和5,000单位每ml的Taq聚合酶的循环变温器中。

在第四步骤中，在自动的DNA测序仪ABI PRISM 310(AppliedBiosystem)或更高级的仪器中对所选多态性片段的等位基因变体进行分型。

在第五步骤中，DNA分子具有独特的拉曼光谱，由于它们是由同样的四种核苷酸构成，我们对其三维结构或多态性片段STR或SNP进行修饰。然后吸附至选自金、银、铂和铜的至少一种金属的纳米颗粒；而它们是根据Lee和Meisel的方法(J.PHYS CHEM 86：3391-3395，1982)从其阳离子还原而形成：金属纳米颗粒具有5至200nm的尺寸。

DNA的三维结构可从自然界中已知的三个基础结构A-DNA、B-DNA和Z-DNA及其他可能的构象(例如C-DNA、D-DNA、E-DNA、L-DNA、P-DNA、S-DNA等，以及H-DNA三链、G4-DNA或四倍体DNA)进行修饰。值得注意的是，许多DNA构象是由于DNA序列上具有的GC量，这种特征在此开发中被充分利用，产生了对多态性片段独特和特定的光谱拉曼信号；从而增加了鉴定多态性STR或SNP片段和防止由可能的伪造者对其复制的额外级别。

本发明人知晓，有许多种方式来修饰DNA的三维结构，因而使用下列方法之一实施所述方法：

a)具有吸附DNA的金属纳米颗粒被作为标志物并入，可使拉曼SERS信号增强10⁶和10¹⁴倍，并且可单独地或以与DNA分子一起产生例如二聚体、三聚体、四聚体等之聚集体的胶体形式添加。当将至少一个连接基团(例如选自苯乙炔、聚四氟乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺等的聚合物)添加至金属纳米颗粒时，甚至增强了该性质；如图2所示。

连接基团也可选自其他类型的分子，例如与DNA分子结合的硅烷、烷或其衍生物，以形成检测为独特拉曼光谱信号的如同真正的分子网络的特定聚集体。

b)也可用DNA-树状聚体复合物(例如PAMAM树状聚体或类似物)来对结构进行修饰，对形成导致如由Caminade AM在“Characterizationof dendrimers”Advanced Drug Delivery Reviews，57，2130-2146，2005中所述之独特拉曼光谱的三维结构特征分型，如图3所示。

c)实现3D修饰的另一种方式是通过使多态性DNA片段与合成的DNA PNA(肽核酸)共价结合。事实上，PNA这样的一类聚酰胺，其类似于具有腺嘌呤、鸟嘌呤、硫胺素和胞嘧啶之单体单元的DNA类似物，其中对应于寡核苷酸的糖键被酰胺键所取代。PNA化合物是由Nielsen(Science，254：1497-15，1991)发现的，可从例如PE Biosystems(FosterCity，California)公司获得；如图4所示。

d)可使用的另一个连接基团，由“适配体”与多态性片段的联合组成，其为通过体外选择的重复循环产生的一类DNA。该方法称为SELEX(通过指数富集的配体系统进化)包括产生将潜在适配体(配体DNA)暴露于多态性STR或SNP片段的重复循环，使得发生结合，然后，从配体分离DNA并使其简化以重复结合过程。在多次循环后，适配体显示出高亲和力和特异性，并且保留针对用作靶标之多态性片段的DNA。由于适配体由寡核苷酸构成，它们可很容易地并入到STR或SNP片段中；如图5所示。

