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CN104902913A - 使用结合剂的免疫治疗 - Google Patents

使用结合剂的免疫治疗 Download PDF

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CN104902913A
CN104902913A CN201380063923.5A CN201380063923A CN104902913A CN 104902913 A CN104902913 A CN 104902913A CN 201380063923 A CN201380063923 A CN 201380063923A CN 104902913 A CN104902913 A CN 104902913A
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CN
China
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pvr
polypeptide
seq
binding agent
soluble receptor
Prior art date
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Application number
CN201380063923.5A
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English (en)
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澳新·L·盖尼
福米克·塔卡达·阿克塞尔罗德
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Ang Kemeide Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Ang Kemeide Pharmaceutical Co Ltd
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Abstract

本发明公开特异性结合人TIGIT的胞外域的结合剂以及使用方法。该结合剂可包括可溶性脊髓灰质炎病毒受体(PVR)变异体，该PVR变异体相较于野生型PVR具有一或多种氨基酸置换。该结合剂可特异性结合人TIGIT的胞外域且不与人CD226的胞外域结合或与之微弱结合，该结合剂可被用于治疗诸如癌之类的疾病的方法。

Description

使用结合剂的免疫治疗
相关申请案的交互参照
本申请案主张于2012年12月4日提出的美国临时申请案第61/733,177号及2013年3月15日提出的美国临时申请案第61/789,268号的优先权，各案以参照方式整体纳入此处。
技术领域
本发明大致关于调节免疫反应的剂，例如可溶性受体、抗体及小分子，以及使用该剂治疗疾病例如癌的方法。
背景技术
免疫治疗的基础在于调控免疫系统，包括先天免疫反应及后天免疫反应。免疫治疗的目的系藉由控制对“外来物”(例如病原体或肿瘤细胞)的免疫反应以治疗疾病。此可能包括诱导或增强特定免疫反应或抑制或减少特定免疫反应的方法。免疫系统是由众多细胞类型组成的高度复杂系统，这些细胞包括T细胞、B细胞、自然杀手细胞、抗原呈现细胞、树突细胞、单核细胞及巨噬细胞。这些细胞拥有复杂且细微的控制它们的交互作用的系统，包括利用众多受体及可溶性因子进行控制。所述细胞利用活化及抑制机制来控制反应，不让不受控制的免疫反应带来负面结果(例如自体免疫疾病)。
癌症免疫监控的概念所根据的理论是，免疫系统可辨识肿瘤细胞、启动免疫反应且抑制肿瘤的发展及/或进展。然而，很清楚的是，许多癌细胞已发展出逃避免疫系统，使肿瘤得以不受抑制地生长的机制。癌症免疫疗法着重于发展可活化及/或增强免疫系统的剂，以达到更有效的杀灭肿瘤细胞及抑制肿瘤生长的反应。
发明内容
本发明提供调节免疫反应的结合剂，例如可溶性受体、多肽、抗体及小分子。本发明亦提供包含该结合剂的组合物，例如医药组合物。本发明另提供投予该结合剂至需要所述剂的受试者的方法。
在一态样中，本发明提供与人TIGIT的胞外域特异性结合的结合剂。此处所使用的“结合剂”包括但不限于可溶性受体、多肽、抗体、小分子及它们的组合。在一些实施方式中，该结合剂包含可溶性受体。在一些实施方式中，该结合剂包含含有脊髓灰质炎病毒(poliovirus)受体(PVR)变异体的可溶性受体。在一些实施方式中，该结合剂系含有脊髓灰质炎病毒(poliovirus)受体(PVR)变异体的可溶性受体。在一些实施方式中，该结合剂包含含有PVR变异体的可溶性受体，其中该PVR变异体相较于野生型PVR包含一或多种氨基酸置换。在一些实施方式中，该结合剂包含含有PVR变异体的可溶性受体，该PVR变异体与人TIGIT的胞外域特异性结合且不与人CD226的胞外域结合或与之微弱结合。在一些实施方式中，该结合剂包含含有PVR变异体的可溶性受体，该PVR变异体与人TIGIT的胞外域特异性结合且亦与人CD96的胞外域结合。在一些实施方式中，该结合剂包含含有PVR变异体的可溶性受体，该PVR变异体与人TIGIT的胞外域及人CD96的胞外域特异性结合，但不与人CD226的胞外域结合或与之微弱结合。在一些实施方式中，该结合剂包含含有PVR变异体的可溶性受体，该PVR变异体与人TIGIT的胞外域特异性结合，且具有相较于野生型PVR减少的与人CD226的胞外域的结合。在一些实施方式中，该结合剂包含含有PVR变异体的可溶性受体，该PVR变异体与人TIGIT的胞外域及人CD96的胞外域特异性结合，但具有相较于野生型PVR减少的与人CD226的胞外域的结合。
在一些实施方式中，该PVR变异体包含一或多种人PVR的免疫球蛋白(Ig)样结构域。在一些实施方式中，该PVR变异体包含人PVR的N端IgV结构域。在一些实施方式中，该PVR变异体包含人PVR的N端IgV结构域，其中该IgV结构域相较于野生型PVR包含一或多种氨基酸置换。在一些实施方式中，该PVR变异体实质上由人PVR的N端IgV结构域组成，其中该IgV结构域相较于野生型PVR包含一或多种氨基酸置换。人PVR的氨基酸序列为该领域已知，包含于此处为SEQ ID NO:1。在一些实施方式中，该PVR变异体包含对应野生型PVR的氨基酸40至143的一或多种氨基酸的置换。在一些实施方式中，该PVR变异体包含对应野生型PVR的氨基酸60至90及/或氨基酸125至133的一或多种氨基酸的置换。在一些实施方式中，该PVR变异体包含对应野生型PVR的氨基酸465、67、72、73、74、81、82、84及85的一或多种氨基酸的置换。在一些实施方式中，该PVR变异体包含对应野生型PVR的氨基酸72的氨基酸置换。在一些实施方式中，该PVR变异体包含对应野生型PVR的氨基酸82的氨基酸置换。在一些实施方式中，该PVR变异体包含对应野生型PVR的氨基酸72及氨基酸82的氨基酸置换。在一些实施方式中，该PVR变异体包含选自SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
在另一态样中，本发明提供一种包含人PVR的一或多种Ig样结构域的多肽，其中该一或多种Ig样结构域相较于野生型PVR包含一或多种氨基酸置换。在一些实施方式中，该多肽与人TIGIT的胞外域特异性结合且不与人CD226的胞外域结合或与之微弱结合。在一些实施方式中，该多肽包含人PVR的N端IgV结构域。在一些实施方式中，该多肽包含PVR的IgV结构域，该PVR的IgV结构域包含人PVR的N端IgV结构域，其中该IgV结构域相较于野生型PVR包含一或多种氨基酸置换。在一些实施方式中，该多肽包含PVR的IgV结构域，该PVR的IgV结构域实质上由人PVR的N端IgV结构域组成，其中该IgV结构域相较于野生型PVR包含一或多种氨基酸置换。在一些实施方式中，多肽包含PVR变异体，其中该PVR变异体相较于野生型PVR包含一或多种氨基酸置换。在一些实施方式中，多肽包含与人TIGIT的胞外域特异性结合且不与人CD226的胞外域结合或与之微弱结合的PVR变异体。在一些实施方式中，该多肽亦与人CD96的胞外域结合。在一些实施方式中，该多肽包含PVR变异体，其中该PVR变异体包含对应野生型PVR的氨基酸40至143的一或多种氨基酸的置换。在一些实施方式中，该多肽包含PVR变异体，其中该PVR变异体包含对应野生型PVR的氨基酸60至90及/或氨基酸125至133的一或多种氨基酸的置换。在一些实施方式中，该多肽包含PVR变异体，其中该PVR变异体包含对应野生型PVR的氨基酸465、67、72、73、74、81、82、84及85的一或多种氨基酸的置换。在一些实施方式中，该多肽包含PVR变异体，其中该PVR变异体包含对应野生型PVR的氨基酸72的氨基酸置换。在一些实施方式中，该多肽包含PVR变异体，其中该PVR变异体包含对应野生型PVR的氨基酸82的氨基酸置换。在一些实施方式中，该多肽包含PVR变异体，其中该PVR变异体包含对应野生型PVR的氨基酸72及氨基酸82的氨基酸置换。在一些实施方式中，该多肽包含选自SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQID NO:20及SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
在另一态样中，本发明提供一种包含人PVR变异体的一或多种Ig样结构域的TIGIT结合剂，其中该PVR的一或多种Ig样结构域相较于野生型PVR包含一或多种氨基酸置换。在另一态样中，本发明提供一种包含人PVR变异体的一或多种Ig样结构域的TIGIT结合剂，其中该PVR的一或多种Ig样结构域包含对应野生型PVR的氨基酸65、67、72、73、74、81、82、84或85的一或多种氨基酸置换。在一些实施方式中，该TIGIT结合剂包含人PVRL2变异体的一或多种Ig样结构域，其中该PVRL2的一或多种Ig样结构域相较于野生型PVRL2包含一或多种氨基酸置换。在一些实施方式中，该TIGIT结合剂包含人PVRL3变异体的一或多种Ig样结构域，其中该PVRL3的一或多种Ig样结构域相较于野生型PVRL3包含一或多种氨基酸置换。在一些实施方式中，该TIGIT结合剂包含人PVRL4变异体的一或多种Ig样结构域，其中该PVRL4的一或多种Ig样结构域相较于野生型PVRL4包含一或多种氨基酸置换。
在前述各种态样及实施方式的某些实施方式以及本说明书中所述的其他态样及实施方式中，该结合剂包含非PVR多肽。在一些实施方式中，该PVR变异体系与非PVR多肽连接。在一些实施方式中，该PVR变异体系与非PVR多肽直接连接。在一些实施方式中，该PVR变异体系藉由肽连接子与非PVR多肽连接。在一些实施方式中，该非PVR多肽包含人Fc区。在一些实施方式中，该非PVR多肽实质上由人Fc区组成。在一些实施方式中，该非PVR多肽由人Fc区组成。在一些实施方式中，该人Fc区系选自SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47及SEQ ID NO:48。
在前述各种态样及实施方式的某些实施方式以及本说明书中所述的其他态样及实施方式中，该结合剂系单价。在一些实施方式中，该结合剂系双价。在一些实施方式中，该结合剂系单特异性。在一些实施方式中，该结合剂系双特异性。
在前述各种态样及实施方式的某些实施方式以及本说明书中所述的其他态样及实施方式中，该结合剂系异多聚体剂。在一些实施方式中，该结合剂系异二聚体剂。在一些实施方式中，该异二聚体剂包含与TIGIT结合的第一多肽及与第二标靶结合的第二多肽。在一些实施方式中，该异二聚体剂包含与TIGIT结合的第一多肽及包含免疫反应刺激剂的第二多肽。在一些实施方式中，该异二聚体剂包含含有此处所述的PVR变异体的第一多肽及包含免疫反应刺激剂的第二多肽。在一些实施方式中，该免疫反应刺激剂可为(但不限于)粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、白介素3(IL-3)、白介素12(IL-12)、白介素1(IL-1)、白介素2(IL-2)、白介素15(IL-15)、CD80、CD86、抗CD3抗体、抗CTLA-4抗体及/或抗CD28抗体。在一些实施方式中，该异二聚体剂包含二种多肽，其中各多肽包含人IgG2 CH3结构域，且其中该第一IgG2 CH3结构域中对应SEQ ID NO:40的位置249及288的位置的氨基酸系经谷氨酸盐或天冬氨酸盐置换，且其中该第二IgG2CH3结构域中对应SEQ ID NO:40的位置236及278的位置的氨基酸系经赖氨酸置换。
在前述各种态样及实施方式的某些实施方式以及本说明书中所述的其他态样及实施方式中，该结合剂增加细胞介导性免疫。在一些实施方式中，该结合剂增加T细胞活性。在一些实施方式中，该结合剂增加溶细胞性T细胞(CTL)活性。在一些实施方式中，该结合剂增加自然杀手细胞(NK)活性。在某些实施方式中，该结合剂系TIGIT介导信号传导的拮抗剂。在某些实施方式中，该结合剂系CD96介导信号传导的拮抗剂。在一些实施方式中，该结合剂抑制TIGIT信号传导。在一些实施方式中，该结合剂抑制CD96信号传导。在一些实施方式中，该结合剂抑制TIGIT信号传导及CD96信号传导。在一些实施方式中，该结合剂增加CD226信号传导。在一些实施方式中，该结合剂抑制TIGIT信号传导、抑制CD96信号传导，但不抑制CD226信号传导。在一些实施方式中，该结合剂抑制TIGIT信号传导、抑制CD96信号传导，且增加CD226信号传导。在一些实施方式中，该结合剂抑制或阻断PVR与TIGIT之间的交互作用。在一些实施方式中，该结合剂抑制或阻断PVR与TIGIT之间的交互作用及PVR与CD96之间的交互作用。在一些实施方式中，该结合剂抑制或阻断PVR与TIGIT之间的交互作用、抑制或阻断PVR与CD96之间的交互作用，但不抑制或阻断PVR与CD226之间的交互作用。在一些实施方式中，该结合剂抑制或阻断PVRL2与TIGIT之间的交互作用。在一些实施方式中，该结合剂抑制或阻断PVRL3与TIGIT之间的交互作用。在一些实施方式中，该结合剂抑制或阻断PVRL4与TIGIT之间的交互作用。
在另一态样中，本发明提供医药组合物，其包含如此处所述的可溶性受体、抗体、多肽或结合剂及医药上可接受的载剂。本发明亦提供于受试者(例如人)治疗癌及/或抑制肿瘤生长的方法，该方法包含对该受试者投予有效量的包含此处所述的结合剂的组合物。
在前述各种态样的某些实施方式以及本说明书中他处所述的其他态样及/或实施方式中，该可溶性受体、抗体、多肽或结合剂系经分离。在某些实施方式中，该可溶性受体、多肽或结合剂系基本上纯的。
在另一态样中，本发明提供多核苷酸，其包含编码如此处所述的可溶性受体、抗体、多肽或结合剂的多核苷酸。在一些实施方式中，该多核苷酸系经分离。在一些实施方式中，本发明另提供包含所述多核苷酸的载体，以及包含所述载体及/或所述多核苷酸的细胞。在一些实施方式中，本发明亦提供包含或产生如此处所述的可溶性受体、抗体、多肽或结合剂的细胞。在一些实施方式中，该细胞系单株细胞系。在一些实施方式中，该细胞系原核细胞。在一些实施方式中，该细胞系真核细胞。
在另一态样中，本发明提供调节受试者的免疫反应的方法。在一些实施方式中，本发明提供增强受试者的免疫反应的方法，该方法包含对该受试者投予治疗有效量的如此处所述的结合剂。在一些实施方式中，本发明提供活化受试者的免疫反应的方法，该方法包含对该受试者投予治疗有效量的如此处所述的结合剂。在一些实施方式中，该免疫反应系抗原刺激引起。在一些实施方式中，该抗原刺激系肿瘤或肿瘤细胞。在一些实施方式中，该抗原刺激系病原体。在一些实施方式中，该抗原刺激系病毒。在一些实施方式中，该抗原刺激系经病毒感染的细胞。在一些实施方式中，本发明提供增强免疫细胞的活性的方法。在一些实施方式中，本发明提供增强CD226阳性细胞的活性的方法，该方法包含使该细胞与有效量的如此处所述的结合剂接触。在一些实施方式中，CD226阳性细胞为T细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞及/或B细胞。在一些实施方式中，本发明提供增强受试者的NK细胞活性的方法，该方法包含对该受试者投予治疗有效量的如此处所述的结合剂。在一些实施方式中，本发明提供增强受试者的T细胞活性的方法，该方法包含对该受试者投予治疗有效量的如此处所述的结合剂。在一些实施方式中，本发明提供增强受试者的T细胞及/或NK细胞活化的方法，该方法包含对该受试者投予治疗有效量的如此处所述的结合剂。在一些实施方式中，本发明提供增强受试者的T细胞反应的方法，该方法包含对该受试者投予治疗有效量的如此处所述的结合剂。在一些实施方式中，本发明提供增强受试者的CTL活性的方法，该方法包含对该受试者投予治疗有效量的如此处所述的结合剂。在一些实施方式中，本发明提供增强受试者的免疫反应的方法，该方法包含对该受试者投予治疗有效量的包含PVR变异体的可溶性受体，其中该可溶性受体(i)抑制TIGIT与PVR之间的交互作用且(ii)抑制CD96与PVR之间的交互作用。在一些实施方式中，本发明提供增强受试者的免疫反应的方法，该方法包含对该受试者投予治疗有效量的包含PVR变异体的可溶性受体，其中该可溶性受体(i)抑制TIGIT与PVR之间的交互作用、(ii)抑制CD96与PVR之间的交互作用且(iii)不抑制CD226与PVR之间的交互作用。
在另一态样中，本发明提供抑制受试者的肿瘤生长的方法，该方法包含对该受试者投予治疗有效量的如此处所述的结合剂。在一些实施方式中，本发明提供抑制肿瘤生长的方法，该方法包含使细胞与有效量的包含PVR变异体的可溶性受体接触。在一些实施方式中，本发明提供抑制肿瘤生长的方法，该方法包含使细胞与有效量的包含PVR变异体的可溶性受体接触，其中该可溶性受体(i)抑制TIGIT与PVR之间的交互作用、(ii)抑制CD96与PVR之间的交互作用且(iii)不抑制CD226与PVR之间的交互作用。在一些实施方式中，本发明提供抑制受试者的肿瘤生长的方法，该方法包含对该受试者投予治疗有效量的如此处所述的结合剂。在一些实施方式中，本发明提供抑制受试者的肿瘤生长的方法，该方包含对受试者投予治疗有效量的如此处所述的结合剂，其中该结合剂与人TIGIT的胞外域特异性结合且抑制TIGIT信号传导且不抑制CD226信号传导。在一些实施方式中，本发明提供抑制人受试者的肿瘤生长的方法，该方法包含测定该肿瘤相较于参考样本或预先决定的PVR量是否具有表达量上升的PVR，及对该受试者投予治疗有效量的如此处所述的结合剂。
在另一态样中，本发明提供治疗受试者的癌的方法，该方法包含对该受试者投予治疗有效量的如此处所述的结合剂。
在前述各种态样及实施方式的某些实施方式以及本说明书中所述的其他态样及实施方式中，该方法包含对该受试者投予免疫反应刺激剂。在一些实施方式中，该免疫反应刺激剂系选自(但不限于)GM-CSF、M-CSF、G-CSF、IL-3、IL-12、IL-15、IL-1、IL-2、CD80、CD86、抗CD3抗体、抗CTLA-4抗体及抗CD28抗体。
在另一态样中，本发明提供选择人受试者以使用如此处所述的结合剂治疗的方法，测定该受试者是否具有相较于参考样本或预先决定的PVR的量为上升的PVR表达量的肿瘤，其中若该肿瘤具有上升的PVR表达量，则选择该受试者为适合治疗。
本发明的态样或实施方式系以马库西群组或其他选择性形式的群组描述，本发明不仅包含被标示为整体的整个群组，但亦包含该群组的个别成员及该主要群组中所有可能的亚群，且亦包含不含其中一或多个群组成员的主要群组。本发明亦设想明确排除该申请专利的发明中任何群组成员的一或多者。
附图说明
图1：PVR家族成员的N端Ig结构域的比对。
图2：PVR家族成员、膜结合性诱饵受体及可溶性受体的示意图。
图3：FACS分析PVR家族成员之间的结合交互作用。(A)HEK-293T细胞经编码PVR-CD4TM-GFP、PVRL1-CD4TM-GFP、PVRL2-CD4TM-GFP、PVRL3-CD4TM-GFP或PVRL4-CD4TM-GFP的cDNA表达载体过渡性转染，接着与可溶性CD226-Fc、TIGIT-Fc或CD96-Fc融合蛋白混合。(B)HEK-293T细胞经编码PVR-CD4TM-GFP、PVRL1-CD4TM-GFP、PVRL2-CD4TM-GFP、PVRL3-CD4TM-GFP或PVRL4-CD4TM-GFP的cDNA表达载体过渡性转染，接着与可溶性PVR-Fc、PVRL1-Fc、PVRL2-Fc、PVRL3-Fc或PVRL4-Fc融合蛋白混合。特异性结合系由各FACS图上的黑色圆框内有信号存在表示。(C)以简图表示在不同PVR家族成员之间所观察到的结合交互作用。
图4：人PVR(SEQ ID NO:17)与人PVRL2(SEQID NO:23)的N端IgV结构域序列显示在PVR变异体(图4A)及PVRL2变异体(图4B)的库中经选择可能改变的特定氨基酸残基(粗体)。
图5：FACS分析PVR变异体与TIGIT、CD96及CD226之间的结合交互作用。HEK-293T细胞经编码PVR-CD4TM-GFP、PVR S72N变异体CD4TM-GFP或PVR Q82K变异体CD4TM-GFP的cDNA表达载体过渡性转染，接着与可溶性TIGIT-Fc融合蛋白、CD96-Fc融合蛋白、CD226-Fc融合蛋白、TIGIT-Fc与CD226-Fc融合蛋白的组合或CD96-Fc与CD226-Fc融合蛋白的组合混合。
图6：自然杀手细胞的细胞毒杀性试验。人NK细胞系经30μg/ml的PVR-Fc变异体Q82K(灰柱)、PVR-Fc野生型对照(黑柱)或仅培养基(白柱)预先处理。标靶细胞(HEK-293T细胞或K562细胞)系经10μM钙黄绿素AM标记，并与NK细胞以效应细胞：标靶细胞12:1的比例混合。收集上清液，于荧光计上以激发光485nm及发射光535nm定量钙黄绿素的释放。
图7：自然杀手细胞的细胞毒杀性试验。将HEK-293T或A549细胞接种于板，使其隔夜生长至长满。NK细胞系经30μg/ml的PVR-Fc变异体Q82K(灰柱)、PVR-Fc野生型对照(黑柱)或仅培养基(白柱)预先处理，然后在有或无人IL-2下添加至标靶细胞。在24小时后收集培养上清液，并藉由ELISA(R&DSystems,Minneapolis,MN)分析IFN-γ含量。
图8：FACS分析PVR变异体与TIGIT、CD226及PVRL3之间的结合交互作用。HEK-293T细胞经编码PVR-CD4TM-GFP、PVR S72N变异体CD4TM-GFP、PVR Q82K变异体CD4TM-GFP或PVR Q82K+S72N双变异体CD4TM-GFP的cDNA表达载体过渡性转染。经24小时后，细胞与可溶性TIGIT-Fc融合蛋白、CD226-Fc融合蛋白或PVRL3-Fc融合蛋白混合，接着利用PE共轭的抗人Fc二级抗体染色。接着藉由流式细胞分析融合蛋白结合。
具体实施方式
本发明的详细说明
本发明提供调节免疫反应的新颖剂，其包括但不限于多肽、可溶性受体及抗体。该剂包括与细胞交互作用及免疫反应信号传导有关的免疫球蛋白超家族的受体成员的促效剂及拮抗剂。本发明亦提供相关的多肽及多核苷酸、包含该剂的组合物及制备该剂的方法。本发明提供筛选调节免疫反应的剂的方法。本发明进一步提供使用该新颖剂的方法，例如活化免疫反应的方法、刺激免疫反应的方法、促进免疫反应的方法、增加免疫反应的方法、活化自然杀手细胞(NK)及/或T细胞的方法、增加NK细胞及/或T细胞的活性的方法、促进NK细胞及/或T细胞的活性的方法、抑制肿瘤生长的方法，及/或治疗癌的方法。
I.定义
为了促进对本发明的了解，以下定义一些用语及用词。
此处所使用的用语“促效剂”及“促效性”系指或描述可直接或间接地实质上诱导、活化、促进、增加或增强标靶及/或途径的生物活性的剂。此处所使用的用语“促效剂”包括任何部分或完全诱导、活化、促进、增加或增强蛋白活性的剂。适当的促效剂特别包括但不限于促效抗体或其片段、可溶性受体、其他融合蛋白、多肽及小分子。
此处所使用的用语“拮抗剂”及“拮抗性”系指或描述可直接或间接、部分或完全阻断、抑制、减少或中和标靶及/或途径的生物活性的剂。此处所使用的用语“拮抗剂”包括任何部分或完全阻断、抑制、减少或中和蛋白活性的剂。适当的拮抗剂特别包括但不限于拮抗抗体或其片段、可溶性受体、其他融合蛋白、多肽及小分子。
此处所使用的用语“调节”系指生物活性的改变或变化。调节包括但不限于刺激或抑制活性。调节可为增加或减少活性、改变结合特性，或任何其他与蛋白、途径、系统或其他生物性关注标靶的活性有关的生物、功能或免疫特性的改变。
此处使用的用语“可溶性受体”系指受体蛋白在该受体的第一跨膜结构域之前的胞外片段，其可以可溶形式自细胞分泌。用语“可溶性受体”包含：包含完整胞外域的分子或该胞外域的片段。
此处使用的用语“连接子”或“连接子区”系指插入第一多肽(例如PVR成分)与第二多肽(例如Fc区)之间的连接子。在一些实施方式中，该连接子系肽连接子。连接子不应不良影响该多肽的表达、分泌或生物活性。较佳地，连接子不具抗原性且不诱发免疫反应。
用语“选择性结合”或“特异性结合”系指结合剂相较于替代性物质包括相关及非相关蛋白，以更频繁、更快速、更长时间、更高亲和性或上述方式的某些组合与表位、蛋白或标靶分子反应或结合。在某些实施方式中，“特异性结合”系指例如结合剂以大约0.1mM或更低，但通常低于大约1μM的KD与蛋白或标靶结合。在某些实施方式中，“特异性结合”系指结合剂以至少约0.1μM或更低、至少约0.01μM或更低或至少约1nM或更低的KD与标靶结合。由于不同物种的同源性蛋白之间具有序列一致性，特异性结合可包括辨识超过一种物种的蛋白或标靶的结合剂。同样地，由于不同蛋白的多肽序列的某些区域内具有同源性，因此特异性结合可包括辨识超过一种蛋白或标靶的结合剂。应了解的是，在某些实施方式中，与第一标靶特异性结合的结合剂可能或可能不与第二标靶特异性结合。因此，“特异性结合”不一定表示(虽然可包括)排他性结合(即与单一标靶结合)。因此，在某些实施方式中，结合剂与一种以上的标靶特异性结合。在某些实施方式中，多重标靶可能由结合剂上的相同的抗原结合部位结合。举例来说，在某些情况下，抗体可能包含二个完全相同的抗原结合部位，该二个抗原结合部位各自与二或多个蛋白上的相同表位特异性结合。在某些可供选择的实施方式中，抗体可能为双特异性且包含至少二个具有不同特异性的抗原结合部位。以非限制性实例而言，双特异性抗体可包含辨识一蛋白上的表位的一抗原结合部位，另包含辨识第二蛋白上的不同表位的第二、不同抗原结合部位。一般来说(但不必然)，所谓的结合系指特异性结合。
用语“多肽”和“肽”以及“蛋白”在此处可交换使用，这些用语系指任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可为线性或分支，其可能包含经修饰的氨基酸，且其可能被非氨基酸中断。所述用语亦包含经天然或人为干预修饰的氨基酸聚合物；例如双硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操纵或修饰，诸如与标记成份共轭。该定义亦包括例如包含一或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸)的多肽，以及包含该领域习知的其他修饰的多肽。应了解的是，由于本发明的多肽可能以抗体或免疫球蛋白超家族的其他成员为主，因此在某些实施方式中，该多肽可能为单链或相连的多个链。
用语“多核苷酸”及“核酸”及“核酸分子”在此处可交换使用，系指任何长度的核苷酸的聚合物，包括DNA及RNA。该核苷酸可为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基及/或它们的类似物，或任何可藉由DNA或RNA聚合酶被纳入聚合物中的底物。
在提及二或多个核酸或多肽时，用语“一致”或百分比“一致性”系指当二或多个序列或子序列经比较及比对(需要时导入间格)以达最高对应性且不把任何保守性氨基酸置换当作序列一致性的部分时，该二或多个序列或子序列系相同或具有相同的特定百分比的核苷酸或氨基酸残基。该百分比一致性可利用序列比较软件或算法测量，或藉由目视检查测量。多种可被用于取得氨基酸或核苷酸序列比对的算法及软件系该领域所广为周知。所述算法及软件包括但不限于BLAST、ALIGN、Megalign、BestFit、GCGWisconsin软件包及它们的变化性产品。在一些实施方式中，本发明的二个核酸或多肽系实质上一致，表示当它们经比较或比对以达最高对应性时，利用序列比较算法或目视检查得知它们具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％且在一些实施方式中至少95％、96％、97％、98％、99％的核苷酸或氨基酸残基一致性。在一些实施方式中，一致性存在于至少约10、至少约20、至少约40至60残基、至少约60至80残基长度或介于之间的任何整数长度的序列区域。在一些实施方式中，一致性存在于60至80残基以上的更长区域，诸如至少约80至100残基，且在一些实施方式中所述序列系与经比较的全长序列诸如核苷酸序列的编码区域实质上一致。
“保守性氨基酸置换”系指其中一个氨基酸残基被另一个具有类似侧链的氨基酸残基替代的置换。具有类似侧链的氨基酸残基群系于该领域中定义，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。举例来说，以苯丙氨酸置换酪氨酸系保守性置换。通常，本发明的多肽、可溶性受体及/或抗体的序列中的保守性置换，不废除含有该氨基酸序列的多肽、可溶性受体或抗体与该标靶结合部位的结合。识别不消除结合性的核苷酸及氨基酸保守性置换的方法系该领域所广为周知。
此处所使用的用语“载体”系指建构物，该建构物能在宿主细胞中递送及通常表达一或多种感兴趣的基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒性载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体、与阳离子缩合剂有关的DNA或RNA表达载体，及包封于脂质体中的DNA或RNA表达载体。
经“分离”的多肽、可溶性受体、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物，系呈现未见于天然中的形式的多肽、可溶性受体、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。经分离的多肽、可溶性受体、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括该些经纯化至一定程度而使它们不再以见于天然中的形式存在者。在一些实施方式中，经纯化的多肽、可溶性受体、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物系实质上纯的。
此处所使用的用语“实质上纯的”系指其为至少50％纯的(即不含污染物)、至少90％纯的、至少95％纯的、至少98％纯的或至少99％纯的物质。
此处所使用的用语“免疫反应”包括来自先天免疫系统及后天免疫系统的反应。其包括T细胞及B细胞反应(例如细胞介导性及/或体液性免疫反应)，以及来自免疫系统的其他细胞的反应，例如自然杀手(NK)细胞(NK)、单核细胞、巨噬细胞等。
此处所使用的用语“癌”及“癌性”系指称或描述哺乳动物的生理状况，其中细胞群具有未受调节的细胞生长的特征。癌的实例包括但不限于癌(carcinoma)、胚细胞瘤、肉瘤及血液性癌诸如淋巴瘤及白血病。
此处所使用的用语“肿瘤”及“瘤(neoplasm)”系指任何由过度细胞生长或增生所导致的组织团块，不论是良性(非癌性)或包括癌前性病灶的恶性(癌性)。
此处所使用的用语“转移”系指癌藉以自原发部位扩散或转移至身体其他区域且在新位置发展类似癌性病灶的过程。“转移”或“转移性”细胞系指与邻近细胞丧失黏着接触且经由血流或淋巴自疾病的原发部位移动以入侵邻近身体结构的细胞。
用语“癌干细胞”、“CSC”、“肿瘤干细胞”及“肿瘤起始细胞”在此处可交换使用，系指源自癌或肿瘤且具有下列特性的细胞：(1)具有广泛增生能力，(2)能进行不对称细胞分裂以产生一或多种类型的经分化的细胞后代，其中该经分化的细胞具有减少的增生或发育能力，及(3)能进行对称细胞分裂以自我更新或自我维持。这些特性授予癌干细胞在连续移植至适当宿主(例如小鼠)时能形成或建立肿瘤或癌的能力，大部分肿瘤细胞无法形成肿瘤。癌干细胞以混乱方式进行自我更新及分化，以形成具有异常细胞类型的肿瘤，该细胞类型可在将来突变发生时改变。
用语“癌细胞”及“肿瘤细胞”系指源自癌或肿瘤或癌前病灶的整体细胞族群，包括非肿瘤发生性细胞(其包含大部分的肿瘤细胞族群)及肿瘤发生性干细胞(癌干细胞)。此处使用的用语“癌细胞”或“肿瘤细胞”当仅用于指称该些缺乏更新及分化能力的细胞时，将由用语“非肿瘤发生性”修饰以区别该些肿瘤细胞与癌干细胞。
此处所使用的用语“肿瘤发生性”系指癌干细胞的功能特性，包括自我更新(导致额外的肿瘤发生性癌干细胞)及增生以产生所有其他肿瘤细胞(导致经分化及因此非肿瘤发生性肿瘤细胞)的特性。
此处所使用的用语“肿瘤发生性”系指源自肿瘤的随机细胞样本在连续移植至适当宿主(例如小鼠)时形成明显肿瘤的能力。
用语“受试者”系指任何动物(例如哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长动物、犬、猫、啮齿动物及该类似动物，该动物将成为特定治疗的接受者。通常，关于人受试者的用语“受试者”及“病患”在此处可交换使用。
用语“医药上可接受”系指经联邦或州政府的管理机关核准(或可核准)或经明列于美国药典或其他普遍公认的药典中的用于动物(包括人)的物质。
用语“医药上可接受的赋形剂、载剂或佐剂”或“可接受的医药载剂”系指可与本发明的至少一种结合剂(例如抗体)一起投予至受试者的赋形剂、载剂或佐剂，且该赋形剂、载剂或佐剂不破坏它们的药理活性，且当以足以递送治疗效应的剂量投予时不具毒性。
用语“有效量”或“治疗有效量”或“治疗效应”，系指有效“治疗”受试者(例如哺乳动物)的疾病或疾患的结合剂、可溶性受体、抗体、多肽、多核苷酸、小型有机分子或其他药物的量。以癌或肿瘤为例，剂(例如可溶性受体或抗体)的治疗有效量具有治疗效应且因此可增强免疫反应、增强抗肿瘤反应、增强免疫细胞的溶细胞活性、增强免疫细胞杀灭肿瘤细胞、减少肿瘤细胞的数量；降低肿瘤发生性、肿瘤发生频率或肿瘤发生能力；减少癌干细胞的数量或频率；减少肿瘤大小；减少癌细胞群；抑制或停止癌细胞浸润至外围器官包括例如癌扩散至软组织及骨；抑制及停止肿瘤或癌细胞转移；抑制及停止肿瘤或癌细胞生长；缓解一或多种与癌相关的症状的严重程度；减少发病率及死亡率；促进生活质量；或所述效应的组合。
用语“治疗”或“缓和”系指(1)治疗性措施，该措施治愈、减缓、减轻经诊断的病理状况或疾患的症状及/或停止该经诊断的病理状况或疾患的进展及(2)预防性或防范性措施，该措施预防或减缓标靶病理状况或疾患的发展。因此该些需要治疗者包括该些已罹患该疾患者、该些易于罹患该疾患者，以及该些欲预防该疾患者。以癌或肿瘤为例，受试者系经本发明的方法成功“治疗”，若该病患显示下列一或多项：增强免疫反应、增强抗肿瘤反应、增强免疫细胞的溶细胞活性、增强免疫细胞杀灭肿瘤细胞、癌细胞的数量减少或完全消失；肿瘤大小减少；抑制或缺乏癌细胞浸润至外围器官包括癌细胞扩散至软组织及骨；抑制或缺乏肿瘤或癌细胞转移；抑制或缺乏癌生长；缓解一或多种与该特定癌相关的症状；减少发病率及死亡率；改善生活质量；减少肿瘤发生性；减少癌干细胞的数量或频率；或一些效应的组合。
如本揭示内容及申请专利范围中所使用者，单数形式的“一”(a,an)及“该”(the)包含复数形式除非上下文另外清楚地说明。
应了解的是，只要此处的实施方式系以用语“包含”描述，其亦提供其他以“由...组成”及/或“实质上由...组成”的用语所描述的类似实施方式。也应了解的是，只要此处的实施方式系以用语“实质上由...组成”描述，其亦提供其他以“由...组成”的用语所描述的类似实施方式。
如此处所使用，提及“约”或“大约”某数值或参数时，其包括(且描述)与该数值或参数相关的实施方式。举例来说，“约X”的叙述包括“X”的叙述。
当使用于此处诸如“A及/或B”的词组中，用语“及/或”系意图包括A及B两者、A或B、A(单独)及B(单独)。同样地，使用于词组诸如“A、B及/或C”中的用语“及/或”系意图包含下列实施方式中的各者：A、B及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A(单独)；B(单独)；及C(单独)。
II.结合剂
本发明提供与免疫球蛋白超家族(特别是PVR家族)的成员结合的剂。PVR家族包括但不限于脊髓灰质炎病毒受体(PVR)、脊髓灰质炎病毒受体相关蛋白1(PVRL1)、脊髓灰质炎病毒受体相关蛋白2(PVRL2)、脊髓灰质炎病毒受体相关蛋白3(PVRL3)、脊髓灰质炎病毒受体相关蛋白4(PVRL4)、具有Ig及ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、CD226及CD96。这些蛋白在结构及功能上皆大致相关。该受体为第一型跨膜蛋白，其通常由含有一或多个免疫球蛋白(Ig)样结构域的胞外域(ECD)、单一跨膜结构域及细胞质尾组成。该受体经由它们的N端Ig样结构域介导交互作用，所述结构域通常与相对细胞表面上的其他Ig样结构域结合(嗜同性交互作用)，且亦与整合素及碳水化合物交互作用(嗜异性交互作用)(Wong et al.,2012,Int.J.Cell Biol.；epub)。
人脊髓灰质炎病毒受体(PVR)系70kD蛋白，其包含三个Ig样胞外域、一跨膜结构域及一细胞质尾。该Ig样结构域包括一N端V型结构域，其后为二个C2型结构域。PVR主要见于内皮细胞、单核细胞、上皮细胞及中枢神经系统细胞。PVR涉及与CD226、CD96、PVRL3及玻连蛋白有关的细胞-细胞交互作用及细胞-基质交互作用。PVR亦称为CD155、类连接蛋白5及NECL-5。
人脊髓灰质炎病毒受体相关蛋白1至4(PVRL1-4)皆具有类似PVR的结构，即三个Ig样结构域(包括一N端V型结构域，其后为二个C2型结构域)、一跨膜结构域及一细胞质尾。PVRL1广泛表达于内皮细胞、上皮细胞、神经元细胞、巨核细胞及CD34阳性干细胞上。PVRL1的功能为单纯疱疹病毒(HSV-1及HSV-2)的受体，且与细胞连结的形成有关。PVRL1又名CD111、连接蛋白1、HVEC、HLGR及PRR1。与PVRL1类似，PVRL2广泛表达于内皮细胞、上皮细胞、神经元细胞、巨核细胞及CD34阳性干细胞上，其功能为HSV的受体。此外，其与细胞连结的形成有关且与CD226和其他PVR家族成员交互作用。PVRL2又名CD112、连接蛋白2、HVEB及PRR2。PVRL3及PVRL4似乎仅微弱表达于大部分正常细胞上，然而与PVRL1及PVRL2类似的是，PVRL3及PVRL4与细胞连结的形成有关。此外，PVRL4被识别为麻疹病毒的受体。PVRL3又名CD113及连接蛋白3，而PVRL4又名连接蛋白4、LNIR及PRR4。
CD226系约65kD的糖蛋白，其包含二个Ig样结构域(其包括二个C2型结构域)，随后为一跨膜结构域及一细胞质尾(其包含免疫受体酪氨酸基底活化模体(ITAM))。CD226系见于自然杀手细胞(NK)、单核细胞、巨噬细胞、T细胞、巨核细胞及B细胞亚群的表面上。CD226与PVR及PVRL2结合，其似乎与NK细胞及T细胞的活化有关。此受体又名DNAM-1、PTA-1及TLiSA1。
TIGIT系26kD的蛋白，其包含一个Ig样V型结构域，随后为一跨膜结构域及一细胞质尾(其包含二个免疫受体酪氨酸基底抑制模体(ITIM))。TIGIT见于NK细胞及大部分活化T细胞的表面上，但在未受刺激的淋巴球上含量低或为阴性。TIGIT与PVR、PVRL2、PVRL3及PVRL4结合，似乎对T细胞及NK细胞皆具有抑制功能。此受体又名VSIG9、Vstm3及WUCAM。
CD96系160kD蛋白，其包含三个Ig样结构域(其包括二个V型结构域及一个C2型结构域)，随后为一跨膜结构域及一包含ITIM模体的胞质尾。CD96系表达于NK细胞及T细胞的表面上。CD96与PVR结合，并被认为CD96的主要功能为介导NK细胞与其他表达PVR的细胞的黏附。然而，ITIM的存在显示CD96亦可能具有抑制功能。此受体又名tactile。
人PVR、PVRL1-4、TIGIT、CD226及CD96的全长氨基酸(aa)序列系该领域所知，在此处提供为SEQ IDNO:1(PVR)、SEQ ID NO:2(PVRL 1)、SEQ ID NO:3(PVRL2)、SEQ ID NO:4(PVRL3)、SEQ ID NO:5(PVRL4)、SEQ ID NO:6(TIGIT)、SEQ ID NO:7(CD96)及SEQ IDNO:8(CD226)。如此处所使用，当提及对应“野生型蛋白”的氨基酸位置，系指全长氨基酸序列(包括信号序列)的编号。
在某些实施方式中，该结合剂系多肽。在一些实施方式中，该结合剂包含可溶性受体。在某些实施方式中，该结合剂系可溶性受体。在某些实施方式中，该结合剂系双特异性剂。在某些实施方式中，该结合剂(例如可溶性受体或多肽)包含PVR变异体。如此处所使用，“变异体”蛋白对应野生型蛋白的氨基酸包含一或多种氨基酸的置换、删除及/或添加。在一些实施方式中，该PVR变异体包含人PVR的一或多种Ig样结构域。在某些实施方式中，该PVR变异体包含人PVR的N端IgV结构域，其中该PVR变异体相较于野生型PVR包含一或多种氨基酸置换。在某些实施方式中，该PVR变异体实质上由人PVR的N端IgV结构域组成，其中该PVR变异体相较于野生型PVR包含一或多种氨基酸置换。在一些实施方式中，该PVR变异体包含人PVR的N端IgV结构域及一个IgC2结构域，其中该PVR变异体相较于野生型PVR包含一或多种氨基酸置换。在一些实施方式中，该PVR变异体包含人PVR的N端IgV结构域及二个IgC2结构域，其中该PVR变异体相较于野生型PVR包含一或多种氨基酸置换。在一些实施方式中，该PVR变异体包含对应野生型PVR的氨基酸40至143的一或多种氨基酸的置换。在一些实施方式中，该PVR变异体包含对应野生型PVR的氨基酸60至90的一或多种氨基酸的置换。在一些实施方式中，该PVR变异体包含对应野生型PVR的氨基酸125至133的一或多种氨基酸的置换。在一些实施方式中，该PVR变异体包含对应野生型PVR的氨基酸60至90及125至133的一或多种氨基酸的置换。在一些实施方式中，该PVR变异体包含对应野生型PVR的氨基酸65、67、72、73、74、81、82、84及85的一或多种氨基酸的置换。在一些实施方式中，该PVR变异体包含对应野生型PVR的氨基酸72的氨基酸置换。在一些实施方式中，该PVR变异体包含对应野生型PVR的氨基酸82的氨基酸置换。在一些实施方式中，该PVR变异体包含对应野生型PVR的氨基酸72及82的一或多种氨基酸的置换。在一些实施方式中，该PVR变异体包含选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO:18、SEQID NO:19、SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:21。
在某些实施方式中，该结合剂(例如可溶性受体或多肽)包含PVRL1变异体。在一些实施方式中，该PVRL1变异体包含人PVRL1的一或多种Ig样结构域。在某些实施方式中，该PVRL1变异体包含人PVRL1的N端IgV结构域，其中该PVRL1变异体相较于野生型PVRL1包含一或多种氨基酸置换。在某些实施方式中，该PVRL1变异体实质上由人PVRL1的N端IgV结构域组成，其中该PVRL1变异体相较于野生型PVRL1包含一或多种氨基酸置换。在一些实施方式中，该PVRL1变异体包含人PVRL1的N端IgV结构域及一个IgC2结构域，其中该PVRL1变异体相较于野生型PVRL1包含一或多种氨基酸置换。在一些实施方式中，该PVRL1变异体包含人PVRL1的N端IgV结构域及二个IgC2结构域，其中该PVRL1变异体相较于野生型PVRL1包含一或多种氨基酸置换。在一些实施方式中，该PVRL1变异体包含对应野生型PVRL1的氨基酸41至144的一或多种氨基酸的置换。在一些实施方式中，该PVRL1变异体包含对应野生型PVRL1的氨基酸61至93的一或多种氨基酸的置换。在一些实施方式中，该PVRL1变异体包含对应野生型PVRL1的氨基酸126至134的一或多种氨基酸的置换。在一些实施方式中，该PVRL1变异体包含对应野生型PVRL1的氨基酸61至93及126至134的一或多种氨基酸的置换。
在某些实施方式中，该结合剂(例如可溶性受体或多肽)包含PVRL2变异体。在一些实施方式中，该PVRL2变异体包含人PVRL2的一或多种Ig样结构域。在某些实施方式中，该PVRL2变异体包含人PVRL2的N端IgV结构域，其中该PVRL2变异体相较于野生型PVRL2包含一或多种氨基酸置换。在某些实施方式中，该PVRL2变异体实质上由人PVRL2的N端IgV结构域组成，其中该PVRL2变异体相较于野生型PVRL2包含一或多种氨基酸置换。在一些实施方式中，该PVRL2变异体包含人PVRL2的N端IgV结构域及一个IgC2结构域，其中该PVRL2变异体相较于野生型PVRL2包含一或多种氨基酸置换。在一些实施方式中，该PVRL2变异体包含人PVRL2的N端IgV结构域及二个IgC2结构域，其中该PVRL2变异体相较于野生型PVRL2包含一或多种氨基酸置换。在一些实施方式中，该PVRL2变异体包含对应野生型PVRL2的氨基酸45至160的一或多种氨基酸的置换。在一些实施方式中，该PVRL2变异体包含对应野生型PVRL2的氨基酸64至97的一或多种氨基酸的置换。在一些实施方式中，该PVRL2变异体包含对应野生型PVRL2的氨基酸142至150的一或多种氨基酸的置换。在一些实施方式中，该PVRL2变异体包含对应野生型PVRL2的氨基酸64至97及142至150的一或多种氨基酸的置换。
在某些实施方式中，该结合剂(例如可溶性受体或多肽)包含PVRL3变异体。在一些实施方式中，该PVRL3变异体包含人PVRL3的一或多种Ig样结构域。在某些实施方式中，该PVRL3变异体包含人PVRL3的N端IgV结构域，其中该PVRL3变异体相较于野生型PVRL3包含一或多种氨基酸置换。在某些实施方式中，该PVRL3变异体实质上由人PVRL3的N端IgV结构域组成，其中该PVRL3变异体相较于野生型PVRL3包含一或多种氨基酸置换。在一些实施方式中，该PVRL3变异体包含人PVRL3的N端IgV结构域及一个IgC2结构域，其中该PVRL3变异体相较于野生型PVRL3包含一或多种氨基酸置换。在一些实施方式中，该PVRL3变异体包含人PVRL3的N端IgV结构域及二个IgC2结构域，其中该PVRL3变异体相较于野生型PVRL3包含一或多种氨基酸置换。在一些实施方式中，该PVRL3变异体包含对应野生型PVRL3的氨基酸68至168的一或多种氨基酸的置换。在一些实施方式中，该PVRL3变异体包含对应野生型PVRL3的氨基酸86至117的一或多种氨基酸的置换。在一些实施方式中，该PVRL3变异体包含对应野生型PVRL3的氨基酸150至158的一或多种氨基酸的置换。在一些实施方式中，该PVRL3变异体包含对应野生型PVRL3的氨基酸86至117及150至158的一或多种氨基酸的置换。
在某些实施方式中，该结合剂(例如可溶性受体或多肽)包含PVRL4变异体。在一些实施方式中，该PVRL4变异体包含人PVRL4的一或多种Ig样结构域。在某些实施方式中，该PVRL4变异体包含人PVRL4的N端IgV结构域，其中该PVRL4变异体相较于野生型PVRL4包含一或多种氨基酸置换。在某些实施方式中，该PVRL4变异体实质上由人PVRL4的N端IgV结构域组成，其中该PVRL4变异体相较于野生型PVRL4包含一或多种氨基酸置换。在一些实施方式中，该PVRL4变异体包含人PVRL4的N端IgV结构域及一个IgC2结构域，其中该PVRL4变异体相较于野生型PVRL4包含一或多种氨基酸置换。在一些实施方式中，该PVRL4变异体包含人PVRL4的N端IgV结构域及二个IgC2结构域，其中该PVRL4变异体相较于野生型PVRL4包含一或多种氨基酸置换。在一些实施方式中，该PVRL4变异体包含对应野生型PVRL4的氨基酸42至147的一或多种氨基酸的置换。在一些实施方式中，该PVRL4变异体包含对应野生型PVRL4的氨基酸62至94的一或多种氨基酸的置换。在一些实施方式中，该PVRL4变异体包含对应野生型PVRL4的氨基酸129至137的一或多种氨基酸的置换。在一些实施方式中，该PVRL4变异体包含对应野生型PVRL4的氨基酸62至94及129至137的一或多种氨基酸的置换。