对于这种情况，制备适配体的方法在美国专利5.270163、US.5.567588、US.5.670637和US.5.843653中是公知的。

e)沿DNA分子的碱基之间置入嵌入剂以使得这种嵌入剂影响DNA的结构，从而在嵌入部位产生双螺旋的扭矩变化；大多数嵌入剂导致了GC序列。

例如，我们可列举以下由James M.Benevides在″Mechanisms ofdrugs-DNA recognition distinguished by Raman spectroscopy″Journal ofRaman Spectroscopy.第39卷.第1627-1624页中充分描述的嵌入剂：溴化乙锭、阿霉素、9-氨基吖啶(9AA)和原黄素(PF)(3，6-二氨基吖啶)以及其他；如图6所示。

f)使得蛋白质与DNA的大沟和小沟连接的另一个联合基团，主要使用与两个沟都相互作用的药物；因此，当发生沉淀或聚集时，DNA的三维结构会有改变。这类药物的一些实例是与大沟相互作用的精胺和与小沟相互作用的亚精胺、腐胺、Hoechst 33258、纺锤菌素、戊烷脒等。

可在“NBD Atlax NMR drug index-DNA complexes”中看到与DNA的大沟和小沟相互作用的每种药物的详细说明。这些药物与DNA的大沟和小沟的相互作用与AT的量直接相关，因此可通过用于标记对象之多态性片段的特征光谱来获得每个SNP或STR片段的序列；如图7中所描述的。

g)DNA-金属二价复合物，例如Sr⁺²、Ba⁺²、Mg⁺²、Ca⁺²，Mn⁺²、Co⁺²、Ni⁺²和Cd⁺²的存在形成了产生在1300-1400cm^-1之间变化的聚集体；因为它们与磷酸盐和/或与含氮碱基反应，通过破坏氢键而使双螺旋去稳定，如JG Duguid在工作"Raman Spectroscopy of DNA-MetalComplexes″(Biophisical Journal第69卷.1995年.第2623至2641页)中所描述的，如图8所示。

在第六步骤中，我们使用Centriconl00型微浓缩器通过超速离心进行浓缩；随后，为了避免降解，通过相转化技术对多态性片段进行微囊化。将微囊化的多态性DNA溶解在溶剂中，然后在相同溶剂中将聚合物以0.25％至10％重量/体积的浓度溶解。可在那些生物可降解和生物不可降解物中无差别地选择使用的聚合物。

在第一方面中，我们优选例如和乙醇酸以及酯类，例如聚酐类、聚氨基甲酸酯、丁酸聚酸(el poliácido butírico)、戊酰聚酸(el poliácidovalerino)等。

同时，在非可生物降解聚合物中，我们优选使用乙烯乙酸乙烯酯和聚丙烯酸，结果也可接受使用聚酰胺及其共聚物和混合物。我们也可使用选自自然界的聚合物，在这种情况下，优选使用来自包括葡聚糖、纤维素、胶原、白蛋白、酪蛋白或类似物之组的至少一种。

随后将所得混合物以至少1/40至4/200的溶剂/非溶剂的比引入到非溶剂中，以自发形成微囊。在该步骤中，溶剂是选自氯仿和亚甲基氯的有机溶剂，而优选的非溶剂是乙醇和己烷。

此外，我们可并入除那些选择以标记对象之外的其他DNA片段，为了掩饰(enmascarar)所选多态性DNA片段；并使其更难以伪造。

在第七步骤中，我们将DNA微球或微囊化的DNA增溶在对拉曼光谱检测为中性的溶液中。

为了掩饰对应于所选多态性DNA片段的拉曼光谱，并使得标志物更难以复制；我们可以使用拉曼活性有机物质的混合物，但其对由多态性片段发射的光谱没有影响或改变作用；理论上获得发射范围在500至2000cm^-1之间的数百万特定光谱。在美国专利20060234248中很好地描述了这些物质。

含有多态性片段的微球可溶解在不同种类的墨中，例如苯胺油墨、石印墨、网印油墨、凹版墨、反应性货币墨、可擦除墨、笔反应性墨、热反应墨、红外线可见墨、光变油墨、渗透墨、光致变色墨、对溶剂或水有化学反应性的墨。