PVR、PVRL1、PVRL2、PVRL3、PVRL4、TIGIT、CD96及CD226的胞外域(ECD)系提供为SEQ ID NO:9至16(不含预测的信号序列)。本领域技术人员对于对应各种ECD结构域的确切氨基酸的了解可能互异。因此，此处所述的ECD的N端及/或C端可能延长或缩短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸。对于ECD内的各个Ig型结构域，此亦为真。
人TIGIT及人CD96系抑制性受体，它们经由其ITIM介导它们的活性，并被认为具有抑制免疫反应的能力。相反地，人CD226系活化受体，其经由ITAM介导其活性，并被认为具有活化免疫反应的能力。TIGIT、CD96及CD226皆表达于NK细胞及T细胞上。这三种受体皆被显示与PVR结合，其中TIGIT相较于CD96及CD226具有最高的PVR亲和性。在许多情况下，似乎以TIGIT的抑制作用为主，因此抗原刺激(例如肿瘤、病毒、感染)引起的免疫反应被减少或抑制。不希望受理论的束缚，吾人认为经由调控抑制性受体TIGIT及/或CD96，可活化及/或增加强烈免疫反应。例如，强烈免疫反应可利用与TIGIT特异性交互作用、但不活化信号传导的结合剂(即“阻断剂”)达成，其中该剂不与CD226结合及/或不影响CD226的活化，因而允许例如NK细胞及/或T细胞的活性增加。若该结合剂与TIGIT及CD96二者专一性交互作用，而不活化这些分子的任何抑制性信号传导，则可强化免疫反应。此可让CD226信号传导成为主要作用，导致强烈或更强烈的免疫反应。
因此，在一些实施方式中，该结合剂(例如可溶性受体)干扰PVR与TIGIT之间的交互作用。在一些实施方式中，该结合剂干扰PVR与TIGIT之间的交互作用及PVR与CD96之间的交互作用。在一些实施方式中，该结合剂干扰PVR与CD96之间的交互作用。在一些实施方式中，该结合剂干扰PVR与TIGIT之间的交互作用，但不干扰PVR与CD226之间的交互作用。在一些实施方式中，该结合剂干扰PVR与TIGIT之间的交互作用及PVR与CD96之间的交互作用，但不干扰PVR与CD226之间的交互作用。在一些实施方式中，该结合剂干扰PVR与CD96之间的交互作用，但不干扰PVR与CD226之间的交互作用。在一些实施方式中，该结合剂包含含有PVR变异体的可溶性受体，其中该结合剂干扰PVR与TIGIT之间的交互作用、PVR与CD96之间的交互作用，但不干扰PVR与CD226之间的交互作用。在一些实施方式中，该结合剂包含含有PVRL2变异体的可溶性受体，其中该结合剂干扰PVRL2与TIGIT之间的交互作用，但不干扰PVRL2与CD226之间的交互作用。
在一些实施方式中，该结合剂(例如可溶性受体)与人TIGIT的胞外域特异性结合。在一些实施方式中，该结合剂与人CD96的胞外域特异性结合。在一些实施方式中，该结合剂与人TIGIT的胞外域特异性结合且与CD96的胞外域结合。在一些实施方式中，该结合剂与人TIGIT的胞外域特异性结合且不与人CD226的胞外域结合(或与之微弱结合)。在一些实施方式中，该结合剂与人CD96的胞外域特异性结合且不与CD226的胞外域结合(或与之微弱结合)。在一些实施方式中，该结合剂与人TIGIT的胞外域特异性结合且与CD96的胞外域结合，但不与人CD226的胞外域结合(或与之微弱结合)。在一些实施方式中，该结合剂包含含有PVR变异体的可溶性受体，其中该结合剂与TIGIT及CD96特异性结合且不与CD226结合(或与之微弱结合)。在一些实施方式中，该结合剂包含含有PVRL2变异体的可溶性受体，其中该结合剂与TIGIT特异性结合且不与CD226结合(或与之微弱结合)。
在一些实施方式中，该结合剂(例如可溶性受体)与人TIGIT的胞外域特异性结合且抑制或干扰PVR与TIGIT之间的交互作用(例如结合)。在一些实施方式中，该结合剂与人TIGIT的胞外域及人CD96的胞外域特异性结合，且抑制或干扰PVR与TIGIT之间的交互作用(例如结合)及PVR与CD96之间的交互作用(例如结合)。在一些实施方式中，该结合剂与人TIGIT的胞外域特异性结合且抑制或干扰PVR与TIGIT之间的交互作用(例如结合)，但不与人CD226的胞外域结合(或与之微弱结合)且不抑制或干扰PVR与CD226之间的交互作用(例如结合)。在一些实施方式中，该结合剂与人TIGIT的胞外域及人CD96的胞外域特异性结合且抑制或干扰PVR与TIGIT之间的交互作用(例如结合)及PVR与CD96之间的交互作用(例如结合)，但不与人CD226的胞外域结合(或与之微弱结合)且不抑制或干扰PVR与CD226之间的交互作用(例如结合)。在一些实施方式中，该结合剂包含含有PVR变异体的可溶性受体，其中该含有PVR变异体的可溶性受体与人TIGIT的胞外域及人CD96的胞外域特异性结合且抑制或干扰PVR与TIGIT之间的交互作用(例如结合)及PVR与CD96之间的交互作用(例如结合)，但不与人CD226的胞外域结合(或与之微弱结合)且不抑制或干扰PVR与CD226之间的交互作用(例如结合)。在一些实施方式中，该结合剂包含含有PVRL2变异体的可溶性受体，其中该含有PVRL2变异体的可溶性受体与人TIGIT的胞外域特异性结合且抑制或干扰PVRL2与TIGIT之间的交互作用(例如结合)及PVR与TIGIT之间的交互作用(例如结合)，但不与人CD226的胞外域结合(或与之微弱结合)且不抑制或干扰PVR与CD226之间的交互作用(例如结合)。
在一些实施方式中，该结合剂(例如可溶性受体)包含PVR变异体，该PVR变异体与人TIGIT的胞外域特异性结合，但不与人CD226的胞外域结合(或与之微弱结合)。在一些实施方式中，该结合剂(例如可溶性受体)包含PVR变异体，该PVR变异体与人TIGIT的胞外域特异性结合且与人CD96的胞外域特异性结合，但不与人CD226的胞外域结合(或与之微弱结合)。在一些实施方式中，该PVR变异体系如此处所述的PVR变异体。在一些实施方式中，该PVR变异体包含选自SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:21的序列。
在一些实施方式中，该结合剂(例如可溶性受体或多肽)包含PVRL2变异体，该PVRL2变异体与人TIGIT的胞外域特异性结合，但不与人CD226的胞外域结合(或与之微弱结合)。在一些实施方式中，该PVRL2变异体系如此处所述的PVRL2变异体。在一些实施方式中，该PVRL2变异体包含SEQ ID NO:38。
在一些实施方式中，该结合剂与人TIGIT的胞外域特异性结合且抑制或干扰PVRL2与TIGIT之间的交互作用(例如结合)。在一些实施方式中，该结合剂与人TIGIT的胞外域特异性结合且抑制或干扰PVRL2与TIGIT之间的交互作用(例如结合)，但不与人CD226的胞外域结合(或与之微弱结合)且不抑制或干扰PVRL2与CD226之间的交互作用(例如结合)。
在一些实施方式中，该结合剂(例如可溶性受体)包含PVRL3变异体，该PVRL3变异体与人TIGIT的胞外域特异性结合。在一些实施方式中，该结合剂(例如可溶性受体)包含PVRL4变异体，该PVRL4变异体与人TIGIT的胞外域特异性结合。
在一些实施方式中，该结合剂与人TIGIT的胞外域特异性结合且抑制或干扰PVRL3与TIGIT之间的交互作用(例如结合)。在一些实施方式中，该结合剂与人TIGIT的胞外域特异性结合且抑制或干扰PVRL4与TIGIT之间的交互作用(例如结合)。
在一些实施方式中，该结合剂系TIGIT结合剂，其包含人PVR变异体的一或多种Ig样结构域。在一些实施方式中，该结合剂系CD96结合剂，其包含人PVR变异体的一或多种Ig样结构域。在一些实施方式中，该结合剂系TIGIT及CD96结合剂，其包含人PVR变异体的一或多种Ig样结构域。在一些实施方式中，该TIGIT结合剂包含人PVR变异体且不与CD226结合(或与之微弱结合)。
在一些实施方式中，该结合剂(例如可溶性受体)系融合蛋白。此处所使用的“融合蛋白”系由包含至少二种基因的核苷酸序列的核酸分子表达的杂合蛋白。在某些实施方式中，该结合剂(例如可溶性受体或多肽)另包含非PVR多肽。在一些实施方式中，可溶性受体可包括与非PVR多肽连接的PVR家族成员ECD或其片段(例如Ig样结构域)，该非PVR多肽包括但不限于人Fc区、蛋白标签(例如myc、FLAG、GST)、其他内源性蛋白或蛋白片段，或任何其他可用的蛋白序列包括在ECD与第二多肽之间的任何连接子区。在某些实施方式中，该非PVR多肽包含人Fc区。在某些实施方式中，该非PVR多肽实质上由人Fc区组成。在某些实施方式中，该非PVR多肽由人Fc区组成。该Fc区可自任一类型的免疫球蛋白如IgG、IgA、IgM、IgD及IgE获得。在一些实施方式中，该Fc区系人IgG1 Fc区。在一些实施方式中，该Fc区系人IgG2 Fc区。在一些实施方式中，该Fc区系野生型Fc区。在一些实施方式中，该Fc区系包含天然氨基酸变异的野生型Fc区。在一些实施方式中，该Fc区系成熟或经修饰的Fc区。在一些实施方式中，该Fc区的N端系经截短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸(例如在铰链结构域)。在一些实施方式中，该Fc区的C端系经截短一或更多个氨基酸(例如缺少C端赖氨酸)。在一些实施方式中，在铰链结构域的氨基酸系经改变以阻止非所欲的双硫键形成。在一些实施方式中，半胱氨酸系经不同氨基酸置换以阻止非所欲的双硫键形成。在一些实施方式中，半胱氨酸系经丝氨酸置换以阻止非所欲的双硫键形成。在一些实施方式中，该Fc区系经修饰以促进异多聚体或异二聚体分子的形成。在某些实施方式中，该非PVR多肽包含SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48。在某些实施方式中，该非PVR多肽实质上由SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48组成。
在某些实施方式中，该结合剂(例如可溶性受体)系包含至少PVR变异体ECD(或PVRL1-4变异体ECD)的片段及Fc区的融合蛋白。在一些实施方式中，该PVR变异体ECD(或其片段)的C端系与该免疫球蛋白Fc区的N端连接。在一些实施方式中，该PVR变异体ECD(或其片段)系与该Fc区直接相连(即不含插入肽连接子(intervening peptide linker))。在一些实施方式中，该PVR变异体ECD(或其片段)系经由肽连接子与该Fc区相连。
此处使用的用语“连接子”系指插入第一多肽(例如PVR变异体ECD或其片段)与第二多肽(例如Fc区)之间的连接子。在一些实施方式中，该连接子系肽连接子。连接子不应不良地影响该融合蛋白的表达、分泌或生物活性。连接子应不具抗原性且不应诱发免疫反应。适当的连接子系本领域技术人员所知，通常包括甘氨酸及丝氨酸残基的混合物，且通常包括无空间位阻的氨基酸。其他可被纳入于可用连接子的氨基酸包括苏氨酸及丙氨酸残基。连接子的长度范围广泛，例如1至50个氨基酸长度、1至22个氨基酸长度、1至10个氨基酸长度、1至5个氨基酸长度或1至3个氨基酸长度。连接子可能包括但不限于SerGly、GGSG、GSGS、GGGS、S(GGS)n其中n系1至7、GRA、聚(Gly)、聚(Ala)、ESGGGGVT(SEQ ID NO:33)、LESGGGGVT(SEQ IDNO:34)、GRAQVT(SEQ ID NO:35)、WRAQVT(SEQ IDNO:36)及ARGRAQVT(SEQ ID NO:37)。此处所使用的连接子系不包括来自该第一多肽(例如PVR变异体ECD或其片段)的C端或该第二多肽(例如Fc区)的N端的氨基酸残基的插入肽序列。
在一些实施方式中，该结合剂系包含第一多肽及第二多肽的融合蛋白，该第一多肽包含SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:38，且该第二多肽包含SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48。在一些实施方式中，该结合剂系包含第一多肽及第二多肽的融合蛋白，该第一多肽包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:21或SEQ ID NO:38，且该第二多肽包含SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28。在一些实施方式中，该结合剂系包含第一多肽及第二多肽的融合蛋白，该第一多肽包含SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:38，且该第二多肽包含SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:43或SEQ ID NO:44。在一些实施方式中，该结合剂系包含第一多肽及第二多肽的融合蛋白，该第一多肽包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或SEQ IDNO:38，且该第二多肽包含SEQ ID NO:30。在一些实施方式中，该结合剂系包含第一多肽及第二多肽的融合蛋白，该第一多肽包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:21或SEQ ID NO:38，且该第二多肽包含SEQ ID NO:31。在一些实施方式中，该结合剂系包含第一多肽及第二多肽的融合蛋白，该第一多肽包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:38，且该第二多肽包含SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:46。在一些实施方式中，该结合剂系包含第一多肽及第二多肽的融合蛋白，该第一多肽包含SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:38，且该第二多肽包含SEQ ID NO:47或SEQ IDNO:48。在一些实施方式中，该结合剂系包含第一多肽及第二多肽的融合蛋白，该第一多肽包含SEQ ID NO:18，且该第二多肽包含SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:47或SEQ ID NO:48。在一些实施方式中，该结合剂系包含第一多肽及第二多肽的融合蛋白，该第一多肽包含SEQ ID NO:19，且该第二多肽包含SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48。在一些实施方式中，该结合剂系包含第一多肽及第二多肽的融合蛋白，该第一多肽包含SEQ ID NO:20，且该第二多肽包含SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ IDNO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48。在一些实施方式中，该结合剂系包含第一多肽及第二多肽的融合蛋白，该第一多肽包含SEQ ID NO:21，且该第二多肽包含SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:43、SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48。
在一些实施方式中，该结合剂包含第一多肽及第二多肽，该第一多肽包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:38，且该第二多肽包含SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:47或SEQ ID NO:48，其中该第一多肽系与该第二多肽直接连接。在一些实施方式中，该结合剂包含第一多肽及第二多肽，该第一多肽包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21，且该第二多肽包含SEQ ID NO:30或SEQ IDNO:31，其中该第一多肽系与该第二多肽直接连接。
在一些实施方式中，该结合剂包含第一多肽及第二多肽，该第一多肽包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:38，且该第二多肽包含SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:47或SEQ ID NO:48，其中该第一多肽藉由连接子与该第二多肽连接。在一些实施方式中，该结合剂包含第一多肽及第二多肽，该第一多肽包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20或SEQ ID NO:21，且该第二多肽包含SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31，其中该第一多肽藉由连接子与该第二多肽连接。
在一些实施方式中，该结合剂包含第一多肽及第二多肽，该第一多肽包含SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21，且该第二多肽包含SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48，其中该第一多肽系与该第二多肽直接连接。在一些实施方式中，该结合剂包含第一多肽及第二多肽，该第一多肽包含SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21，且该第二多肽包含SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31，其中该第一多肽系与该第二多肽直接连接。
在一些实施方式中，该结合剂包含第一多肽及第二多肽，该第一多肽包含SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21，且该第二多肽包含SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48，其中该第一多肽藉由连接子与该第二多肽连接。在一些实施方式中，该结合剂包含第一多肽及第二多肽，该第一多肽包含SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21，且该第二多肽包含SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31，其中该第一多肽藉由连接子与该第二多肽连接。
在一些实施方式中，该结合剂包含第一多肽及第二多肽，该第一多肽系与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:38具有至少80％一致性，且该第二多肽包含SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ IDNO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48，其中该第一多肽系与该第二多肽直接连接。在一些实施方式中，该第一多肽系与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:38具有至少85％、至少90％、至少95％的一致性。
在一些实施方式中，该结合剂包含第一多肽及第二多肽，该第一多肽系与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:38具有至少80％一致性，且该第二多肽包含SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ IDNO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48，其中该第一多肽藉由连接子与该第二多肽连接。在一些实施方式中，该第一多肽系与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:38具有至少85％、至少90％、至少95％的一致性。
受体蛋白通常包含引导该蛋白运输的信号序列。信号序列(又称信号肽或前导序列)位于新生多肽的N端。它们引导该多肽至内质网且所述蛋白被分类至它们应该去的地方，例如胞器的内部空间、细胞内部的膜、细胞的外膜或经分泌至细胞外部。大部分信号序列在蛋白被运送至内质网后，藉由信号肽酶与该蛋白切割。自该多肽切割该信号序列通常发生于氨基酸序列的特定位点，且取决于该信号序列内的氨基酸残基。虽然通常有一个特定的切割位点，但信号肽酶可能识别及/或使用一个以上的切割位点，导致该多肽不相同的N端。举例来说，使用信号序列内的不同的切割位点可导致具有不同N端氨基酸的多肽的表达。因此，在一些实施方式中，此处所述的多肽可能包含具有不同N端的多肽的混合物。在一些实施方式中，该N端的长度相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸。在一些实施方式中，该N端的长度相差1、2、3、4或5个氨基酸。在一些实施方式中，该多肽为实质上相同，即该多肽具有相同的N端。在一些实施方式中，该多肽的信号序列包含一或多个(例如一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、等等)氨基酸置换及/或删除。在一些实施方式中，该多肽的信号序列包含让一个切割位点变成主要切割位点的氨基酸置换及/或删除，藉此导致具有一种N端的实质上相同的多肽。在一些实施方式中，该多肽的信号序列不是天然(例如PVR家族成员)信号序列。
本领域技术人员将了解，本发明的某些结合剂将包含融合蛋白，相较于具有大约相同免疫原性的包含天然或未经改变的Fc区的融合蛋白，其中至少部分的Fc区系经删除或以其他方式改变，以提供所欲的生化特征，例如减少的血清半衰期、增加的血清半衰期或增加的标靶细胞定位。对Fc区的修饰可能包括添加、删除或置换一或多个结构域中的一或多个氨基酸。此处所揭示的经修饰的融合蛋白可能包含对二个重链恒定结构域的一或多者(CH2或CH3)或对铰链区的改变或修饰。在其他实施方式中，整个CH2结构域可被移除(ΔCH2建构体)。在一些实施方式中，该遗漏的恒定区结构域系由短氨基酸间隔子(例如10个aa残基)置换，以提供通常由该遗漏恒定区结构域所授予的一些分子柔韧性。
在一些实施方式中，该经修饰的融合蛋白系经建构以直接连接CH3结构域与该铰链区或该第一多肽。在其他实施方式中，肽间隔子被插入该第一多肽的铰链区与经修饰的CH2及/或CH3结构域之间。举例来说，可表达其中CH2结构域被删除且剩余的CH3结构域(经修饰或未经修饰)系以5至20个氨基酸间隔子与铰链区或第一多肽连接的建构体。该间隔子可被添加以确保恒定区的调节元件维持自由及可接近，或该铰链区维持可弯折。然而，应注意氨基酸间隔子在一些情况中可能证实具有免疫原性，且诱发拮抗该建构体的非所欲免疫反应。因此，在某些实施方式中，任何添加至建构体的间隔子将为相对非免疫原性，以维持该融合蛋白的所欲生物性质。
在一些实施方式中，该经修饰的融合蛋白可能仅具有恒定结构域的部分删除或置换少数或甚至单一个氨基酸。举例来说，在CH2结构域的选择区域中的单一氨基酸突变可能足以实质上减少Fc结合，因此增加标靶细胞定位。类似地，所欲的是单纯删除该一或多个恒定区结构域中控制特定效应功能(例如补体C1q结合)的部分。该恒定区的部分删除可增进该结合剂的选择特性(例如血清半衰期)，同时保留其他与该主题恒定区结构域完整有关的所欲功能。另外，如上所述，该揭示融合蛋白的恒定区可经由一或多个氨基酸的突变或置换修饰以增进该形成建构物的特性。在这方面可能扰乱由保守性结合位点所提供的活性(例如Fc结合)，同时实质上维持该经修饰的融合蛋白的构造及免疫原性特性。在某些实施方式中，该经修饰的融合蛋白包含添加一或多个氨基酸至恒定区以增进所欲特征诸如减少或增加效应功能或提供更多细胞毒素或碳水化合物连接位点。