在第八步骤中，(如果必要的话)我们进行确定并校正溶液的流动性程度和浓度，以使其能够适当的施用到待标记的对象。

据估计，在施用器中溶液流动性的程度应具有的浓度为每mm²标记表面6pg至10pg。

最后，在第九步骤中，在施用器中携带的标志物可选自笔、微纤维、笔、多种类型的过滤器、雾化器、绘图工具、刷子、印章或作为电子照相打印机内的自动机器或者喷墨型机器、平版胶印、活版印刷、凹版印刷、电子照相、丝网印刷系统和印刷纺织品等。

在一个替代实施方案中，采用作为中介并入含有标志物的溶液和待标记的对象间的装置；在这种情况下，所述中介装置并入在所述溶液中。

该中介装置可选自多种物质，例如硝化纤维素、纸张、木头、纸板、塑料、增强尼龙、布、例如液滴的有机物质或无机凝胶等。

在选择了施用器之后，我们对所期望的对象进行标记。

本发明还包括通过应用检测包含在遗传标志物中的多态性DNA片段检测标志物的方法，其通过检测核苷酸的合适方法实现，包括但不限制于：普通拉曼散射、共振拉曼散射、表面增强拉曼散射、表面增强共振拉曼散射、相干反斯托克斯拉曼光谱法(CARS)、受激拉曼散射、逆拉曼光谱术、受激拉曼增益光谱术、超拉曼散射、分子光学激光检测器(MOLE)或拉曼微探针或拉曼显微术或共聚焦拉曼显微光谱术、三维或扫描拉曼、NIR光谱术、拉曼饱和光谱术、时间分辨共振拉曼术、拉曼光谱去偶或UV拉曼显微术。

用于产生存在于标记物品中之多态性片段的光谱色拉曼光谱仪，可以是具有400至1200nm范围内波长的激光且具有可变电压的台式或便携装置。在本发明中，我们已使用了具有633nm和785nm激光的便携式拉曼检测器，但这并不限制于具有其他特征的装置；如图9所示。

本发明还包括一种用于确认的方法，其包括抑制DNA之特征性荧光的第一步骤；比较从由多态性DNA发射的光谱中获得的峰之强度的上限值和下限值与先前存储在光谱文库中的参考极限值，从而产生通过正或负认证的即时响应的第二步骤。

参照所述第一阶段，使用具有操作特征的拉曼光谱，以一系列步骤实现荧光的抑制，所述步骤包括：确定响应光谱每个点周围区段获得的光谱数据之平均强度值的步骤以及从对应于DNA标志物的光谱的每个点减去所述平均值的步骤。

同时，所述第二步骤包括比较所获得之拉曼峰数据与存储在数据库中之拉曼峰数据的步骤；以及比较每个峰的波数和强度与存储在上述数据库中之光谱数据的步骤。

使用所述对应于每个多态性片段STR或SNP之光谱的储存数据来标记对象。

本发明人知晓，在发射拉曼光谱中的波长是样品中分子的化学组成和结构的表征，同时散射光的强度依赖于样品中的分子浓度。这就是为什么使用不同于0.9nm(纳摩尔)之SNP或STR多态性片段的开发浓度，0.9nm是拉曼SERS的检出限；从而产生额外的安全级别，因为潜在的伪造者也必须知晓多态性片段的浓度以精确地重现由标记物品所发出的相同光谱。

由多态性片段发射的拉曼光谱的检测值可经由连接到数据网络的电信系统、模拟电话线、数字电话线、手机和/或计算机等发送。

一旦检测并认证了所标记的对象，我们进行多态性STR或SNP片段的鉴定，通过聚合酶链式反应的手段将它们分型。在这种情况下，绝对必需要知晓他们的名称以使用适合于相应分析的特定试剂和扩增条件。

因此，重要的是提到发明者将用于标记对象的每个片段与Genbank(los bancos de genes)中一些已有的代码联系起来。结合使用的多态性STR或SNP片段，创建了独特的代码，类似于PIN号，其对应于不同生物基因组中数千多态性位点中的确切位置。

这样的代码的持有者是标记对象的所有者。

如果发生争议，那么标记对象的所有者可披露对应于每个PIN号的片段，并且世界上任何的分子生物学实验室均可独立于这些片段的供应者确认其存在。

因此，如果发生法律纠纷，那么各方的权利得到了保障，因为根据需要可在世界上任何地方独立地进行关于标记对象身份的遗传测试。

一旦你披露了使用的多态性片段的名称，即可通过聚合酶链式反应的方法进行DNA分型，但也可通过现有技术中常见的方法和技术进行，例如使用如JM Robertson(1994)提倡的凝胶；根据Mc.Cord(1993)的毛细管电泳；由Y.Wang(1995)给出的多重杂交检测或多个毛细管；使用如Woolley(1996)建立的微芯片；根据Becker(1997)的质谱术等等。并且，还可通过如Orita等(1989)示出的单链构象分析；如Landeegren等(1988)指出的等位基因特异性寡核苷酸；根据Syvanen等人(1990)的多重引物延伸或者通过任何其他技术，例如微芯片、质谱术等检测SNP。

此外，本发明人知晓SNP负责生物的表型特征。在本发明中，方法包含了上述相同的12个步骤，其中所使用的唯一多态性遗传标志物是SNP，特别是那些负责用于鉴定生物或从它们衍生出的任何产物的表型性状。例如，你可以用表征颜色、气味或味道的SNP来标记任何酒；或者护照，你可以将负责一个人表型特征(例如眼睛颜色、头发颜色、皮肤颜色等)的一滴SNP的所有片段放置在其中。创建“遗传拼图(fotogenética)”，当通过SERS拉曼进行检测并用特殊软件使其数字化时，可直接对持有护照的人员进行检查。例如，SNP SLC24A4的变体与眼睛和头发的颜色相关，邻近KITLG的变体与头发的颜色相关，TYR的两个变体与棕色眼睛和雀斑相关，6p 25.3的变体与雀斑相关，在OCA2SNP的三个变体中发现了蓝眼睛颜色并且不同的肤色色调都与5′近端调节控制OCA2有关。几位作者调查并发现了越来越多的相关表型特征，其中我们可以提到Sulen，P，Gudbjartsson在基因“Genetic determinants ofhair，eye and skin pigmentation in Europeans”Nat Gen 2007.12月.39(12)：1415和Duffy DL在“A three SNP haplotype in intron 1 of OCA2 ExplainsMOST human eye color variation”等；如图12以及13A和13B所示。

我们用本文报道的遗传标志物可以以绝对确定性标记并鉴定许多对象，例如绘画、雕塑、体育用品、艺术品、工艺品、磁带录像机、电视机和任何家用物品，还有计算机、打印机、软件、办公用品和商业设备。

它还可以鉴定香水、衣服、手提包、公文包、不同产品的盒子、泡状药品(blister de medicamentos)、药物、汽车零件、飞机、自行车、股票证券、机票(billetes de avión)、行李领取票、支票、可流通票据、商业票据、法律文件、遗嘱、契约、合同、信托、租约、转让、地役权、邮政文件、邮票、债券、身份证、出生证明、驾驶执照、装货发票、标签、医疗表格、医疗记录、处方、原创艺术品、珍贵邮票、银行文件、信用卡、信用卡授权、发票、账单、许可证、授权、申请书和纳税申报单、账单、货币、支票、法律文件、身份证、驾驶许可证、护照、签证、信用卡、电话以及类似对象例如学位证书、库存清单和彩票等。

本发明提供了多种技术复杂性以防止对标记对象的伪造。它们包括如下安全级别：

第一级：包括确定聚合物的化学结构。能够分析用于标记对象的多态性片段之组成的伪造者应该首先弄清楚用于对所述片段进行微囊化的聚合物的结构，以实现打开但不改变内部的DNA。

第二级：包括多态性片段的鉴定。如果伪造者最终通过了第一级，为了鉴定用于标记对象的多态性片段，他必须知晓用特定的引物对进行PCR反应的多态性STR或SNP片段的名称以及适合于实现扩增的反应条件。