该领域已知的是恒定区介导数种效应功能。举例来说，补体的C1成分与(结合至抗原的)IgG或IgM抗体的Fc区结合活化该补体系统。补体活化于细胞病原体的调理作用及溶解中至为重要。补体活化亦刺激发炎反应，且亦与自体免疫超敏性有关。此外，Fc区可与表达Fc受体(FcR)的细胞结合。有一些Fc受体对不同类型的抗体具有特异性，包括IgG(γ受体)、IgE(ε受体)、IgA(α受体)及IgM(μ受体)。
因此，在某些实施方式中，该经修饰的融合蛋白提供经改变的效应功能，该经改变的效应功能因此影响该投予剂的生物特性。举例来说，在一些实施方式中，删除或不活化(经由点突变或其他方法)恒定区结构域可能减少循环中经修饰的剂与Fc受体结合，藉此增加标靶细胞定位。在其他实施方式中，恒定区修饰增加或减少剂的血清半衰期。在一些实施方式中，恒定区系经修饰以消除双硫键或寡糖连接位点。
在某些实施方式中，经修饰的融合蛋白不具有一或多种通常与Fc区有关的效应功能。在一些实施方式中，该剂不具ADCC活性及/或不具CDC活性。在某些实施方式中，该剂不与Fc受体及/或补体因子结合。在某些实施方式中，该剂不具效应功能。
本发明亦包含异二聚体分子。通常该异二聚体分子包含二种多肽。在一些实施方式中，该异二聚体分子能与至少二种标靶结合。所述标靶可为例如在单一细胞上的二种不同的受体或在二种不同细胞上的二种不同的标靶。因此，在一些实施方式中，该异二聚体分子的一多肽包含此处描述的多肽(例如与TIGIT结合)且该异二聚体分子的一多肽系抗体。在一些实施方式中，该异二聚体分子能与一标靶结合且亦包含“非结合性”功能。因此，在一些实施方式中，该异二聚体分子的一多肽包含此处描述的多肽(例如与TIGIT结合)且该异二聚体分子的一多肽系免疫反应刺激剂。此处所使用的用语“免疫反应刺激剂”系以最广泛的定义使用，系指藉由诱导任何免疫系统成分的活化或增加任何免疫系统成分的活性以直接或间接刺激免疫系统的物质。例如，免疫反应刺激剂包括细胞介素，以及各种抗原包括肿瘤抗原及衍生自病原体的抗原。在一些实施方式中，该免疫反应刺激剂包括但不限于集落刺激因子(例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、干细胞因子(SCF)、白介素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18)、阻断免疫抑制功能的抗体(例如抗CTLA4抗体、抗CD28抗体、抗CD3抗体)、类铎受体(例如TLR4、TLR7、TLR9)或B7家族的成员(例如CD80、CD86)。
在一些实施方式中，该异二聚体分子可与第一标靶(例如TIGIT)及第二标靶(例如在淋巴细胞上的效应分子(如CD2、CD3、CD28或CD80)或Fc受体(如CD64、CD32或CD16))结合，以诱发更强烈的细胞性免疫反应。
在一些实施方式中，异二聚体分子相较于个别剂具有增强的效力。本领域技术人员已知的是任何剂(例如可溶性受体或细胞介素)可具有独特的药物动力学(PK)(例如循环半衰期)。在一些实施方式中，异二聚体分子具有同步两种活性剂及/或多肽的PK的能力，其中该两种个别剂及/或多肽具有不同PK特性。在一些实施方式中，异二聚体分子具有集中两种剂及/或多肽的作用于相同区域(例如肿瘤及/或肿瘤环境)的能力。在一些实施方式中，异二聚体分子具有集中两种剂及/或多肽的作用至相同标靶(例如肿瘤或肿瘤细胞)的能力。在一些实施方式中，异二聚体分子具有靶向二种剂及/或多肽的作用至超过一种生物途径或超过一种免疫反应的态样的能力。在一些实施方式中，该异二聚体分子相较于单独的该剂及/或多肽的任一者具有减少的毒性及/或不良反应。在一些实施方式中，该异二聚体分子相较于二种个别剂及/或多肽的混合物或作为单一剂的抗体具有减少的毒性及/或不良反应。在一些实施方式中，该异二聚体分子具有增加的治疗指数。在一些实施方式中，该异二聚体分子相较于二种个别剂及/或多肽的混合物或作为单一剂的该剂及/或多肽具有增加的治疗指数。
在一些实施方式中，该结合剂系多二聚体分子，其包含第一CH3结构域及第二CH3结构域，该第一CH3结构域及第二CH3结构域各自经修饰以促进异多聚体或异二聚体的形成。在一些实施方式中，该第一及第二CH3结构域系利用突点对应孔洞技术加以修饰。在一些实施方式中，该第一及第二CH3结构域包含氨基酸的改变，所述氨基酸的改变导致不同的静电交互作用。在一些实施方式中，该第一及第二CH3结构域包含氨基酸的改变，所述氨基酸的改变导致不同的疏水性/亲水性交互作用(见例如美国专利申请案公开号2011/0123532)。
在一些实施方式中，该结合剂(例如可溶性受体或多肽)系异二聚体分子，其包含选自下列的重链恒定区：(a)第一人IgG1恒定区，其中在对应SEQ ID NO:39的位置253及292的氨基酸系经谷氨酸盐或天冬氨酸盐置换，及第二人IgG1恒定区，其中在对应SEQ ID NO:39的位置240及282的氨基酸系经赖氨酸置换；(b)第一人IgG2恒定区，其中对应SEQ ID NO:40的位置249及288的氨基酸系经谷氨酸盐或天冬氨酸盐置换，及第二人IgG2恒定区，其中对应SEQ ID NO:40的位置236及278的氨基酸系经赖氨酸置换；(c)第一人IgG3恒定区，其中对应SEQ IDNO:41的位置300及339的氨基酸系经谷氨酸盐或天冬氨酸盐置换，及第二人IgG3恒定区，其中对应SEQ ID NO:41的位置287及329的氨基酸系经赖氨酸置换；及(d)第一人IgG4恒定区，其中对应SEQ ID NO:42的位置250及289的氨基酸系经谷氨酸盐或天冬氨酸盐置换，及第二IgG4恒定区，其中对应SEQ ID NO:42的位置237及279的氨基酸系经赖氨酸置换。
在一些实施方式中，该异二聚体蛋白包含二种多肽，其中各多肽包含人IgG2 CH3结构域，且其中一IgG2 CH3结构域中对应SEQ ID NO:40的位置249及288的位置的氨基酸系经谷氨酸盐或天冬氨酸盐置换，且其中另一IgG2 CH3结构域中对应SEQ ID NO:40的位置236及278的位置的氨基酸系经赖氨酸置换。
在一些实施方式中，该结合剂(例如可溶性受体)系异二聚体分子，其包含在对应SEQ ID NO:39的位置253及292的位置具有氨基酸置换的第一人IgG1恒定区(其中所述氨基酸系经谷氨酸盐或天冬氨酸盐置换)，及在对应SEQ ID NO:39的位置240及282的位置具有氨基酸置换的第二人IgG1恒定区(其中所述氨基酸系经赖氨酸置换)。在一些实施方式中，该结合剂(例如可溶性受体)系融合蛋白，其包含在对应SEQ ID NO:40的位置249及288的位置具有氨基酸置换的第一人IgG2恒定区(其中所述氨基酸系经谷氨酸盐或天冬氨酸盐置换)，及在对应SEQ ID NO:40的位置236及278的位置具有氨基酸置换的第二人IgG2恒定区(其中所述氨基酸系经赖氨酸置换)。在一些实施方式中，该结合剂(例如可溶性受体)系融合蛋白，其包含在对应SEQ ID NO:41的位置300及339的位置具有氨基酸置换的第一人IgG3恒定区(其中所述氨基酸系经谷氨酸盐或天冬氨酸盐置换)，及在对应SEQ ID NO:41的位置287及329的位置具有氨基酸置换的第二人IgG3恒定区(其中所述氨基酸系经赖氨酸置换)。在一些实施方式中，该结合剂(例如可溶性受体)系融合蛋白，其包含在对应SEQ ID NO:42的位置250及289的位置具有氨基酸置换的第一人IgG4恒定区(其中所述氨基酸系经谷氨酸盐或天冬氨酸盐置换)，及在对应SEQ ID NO:42的位置237及279的位置具有氨基酸置换的第二人IgG4恒定区(其中所述氨基酸系经赖氨酸置换)。
在一些实施方式中，该结合剂(例如可溶性受体)系融合蛋白，其包含在对应SEQ ID NO:40的位置249及288的位置具有氨基酸置换的第一人IgG2恒定区(其中所述氨基酸系经谷氨酸盐置换)，及在对应位置236及278的位置具有氨基酸置换的第二人IgG2恒定区(其中所述氨基酸系经赖氨酸置换)。在一些实施方式中，该结合剂(例如可溶性受体)系融合蛋白，其包含在对应位置249及288的位置具有氨基酸置换的第一人IgG2恒定区(其中所述氨基酸系经天冬氨酸盐置换)，及在对应位置236及278的位置具有氨基酸置换的第二人IgG2恒定区(其中所述氨基酸系经赖氨酸置换)。
在一些实施方式中，此处所述的结合剂系单价。在一些实施方式中，该结合剂系异二聚体蛋白，其系单价。在一些实施方式中，该结合剂包含可溶性受体，其系单价。在一些实施方式中，此处所述的结合剂系双价。在一些实施方式中，此处所述的结合剂系单特异性。在一些实施方式中，此处所述的结合剂系双特异性。在一些实施方式中，此处所述的结合剂系多特异性。
在一些实施方式中，该结合剂与此处所述的可溶性受体及/或多肽系实质上同源性。这些结合剂可包含例如保守性置换突变，即以类似氨基酸置换一或多种氨基酸。例如，保守性置换系指以同类型的氨基酸置换另一者，像是例如以一酸性氨基酸置换另一酸性氨基酸、以一碱性氨基酸置换另一碱性氨基酸或以一中性氨基酸置换另一中性氨基酸。保守性氨基酸置换的目的系该领域广为周知并于此处描述。
在一些实施方式中，该结合剂系双特异性抗体。双特异性抗体可特异性辨识及结合至少二种不同表位。所述不同的表位可位于相同分子内(例如位于人TIGIT上的二个表位)或位于不同分子上(例如一表位位于TIGIT上，一表位位于CD96上)。在一些实施方式中，该双特异性抗体系单株人或人化抗体。在一些实施方式中，该抗体可特异性辨识及结合第一抗原标靶(例如TIGIT)及第二抗原标靶像是在淋巴细胞上的效应分子(例如CD2、CD3、CD28或CD80)或Fc受体(例如CD64、CD32或CD16)以使细胞性防御机制集中于表达该第一抗原标靶的细胞。在一些实施方式中，所述抗体可被用于引导细胞毒性剂至表达特定标靶抗原的细胞。这些抗体具有抗原结合臂及与细胞毒性剂或放射性核种螯合剂诸如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA结合的臂。
用于制备双特异性抗体的技术系本领域技术人员所知，见例如Millstein et al.,1983,Nature,305:537-539；Brennan et al.,1985,Science,229:81；Suresh et al.,1986,Methods in Enzymol.,121:120；Traunecker et al.,1991,EMBO J.,10:3655-3659；Shalaby et al.,1992,J.Exp.Med.,175:217-225；Kostelny et al.,1992,J.Immunol.,148:1547-1553；Gruber et al.,1994,J.Immunol.,152:5368；美国专利第5,731,168号及美国专利公开号2011/0123532。双特异性抗体可为完整抗体或抗体片段。本发明亦考虑超过两价的抗体。例如，可制备三特异性抗体(Tutt et al.,1991,J.Immunol.,147:60)。
在一些实施方式中，该结合剂系与人TIGIT的胞外域特异性结合的双特异性抗体。在一些实施方式中，该双特异性抗体与TIGIT的胞外域及CD96的胞外域特异性结合。在一些实施方式中，该结合剂系双特异性抗体，其包含与人TIGIT特异性结合的第一抗原结合部位及与人CD96特异性结合的第二抗原结合部位。在一些实施方式中，该结合剂系双特异性抗体，其包含与人TIGIT特异性结合的第一抗原结合部位及与人CD96特异性结合的第二抗原结合部位，其中该第一及第二抗原结合部位的轻链系一致。
在一些实施方式中，该结合剂系与人TIGIT的胞外域特异性结合且阻断TIGIT信号传导的双特异性抗体。在一些实施方式中，该结合剂系与人TIGIT的胞外域特异性结合且与人CD96的胞外域结合且阻断TIGIT信号传导且阻断CD96信号传导的双特异性抗体。
本发明的结合剂(例如可溶性受体或多肽)的特异性结合可使用该领域已知的任何方法检测。可使用的免疫检测包括但不限于竞争性及非竞争性检测系统，所述系统利用诸如Biacore分析、FACS分析、免疫荧光、免疫细胞化学、Western印迹分析、放射性免疫测定、ELISA、“三明治式”免疫测定、免疫沉淀分析、沉淀反应、胶体扩散沉淀反应、免疫扩散分析、凝集测定、补体固定测定、免疫放射分析、荧光免疫分析及蛋白质A免疫分析的技术。所述检测系例行性检测且为该领域中广为周知(见例如Ausubel etal.,Editors,1994-present,Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,Inc.,New York,NY)。
例如，结合剂(例如可溶性受体)与标靶例如TIGIT的特异性结合可利用ELISA测定。ELISA测定包含准备抗原，以抗原包覆96孔微量板的孔槽，添加与可检测的化合物诸如酶受质(例如辣根过氧化酶或碱性磷酸酶)共轭的结合剂至孔槽，培养一段时间后，检测与该抗原结合的结合剂的存在。在一些实施方式中，该结合剂不与可检测的化合物共轭，而是将辨识该结合剂与可检测的化合物共轭的抗体(例如与PE共轭的抗Fc抗体)添加至孔槽。在一些实施方式中，不以抗原包覆孔槽，而是以结合剂包覆孔槽，并于添加抗原至该经包覆的孔槽后加入与可检测的化合物共轭的抗体。本领域技术人员将了解可经修改以增加经检测的信号的参数以及该领域所知的ELISA的其他变量。
在另一实例中，结合剂(例如可溶性受体)与标靶的特异性结合可利用FACS测定。FACS筛选测定可包含产生cDNA建构物以表达抗原为融合蛋白(例如TIGIT-CD4TM)，将该建构物转染至细胞中，使该抗原表达在细胞表面，使该结合剂与该经转染的细胞混合，并培养一段时间。被结合剂结合的细胞可利用辨识该结合剂的与可检测的化合物共轭的二级抗体(例如与PE共轭的抗Fc抗体)及流式细胞仪分析识别。FACS筛选测定可用于识别与超过一种受体(例如TIGIT及CD96)结合的结合剂。FACS筛选测定可用于显示结合剂不与受体结合或与受体微弱结合。本领域技术人员将了解可经修改以优化经检测的信号的参数以及其他可增进筛选(例如筛选阻断剂)的FACS变数。
结合剂(例如可溶性受体)与标靶(例如TIGIT)的结合亲和性及结合剂/标靶交互反应的解离速率可藉由竞争性结合测定决定。竞争性结合测定的一实例系放射性免疫测定，其包含在渐增量的未经标记的标靶存在下，培养经标记的标靶(例如3H或125I)或其片段或变异体与感兴趣的结合剂，之后检测与该经标记的标靶结合的结合剂。该结合剂与标靶(例如TIGIT)的亲和性及结合解离速率可由斯卡查德(Scatchard)图分析的资料测定。在一些实施方式中，Biacore动力学分析系用于测定与标靶(例如TIGIT)结合的结合剂的结合及解离速率。Biacore动力学分析包含分析结合剂与芯片表面上经固定的标靶(例如TIGIT)的结合及解离。
在一些实施方式中，该结合剂(例如可溶性受体)以约1μM或更低、约100nM或更低、约40nM或更低、约20nM或更低、约10nM或更低、约1nM或更低或约0.1nM或更低的解离常数(KD)与TIGIT结合。在一些实施方式中，该结合剂以大约1nM或更低的KD与TIGIT结合。在一些实施方式中，该结合剂以大约0.1nM或更低的KD与TIGIT结合。在一些实施方式中，该结合剂以大约0.1nM或更低的KD与人TIGIT结合。在一些实施方式中，该结合剂(例如可溶性受体)亦以约1μM或更低、约100nM或更低、约40nM或更低、约20nM或更低、约10nM或更低、约1nM或更低或约0.1nM或更低的KD与CD96结合。在一些实施方式中，该结合剂亦以大约1nM或更低的KD与CD96结合。在一些实施方式中，该结合剂亦以大约0.1nM或更低的KD与CD96结合。在一些实施方式中，该结合剂亦以大约0.1nM或更低的KD与CD96结合。在一些实施方式中，该结合剂以大约10nM或更低的KD与人TIGIT及小鼠TIGIT结合。在一些实施方式中，该结合剂以大约1nM或更低的KD与人TIGIT及小鼠TIGIT结合。在一些实施方式中，该结合剂以大约0.1nM或更低的KD与人TIGIT及小鼠TIGIT结合。在一些实施方式中，该结合剂不与人CD226结合。在一些实施方式中，该结合剂以高KD与人CD226结合(微弱结合)。
在一些实施方式中，该结合剂对TIGIT的解离常数系利用固定于Biacore芯片上的包含至少部分的TIGIT胞外域的TIGIT融合蛋白所测得的解离常数。在一些实施方式中，该结合剂对CD96的解离常数系利用固定于Biacore芯片上的包含至少部分的CD96胞外域的CD96融合蛋白所测得的解离常数。在一些实施方式中，该结合剂或缺乏结合对CD226的解离常数系利用固定于Biacore芯片上的包含至少部分的CD226胞外域的CD226融合蛋白所测得的解离常数。
在一些实施方式中，该结合剂以约1μM或更低、约100nM或更低、约40nM或更低、约20nM或更低、约10nM或更低、约1nM或更低或约0.1nM或更低的半数最高有效浓度(EC50)与人TIGIT结合。在某些实施方式中，该结合剂亦以约40nM或更低、约20nM或更低、约10nM或更低、约1nM或更低或约0.1nM或更低的EC50与人CD96结合。
在某些实施方式中，此处所述的结合剂与TIGIT及/或CD96结合且调节免疫反应。在一些实施方式中，结合剂(例如可溶性受体)活化及/或增加免疫反应。在一些实施方式中，结合剂增加、促进或增强细胞介导性免疫。在一些实施方式中，结合剂增加、促进或增强先天细胞介导性免疫。在一些实施方式中，结合剂增加、促进或增强后天细胞介导性免疫。在一些实施方式中，结合剂增加、促进或增强T细胞活性。在一些实施方式中，结合剂增加、促进或增强溶细胞性T细胞(CTL)活性。在一些实施方式中，结合剂增加、促进或增强NK细胞活性。在一些实施方式中，结合剂增加、促进或增强淋巴介质活化的杀手细胞(LAK)活性。在一些实施方式中，结合剂增加、促进或增强肿瘤细胞杀灭。在一些实施方式中，结合剂增加、促进或增强肿瘤生长抑制。
在一些实施方式中，此处所述的结合剂与TIGIT结合且抑制TIGIT信号传导。在一些实施方式中，结合剂(例如可溶性受体)与TIGIT结合且抑制TIGIT信号传导。在某些实施方式中，结合剂系TIGIT介导信号传导的拮抗剂。在一些实施方式中，此处所述的结合剂与CD96结合且抑制CD96信号传导。在一些实施方式中，结合剂(例如可溶性受体)与CD96结合且抑制CD96信号传导。在一些实施方式中，结合剂系CD96介导信号传导的拮抗剂。在一些实施方式中，此处所述的结合剂与TIGIT及CD96结合且抑制TIGIT信号传导及CD96信号传导。在一些实施方式中，结合剂(例如可溶性受体)与TIGIT及CD96结合且阻断TIGIT信号传导并阻断CD96信号传导。在一些实施方式中，结合剂系TIGIT介导信号传导的拮抗剂及CD96介导信号传导的拮抗剂。在一些实施方式中，此处所述的结合剂与TIGIT结合且抑制TIGIT信号传导，但不与CD226结合(或与之微弱结合)且不抑制CD226信号传导。在一些实施方式中，此处所述的结合剂与TIGIT及CD96结合且抑制TIGIT及CD96信号传导，但不与CD226结合(或与之微弱结合)且不抑制CD226信号传导。在一些实施方式中，此处所述的结合剂与TIGIT结合、抑制TIGIT信号传导及增加CD226信号传导。在一些实施方式中，此处所述的结合剂与TIGIT及CD96结合、抑制TIGIT及CD96信号传导及增加CD226信号传导。在一些实施方式中，此处所述的结合剂增加CD226信号传导。
在一些实施方式中，结合剂包含含有此处所述的PVR变异体的可溶性受体，其中该PVR变异体与TIGIT结合且阻断TIGIT活性。在一些实施方式中，结合剂包含含有此处所述的PVR变异体的可溶性受体，其中该PVR变异体与TIGIT结合且阻断TIGIT活性，其亦与CD96结合且阻断CD96活性。在一些实施方式中，结合剂包含含有此处所述的PVR变异体的可溶性受体，其中该PVR变异体与TIGIT结合且增加CD226活性。
在某些实施方式中，此处所述的结合剂系人CD226的(直接或间接)促效剂。在一些实施方式中，该结合剂系CD226的促效剂且活化及/或增加免疫反应。在一些实施方式中，该结合剂系CD226的促效剂且活化及/或增加NK细胞及/或T细胞的活性(例如溶细胞性活性或细胞介素产生)。在某些实施方式中，该结合剂增加至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约50％、至少约75％、至少约90％或约100％的活性。
在某些实施方式中，此处所述的结合剂系TIGIT及/或CD96的(直接或间接)拮抗剂。在一些实施方式中，该结合剂系TIGIT及/或CD96的拮抗剂且活化及/或增加免疫反应。在一些实施方式中，该结合剂系TIGIT及/或CD96的拮抗剂且活化及/或增加NK细胞及/或T细胞的活性(例如溶细胞性活性或细胞介素产生)。在某些实施方式中，该结合剂增加至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约50％、至少约75％、至少约90％或约100％的活性。
在某些实施方式中，此处所述的结合剂增加NK细胞的活化。在某些实施方式中，结合剂(例如可溶性受体)增加T细胞的活化。在某些实施方式中，结合剂对NK细胞及/或T细胞的活化，导致NK细胞及/或T细胞的活化量增加至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约90％或至少约95％。
用于测定结合剂(或候选结合剂)是否调节免疫反应的活体内及活体外测定系该领域所知或正在发展。在一些实施方式中，可使用检测T细胞活化的功能性测定。例如，T细胞群可在此处所述的结合剂存在或不存在下，利用表达PVR的经照射的异体细胞刺激。阻断TIGIT及/或CD96信号传导的剂将造成T细胞活化增加，可检测到细胞增生及细胞周期进行、IL-2产生及/或CD25及CD69上调。在一些实施方式中，可使用检测NK细胞活性的功能性测定。例如，表达PVR的标靶细胞群可在此处所述的结合剂存在或不存在下，与NK细胞共培养。阻断TIGIT及/或CD96信号传导的剂将造成被NK细胞杀灭的标靶细胞的百分比增加。
在某些实施方式中，该结合剂可抑制肿瘤生长。在某些实施方式中，该结合剂可抑制活体内(例如异种移植小鼠模型及/或于罹患癌的人)的肿瘤生长。
在某些实施方式中，该结合剂可减少肿瘤的肿瘤发生性。在某些实施方式中，该结合剂可于动物模型诸如小鼠异种移植模型中减少肿瘤的肿瘤发生性。在某些实施方式中，该结合剂可于动物模型诸如小鼠异种移植模型中减少包含癌干细胞的肿瘤的肿瘤发生性。在某些实施方式中，肿瘤中癌干细胞的数量或频率系减少至少约二倍、约三倍、约五倍、约十倍、约50倍、约100倍、或约1000倍。在某些实施方式中，癌干细胞的数量或频率减少系藉由使用动物模型的限制稀释试验测定。有关使用限制稀释试验以测定肿瘤中癌干细胞的数量或频率减少的其他实例及指南可见例如国际公开号WO 2008/042236、美国专利公开号2008/0064049及美国专利公开号2008/0178305。
在某些实施方式中，该结合剂具有一或多种下列影响：抑制肿瘤细胞增生、抑制肿瘤生长、减少肿瘤的肿瘤发生性、藉由减少肿瘤中癌干细胞的频率减少肿瘤的肿瘤发生性、刺激肿瘤细胞的细胞死亡、增加细胞接触依赖性生长抑制、增加肿瘤细胞的细胞凋亡、减少上皮-间质转化(EMT)或减少肿瘤细胞的存活。在一些实施方式中，该结合剂具有一或多种下列影响：抑制病毒感染、抑制慢性病毒感染、减少病毒载量、刺激经病毒感染细胞的细胞死亡或减少经病毒感染细胞的数量或百分比。
在某些实施方式中，此处描述的结合剂于小鼠、长尾猕猴(cynomolgus monkey)或人体内具有至少约5小时、至少约10小时、至少约24小时、至少约3天、至少约1周、或至少约2周的循环半衰期。在某些实施方式中，该结合抗体系IgG(例如IgG1或IgG2)融合蛋白，其于小鼠、长尾猕猴或人体内具有至少约5小时、至少约10小时、至少约24小时、至少约3天、至少约1周、或至少约2周的循环半衰期。增加(或减少)剂(诸如多肽及可溶性受体)的半衰期的方法系该领域所知。举例来说，增加IgG融合蛋白循环半衰期的已知方法，包括导入突变至Fc区，此增加pH6.0时抗体对新生儿Fc受体(FcRn)的pH依赖性结合(见例如美国专利公开号2005/0276799、2007/0148164及2007/0122403)。增加缺乏Fc区的可溶性受体的循环半衰期的已知方法包括像是PEG化的技术。