虽然人们可能认为克隆方法可用于鉴定多态性片段，但这是不可能的；因为，一方面，这些多态性片段已被修饰，而且，在目前的开发中使用的浓度也排除了这种可能性。

第三级：涉及多态性片段的表征，因为假设伪造者已经成功地避开了上述级别，他还必须知晓每个多态性片段的等位基因变体以精确地再现用来标记对象的那些。

第四级：包含用标志物的浓度进行工作，所述浓度与用来阻止使用分子克隆技术的多态性STR或SNP片段的下限值相一致。

第五级：涉及使用一种分子的三维构象或其组合来修饰DNA分子的三维结构，防止伪造者如果不清楚所述修饰而逆转该过程。

第六级：用额外的DNA片段掩饰标志物以使得伪造者必须知晓他所鉴定的哪些片段已被用于标记对象。包括将额外的DNA片段添加至真正用于创建独特代码号的片段。

第七级：产生的拉曼光谱迫使伪造者知晓哪些是对应于多态性DNA片段的波长峰，所述多态性DNA片段的DNA分子的三维结构已在之前被修饰。

第八级：用不同的拉曼活性物质掩饰标志物的拉曼光谱峰。即使伪造者应用SERS方法，他必须区分哪些是对应于用于生成独特代码或PIN的多态性DNA片段的峰，以及哪些是对应于添加以掩饰标志物之拉曼活性化学物质的峰。

第九级：包括编码或加密数据库。如果伪造者战胜了之前的安全级别，他必须进行解码以恰当地解释和应用响应光谱。

第十级：涉及每个多态性片段的相对浓度的变化，从而使得通过比较由多态性DNA所发射的光谱中获得的峰之强度的顶值和底值与之前存储在响应光谱的数据库中的极限值来进行认证。所以，伪造者应检测哪一个是在标志物中使用的每个多态性DNA片段的相对浓度。

应用实施例

用已付诸实践的几个实施例来完成所述说明，其提出了具有示例性目的的整体，它们用作纯粹的说明性功能，但在任何情况下都不会限制本发明。

因此，已经报道了导致实现本发明之步骤的一种可能顺序以及它是如何发挥作用的，并且该文件由包含在随后附加的所有权条款中本发明的综合补充。

实施例#1.种间DNA作为防伪标签的用途

创建不存在于自然界中的DNA分子。提取6pg的DNA并扩增玉米基因ZmZ1P5、人基因D13S317和犬基因ZUBECA6；使用ABI PRISM310测序仪(Applied Biosystem)来确定每个基因座的等位基因变体。根据Lee描述的技术，将最终的PCR产物与0.25M银原子的终溶液混合。随后，为了将标志物精确地施加到所期望的对象上，在聚苯乙烯中微囊化DNA片段并溶于足够的水中。使用DeltaNu拉曼检测器(DeltaNu RamanInspector)与在785nm下120mW，8cm^-1分辨率，光谱范围200-2000cm^-1的激光进行拉曼SERS检测。并且为了认证，用NuSpec数据采集和文库软件来与数据库比较数据。如果发生诉讼，那么世界上任何专业的实验室均可以对用作标签的遗传图谱进行鉴定。但是，不得不使用合适的有机溶剂来溶解微球，并且一旦披露了由每个物种Genbank(gen bank)的登录代码形成的PIN(例如，ZmZIP5ZUBECA6D13S317)，则可使用适当的试剂(引物)通过PCR来分析等位基因变体(参见图10)。

实施例#2.个人的DNA作为防伪标签的用途

创建个人的DNA分子。如果发生诉讼，那么披露具有每个STR/SNPGenbank之登录代码的PIN；以及使用各个片段的等位基因变体(例如，X0629288X147201011M8652545)，并且世界上任何专业的实验室都可不依赖产品的制造商而重新创建遗传图谱。