在本发明的一些实施方式中，该结合剂系多肽。该多肽可为与TIGIT及/或CD96结合的重组多肽、天然多肽或合成多肽。该领域将同意本发明的一些氨基酸序列可变化而不会对该蛋白质的结构或功能造成显著影响。因此，本发明另包括多肽变异体，其显示与TIGIT及/或CD96的实质结合活性。在一些实施方式中，该多肽的氨基酸序列变异体包括删除、插入、倒位、重复及/或其他类型的置换。
该多肽、类似物及它们的变异体可另经修饰以包含正常非该多肽的部分的额外化学基团。所述衍生化基团可增进该多肽的溶解性、生物半衰期及/或吸收。所述基团亦可减少或消除该多肽及变异体的非所欲的不良反应。有关化学基团的介绍可见Remington:The Science and Practice of Pharmacy,22stEdition,2012,Pharmaceutical Press,London。
此处所述的多肽可藉由该领域已知的任何适当方法产生。所述方法从直接蛋白质合成方法至建构编码多肽序列的DNA序列及在适当宿主中表达所述序列皆可。在一些实施方式中，DNA序列系利用重组技术建构，其藉由分离或合成编码感兴趣的野生型蛋白质的DNA序列。可任意选择地，该序列可藉由定点突变形成突变以提供其功能性类似物。见例如Zoeller et al.,1984,PNAS,81:5662-5066及美国专利第4,588,585号。
在一些实施方式中，编码感兴趣的多肽的DNA序列可藉由化学合成利用寡核苷酸合成器建构。寡核苷酸可根据该所欲多肽的氨基酸序列设计，并选择该些将产生感兴趣重组多肽的宿主细胞所偏好的密码子。标准方法可被用于合成编码经分离的感兴趣多肽的多核苷酸序列。举例来说，完全氨基酸序列可被用于建构反向翻译基因(back-translated gene)。另外，可合成包含编码经分离的特定多肽的核苷酸序列的DNA寡聚体。例如，多个编码该所欲多肽的部分的小型寡核苷酸可被合成然后连接。个别寡核苷酸通常包含5'或3'悬端以用于互补组装。
一经组装(藉由合成、定点突变形成或其他方法)，该编码感兴趣的特定多肽的多核苷酸序列可被插入表达载体并可操作性连接适合该蛋白质于所欲宿主内表达的表达控制序列。适当组装可藉由核苷酸测序、限制酶定位及/或于适当宿主内表达生物活性多肽证实。如该领域所广为周知，为了在宿主内获得高表达量的经转染的基因，该基因必须可操作性连接在选定的表达宿主内具功能性的转录及翻译表达控制序列。
在某些实施方式中，重组表达载体被用于扩增及表达编码此处所述的结合剂(例如可溶性受体)的DNA。举例来说，重组表达载体可为可复制的DNA建构体，其具有与适当转录及/或翻译调节元件可操作性连接的编码结合剂的多肽链的合成性或cDNA衍生性DNA片段，该调节元件系源自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因。转录单位通常包含下列的组合：(1)于基因表达中具有调节作用的基因元件，例如转录启动子或增强子，(2)经转录成mRNA然后翻译成蛋白质的结构或编码序列，及(3)适当的转录及翻译启动及终止序列。调节元件可包括操作子序列以控制转录。通常由复制起点授予的于宿主内复制的能力及有利转化物辨识的选择基因可被额外纳入。DNA区系“可操作性连接”当它们彼此之间系功能性相关。举例来说，信号肽的DNA(分泌前导序列)系可操作性连接多肽的DNA，若其被表达为参与该多肽分泌的前体；启动子系可操作性连接编码序列，若其控制该序列的转录；或核糖体结合位点系可操作性连接编码序列，若其位置系为了允许翻译。在一些实施方式中，适用于酵母菌表达系统的结构元件包括使宿主细胞得以胞外分泌经翻译的蛋白质的前导序列。在其他实施方式中，当重组蛋白质系于无前导或转运序列存在时表达，其可包括N端甲硫氨酸残基。此残基之后可任意选择地与该经表达的重组蛋白质切开以提供最终产物。
表达控制序列及表达载体的选择取决于宿主选择。多样化的表达宿主/载体组合可被采用。可用于真核宿主的表达载体包括例如包含源自SV40、牛乳头状瘤病毒、腺病毒及巨细胞病毒的表达控制序列的载体。可用于细菌宿主的表达载体包括已知的细菌质粒，像是源自大肠杆菌的质粒(包括pCR1、pBR322、pMB9及其衍生物)，及广泛宿主范围质粒像是M13及其他丝状单股DNA噬菌体。
用于表达多肽(或用来作为标靶的蛋白)的适当宿主细胞包括原核生物、酵母菌细胞、昆虫细胞或在适当启动子控制下的高级真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性有机体，例如大肠杆菌(E.coli)或杆菌(Bacillus)。高级真核细胞包括如下所述的哺乳动物来源的株化细胞系。不含细胞的翻译系统亦可被采用。用于细菌性、真菌性、酵母菌性及哺乳动物细胞性宿主的适当克隆及表达载体系描述于Pouwels et al.(1985,Cloning Vectors:ALaboratory Manual,Elsevier,New York,NY)。有关蛋白质产生(包括抗体产生)方法的额外信息可见于例如美国专利公开号2008/0187954；美国专利第6,413,746及6,660,501号；及国际专利公开号WO 2004/009823。
多种哺乳动物细胞培养系统被用于表达重组多肽。于哺乳动物细胞中表达重组蛋白可为较佳，因为这些蛋白通常经过正确折叠、适当修饰且具生物功能性。适当哺乳动物宿主细胞系的实例包括COS-7(猴肾来源)、L-929(小鼠纤维母细胞来源)、C127(小鼠乳房肿瘤来源)、3T3(小鼠纤维母细胞来源)、CHO(中国仓鼠卵巢来源)、HeLa(人子宫颈癌来源)、BHK(仓鼠肾纤维母细胞来源)及HEK-293(人胚胎肾来源)细胞系及它们的变异株。哺乳动物表达载体可包含非转录元件(诸如复制起点、与所欲表达的基因相连的适当启动子及增强子，及其他5'或3'侧翼非转录序列)及5'或3'非翻译序列(诸如必要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供点及受点，及转录终止序列)。
于昆虫细胞培养系统(例如杆状病毒)中表达重组蛋白质亦提供产生正确折叠及具生物功能的蛋白质的有效方法。用于在昆虫细胞中产生异源性蛋白质的杆状病毒系统系本领域技术人员所广为周知(见例如Luckow and Summers,1988,Bio/Technology,6:47)。
因此，本发明提供包含此处所述的结合剂的细胞。在一些实施方式中，所述细胞产生此处所述的结合剂。在某些实施方式中，所述细胞产生融合蛋白。在一些实施方式中，所述细胞产生可溶性受体。在一些实施方式中，所述细胞产生抗体。在一些实施方式中，所述细胞产生双特异性抗体。在一些实施方式中，所述细胞产生异二聚体蛋白。
由经转化的宿主产生的蛋白质可根据任何适当方法纯化。标准方法包括层析(例如离子交换、亲和性及尺寸柱层析)、离心、差别溶解或藉由任何其他用于蛋白质纯化的标准技术。亲和性标签诸如六组氨酸、麦芽糖结合结构域、流感外套序列及麸胱甘肽-S-转移酶可被连接至该蛋白质以允许藉由通过适当亲和性管柱的轻易纯化。经分离的蛋白亦可经物理特征化，使用像是蛋白水解、质谱分析(MS)、核磁共振(NMR)、高效液相层析(HPLC)及x光结晶的技术。
在一些实施方式中，源自分泌重组蛋白质至培养基的表达系统的上清液可利用商用蛋白质浓缩过滤器先行浓缩，例如使用阿密康(Amicon)或密里博(Millipore)Pellicon超过滤单位浓缩。在浓缩步骤之后，该浓缩液可被加至适当纯化基材。在一些实施方式中，可采用阴离子交换树脂，例如具有二乙基氨基乙基(DEAE)悬挂基团的基材或基质。该基材可为丙烯酰胺、洋菜糖、葡聚糖、纤维素或其他常用于蛋白质纯化的基材。在一些实施方式中，可采用阳离子交换步骤。适当的阳离子交换基材包括包含磺丙基或羧甲基的各种不可溶基材。在一些实施方式中，可采用羟磷灰石基质，包括但不限于陶瓷羟磷灰石(CHT)。在某些实施方式中，一或多种应用疏水性逆相HPLC基质(例如具有悬挂甲基或其他脂肪族基团的硅胶)的逆相HPLC步骤可被采用以进一步纯化结合剂。上述的ㄧ些或所有纯化步骤的各种组合亦可被应用以提供均质性重组蛋白。
在一些实施方式中，于细菌培养中生产的重组蛋白质可被分离，例如藉由自细胞团块初步萃取，接着进行一或多次浓缩、盐析、水性离子交换或大小排除层析步骤。HPLC可被使用于最终纯化步骤。用于表达重组蛋白的微生物细胞可藉由任何方便方法破碎，包括冷冻解冻循环、超音波震荡、机械破碎或使用细胞溶解剂。
该领域已知的用于纯化多肽的方法亦包括例如该些于美国专利公开号2008/0312425、2008/0177048及2009/0187005所述者。
在某些实施方式中，此处所述的结合剂系不包含免疫球蛋白Fc区的多肽。在某些实施方式中，该多肽包含选自蛋白A、蛋白G、脂质运载蛋白(lipocalin)、纤维粘连蛋白结构域、锚蛋白(ankyrin)共同重复结构域或硫氧还蛋白类型的蛋白质支架。用于识别及产生以高亲和性与蛋白质标靶结合的非抗体多肽的各种方法系该领域所知。见例如Skerra,2007,Curr.Opin.Biotechnol.,18:295-304；Hosse et al.,2006,Protein Science,15:14-27；Gill et al.,2006,Curr.Opin.Biotechnol.,17:653-658；Nygren,2008,FEBS J.,275:2668-76；and Skerra,2008,FEBS J.,275:2677-83。在某些实施方式中，噬菌体展示技术可被用于生产及/或识别结合多肽。在某些实施方式中，哺乳动物细胞展示技术可被用于生产及/或识别结合多肽。
进一步所欲的是修饰多肽以增加(或减少)其血清半衰期。此可藉由例如使多肽中的适当区域发生突变以纳入救援受体结合表位至多肽中达成，或藉由将该表位纳入肽标签中然后使该肽标签与多肽的末端或中间融合(例如藉由DNA或肽合成)达成。
异源共轭分子亦属于本发明的范围内。异源共轭分子系由二个共价连接的多肽组成。所述分子被计划用于例如使免疫细胞以非所欲的细胞(例如肿瘤细胞)为标靶。亦考虑到所述异源共轭分子可利用已知的合成蛋白质化学方法于试管内制备，包括该些涉及交联剂的方法。举例来说，免疫毒素可利用双硫交换反应或藉由形成硫醚键加以建构。为达此目的的适当试剂实例包括亚氨基硫醇盐及甲基-4-巯基丁亚氨酸酯。
在某些实施方式中，此处所述的结合剂可以数种共轭(即免疫共轭物或放射共轭物)或非共轭形式的任一者被使用。在某些实施方式中，该结合剂可以非共轭形式被使用以驾驭受试者的天然防御机制，包括CDC及ADCC，以消灭恶性或癌细胞。
在某些实施方式中，此处所述的结合剂系小分子。用语“小分子”通常系指低分子量的有机化合物，其就定义上来说不是肽/蛋白。此处所述的小分子结合剂可以高亲和性与TIGIT及/或CD96结合且干扰或阻断TIGIT及/或CD96与PVR的交互作用。在一些实施方式中，该小分子干扰或阻断TIGIT及/或CD96与PVR的交互作用，中断TIGIT信号传导，但不中断CD226信号传导。
在一些实施方式中，此处所述的结合剂系与细胞毒性剂共轭。在一些实施方式中，该细胞毒性剂系化学治疗剂，包括但不限于甲胺喋呤(methotrexate)、甲烯土霉素(adriamicin)、多柔比星(doxorubicin)、霉法兰(melphalan)、丝裂霉素C(mitomycinC)、氯芥苯丁酸(chlorambucil)、正定霉素(daunorubicin)或其他插入剂。在一些实施方式中，该细胞毒性剂系细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素及它们的片段，包括但不限于白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链、蓖麻毒素A链、相思豆毒素(abrin)A链、莫迪素(modeccin)A链、α-次黄嘌呤(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、泻果素(curcin)、巴豆素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、丝裂胶素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)及新月毒素(tricothecene)。在一些实施方式中，该细胞毒性剂系放射性同位素以产生放射共轭物或经放射共轭的结合剂。多种放射性核种可用于产生经放射共轭的结合剂，包括但不限于90Y、125I、131I、123I、111In、131In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re、188Re及212Bi。本发明亦可使用结合剂与一或多种小分子毒素的共轭物，所述毒素诸如卡利奇霉素(calicheamicin)、类美坦素(maytansinoids)、新月毒素(trichothene)、CC1065及具有毒素活性的该些毒素的衍生物。在一些实施方式中，此处所述的结合剂系与类美坦素共轭。在一些实施方式中，此处所述的结合剂系与美登素(DM1)共轭。结合剂与细胞毒性剂的共轭物可利用各种双官能性蛋白偶合剂制备，例如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)、二亚胺环硫丁烷(IT)、亚氨酸酯的双官能基衍生物(诸如己二亚胺二甲酯HCL)、活性酯的双官能基衍生物(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺)、醛的双官能基衍生物(诸如戊二醛)、双迭氮化合物(诸如双(对-迭氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双-(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如2,6-二异氰酸甲苯酯)及双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝苯)。
III.多核苷酸
在某些实施方式中，本发明包含多核苷酸，其包含编码此处所述的结合剂(例如可溶性受体或多肽)的多核苷酸。用语“编码多肽的多核苷酸”包含仅包括该多肽的编码序列的多核苷酸，以及包括额外的编码及/或非编码序列的多核苷酸。本发明的多核苷酸可为RNA的形式或DNA的形式。DNA包括cDNA、基因组DNA及合成性DNA；可为双股或单股，若单股可为编码股或非编码(反义)股。
在某些实施方式中，该多核苷酸包含编码包含选自下列的氨基酸序列的多肽的多核苷酸：SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:31及SEQ ID NO:38。在某些实施方式中，该多核苷酸包含编码包含选自下列的氨基酸序列的多肽的多核苷酸：SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:38。
在某些实施方式中，多核苷酸包含具有核苷酸序列的多核苷酸，该核苷酸序列与编码选自下列氨基酸序列的多核苷酸具有至少80％一致性、至少85％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性，及在一些实施方式中至少96％、97％、98％或99％一致性：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31及SEQ ID NO:38。在某些实施方式中，多核苷酸包含具有核苷酸序列的多核苷酸，该核苷酸序列与编码选自下列氨基酸序列的多核苷酸具有至少80％一致性、至少85％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性，及在一些实施方式中至少96％、97％、98％或99％一致性：SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21及SEQ IDNO:38。本发明亦提供多核苷酸，其包含与编码选自下列的氨基酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸：SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:31及SEQ ID NO:38。本发明亦提供多核苷酸，其包含与编码选自下列的氨基酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸：SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:38。本发明亦提供多核苷酸，其包含与编码选自下列的氨基酸序列的多核苷酸的互补物杂交的多核苷酸：SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:38。在某些实施方式中，该杂交系于高度严谨度条件下发生。高度严谨度的条件系本领域技术人员所知，可包括但不限于：(1)采用低离子张力及高温清洗，例如于50℃的15mM氯化钠/1.5mM柠檬酸钠(1x SSC)及0.1％十二基硫酸钠；(2)在杂交期间采用变性剂，诸如甲酰胺，例如42℃的具有0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯基吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液的于pH 6.5的5x SSC(0.75M NaCl，75mM柠檬酸钠)中的50％(体积/体积)甲酰胺；或(3)采用42℃于50％甲酰胺、5x SSC、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5x丹哈德(Denhardt’s)溶液、经超音波化的鲑鱼精子DNA(50μg/ml)、0.1％SDS及10％硫酸葡聚糖，于55℃以含有50％甲酰胺的0.2x SSC清洗，之后于55℃以含有EDTA的0.1x SSC进行高严谨度清洗。
在某些实施方式中，多核苷酸包含融合至多核苷酸的相同阅读框的成熟多肽的编码序列，该编码序列有助于例如多肽自宿主细胞的表达及分泌(例如作为分泌序列以控制源自细胞的多肽的运输的前导序列)。具有前导序列的多肽系前体蛋白，该前导序列可由宿主细胞切割以形成成熟形式的多肽。所述多核苷酸亦可编码蛋白原，蛋白原系成熟蛋白质加上额外的5'氨基酸残基。具有原序列(prosequence)的成熟蛋白质系蛋白原，其系不活化形式的蛋白质。一旦原序列被切割后，剩下即为活性成熟蛋白质。
在某些实施方式中，多核苷酸包含融合至标志序列的相同阅读框的成熟多肽的编码序列，以允许例如用于纯化该经编码的多肽。举例来说，该标志序列可为由pQE-9载体供应的六组氨酸标签以提供在细菌宿主的例中用于纯化与该标记融合的成熟多肽，或当使用哺乳动物宿主(例如COS-7细胞)时该标志序列可为源自流感血球凝集素蛋白质的血球凝集素(HA)标签。在一些实施方式中，该标志序列系FLAG卷标，即可与其他亲和性标签搭配使用的序列DYKDDDDK的肽(SEQ ID NO:32)。
本发明另关于上述多核苷酸编码片段、类似物及/或衍生物的变异体。
在某些实施方式中，本发明提供多核苷酸，其包含具有核苷酸序列的多核苷酸，该核苷酸序列与编码包含此处所述的结合剂(例如可溶性受体或多肽)的多肽的多核苷酸具有至少约80％一致性、至少约85％一致性、至少约90％一致性、至少约95％一致性，及在一些实施方式中至少约96％、97％、98％或99％一致性。
如此处所使用的用语，具有与参考核苷酸序列至少例如95％“一致性”的核苷酸序列的多核苷酸系意图表示该多核苷酸的核苷酸序列系与该参考序列相同，除了该多核苷酸序列可在该参考核苷酸序列的每100个核苷酸中包括最多五个点突变。换言之，为了获得具有与参考核苷酸序列至少95％一致性的核苷酸序列的多核苷酸，在参考序列中最多5％的核苷酸可被删除或以另一核苷酸置换，或参考序列中总核苷酸数量的最多5％的核苷酸可被插入该参考序列中。这些参考序列的突变可发生在该参考核苷酸序列的5'或3'端位置或该些末端位置之间的任何位置，这些位置个自分散在参考序列的核苷酸之中或在参考序列内以一或多个连续族群存在。
多核苷酸变异体可包含编码区、非编码区或两区中的改变。在一些实施方式中，多核苷酸变异体包含产生静默置换、添加或删除的改变，但不改变该经编码的多肽的性质或活性。在一些实施方式中，多核苷酸变异体包含导致该多肽的氨基酸序列无改变的静默置换(由于基因密码的简并)。多核苷酸变异体可为了多种原因而产生，例如为了优化密码子于特定宿主的表达(例如将人mRNA中的密码子改变成该些细菌宿主诸如大肠杆菌所偏好的密码子)。在一些实施方式中，多核苷酸变异体在序列的非编码或编码区包含至少一个静默突变。
在一些实施方式中，产生多核苷酸变异体以调节或改变该经编码的多肽的表达(或表达量)。在一些实施方式中，产生多核苷酸变异体以增加该经编码的多肽的表达。在一些实施方式中，产生多核苷酸变异体以减少该经编码的多肽的表达。在一些实施方式中，多核苷酸变异体相较于亲代多核苷酸序列增加该经编码的多肽的表达。在一些实施方式中，多核苷酸变异体相较于亲代多核苷酸序列减少该经编码的多肽的表达。
在一些实施方式中，产生至少一种多核苷酸变异体(不改变该经编码的多肽的氨基酸序列)以增加异二聚分子的产生。在一些实施方式中，产生至少一种多核苷酸变异体(不改变该经编码的多肽的氨基酸序列)以增加双特异性抗体的产生。
在某些实施方式中，多核苷酸系经分离。在某些实施方式中，多核苷酸系实质上纯的。
本发明亦提供此处所述的包含该多核苷酸的载体及细胞。在一些实施方式中，表达载体包含多核苷酸分子。在一些实施方式中，宿主细胞包含表达载体，该表达载体包含该多核苷酸分子。在一些实施方式中，宿主细胞包含多核苷酸分子。
IV.使用方法及医药组合物
本发明的结合剂可用于各种应用，包括但不限于治疗性治疗方法诸如癌的免疫治疗。在某些实施方式中，该结合剂可用于活化、促进、增加及/或增强免疫反应、抑制肿瘤生长、减少肿瘤体积、增加肿瘤细胞的细胞凋亡及/或减少肿瘤的肿瘤发生性。本发明的结合剂亦可用于对抗病原体例如病毒的免疫治疗。在某些实施方式中，该结合剂可用于活化、促进、增加及/或增强免疫反应、抑制病毒感染、减少病毒感染、增加经病毒感染的细胞的细胞凋亡及/或增加杀灭经病毒感染的细胞。使用方法可为试管内、活体外或活体内方法。在一些实施方式中，结合剂系免疫反应的促效剂。在一些实施方式中，结合剂系TIGIT的拮抗剂。在一些实施方式中，结合剂系CD96的拮抗剂。在一些实施方式中，结合剂系TIGIT及CD96的拮抗剂。在一些实施方式中，结合剂系CD226的促效剂。
本发明提供使用此处所述的结合剂活化受试者的免疫反应的方法。在一些实施方式中，本发明提供使用此处所述的结合剂促进受试者的免疫反应的方法。在一些实施方式中，本发明提供使用此处所述的结合剂增加受试者的免疫反应的方法。在一些实施方式中，本发明提供使用此处所述的结合剂增强受试者的免疫反应的方法。在一些实施方式中，活化、促进、增加及/或增强免疫反应包含增加细胞介导性免疫。在一些实施方式中，活化、促进、增加及/或增强免疫反应包含增加T细胞活性。在一些实施方式中，活化、促进、增加及/或增强免疫反应包含增加CTL活性。在一些实施方式中，活化、促进、增加及/或增强免疫反应包含增加NK细胞活性。在一些实施方式中，活化、促进、增加及/或增强免疫反应包含增加T细胞活性及增加NK细胞活性。在一些实施方式中，活化、促进、增加及/或增强免疫反应包含增加CTL活性及增加NK细胞活性。在一些实施方式中，该免疫反应系抗原刺激的结果。在一些实施方式中，该抗原刺激系肿瘤细胞。在一些实施方式中，该抗原刺激系癌。在一些实施方式中，该抗原刺激系病原体。在一些实施方式中，该抗原刺激系经病毒感染的细胞。
在一些实施方式中，增强受试者的免疫反应的方法包含对该受试者投予治疗有效量的此处所述的结合剂，其中该结合剂抑制TIGIT与PVR之间的交互作用、抑制CD96与PVR之间的交互作用且不抑制CD226与PVR之间的交互作用。
在一些实施方式中，本发明提供增加CD226阳性细胞的活性的方法。在一些实施方式中，该方法包含使CD226阳性细胞与有效量的如此处所述的结合剂接触。在一些实施方式中，CD226阳性细胞为T细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞及/或B细胞。在一些实施方式中，CD226阳性细胞的活性增加系由溶细胞活性增加可证。在一些实施方式中，CD226阳性细胞的活性增加系由标靶细胞杀灭增加可证。在一些实施方式中，CD226阳性细胞的活性增加系由肿瘤细胞杀灭增加可证。在一些实施方式中，CD226阳性细胞的活性增加系由肿瘤生长抑制可证。在一些实施方式中，CD226阳性细胞的活性增加系由病毒感染抑制可证。在一些实施方式中，CD226阳性细胞的活性增加系由经病毒感染的细胞杀灭增加可证。
本发明亦提供利用此处所述的结合剂抑制肿瘤生长的方法。在某些实施方式中，该抑制肿瘤生长的方法包含于试管内使细胞混合物与结合剂接触。例如，与免疫细胞(例如T细胞或NK细胞)混合的永生化细胞系或癌细胞系系于其中添加结合剂的培养基中培养。在一些实施方式中，肿瘤细胞系自病患样本(例如组织活体样本、胸膜渗液或血液样本)分离，与免疫细胞(例如T细胞及/或NK细胞)混合，并于其中添加结合剂的培养基中培养。在一些实施方式中，结合剂增加、促进及/或增强免疫细胞的活性。在一些实施方式中，该结合剂抑制肿瘤细胞生长。在一些实施方式中，该结合剂包含可溶性受体。在一些实施方式中，该结合剂系可溶性受体。在一些实施方式中，该结合剂系抗体。在一些实施方式中，该结合剂系多肽。
在一些实施方式中，该抑制肿瘤生长的方法包含于活体内使肿瘤或肿瘤细胞与结合剂接触。在某些实施方式中，使肿瘤或肿瘤细胞与结合剂接触系于动物模型中进行。例如，结合剂被投予至具有同系肿瘤的小鼠。在一些实施方式中，结合剂增加、促进及/或增强小鼠的免疫细胞的活性。在一些实施方式中，该结合剂抑制肿瘤生长。在一些实施方式中，该结合剂系于导入肿瘤细胞至动物的同时或短时间内投予以预防肿瘤生长(“预防模型”)。在一些实施方式中，该结合剂系于肿瘤生长至特定大小后投予以作为治疗之用(“治疗模型”)。在一些实施方式中，该结合剂包含可溶性受体。在一些实施方式中，该结合剂系可溶性受体。在一些实施方式中，该结合剂系抗体。在一些实施方式中，该结合剂系多肽。
在某些实施方式中，抑制肿瘤生长的方法包含对受试者投予治疗有效量的此处所述的结合剂。在某些实施方式中，该受试者系人。在某些实施方式中，该受试者具有肿瘤或肿瘤已被移除。在一些实施方式中，该结合剂包含可溶性受体。在一些实施方式中，该结合剂系可溶性受体。在一些实施方式中，该结合剂系抗体。在一些实施方式中，该结合剂系多肽。
此外，本发明提供抑制受试者体内肿瘤生长的方法，该方法包含对该受试者投予治疗有效量的结合剂。在某些实施方式中，该肿瘤包含癌干细胞。在某些实施方式中，该肿瘤中癌干细胞的频率系藉由投予结合剂而减少。在一些实施方式中，本发明提供减少受试者的肿瘤中癌干细胞的频率的方法，该方法包含对该受试者投予治疗有效量的结合剂。在一些实施方式中，该结合剂包含可溶性受体。在一些实施方式中，该结合剂系可溶性受体。在一些实施方式中，该结合剂系抗体。在一些实施方式中，该结合剂系多肽。
在一些实施方式中，抑制受试者的肿瘤生长的方法包含：对该受试者投予治疗有效量的此处所述的结合剂，其中该结合剂抑制TIGIT与PVR之间的交互作用、抑制CD96与PVR之间的交互作用且不抑制CD226与PVR之间的交互作用。在一些实施方式中，该PVR系表达于肿瘤细胞上。在一些实施方式中，TIGIT系表达于NK细胞及/或T细胞上。在一些实施方式中，CD96系表达于NK细胞及/或T细胞上。在一些实施方式中，CD226系表达于NK细胞及/或T细胞上。在一些实施方式中，PVR系表达于肿瘤细胞上且TIGIT及CD226系表达于NK细胞及/或T细胞上。在一些实施方式中，PVR系表达于肿瘤细胞上且TIGIT、CD96及CD226系表达于NK细胞及/或T细胞上。
此外，本发明提供减少受试者体内肿瘤的肿瘤发生性的方法，该方法包含对该受试者投予治疗有效量的如此处所述的结合剂。在某些实施方式中，该肿瘤包含癌干细胞。在一些实施方式中，该肿瘤的肿瘤发生性藉由减少肿瘤中癌干细胞的频率降低。在一些实施方式中，该方法包含使用此处所述的结合剂。在某些实施方式中，该肿瘤中癌干细胞的频率藉由投予结合剂而减少。
在一些实施方式中，该肿瘤系实质肿瘤。在某些实施方式中，该肿瘤系选自结直肠肿瘤、胰肿瘤、肺肿瘤、卵巢肿瘤、肝肿瘤、乳房肿瘤、肾肿瘤、前列腺肿瘤、神经内分泌肿瘤、胃肠道肿瘤、黑色素瘤、子宫颈肿瘤、膀胱肿瘤、神经胶母细胞瘤或头颈肿瘤的肿瘤。在某些实施方式中，该肿瘤系结直肠肿瘤。在某些实施方式中，该肿瘤系卵巢肿瘤。在一些实施方式中，该肿瘤系肺肿瘤。在某些实施方式中，该肿瘤系胰肿瘤。在某些实施方式中，该肿瘤系黑色素瘤。
本发明另提供治疗受试者的癌的方法，该方法包含对该受试者投予治疗有效量的结合剂。在一些实施方式中，该结合剂与TIGIT及/或CD96的胞外域结合、增加免疫反应及抑制或减少癌的生长。在一些实施方式中，该结合剂与TIGIT结合。在一些实施方式中，该结合剂与TIGIT及CD96结合。在一些实施方式中，该结合剂与TIGIT结合且不与CD226结合(或与之微弱结合)。在一些实施方式中，该结合剂与TIGIT及CD96结合且不与CD226结合(或与之微弱结合)。在一些实施方式中，该结合剂包含可溶性受体。在一些实施方式中，该结合剂系可溶性受体。在一些实施方式中，该结合剂系抗体。在一些实施方式中，该结合剂系多肽。
本发明提供治疗癌的方法，该方法包含对受试者(例如需要治疗的受试者)投予治疗有效量的如此处所述的结合剂。在某些实施方式中，该受试者系人。在某些实施方式中，该受试者罹患癌性肿瘤。在某些实施方式中，该受试者罹患的肿瘤已经移除。
在某些实施方式中，该癌系选自结直肠癌、胰癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、乳癌、肾癌、前列腺癌、胃肠癌、黑色素瘤、子宫颈癌、神经内分泌癌、膀胱癌、神经胶母细胞瘤或头颈癌的癌。在某些实施方式中，该癌系胰癌。在某些实施方式中，该癌系卵巢癌。在某些实施方式中，该癌系结直肠癌。在某些实施方式中，该癌系乳癌。在某些实施方式中，该癌系前列腺癌。在某些实施方式中，该癌系肺癌。在某些实施方式中，该癌系黑色素瘤。
在一些实施方式中，该癌系血液性癌。在一些实施方式中，该癌系选自：急性骨髓性白血病(AML)、霍奇金氏(Hodgkin)淋巴瘤、多发性骨髓瘤、T细胞急性淋巴胚细胞白血病(T-ALL)、慢性淋巴细胞性(CLL)、毛细胞白血病、慢性骨髓性白血病(CML)、非霍奇金氏淋巴瘤、弥漫性大型B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)及皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)。
本发明亦提供失活、抑制或压抑细胞中TIGIT及/或CD96信号传导的方法，该方法包含使该细胞与有效量的此处所述的结合剂接触。在某些实施方式中，该细胞系T细胞。在一些实施方式中，该细胞系溶细胞性细胞。在一些实施方式中，该细胞系CTL。在一些实施方式中，该细胞系NK细胞。在某些实施方式中，该方法系活体内方法，其中使该细胞与结合剂接触的步骤包含对该受试者投予治疗有效量的该结合剂。在一些实施方式中，该方法系试管内方法或活体外方法。在某些实施方式中，该结合剂抑制、压抑及/或降低TIGIT及/或CD96信号传导。在一些实施方式中，该结合剂包含可溶性受体。在一些实施方式中，该结合剂系可溶性受体。在一些实施方式中，该结合剂系多肽。在一些实施方式中，该结合剂系抗体。
本发明亦提供活化或增强细胞中CD226信号传导的方法，该方法包含使该细胞与有效量的此处所述的结合剂接触。在某些实施方式中，该细胞系T细胞。在一些实施方式中，该细胞系溶细胞性细胞。在一些实施方式中，该细胞系CTL。在一些实施方式中，该细胞系NK细胞。在某些实施方式中，该方法系活体内方法，其中使该细胞与结合剂接触的步骤包含对该受试者投予治疗有效量的该结合剂。在一些实施方式中，该方法系试管内方法或活体外方法。在某些实施方式中，该结合剂活化、促进、诱导、增强及/或增加CD226信号传导。在一些实施方式中，该结合剂包含可溶性受体。在一些实施方式中，该结合剂系可溶性受体。在一些实施方式中，该结合剂系多肽。在一些实施方式中，该结合剂系抗体。
该免疫球蛋白超家族的某些成员于细胞(例如肿瘤细胞或经病毒感染的细胞)上的过度表达或异常暴露可允许所述受体成为免疫系统监测的标靶(“免疫监控”)。例如，上皮细胞生物学的重要特征为上皮细胞以单细胞层存在。因此，它们具有三种不同表面，即暴露于腔室的顶表面、与基底膜交互作用的底侧膜及形成邻近细胞之间交互作用区域的“细胞间表面”。不受理论束缚，吾人相信该Ig超家族的某些成员大抵被局限于此第三表面(细胞间表面)，因为这是有可能发生直接细胞-细胞沟通的区域。
许多蛋白涉及细胞对细胞的交互作用及细胞与微环境的交互作用。若干所述蛋白已知位于细胞间膜区域内，包括有助于黏连连接的钙黏素、有助于间隙连接的连结蛋白，及有助于紧密连接的紧密连接蛋白及紧连蛋白。除了上述蛋白之外，其他蛋白被认为位于由紧密连接及黏连连接产生的顶部连接复合物中。例如，在某些正常细胞结构之内，该Ig超家族的成员(例如受体)将表达在细胞间表面处，因此不会被此处所述的结合剂检测到。然而，细胞形态学改变的细胞或丧失正常细胞结构的细胞(例如肿瘤细胞或经病毒感染的细胞)可能具有异常暴露的蛋白/受体，例如PVR、PVRL2及/或PVRL3，使这些细胞可以被此处所述的结合剂监控检测到。
此外，PVR家族成员于细胞表面上的过度表达可能使该细胞成为表达相反受体的细胞(例如CTL及/或NK细胞)的更佳标靶。有趣的是，人PVR及PVRL2已被发现过度表达于某些肿瘤上，包括结直肠癌、胃癌、卵巢癌、神经胚细胞瘤、骨髓性白血病及多发性骨髓瘤(见例如Masson et al.,2001,Gut,49:236-240；Tahara-Hanaoka et al.,2006,Blood,107:1491-1496；Carlstenet al.,2007,Cancer Res.,67:1317-1325；Castriconi et al.,2004,Cancer Res.,64:9180-9184；Pende et al.,2005,Blood,105:2066-2073；El-Sherbiny et al.,2007,Cancer Res.,67:8444-8449)。
因此，本发明提供识别适合以结合剂治疗的人受试者的方法，该方法包含：测定该受试者是否具有PVR的量相较于参考样本的PVR表达或预先决定的PVR的量为上升的肿瘤。此处所使用的“参考样本”包括但不限于正常组织、该相同组织类型的非癌性组织、该相同组织类型的肿瘤组织及不同组织类型的肿瘤组织。因此，在一些实施方式中，PVR于肿瘤中的表达量系与正常组织中的PVR的表达量比较。在一些实施方式中，PVR于肿瘤中的表达量系与相同组织类型的非癌性组织中的PVR的表达量比较。在一些实施方式中，PVR于肿瘤中的表达量系与相同组织类型的肿瘤中的PVR的表达量比较。在一些实施方式中，PVR于肿瘤中的表达量系与不同组织类型的肿瘤中的PVR的表达量比较。因此，在一些实施方式中，PVR于肿瘤中的表达量系与预先决定的PVR的量比较。在一些实施方式中，测定PVR的表达量系于治疗前进行。在一些实施方式中，测定PVR的表达量系藉由免疫组织化学法进行。在一些实施方式中，若该肿瘤或癌相较于PVR于参考样本中的表达或预先决定的量具有升高表达量的PVR，则对该受试者投予此处所述的结合剂。例如，在一些实施方式中，若该肿瘤相较于PVR于参考样本中的表达量具有升高表达量的PVR，则对该受试者投予此处所述的结合剂。在一些实施方式中，若该肿瘤相较于预先决定的PVR量具有升高表达量的PVR，则对该受试者投予此处所述的结合剂。
在一些实施方式中，若该肿瘤具有上升量的PVR，则选择该受试者为适合以与TIGIT及/或CD96特异性结合的结合剂治疗。在一些实施方式中，若经选择为适合治疗，则对该受试者投予此处所述的结合剂。在某些实施方式中，该受试者罹患的肿瘤已经移除。
本发明亦提供识别适合以结合剂治疗的人受试者的方法，该方法包含：测定该受试者是否具有PVR异常表达的肿瘤(相较于相同类型的组织或参考样本中的PVR表达)。在一些实施方式中，若该肿瘤具有异常表达的PVR，则选择该受试者为适合以与TIGIT及/或CD96特异性结合的结合剂治疗。在一些实施方式中，若经选择为适合治疗，则对该受试者投予此处所述的结合剂。在某些实施方式中，该受试者罹患的肿瘤已经移除。
本发明亦提供选择人受试者以使用如此处所述的结合剂治疗的方法，该方法包含：测定该受试者是否具有PVR表达量上升的肿瘤，其中若该肿瘤具有上升的PVR表达量，则选择该受试者为适合治疗。在一些实施方式中，抑制人受试者的肿瘤生长的方法包含：测定该肿瘤是否具有表达量上升的PVR，及对该受试者投予治疗有效量的如此处所述的结合剂。在一些实施方式中，治疗人受试者的癌的方法包含：(a)选择适合治疗的受试者，该选择系根据(至少部分根据)该受试者具有上升量的PVR的癌，及(b)对该受试者投予如此处所述的治疗有效量的结合剂。
用于测定细胞、肿瘤或癌中的PVR核酸表达量的方法系本领域技术人员所知。所述方法包括但不限于PCR基底试验、微数组分析及核苷酸测序(例如NextGen测序)。用于测定PVR蛋白于细胞、肿瘤或癌中的表达量的方法包括但不限于Western印迹分析、蛋白矩阵、ELISA、免疫组织化学(IHC)及FACS。
测定肿瘤或癌是否具有上升的PVR表达量的方法可使用多种样本。在一些实施方式中，该样本系取自具有肿瘤或癌的受试者。在一些实施方式中，该样本系新鲜肿瘤/癌样本。在一些实施方式中，该样本系冷冻肿瘤/癌样本。在一些实施方式中，该样本系经福尔马林固定的石蜡包埋样本。在一些实施方式中，该样本系血液样本。在一些实施方式中，该样本系血浆样本。在一些实施方式中，该样本系处理成细胞溶解物。在一些实施方式中，该样本系处理成DNA或RNA。
本发明另提供包含此处所述的结合剂的医药组合物。在某些实施方式中，该医药组合物另包含医药上可接受的载剂。在一些实施方式中，该医药组合物具有免疫治疗用途。在一些实施方式中，该医药组合物于受试者(例如人病患)中具有抑制肿瘤生长的用途。在一些实施方式中，该医药组合物于受试者(例如人病患)中具有治疗癌的用途。
在某些实施方式中，供储存及使用的调制剂系藉由组合本发明的经纯化的结合剂与医药上可接受的载剂(例如载体或赋形剂)加以制备。适当的医药上可接受的载剂包括但不限于非毒性缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐及其他有机酸；盐诸如氯化钠；抗氧化剂包括抗坏血酸及甲硫氨酸；保存剂诸如十八基二甲基苄基氯化铵、六甲氯胺、氯化苯甲烃铵、氯化苄乙氧铵、酚醇、丁醇、苄醇、烷基对羟苯甲酸酯类诸如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇及间甲酚；低分子量多肽(例如少于约10个氨基酸残基)；蛋白质诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物诸如聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；碳水化合物诸如单醣、双醣、葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂诸如EDTA；糖类诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；盐形成抗衡离子诸如钠；金属复合物(例如锌蛋白质复合物)；及非离子性界面活性剂诸如TWEEN或聚乙二醇(PEG)(Remington:The Science andPractice of Pharmacy,22stEdition,2012,PharmaceuticalPress,London.)。
本发明的医药组合物可以任何数量的方式经局部或系统投予。投予可为藉由表皮贴片、经皮贴片、软膏、乳液、乳膏、胶剂、滴剂、栓剂、喷剂、液剂及粉剂的局部投予；藉由吸入或喷入粉剂或气雾剂的经肺投予，包括藉由喷雾器、气管内或鼻内投予；经口；或非经肠投予包括静脉内、动脉内、肿瘤内、皮下、腹膜内、肌肉内(例如注射或输注)或颅内(例如脊椎鞘内或心室内)投予。
该治疗调制剂可呈单位剂量形式。所述调制剂包括片剂、丸剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、水或非水性介质的溶液或悬浮液、或栓剂。在固态组合物诸如片剂中，该主要活性成分系与医药载剂混合。常规的制锭成分包括玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或胶、及稀释剂(例如水)。这些可被用来形成含有本发明的化合物或其无毒性、医药上可接受的盐的均质混合物的固体预调制组合物。该固体预调制组合物接着被分成上述种类的单位剂量形式。片剂、丸剂等调制剂或组合物可经包覆或经其他方式复合以提供提供具有长效优点的剂型。举例来说，片剂或丸剂可包含由外部成份包覆的内部组合物。另外，该两种成份可以肠溶层分开，该肠溶层用来抵抗崩解，以使该内部成份完整通过胃或被延迟释放。多种物质可被用于该肠溶层或包覆层，所述物质包括多种聚合酸及聚合酸与诸如虫胶、鲸腊醇及醋酸纤维素的物质的混合物。
此处所述的结合剂亦可被包封于微胶囊中。所述微胶囊藉由例如凝聚技术或藉由界面聚合化制备，例如分别于于胶体药物递送系统中(例如脂质体、白蛋白微球、微乳化液、纳米微粒及纳米微囊)或于巨乳化液(macroemulsions)中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊及聚-(异丁烯酸甲酯)微胶囊，如Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,22stEdition,2012,Pharmaceutical Press,London所述。
在某些实施方式中，医药调制剂包括与脂质体复合的本发明的结合剂。产生脂质体的方法系本领域技术人员所知。举例来说，有些脂质体可藉由逆相蒸发含有磷脂酰胆碱、胆固醇及PEG-衍生性磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物加以产生。脂质体可被挤压通过定义孔径大小的滤网以产生具有所欲直径的脂质体。
在某些实施方式中，持续释放的制剂可被产生。持续释放制剂的适当实例包括含有结合剂的固相疏水性聚合物的半透性基体，其中该基体系呈形状对象的形式(例如膜或微胶囊)。持续释放基体的实例包括聚酯、水凝胶(诸如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚乙烯醇)、聚交酯、L-谷氨酸及7乙基-L-谷氨酸盐的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物及柳菩林(leuprolideacetate)所组成的注射型微球)、蔗糖乙酸异丁酸酯及聚-D-(-)-3-羟丁酸。
在某些实施方式中，除了投予结合剂之外，该方法或治疗另包含投予至少一种免疫反应刺激剂。在一些实施方式中，该免疫反应刺激剂包括但不限于集落刺激因子(例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、干细胞因子(SCF)、白介素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18)、阻断免疫抑制功能的抗体(例如抗CTLA4抗体、抗CD28抗体、抗CD3抗体)、类铎受体(Toll-like receptor)(例如TLR4、TLR7、TLR9)或B7家族的成员(例如CD80、CD86)。免疫反应刺激剂可于投予该结合剂之前、同时及/或之后投予。本发明亦提供包含结合剂与该免疫刺激剂的医药组合物。在一些实施方式中，该免疫反应刺激剂包含1、2、3或更多种免疫反应刺激剂。
在某些实施方式中，除了投予结合剂之外，该方法或治疗另包含投予至少一种额外治疗剂。额外治疗剂可于投予该结合剂之前、同时及/或之后投予。本发明亦提供包含结合剂与该额外治疗剂的医药组合物。在一些实施方式中，该至少一种额外治疗剂包含1、2、3或更多种额外的治疗剂。
含有二种或二种以上治疗剂的联合疗法通常使用具有不同作用机制的剂，虽然并非必要。使用不同作用机制的剂的联合疗法可能导致加成或协同效应。联合疗法可能允许相较于单一疗法使用较低剂量的各剂，藉以减少该(等)剂的毒性不良反应及/或增加治疗指数。联合疗法可能减少抗药性癌细胞发生的可能性。在一些实施方式中，联合疗法包含影响免疫反应(例如增强或活化该反应)的治疗剂及影响(例如抑制或杀灭)该肿瘤/癌细胞的治疗剂。
在一些实施方式中，结合剂与至少一种额外治疗剂的组合导致加成或协同效果。在一些实施方式中，该联合疗法导致该结合剂的治疗指数增加。在一些实施方式中，该联合疗法导致该额外剂的治疗指数增加。在一些实施方式中，该联合疗法导致该结合剂的毒性及/或不良反应减少。在一些实施方式中，该联合疗法导致该额外剂的毒性及/或不良反应减少。
有用类别的治疗剂包括例如抗微管蛋白剂、耳抑素、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、烷化剂(例如铂复合物诸如顺铂(cisplatin)、单(铂)、二(铂)及三核铂复合物及卡铂(carboplatin))、蒽环类(anthracycline)、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢物、化学疗法致敏剂、双联霉素(duocarmycin)、依扥泊苷(etoposide)、氟化嘧啶、离子载体、莱克西托素(lexitropsin)、亚硝基尿素、普拉汀诺(platinol)、嘌呤抗代谢物、嘌呤霉素(puromycin)、放射线致敏剂、类固醇、紫杉烷、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱或该类似物。在某些实施方式中，第二治疗剂系烷化剂、抗代谢物、抗有丝分裂剂、拓扑异构酶抑制剂或血管生成抑制剂。
可与此处所述的结合剂组合投予的治疗剂包括化学治疗剂。因此，在一些实施方式中，该方法或治疗牵涉投予本发明的结合剂与化学治疗剂的组合或与化学治疗剂鸡尾酒的组合。结合剂的治疗可发生于投予化学治疗剂之前、同时或之后。组合投予可包括于单一医药调制剂中共投或利用分开的调制剂共投，或以任何顺序连续投予但通常在一段期间内以使所有活性剂可同步展现它们的生物活性。所述化学治疗剂的准备及投予计划可根据制造商的说明使用或由经验丰富的医生凭经验决定。所述化学治疗的准备及投予计划亦描述于The Chemotherapy Source Book,4thEdition,2008,M.C.Perry,Editor,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA。