实施例#3.SNP(表型性状)用于护照认证的用途

当通过SERS拉曼检测和数字化时，使用负责人表型特征(例如眼睛颜色、头发、皮肤颜色等)的SNP可创建“遗传拼图”；它允许对拥有护照的人进行直接比较。分析了如下(在图13A中)详述的从人唾液提取的0.5ugr DNA和6个SNP基因。图13B中示出了根据这6个SNP扩增的基因型变体，用于确定棕色或蓝色眼睛的可能的假定方案。

实施例#4.含有多态性DNA的微球作为纸币中之防伪标签的用途

在图14中示出了用于此目的的用途。

Claims

1.用于获得待鉴定对象之标志物的方法，其至少包括选择用于DNA提取之生物的第一步骤以及测定并校正溶液流动性程度的第八步骤；其特征在于还包括：

·第二步骤，其将所获得的样品包含在含有9至10.2mM Tris-HCl；0.95至0.11的EDTA；20％SDS(重量/体积)以及9.8至10.3mg/mL蛋白酶K的溶液中，并以10∶9(体积/体积)比值的苯酚/氯仿进行纯化；

·第三步骤，扩增存在于DNA样品中的短串联多态性片段(STR)或单核苷酸多态性(SNP)；

·第四步骤，确定所选多态性片段的等位基因变体；

·第五步骤，修饰多态性STR/SNP片段的三维结构并吸附至至少一种金属的纳米颗粒；

·第六步骤，多态性片段的浓缩和微囊化；和

·第七步骤，通过拉曼光谱检测DNA微球或微囊化DNA的增溶作用。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在所述第五步骤中，所述金属选自金、银、铂或者铜。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在所述第五步骤中，通过选自以下的方法来修饰DNA的三维结构：

I.单独添加或作为吸附了DNA以与所述DNA分子产生例如二聚体、三聚体或四聚体之聚集体的金属纳米颗粒的胶体添加；将选自聚合物、硅烷或烷及其衍生物的至少一种连接基团添加至所述金属纳米颗粒，并且其中所述聚合物选自苯乙炔、聚四氟乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺或类似物，

II.添加DNA复合物-树状聚体PAMAM类型或类似物以形成具有单拉曼光谱的特征性三维结构，

III.通过使多态性DNA片段与合成型PNA(肽核酸)共价连接，

IV.通过使多态性STR/SNP的片段与用SELEX方法获得的适配体结合，

V.通过DNA双螺旋的盘绕，通过使用在碱基之间以及沿所述双螺旋的嵌入分子；嵌入剂选自溴化乙锭、阿霉素、9-氨基吖啶(9AA)和原黄素(PF)(3，6-二氨基吖啶)，

VI.通过使用选自精胺、亚精胺、腐胺、Hoechst 33258、纺锤菌素、戊烷脒或类似物的药物使蛋白质沉淀或聚集到DNA的大沟和小沟，

VII.通过与磷酸盐和/或含氮碱基反应的聚集体形成，使用二价金属复合物例如Sr⁺²、Ba⁺²、Mg⁺²、Ca⁺²、Mn⁺²、Co⁺²、Ni⁺²和Cd⁺²通过破坏DNA的氢键而使双螺旋去稳定。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于在所述第VI项中，这些药物与DNA的大沟和小沟的相互作用直接与AT的量相关，因此，每部分STR或SNP的序列可获得用于标记对象之多态性片段的特征性光谱。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在所述第五步骤中，将吸附了DNA的所述金属纳米颗粒并入到标志物使拉曼SERS信号增加10⁶至10¹⁴倍。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于在所述第五步骤中，所述连接基团选自硅烷和烷分子或其衍生物，所述连接基团与DNA分子连接以形成聚集体，所述聚集体的特征为形成单拉曼光谱信号的分子网络。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在所述第六步骤中，通过超速离心浓缩并通过相转化技术微囊化多态性DNA片段；将多态性DNA溶解在溶剂中，然后选自可生物降解聚合物和非可生物降解聚合物的聚合物以0.25％至10％重量/体积的浓度也溶解在相同溶剂中。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于在所述第六步骤中，所述溶剂为选自氯仿和亚甲基氯的有机溶剂，并且非溶剂选自乙醇和己烷。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于在所述第六步骤中，所述可生物降解的聚合物选自乳酸、乙醇酸、聚酐、聚氨基甲酸酯、丁酸聚酸、戊酰聚酸或类似物。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于在所述第六步骤中，所述非可生物降解聚合物选自乙烯乙酸乙烯酯、聚丙烯酸、聚酰胺及其共聚物和混合物。