可用于本发明的化学治疗剂包括但不限于：烷化剂诸如噻替派(thiotepa)及环磷酰胺(cyclosphosphamide)(CYTOXAN)；烷基磺酸盐诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶诸如苯多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、甲基优瑞多巴(meturedopa)及优瑞多巴(uredopa)；伸乙亚胺(ethylenimines)及甲基三聚氰胺(methylamelamines)包括阿草特胺(altretamine)、三亚乙基三聚氰胺(triethylenemelamine)、三乙烯磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙烯硫磷酰胺(triethylenethiophosphaoramide)及三羟甲基三聚氰胺(trimethylolomelamime)；氮芥子气诸如氯芥苯丁酸(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、cholophosphamide、雌二醇氮芥(estramustine)、异环磷酸胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、霉法兰(melphalan)、新氮芥(novembichin)、胆甾醇苯乙酸氮芥(phenesterine)、松龙苯芥(prednimustine)、氯乙环磷酰胺(trofosfamide)、尿嘧啶芥(uracil mustard)；亚硝基脲(nitrosureas)诸如卡氮芥(carmustine)、吡葡亚硝脲(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、罗氮芥(lomustine)、尼氮芥(nimustine)、雷诺氮芥(ranimustine)；抗生素诸如阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycins)、放线菌素C(cactinomycin)、卡利奇霉素(calicheamicin)、卡拉比辛(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycins)、达克霉素(dactinomycin)、正定霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-羰基-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表阿霉素(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycins)、霉酚酸、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、波弗霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链霉黑素(streptonigrin)、链脲佐菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、鸟苯美司(ubenimex)、新制癌菌素(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢剂诸如甲胺喋呤(methotrexate)及5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物诸如二甲叶酸(denopterin)、甲胺喋呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲蝶呤(trimetrexate)；嘌呤类似物诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-硫唑脲嘧啶(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、胞嘧啶阿拉伯糖苷、二脱氧尿苷、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-FU；雄性素诸如卡鲁睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、硫雄甾醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪内酮(testolactone)；抗肾上腺剂诸如胺鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂诸如亚叶酸；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；贝斯特氮芥(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elformithine；依利醋铵(elliptiniumacetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓(gallium nitrate)；羟基脲；香菇糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK；雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofuran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺(2,2',2"-trichlorotriethylamine)；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷(Ara-C)；类紫杉醇(taxoids)例如太平洋紫杉醇(TAXOL)及多西紫杉醇(TAXOTERE)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤(mercaptopurine)；铂类似物诸如顺铂(cisplatin)及卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂(platinum)；依扥泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；丝裂霉素C；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；温诺平(navelbine)；米托蒽醌(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；道诺霉素(daunomycin)；胺喋呤(aminopterin)；伊班膦酸盐(ibandronate)；CPT11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；埃斯培拉霉素(esperamicins)；卡培他滨(capecitabine)(XELODA)及上述任一剂的医药上可接受的盐、酸或衍生物。化学治疗剂亦包括用来调节或抑制荷尔蒙对肿瘤的作用的抗荷尔蒙剂，诸如抗雌激素剂包括例如它莫西芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、芳香酶抑制剂4(5)-咪唑、4-羟基它莫西芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)及托瑞米芬(toremifene)(FARESTON)；及抗雄性素剂诸如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、柳普林(leuprolide)及戈舍瑞林(goserelin)；及上述任一剂的医药上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方式中，该额外治疗剂系顺铂。在某些实施方式中，该额外治疗剂系卡铂。
在某些实施方式中，该化学治疗剂系拓扑异构酶抑制剂。拓扑异构酶抑制剂系干扰拓扑异构酶(例如拓扑异构酶I或II)的活性的化学治疗剂。拓扑异构酶抑制剂包括但不限于盐酸多柔比星(doxorubicin HCl)、柠檬酸正定霉素(daunorubicin citrate)、盐酸米托蒽醌(mitoxantrone HCl)、放线菌素D、依扥泊苷(etoposide)、盐酸拓扑替康(topotecan HCl)、替尼泊苷(teniposide)(VM-26)及伊立替康(irinotecan)，以及这些任一剂的医药上可接受的盐、酸或衍生物。在一些实施方式中，该额外治疗剂系伊立替康。
在某些实施方式中，该化学治疗剂系抗代谢剂。抗代谢剂系一化学物质，其结构类似正常生化反应所需的代谢物，但仍有足够的不同处以干扰一或多种细胞正常功能，诸如细胞分裂。抗代谢剂包括但不限于吉西他滨(gemcitabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、卡培他滨(capecitabine)、甲胺喋呤钠、雷替曲塞(ralitrexed)、培美曲塞(pemetrexed)、替加氟(tegafur)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside)、硫鸟嘌呤、5-氮杂胞苷、6-巯基嘌呤、硫唑嘌呤、6-硫鸟嘌呤、喷司他丁(pentostatin)、磷酸氟达拉滨(fludarabine phosphate)及克拉屈滨(cladribine)，以及这些任一剂的医药上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方式中，该额外治疗剂系吉西他滨。
在某些实施方式中，该化学治疗剂系抗有丝分裂剂，包括但不限于与微管蛋白结合的剂。在一些实施方式中，该剂系紫杉烷。在某些实施方式中，该剂系太平洋紫杉醇(paclitaxel)或多西紫杉醇(docetaxel)，或太平洋紫杉醇或多西紫杉醇的医药上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方式中，该剂系太平洋紫杉醇(TAXOL)、多西紫杉醇(TAXOTERE)、白蛋白结合型太平洋紫杉醇(ABRAXANE)、DHA-太平洋紫杉醇或PG-太平洋紫杉醇。在某些替代性实施方式中，该抗有丝分裂剂包含长春花生物碱，诸如长春新碱(vincristine)、长春碱(binblastine)、长春瑞滨(vinorelbine)或长春地辛(vindesine)或它们的医药上可接受的盐、酸或衍生物。在一些实施方式中，该抗有丝分裂剂系驱动蛋白(kinesin)Eg5的抑制剂或有丝分裂激酶诸如Aurora A或Plk1的抑制剂。在某些实施方式中，该额外治疗剂系太平洋紫杉醇(paclitaxel)。
在一些实施方式中，额外治疗剂包含诸如小分子的剂。举例来说，治疗可涉及组合投予本发明的结合剂与作为肿瘤相关性抗原的抑制剂的小分子，该肿瘤相关性抗原包括但不限于EGFR、HER2(ErbB2)及/或VEGF。在一些实施方式中，本发明的结合剂系与选自下列的蛋白激酶抑制剂组合投予：吉非替尼(gefitinib)(IRESSA)、埃罗替尼(erlotinib)(TARCEVA)、舒尼替尼(sunitinib)(SUTENT)、拉帕替尼(lapatanib)、凡德他尼(vandetanib)(ZACTIMA)、AEE788、CI-1033、西地尼布(cediranib)(RECENTIN)、索拉非尼(sorafenib)(NEXAVAR)及帕唑帕尼(pazopanib)(GW786034B)。在一些实施方式中，额外治疗剂包含mTOR抑制剂。
在某些实施方式中，该额外治疗剂系抑制癌干细胞途径的小分子。在一些实施方式中，该额外治疗剂系缺口途径(Notch pathway)的抑制剂。在一些实施方式中，该额外治疗剂系Wnt途径的抑制剂。在一些实施方式中，该额外治疗剂系BMP途径的抑制剂。在一些实施方式中，该额外治疗剂系Hippo途径的抑制剂。在一些实施方式中，该额外治疗剂系mTOR/AKR途径的抑制剂。
在一些实施方式中，额外治疗剂包含生物性分子像是抗体。举例来说，治疗可涉及组合投予本发明的结合剂与拮抗肿瘤相关性抗原的抗体，包括但不限于与EGFR、HER2/ErbB2及/或VEGF结合的抗体。在某些实施方式中，该额外治疗剂系与癌干细胞标记特异性结合的抗体。在一些实施方式中，该额外治疗剂系与缺口途径的成份结合的抗体。在一些实施方式中，该额外治疗剂系与Wnt途径的成份结合的抗体。在某些实施方式中，该额外治疗剂系抑制癌干细胞途径的抗体。在一些实施方式中，该额外治疗剂系缺口途径的抑制剂。在一些实施方式中，该额外治疗剂系Wnt途径的抑制剂。在一些实施方式中，该额外治疗剂系BMP途径的抑制剂。在一些实施方式中，该额外治疗剂系抑制β-连环蛋白信号传导的抗体。在某些实施方式中，该额外治疗剂系血管生成抑制剂的抗体(例如抗VEGF或VEGF受体抗体)。在某些实施方式中，该额外治疗剂系贝伐珠单抗(bevacizumab)(AVASTIN)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)(HERCEPTIN)、帕妥珠单抗(pertuzumab)(OMNITARG)、帕尼单抗(panitumumab)(VECTIBIX)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、扎鲁木单抗(zalutumumab)或西妥昔单抗(cetuximab)(ERBITUX)。
另外，以此处所述的结合剂治疗可包括与其他生物分子组合治疗，像是一或多种细胞介素(例如淋巴介质、白介素、肿瘤坏死因子及/或生长因子)，或可伴随手术移除肿瘤、移除癌细胞或任何其他医师认为必要的治疗。
在一些实施方式中，该结合剂可与选自但不限于下列的生长因子组合：肾上腺髓质素(AM)、血管生成素(Ang)、BMP、BDNF、EGF、红血球生成素(EPO)、FGF、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GDF9、HGF、HDGF、IGF、移动刺激因子、肌肉抑制素(GDF-8)、NGF、神经生长激素、PDGF、血小板生成素、TGF-α、TGF-β、TNF-α、VEGF、PlGF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15及IL-18。
在某些实施方式中，该治疗涉及投予本发明的结合剂与放射治疗的组合。结合剂的治疗可发生于投予放射治疗之前、同时或之后。该放射治疗的投予计划可由经验丰富的医生决定。
在某些实施方式中，该治疗涉及投予本发明的结合剂与抗病毒治疗的组合。结合剂的治疗可发生于投予抗病毒治疗之前、同时或之后。用于联合疗法中的抗病毒药物将取决于受试者受感染的病毒。
组合投予可包括于单一医药调制剂中共投或利用分开的调制剂共投，或以任何顺序连续投予但通常在一段期间内以使所有活性剂可同步展现它们的生物活性。
将了解的是，结合剂与至少一种额外治疗剂的组合可以任何顺序投予或同时投予。在一些实施方式中，该结合剂将被投予至已先接受第二治疗剂治疗的病患。在某些其他实施方式中，该结合剂与第二治疗剂将被实质上同步或同时投予。举例来说，受试者可能在接受第二治疗剂(例如化学治疗)的疗程时被给予结合剂(例如可溶性受体)。在某些实施方式中，结合剂将于接受第二治疗剂治疗的一年内被投予。在某些替代性实施方式中，结合剂将于接受第二治疗剂的任何治疗的10、8、6、4或2个月内被投予。在某些其他实施方式中，结合剂将于接受第二治疗剂的任何治疗的4、3、2或1周内被投予。在一些实施方式中，结合剂将于接受第二治疗剂的任何治疗的5、4、3、2或1天内被投予。将另外了解的是，该二(或多)种剂或治疗可在数小时或数分钟内(即实质上同步)被投予至受试者。
以疾病的治疗而言，本发明的结合剂的适当剂量取决于所欲治疗的疾病类型、该疾病的严重性及病程、该疾病的反应性、该结合剂系经投予以达治疗或预防目的、先前治疗、该病患的临床病史等，所有皆由主治医师斟酌。该结合剂可经投予一次或在数天至数月期间的治疗系列投予，或直到达成疗效或达到减少的疾病状态(例如肿瘤大小减少)。理想投药计划可自药物累积于病患体内的测量值加以计算，且将视个别剂的相对强度而异。主治医师可决定理想剂量、投药方法及重复频率。在某些实施方式中，剂量系0.01μg至100mg/kg体重、0.1μg至100mg/kg体重、1μg至100mg/kg体重、1mg至100mg/kg体重、1mg至80mg/kg体重、10mg至100mg/kg体重、10mg至75mg/kg体重、或10mg至50mg/kg体重。在某些实施方式中，该结合剂的剂量系约0.1mg至约20mg/kg体重。在一些实施方式中，该结合剂的剂量系约0.5mg/kg体重。在一些实施方式中，该结合剂的剂量系约1mg/kg体重。在一些实施方式中，该结合剂的剂量系约1.5mg/kg体重。在一些实施方式中，该结合剂的剂量系约2mg/kg体重。在一些实施方式中，该结合剂的剂量系约2.5mg/kg体重。在一些实施方式中，该结合剂的剂量系约5mg/kg体重。在一些实施方式中，该结合剂的剂量系约7.5mg/kg体重。在一些实施方式中，该结合剂的剂量系约10mg/kg体重。在一些实施方式中，该结合剂的剂量系约12.5mg/kg体重。在一些实施方式中，该结合剂的剂量系约15mg/kg体重。在某些实施方式中，该剂量可于每天、每周、每月或每年给予一次或多次。在某些实施方式中，该结合剂系给予每周一次、每二周一次、每三周一次或每四周一次。
在一些实施方式中，结合剂可以一开始较高的“起始”剂量投予，之后投予一或多次较低剂量。在一些实施方式中，投予的频率亦可能改变。在一些实施方式中，投药计划可能包含投予初始剂量，然后每周、每二周、每三周或每月投予一次额外剂量(或“维持”剂量)。举例来说，投药计划可能包含投予起始剂量，然后投予例如一半起始剂量的每周维持剂量。或投药计划可能包含投予起始剂量，然后每隔一周投予例如一半起始剂量的维持剂量。或投药计划可能包含三周投予三次起始剂量，然后每隔一周投予例如相同量的维持剂量。
如本领域技术人员所知，投予任何治疗剂可能导致不良反应及/或毒性。在一些情况中，不良反应及/或毒性非常严重以至于无法投予治疗有效剂量的特定剂。在一些情况中，药物治疗必须中断，并尝试其他剂。然而，许多相同治疗类别的剂通常展现类似的不良反应及/或毒性，表示病患必须停止治疗，或可能的话忍受与该治疗剂有关的不适不良反应。
因此，本发明提供对受试者投予此处所述的结合剂的方法，该方法包含利用间歇性投药计划投予一或多剂，如此可能减少与投予结合剂、化学治疗剂等有关的不良反应及/或毒性。在一些实施方式中，治疗人受试者的癌的方法包含对该受试者投予治疗有效剂量的结合剂与治疗有效剂量的化学治疗剂的组合，其中该一或二种剂系根据间歇性投药计划投予。在一些实施方式中，该间歇性投药计划包含对该受试者投予初始剂量的结合剂，接着大约每2周投予一次该结合剂的后续剂量。在一些实施方式中，该间歇性投药计划包含对该受试者投予初始剂量的结合剂，接着大约每3周投予一次该结合剂的后续剂量。在一些实施方式中，该间歇性投药计划包含对该受试者投予初始剂量的结合剂，接着大约每4周投予一次该结合剂的后续剂量。在一些实施方式中，该结合剂利用间歇性投药计划投予，且该化学治疗剂每周投予。
V.筛选
本发明提供识别调节免疫反应的剂的筛选方法。在一些实施方式中，本发明提供筛选调节免疫反应的候选剂的方法，包括但不限于蛋白、肽、拟肽、小分子、化合物或其他药物。
在一些实施方式中，筛选调节免疫反应的候选剂的方法，包含测定该剂是否对免疫反应细胞有影响。在一些实施方式中，筛选调节免疫反应的候选剂的方法，包含测定该剂是否能增加免疫细胞的活性。在一些实施方式中，筛选调节免疫反应的候选剂的方法，包含测定该剂是否能增加溶细胞性细胞例如CTL及/或NK细胞的活性。
VI.包含结合剂的试剂盒
本发明提供包含此处所述的结合剂的试剂盒(kit)，其可被用于实施此处所述的方法。在某些实施方式中，试剂盒包含于一或多个容器中的至少一种经纯化的结合剂。在一些实施方式中，该试剂盒包含所有实施检测试验所必需及/或足以实施检测试验的成份，包括所有对照物、使用说明及任何必要软件以供结果分析及表达。本领域技术人员将显而易见的是，本发明所揭示的结合剂可被轻易纳入该领域所广为周知的已建立的试剂盒格式之一。
本发明另提供包含结合剂以及至少一种额外治疗剂的试剂盒。在某些实施方式中，该第二(或更多)治疗剂系化学治疗剂。在某些实施方式中，该第二(或更多)治疗剂系血管生成抑制剂。
本发明的实施方式可藉由参考下列非限制性实施例进一步定义，以下实施例描述本发明的某些抗体的详细制备及使用本发明的抗体的方法。本领域技术人员将显而易见的是，许多在材料及方法上的调整可加以实施而不背离本发明的范围。
实施例1
PVR家族建构体
制备PVR家族成员TIGIT、CD96、CD226、PVRL1、PVRL2、PVRL3、PVRL4、PVR及PVR变异体的蛋白建构体，包括膜结合型蛋白及可溶性受体(图2)。各种膜结合型受体被设计为在信号传导方面不具功能性，因为跨膜及细胞质结构域被人CD4跨膜结构域及细胞内绿色荧光蛋白(GFP)标签置换。该膜结合型蛋白建构体系藉由接合人PVR家族蛋白的胞外域(ECD)的至少一个结构域与CD4的跨膜结构域及C端GFP蛋白标签产生，使用标准重组DNA技术。这些建构体被称为“PVR家族成员”-CD4TM-GFP，例如PVR-CD4TM-GFP。可溶性受体被设计为包括与免疫球蛋白Fc结构域连接的至少一个ECD结构域。该可溶性受体PVR家族蛋白建构体系藉由接合人PVR家族成员蛋白的ECD区与人IgG1的Fc结构域产生，使用标准重组DNA技术。这些建构体被称为“PVR家族成员”-Fc，例如CD226-Fc。如本领域技术人员所知，用于建构体中的任何给定蛋白的ECD区可能包含该ECD或包含该ECD的片段，例如仅IgV结构域。同样的，被视为ECD或Ig结构域者之间可能有一、二、三或更多个在该结构域的氨基端、羧基端或两端的氨基酸差异。这些融合蛋白可被用于检查PVR家族成员的结合交互作用。
所产生的建构体包括源自表2的PVR家族成员的ECD区或其片段。
表2
实施例2
PVR家族成员之间的结合交互作用
PVR家族成员之间的结合交互作用系藉由流式细胞分析检测。各家族成员皆被表达为Fc融合蛋白及膜结合型两种形式，该Fc融合蛋白包含该受体的至少一个ECD结构域，其与人IgG1的Fc区融合，该膜结合型包含该受体的至少一个ECD结构域，其与人CD4跨膜区及细胞内绿色荧光(GFP)蛋白标签融合(见实施例1)。
个别潜在结合交互作用的检测，系藉由以编码特定膜结合型受体(PVR、PVRL1、PVRL2、PVRL3或PVRL4)的表达载体转染HEK-293T细胞，接着检测特定受体-Fc融合蛋白(CD96、TIGIT或CD226)与该经转染的细胞结合的能力进行。HEK-293T细胞经编码PVR-CD4TM-GFP、PVRL1-CD4TM-GFP、PVRL2-CD4TM-GFP、PVRL3-CD4TM-GFP或PVRL4-CD4TM-GFP的cDNA表达载体过渡性转染，接着与可溶性CD226-Fc、TIGIT-Fc或CD96-Fc融合蛋白混合。此外，个别潜在结合交互作用的检测，系藉由以编码特定膜结合型受体(PVR、PVRL1、PVRL2、PVRL3或PVRL4)的表达载体转染HEK-293T细胞，接着检测特定受体-Fc融合蛋白(PVR、PVRL1、PVRL2、PVRL3或PVRL4)与该经转染的细胞结合的能力进行。HEK-293T细胞经编码PVR-CD4TM-GFP、PVRL1-CD4TM-GFP、PVRL2-CD4TM-GFP、PVRL3-CD4TM-GFP或PVRL4-CD4TM-GFP的cDNA表达载体过渡性转染，接着与可溶性PVR-Fc、PVRL1-Fc、PVRL2-Fc、PVRL3-Fc或PVRL4-Fc融合蛋白混合。结合系藉由后续利用与藻红素(PE)共轭的抗人Fc抗体染色所述细胞，然后利用流式细胞仪检测。
如图3A所示，膜结合型PVR被可溶性受体CD226、TIGIT及CD96结合。此外，可溶性受体CD226与PVRL2微弱结合，可溶性受体TIGIT与PVRL2、PVRL3及PVRL4结合。如图3B所示，可溶性受体PVR与PVRL3结合，可溶性受体PVRL1与PVRL3及PVRL4结合，可溶性受体PVRL3与PVRL1、PVRL2及PVR结合，可溶性受体PVRL4与PVRL1结合。阳性结合交互作用以圆圈强调。亦以简图表示在不同PVR家族成员之间所观察到的结合交互作用(图3C)。在此分析所示的某些结合交互作用似乎是新观察到的交互作用。
实施例3
产生PVR变异体
与TIGIT结合的PVR的结晶结构先前已被揭示(见Stengel et al.,2012,PNAS,109:5399-5404)。检视该结构，选出似乎与TIGIT结合无关，但可能影响CD226或CD96结合的PVR内的残基。这些残基系强调显示于图4。人PVR变异体N端IgV结构域分子的cDNA表达库系经设计及产生，其中氨基酸位置65、67、72、73、74、81、82、84及85(SEQ ID NO:18)各自经所有12种氨基酸置换。该cDNA表达载体编码与CD4跨膜结构域及绿色荧光蛋白(GFP)标签融合的该PVR的N端IgV结构域。该表达载体质粒亦包含细菌安比西林(ampicillin)抗药性基因。该PVR变异体分子的cDNA库系于100倍过量缺乏安比西林抗药性的不相关载体存在下被转染至CAP-T细胞。CAP-T细胞系永生化的羊水细胞系，其稳定表达SV40大型T抗原(CEVECPharmaceuticals,Koln Germany)。此策略的设计是为了减少每细胞转染的独特PVR变异质粒的数量。在转染后48小时，细胞与经荧光标记的TIGIT-Fc、CD96-Fc、CD226-Fc、TIGIT-Fc与CD226-Fc的组合或CD96-Fc与CD226-Fc的组合一起培养。细胞藉由荧光激活细胞分选(FACS)分析，以分离显示与TIGIT或CD96结合但不与CD226结合的细胞。自所述分离细胞收集质粒，使用所述质粒以转化细菌，然后将细菌接种于含有安比西林的板。测序及分析单菌落的质粒。以此方式可识别能致使PVR与TIGIT、CD96及CD226的相关结合的氨基酸置换。