11.根据权利要求7所述的方法，其特征在于在所述第六步骤中，所述聚合物为选自葡聚糖、纤维素、胶原、白蛋白、酪蛋白或类似物的至少一种。

12.根据权利要求7所述的方法，其特征在于在所述第六步骤中，所述溶剂/非溶剂的比值为1/40至4/200。

13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在所述第六步骤中，用微型浓缩器例如Centricon100通过超速离心进行浓缩。

14.根据权利要求1所述方法获得的标志物，其特征在于使用的多态性DNA片段的浓度不同于0.9nM。

15.根据权利要求14所述的标志物，其特征在于对使用的每个多态性DNA片段分配了Genbank中的已有代码编号，使得在标志物中使用的多态性片段STR/SNP的组合创建了对应于所使用生物体的基因组或其DNA中多态性位点内确切位点的独特代码编号。

16.根据权利要求14所述的标志物，其特征在于并入不是选择来形成独特编号的那些DNA片段的其他DNA片段，来掩饰所选的多态性DNA片段。

17.根据权利要求14所述的标志物，其特征在于通过添加拉曼活性有机物质来掩饰多态性DNA片段的拉曼光谱，而不影响由所述多态性片段发射的原始光谱。

18.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述方法包括用选自但不限制于以下的方法对包含在所述标志物中的多态性DNA片段进行检测：普通拉曼散射；共振拉曼散射；表面增强拉曼散射；表面增强共振拉曼散射；相干反斯托克斯拉曼光谱法(CARS)；受激拉曼散射；逆拉曼光谱术；受激拉曼增益光谱术；超拉曼散射；分子光学激光检测器(MOLE)或拉曼微探针或拉曼显微术或共聚焦拉曼显微光谱术；三维或扫描拉曼、NIR光谱术、拉曼饱和光谱术；时间分辨共振拉曼；拉曼光谱术去偶或UV拉曼显微术。

19.根据权利要求1所述的认证方法，其特征在于所述方法包括抑制DNA特征性荧光的第一步骤，以及第二步骤，在所述第二步骤中比较在由多态性DNA片段发射的光谱中获得的峰强度的上限值和下限值与之前作为参考存储的极限值；并给予即时的认证响应，正匹配或负匹配。

20.根据权利要求19所述的认证方法，其特征在于消除荧光的所述第一步骤包括测定在所述响应光谱的每个点周围区段内获得的光谱数据之平均强度值的步骤以及在所使用的DNA片段的每个点处减去所述平均值的步骤。

21.根据权利要求19所述的认证方法，其特征在于所述第二步骤包括比较所获得的拉曼峰数据与存储在数据库中的拉曼峰数据的步骤以及将各个峰的波数和强度与存储在数据库中的光谱数据进行比较之随后的步骤。

22.根据权利要求19所述的认证方法，其特征在于所述存储的数据对应于用于标记对象的每个多态性STR/SNP片段的光谱。

23.根据权利要求19所述的认证方法，其特征在于通过下面的任意电信系统发送由所述多态性DNA片段发射的拉曼光谱的检测值：与数据网络或等同物相连接的计算机、模拟电话线、数字电话线、手机。

24.根据权利要求1所述的验证方法，其特征在于一旦检测并认证了所述标记的对象，则通过聚合酶链式反应进行多态性STR/SNP片段的鉴定。

25.根据权利要求24所述的验证方法，其特征在于其包括建立多态性片段STR/SNP的名称的步骤以及调节试剂以获得适当扩增条件的步骤。

26.根据权利要求24所述的验证方法，其特征在于可通过用分子生物学技术对多态性片段进行分析并将分析结果与数据库中的证据进行比较，来确定分配给单个多态性片段并包含在该数据库中的编号。

27.根据权利要求24所述的验证方法，其特征在于用现有技术中的常规方法和技术来进行多态性片段STR/SNP的分型，例如使用凝胶、毛细管电泳、多重杂交检测或多个毛细管；使用微芯片和质谱术以及其他方法。

28.根据权利要求24所述的验证方法，其特征在于通过单链构象分析；或等位基因特异性寡核苷酸；通过多引物延伸或通过可在芯片和质谱术中提及的任何其他技术进行单碱基多态性的检测。

29.向待鉴定的对象并入标志物的方法，其中所述标志物是根据权利要求1获得的，所述方法包括将所述标签并入流体的步骤以及将含有所述标志物的流体包含在施用器中的步骤，其特征在于包含在溶液中的标志物以每mm²表面6至10pg的浓度存在。

30.根据权利要求29所述的向待鉴定的对象并入标志物的方法，其特征在于将具有多态性DNA片段的微球溶解在不同种类的墨中，如苯胺油墨、石印墨、网印油墨、凹版墨、反应性货币墨、可擦除墨、笔反应性墨、热反应墨、红外线可见墨、光变油墨、渗透性墨、光致变色墨、对溶剂或水有化学反应性的墨。

31.根据权利要求29所述的向待鉴定的对象并入标志物的方法，其特征在于所述施用器选自笔、微纤维、笔、喷雾器、绘图工具、刷子、印章、电子照相打印机类型喷墨、平版胶印或活版印刷、凹版印刷、静电干印复制法、丝网印刷、纺织品印刷系统或类似物、过滤器。

32.根据权利要求29所述的向待鉴定的对象并入标志物的方法，其特征在于在含有所述标志物的溶液与待标记的对象之间，使用作为中介并入所述溶液中的装置，所述装置选自硝化纤维素、纸张、木头、纸板、塑料、增强尼龙、布、例如液滴的有机物质或者无机凝胶。

33.根据权利要求29所述的向待鉴定的对象并入标志物的方法，其特征在于将包含所述标签的溶液并入到以下物品中：绘画、雕塑、体育用品、艺术品、工艺品、磁带录像机、电视机和任何家用物品，还有计算机、打印机、软件、办公用品和商业设备、香水、衣服、手提包、公文包、不同产品的盒子、泡状药品、药物、汽车零件、飞机、自行车、股票证券、机票、行李领取票、支票、可流通票据、商业票据、法律文件、遗嘱、契约、合同、信托、租约、转让、地役权、邮政文件、邮票、债券、身份证、出生证明、驾驶执照、装货发票、标签、医疗表格、医疗记录、处方、作品原创艺术品、珍贵邮票、银行文件、信用卡、信用卡授权、发票、账单、许可证、授权、申请书和纳税申报单、账单、货币、支票、法律文件、身份证、驾驶许可证、护照、签证、信用卡、电话和类似对象例如学位证书、存货清单和彩票。

34.根据权利要求1所述的方法，其特征在于包括以下级别：第一级，其包括确定用于对多态性DNA片段进行微囊化之聚合物的化学结构；第二级，其包括鉴定所使用的经修饰多态性DNA片段；第三级，其包括对每个多态性片段的等位基因变体进行分型或鉴定；第四级，其包括使标志物的浓度适应于所使用之多态性STR/SNP片段的下限；第五级，使用所述分子的一个三维构象或一个组合进行DNA分子三维结构的修饰；第六级，其包括通过添加不同的DNA片段来掩饰标志物；第七级，其包括使用经修饰的多态性片段的拉曼光谱；第八级，其包括用不同活性物质的拉曼光谱掩饰所述标志物的拉曼光谱；第九级，其包括编码数据库；以及第十级，即改变各多态性片段的相对浓度。