图5显示二种所述氨基酸变异体的结合模式。PVR变异体S72N(丝氨酸置换为天冬酰胺)相较于野生型PVR不显著影响与TIGIT或CD96的结合，但PVR变异体S72N相较于野生型PVR显著减少与CD226的结合。另一变异体PVR变异体Q82K(谷氨酰胺置换为赖氨酸)相较于在TIGIT及CD226存在下具有不同结合模式的野生型PVR似乎具有增加的与TIGIT的结合。此可能允许TIGIT更有效地与CD226竞争与可用变异体PVR的结合。
实施例4
自然杀手细胞(NK)的细胞毒杀性试验
人慢性骨髓性白血病细胞系K562及人肺腺癌细胞系A549系于RPMI 1640培养基(Gibco/Life Technologies,Carlsbad,CA)中培养，该培养基添加10％(v/v)胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素及100μg/ml链霉素(Gibco)，培养条件为37℃、潮湿5％CO2大气下。K562细胞系经GFP、人PVR或人PVR变异体电穿孔转染(每2×106细胞4μg DNA)，根据厂商建议的方式使用Amaxa Nucleofector装置及Nucleofector试剂盒V(Lonza,Basel,Switzerland)。转染效率通常为60至70％，以流式细胞分析GFP阳性率显示。A549细胞系经相同建构体转染(每1×106细胞3μg DNA)，根据厂商说明使用FuGENE 6转染试剂(Promega,Madison,WI)。转染效率通常>95％。
初代人NK细胞系直接自新鲜周边血液白血球层分离(Stanford Blood Center,Palo Alto,CA)，新鲜血液先与RosetteSep NK细胞富集鸡尾酒(Stem Cell Technologies,Vancouver,British Columbia,Canada)培养30分钟，然后利用Ficoll-Hypaque密度梯度离心(Stem Cell Technologies)。人NK细胞系于不含L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中培养，该培养基添加10％FBS、100U/ml青霉素及100μg/ml链霉素。经分离的NK细胞以流式细胞分析例行性显示>98％CD56+CD3-。NK细胞系NK-92系购自美国菌种保存中心(American Type CultureCollection)(Manassas,VA)，并维持于包含20％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素及150U/ml重组人IL-2的RPMI 1640中。
NK-92细胞或初代人NK细胞系接种于包含或不含300U/ml重组人IL-2(PeproTech,Rocky Hill,NJ)的96孔V型底盘，并于37℃下隔夜培养。在一些实验中，NK-92细胞或初代NK细胞在用于细胞毒杀性试验之前系与10μg/ml的抗NKp30、NKp46或NKG2D特异性封闭抗体(Biolegend,San Diego,CA)或等量的同型相符多株人IgG(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)于4℃下一起培养30分钟。标靶细胞(经GFP、人PVR或人PVR变异体转染的K562或A549细胞)系经10μM钙黄绿素AM(LifeTechnologies)于37℃下标记1小时，接着以不同的效应细胞：标靶细胞比例(50:1至3:1)与NK细胞组合。在37℃下培养4小时之后，收集不含细胞的上清液，于荧光计上以激发光485nm及发射光535nm定量钙黄绿素的释放。特异性细胞溶解的百分比系以下式决定：％溶解＝100×(ER-SR)/(MR-SR)，其中ER、SR及MR分别代表实验、自发及最大钙黄绿素释放。自发释放系由单独培养于培养基中的标靶细胞所散发的荧光(即效应细胞不存在下)，最大释放系利用等量的10％SDS溶解标靶细胞时所测定。
在一些实验中，NK细胞的细胞毒杀性系于可溶性人PVR-Fc或人PVR-Fc变异体存在下评估。初代人NK细胞或NK-92细胞系如上述接种，并添加10μg/ml的PVR-Fc或该人PVR-Fc变异体。NK细胞溶解K562细胞或A549细胞的作用系如上述分析。
新鲜分离的初代人NK细胞系于37℃下、含有或者没有300IU/ml重组人IL-2(PeproTech,Rocky Hill,NJ)下隔夜培养。NK细胞接着经30μg/ml的PVR-Fc变异体Q82K(灰柱)、PVR-Fc野生型对照(黑柱)或仅培养基(白柱)在4℃下、HBSS中培养30分钟预先处理。NK细胞利用添加额外30μg/ml的PVR-Fc变异体或PVR-Fc WT的培养基洗涤、重悬，并接种至96孔V形底盘。标靶细胞(HEK-293T细胞或K562细胞)系经10μM钙黄绿素AM(Life Technologies,Grand Island NY)于37℃下标记2小时，接着与NK细胞以效应细胞：标靶细胞12:1的比例混合。在37℃下培养4小时之后，收集不含细胞的上清液，于荧光计上以激发光485nm及发射光535nm定量钙黄绿素的释放。特异性细胞溶解的百分比系如上述。
经PVR变异体Q82K处理的NK细胞，相较于未经处理的NK细胞或经野生型PVR处理的NK细胞，显示增加杀灭标靶细胞的能力(图6)。在所有样本中，添加IL-2使细胞溶解增加。
NK活化及/或活性亦可藉由测量试验期间由NK细胞产生的IFN-γ的量评估。将HEK-293T或A549细胞以5×104标靶细胞/孔的密度接种于96孔平底盘的孔槽。使标靶细胞隔夜生长至长满。新鲜分离的人NK细胞经30μg/ml的PVR-Fc变异体Q82K(灰柱)、PVR-Fc野生型对照(黑柱)或仅培养基(白柱)在4℃下、HBSS中培养30分钟预先处理。NK细胞接着利用添加额外30μg/ml的PVR-Fc变异体或PVR-Fc WT的培养基洗涤、重悬，并于包含300IU/ml人IL-2的培养基中以2×105细胞/孔添加至标靶细胞。另一组重复细胞以不含人IL-2的培养基培养。在24小时后收集培养上清液，并藉由ELISA(R&D Systems,Minneapolis,MN)分析IFN-γ含量。
在IL-2不存在下，NK细胞产生极少量的IFN-γ，不同样本之间似乎没有差异。相反地，在IL-2存在下，经PVR-Fc变异体Q82K预先处理的NK细胞，相较于经PVR-Fc野生型或未经处理的对照组，产生较高量的IFN-γ(图7)。
实施例5
FACS分析PVR变异体与TIGIT、CD226及PVRL3之间的结合交互作用
HEK-293T细胞经编码PVR-CD4TM-GFP、PVRS72N变异体CD4TM-GFP、PVR Q82K变异体CD4TM-GFP或PVR Q82K+S72N双变异体CD4TM-GFP的cDNA表达载体过渡性转染。经24小时后，细胞与可溶性TIGIT-Fc融合蛋白、CD226-Fc融合蛋白或PVRL3-Fc融合蛋白混合，接着利用PE共轭的抗人Fc二级抗体染色。接着藉由流式细胞分析融合蛋白结合。
结果显示，双突变PVR融合蛋白相较于亲代野生型PVR展现经改善的与TIGIT结合，但与CD226无可侦测的结合(图8)。PVR变异体相较于野生型PVR具有可相比或略为改善的与PVRL3结合。因此，除了增强免疫反应之外(例如针对肿瘤)，PVR变异体可能具有优先定位肿瘤的能力，这是因为其与藉由干扰正常紧密连接结构而暴露于肿瘤上的P V RL 3结合并标靶肿瘤细胞以供免疫监控。
应了解此处所描述的实施例及实施方式仅供说明示范的目的，各种对于它们的修饰或改变将由本领域技术人员建议且将被纳入本申请案的精神与范围内。
所有此处所提及的公开数据、专利、专利申请案、网站及编号/数据库序列包括多核苷酸及多肽序列在此系以参照方式整体纳入此处以符合所有目的，和特别且独立指出个别公开资料、专利、专利申请案、网站或编号/数据库序列各自以参照方式被纳入的范围相同。
本说明书中揭示的序列如下：
人PVR，画底线处为预测信号序列(SEQ ID NO：1)
MARAMAAAWPLLLVALLVLSWPPPGTGDVVVQAPTQVPGFLGDSVTLPCYLQVPNMEVTHVSQLTWARHGESGSMAVFHQTQGPSYSESKRLEFVAARLGAELRNASLRMFGLRVEDEGNYTCLFVTFPQGSRSVDIWLRVLAKPQNTAEVQKVQLTGEPVPMARCVSTGGRPPAQITWHSDLGGMPNTSQVPGFLSGTVTVTSLWILVPSSQVDGKNVTCKVEHESFEKPQLLTVNLTVYYPPEVSISGYDNNWYLGQNEATLTCDARSNPEPTGYNWSTTMGPLPPFAVAQGAQLLIRPVDKPINTTLICNVTNALGARQAELTVQVKEGPPSEHSGMSRNAIIFLVLGILVFLILLGIGIYFYWSKCSREVLWHCHLCPSSTEHASASANGHVSYSAVSRENSSSQDPQTEGTR
人PVRL1，画底线处为预测信号序列(SEQ ID NO：2)
MARMGLAGAAGRWWGLALGLTAFFLPGVHSQVVQVNDSMYGFIGTDVVLHCSFANPLPSVKITQVTWQKSTNGSKQNVAIYNPSMGVSVLAPYRERVEFLRPSFTDGTIRLSRLELEDEGVYICEFATFPTGNRESQLNLTVMAKPTNWIEGTQAVLRAKKGQDDKVLVATCTSANGKPPSVVSWETRLKGEAEYQEIRNPNGTVTVISRYRLVPSREAHQQSLACIVNYHMDRFKESLTLNVQYEPEVTIEGFDGNWYLQRMDVKLTCKADANPPATEYHWTTLNGSLPKGVEAQNRTLFFKGPINYSLAGTYICEATNPIGTRSGQVEVNITEFPYTPSPPEHGRRAGPVPTAIIGGVAGSILLVLIVVGGIVVALRRRRHTFKGDYSTKKHVYGNGYSKAGIPQHHPPMAQNLQYPDDSDDEKKAGPLGGSSYEEEEEEEEGGGGGERKVGGPHPKYDEDAKRPYFTVDEAEARQDGYGDRTLGYQYDPEQLDLAENMVSQNDGSFISKKEWYV
人PVRL2，画底线处为预测信号序列(SEQ ID NO：3)
MARAAALLPSRSPPTPLLWPLLLLLLLETGAQDVRVQVLPEVRGQLGGTVELPCHLLPPVPGLYISLVTWQRPDAPANHQNVAAFHPKMGPSFPSPKPGSERLSFVSAKQSTGQDTEAELQDATLALHGLTVEDEGNYTCEFATFPKGSVRGMTWLRVIAKPKNQAEAQKVTFSQDPTTVALCISKEGRPPARISWLSSLDWEAKETQVSGTLAGTVTVTSRFTLVPSGRADGVTVTCKVEHESFEEPALIPVTLSVRYPPEVSISGYDDNWYLGRTDATLSCDVRSNPEPTGYDWSTTSGTFPTSAVAQGSQLVIHAVDSLFNTTFVCTVTNAVGMGRAEQVIFVRETPNTAGAGATGGIIGGIIAAIIATAVAATGILICRQQRKEQTLQGAEEDEDLEGPPSYKPPTPKAKLEAQEMPSQLFTLGASEHSPLKTPYFDAGASCTEQEMPRYHELPTLEERSGPLHPGATSLGSPIPVPPGPPAVEDVSLDLEDEEGEEEEEYLDKINPIYDALSYSSPSDSYQGKGFVMSRAMYV
人PVRL3，画底线处为预测信号序列(SEQ ID NO：4)
MARTLRPSPLCPGGGKAQLSSASLLGAGLLLQPPTPPPLLLLLFPLLLFSRLCGALAGPIIVEPHVTAVWGKNVSLKCLIEVNETITQISWEKIHGKSSQTVAVHHPQYGFSVQGEYQGRVLFKNYSLNDATITLHNIGFSDSGKYICKAVTFPLGNAQSSTTVTVLVEPTVSLIKGPDSLIDGGNETVAAICIAATGKPVAHIDWEGDLGEMESTTTSFPNETATIISQYKLFPTRFARGRRITCVVKHPALEKDIRYSFILDIQYAPEVSVTGYDGNWFVGRKGVNLKCNADANPPPFKSVWSRLDGQWPDGLLASDNTLHFVHPLTFNYSGVYICKVTNSLGQRSDQKVIYISDPPTTTTLQPTIQWHPSTADIEDLATEPKKLPFPLSTLATIKDDTIATIIASVVGGALFIVLVSVLAGIFCYRRRRTFRGDYFAKNYIPPSDMQKESQIDVLQQDELDSYPDSVKKENKNPVNNLIRKDYLEEPEKTQWNNVENLNRFERPMDYYEDLKMGMKFVSDEHYDENEDDLVSHVDGSVISRREWYV
人PVRL4，画底线处为预测信号序列(SEQ ID NO：4)
MPLSLGAEMWGPEAWLLLLLLLASFTGRCPAGELETSDVVTVVLGQDAKLPCFYRGDSGEQVGQVAWARVDAGEGAQELALLHSKYGLHVSPAYEGRVEQPPPPRNPLDGSVLLRNAVQADEGEYECRVSTFPAGSFQARLRLRVLVPPLPSLNPGPALEEGQGLTLAASCTAEGSPAPSVTWDTEVKGTTSSRSFKHSRSAAVTSEFHLVPSRSMNGQPLTCVVSHPGLLQDQRITHILHVSFLAEASVRGLEDQNLWHIGREGAMLKCLSEGQPPPSYNWTRLDGPLPSGVRVDGDTLGFPPLTTEHSGIYVCHVSNEFSSRDSQVTVDVLDPQEDSGKQVDLVSASVVVVGVIAALLFCLLVVVVVLMSRYHRRKAQQMTQKYEEELTLTRENSIRRLHSHHTDPRSQPEESVGLRAEGHPDSLKDNSSCSVMSEEPEGRSYSTLTTVREIETQTELLSPGSGRAEEEEDQDEGIKQAMNHFVQENGTLRAKPTGNGIYINGRGHLV
人TIGIT，画底线处为预测信号序列(SEQ ID NO：6)
MRWCLLLIWAQGLRQAPLASGMMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIPLLGAMAATLVVICTAVIVVVALTRKKKALRIHSVEGDLRRKSAGQEEWSPSAPSPPGSCVQAEAAPAGLCGEQRGEDCAELHDYFNVLSYRSLGNCSFFTETG
人CD96，画底线处为预测信号序列(SEQ ID NO：7)
MEKKWKYCAVYYIIQIHFVKGVWEKTVNTEENVYATLGSDVNLTCQTQTVGFFVQMQWSKVTNKIDLIAVYHPQYGFYCAYGRPCESLVTFTETPENGSKWTLHLRNMSCSVSGRYECMLVLYPEGIQTKIYNLLIQTHVTADEWNSNHTIEIEINQTLEIPCFQNSSSKISSEFTYAWSVENSSTDSWVLLSKGIKEDNGTQETLISQNHLISNSTLLKDRVKLGTDYRLHLSPVQIFDDGRKFSCHIRVGPNKILRSSTTVKVFAKPEIPVIVENNSTDVLVERRFTCLLKNVFPKANITWFIDGSFLHDEKEGIYITNEERKGKDGFLELKSVLTRVHSNKPAQSDNLTIWCMALSPVPGNKVWNISSEKITFLLGSEISSTDPPLSVTESTLDTQPSPASSVSPARYPATSSVTLVDVSALRPNTTPQPSNSSMTTRGFNYPWTSSGTDTKKSVSRIPSETYSSSPSGAGSTLHDNVFTSTARAFSEVPTTANGSTKTNHVHITGIVVNKPKDGMSWPVIVAALLFCCMILFGLGVRKWCQYQKEIMERPPPFKPPPPPIKYTCIQEPNESDLPYHEMETL
人CD226，画底线处为预测信号序列(SEQ ID NO：8)
MDYPTLLLALLHVYRALCEEVLWHTSVPFAENMSLECVYPSMGILTQVEWFKIGTQQDSIAIFSPTHGMVIRKPYAERVYFLNSTMASNNMTLFFRNASEDDVGYYSCSLYTYPQGTWQKVIQVVQSDSFEAAVPSNSHIVSEPGKNVTLTCQPQMTWPVQAVRWEKIQPRQIDLLTYCNLVHGRNFTSKFPRQIVSNCSHGRWSVIVIPDVTVSDSGLYRCYLQASAGENETFVMRLTVAEGKTDNQYTLFVAGGTVLLLLFVISITTIIVIFLNRRRRRERRDLFTESWDTQKAPNNYRSPISTSQPTNQSMDDTREDIYVNYPTFSRRPKTRV
PVR家族
人PVR-ECD，不含预测信号序列(SEQ ID NO：9)
DVVVQAPTQVPGFLGDSVTLPCYLQVPNMEVTHVSQLTWARHGESGSMAVFHQTQGPSYSESKRLEFVAARLGAELRNASLRMFGLRVEDEGNYTCLFVTFPQGSRSVDIWLRVLAKPQNTAEVQKVQLTGEPVPMARCVSTGGRPPAQITWHSDLGGMPNTSQVPGFLSGTVTVTSLWILVPSSQVDGKNVTCKVEHESFEKPQLLTVNLTVYYPPEVSISGYDNNWYLGQNEATLTCDARSNPEPTGYNWSTTMGPLPPFAVAQGAQLLIRPVDKPINTTLICNVTNALGARQAELTVQVKEGPPSEHSGMSRN
人PVRL1-ECD，不含预测信号序列(SEQ ID NO：10)
QVVQVNDSMYGFIGTDVVLHCSFANPLPSVKITQVTWQKSTNGSKQNVAIYNPSMGVSVLAPYRERVEFLRPSFTDGTIRLSRLELEDEGVYICEFATFPTGNRESQLNLTVMAKPTNWIEGTQAVLRAKKGQDDKVLVATCTSANGKPPSVVSWETRLKGEAEYQEIRNPNGTVTVISRYRLVPSREAHQQSLACIVNYHMDRFKESLTLNVQYEPEVTIEGFDGNWYLQRMDVKLTCKADANPPATEYHWTTLNGSLPKGVEAQNRTLFFKGPINYSLAGTYICEATNPIGTRSGQVEVNITEFPYTPSPPEHGRRAGPVPTA
人PVRL2-ECD，不含预测信号序列(SEQ ID NO：11)
QDVRVQVLPEVRGQLGGTVELPCHLLPPVPGLYISLVTWQRPDAPANHQNVAAFHPKMGPSFPSPKPGSERLSFVSAKQSTGQDTEAELQDATLALHGLTVEDEGNYTCEFATFPKGSVRGMTWLRVIAKPKNQAEAQKVTFSQDPTTVALCISKEGRPPARISWLSSLDWEAKETQVSGTLAGTVTVTSRFTLVPSGRADGVTVTCKVEHESFEEPALIPVTLSVRYPPEVSISGYDDNWYLGRTDATLSCDVRSNPEPTGYDWSTTSGTFPTSAVAQGSQLVIHAVDSLFNTTFVCTVTNAVGMGRAEQVIFVRETPNTAGAGATGG
人PVRL3-ECD，不含预测信号序列(SEQ ID NO：12)
GPIIVEPHVTAVWGKNVSLKCLIEVNETITQISWEKIHGKSSQTVAVHHPQYGFSVQGEYQGRVLFKNYSLNDATITLHNIGFSDSGKYICKAVTFPLGNAQSSTTVTVLVEPTVSLIKGPDSLIDGGNETVAAICIAATGKPVAHIDWEGDLGEMESTTTSFPNETATIISQYKLFPTRFARGRRITCVVKHPALEKDIRYSFILDIQYAPEVSVTGYDGNWFVGRKGVNLKCNADANPPPFKSVWSRLDGQWPDGLLASDNTLHFVHPLTFNYSGVYICKVTNSLGQRSDQKVIYISDPPTTTTLQPTIQWHPSTADIEDLATEPKKLPFPLSTLATIKDDTIAT
人PVRL4-ECD，不含预测信号序列(SEQ ID NO：13)
GELETSDVVTVVLGQDAKLPCFYRGDSGEQVGQVAWARVDAGEGAQELALLHSKYGLHVSPAYEGRVEQPPPPRNPLDGSVLLRNAVQADEGEYECRVSTFPAGSFQARLRLRVLVPPLPSLNPGPALEEGQGLTLAASCTAEGSPAPSVTWDTEVKGTTSSRSFKHSRSAAVTSEFHLVPSRSMNGQPLTCVVSHPGLLQDQRITHILHVSFLAEASVRGLEDQNLWHIGREGAMLKCLSEGQPPPSYNWTRLDGPLPSGVRVDGDTLGFPPLTTEHSGIYVCHVSNEFSSRDSQVTVDVLDPQEDSGKQVDLVSAS
人TIGIT-ECD，不含预测信号序列(SEQ ID NO：14)
MMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIPLLGAMAATLVVICTAVIVVVA
人CD96-ECD，不含预测信号序列(SEQ ID NO：15)
KTVNTEENVYATLGSDVNLTCQTQTVGFFVQMQWSKVTNKIDLIAVYHPQYGFYCAYGRPCESLVTFTETPENGSKWTLHLRNMSCSVSGRYECMLVLYPEGIQTKIYNLLIQTHVTADEWNSNHTIEIEINQTLEIPCFQNSSSKISSEFTYAWSVENSSTDSWVLLSKGIKEDNGTQETLISQNHLISNSTLLKDRVKLGTDYRLHLSPVQIFDDGRKFSCHIRVGPNKILRSSTTVKVFAKPEIPVIVENNSTDVLVERRFTCLLKNVFPKANITWFIDGSFLHDEKEGIYITNEERKGKDGFLELKSVLTRVHSNKPAQSDNLTIWCMALSPVPGNKVWNISSEKITFLLGSEISSTDPPLSVTESTLDTQPSPASSVSPARYPATSSVTLVDVSALRPNTTPQPSNSSMTTRGFNYPWTSSGTDTKKSVSRIPSETYSSSPSGAGSTLHDNVFTSTARAFSEVPTTANGSTKTNHVHITGIVVNKPKDGMS
人CD226-ECD，不含预测信号序列(SEQ ID NO：16)
EEVLWHTSVPFAENMSLECVYPSMGILTQVEWFKIGTQQDSIAIFSPTHGMVIRKPYAERVYFLNSTMASNNMTLFFRNASEDDVGYYSCSLYTYPQGTWQKVIQVVQSDSFEAAVPSNSHIVSEPGKNVTLTCQPQMTWPVQAVRWEKIQPRQIDLLTYCNLVHGRNFTSKFPRQIVSNCSHGRWSVIVIPDVTVSDSGLYRCYLQASAGENETFVMRLTVAEGKTDNQYTLFVA
人PVR-N端IgV结构域(SEQ ID NO：17)
DVVVQAPTQVPGFLGDSVTLPCYLQVPNMEVTHVSQLTWARHGESGSMAVFHQTQGPSYSESKRLEFVAARLGAELRNASLRMFGLRVEDEGNYTCLFVTFPQGSRSVDIWLRVLA
人PVR变异体1-N端IgV结构域(SEQ ID NO：18)
DVVVQAPTQVPGFLGDSVTLPCYLQVPNMEVTHVSQLXWXRHGEXXXMAVFHQXXGXXYSESKRLEFVAARLGAELRNASLRMFGLRVEDEGNYTCLFVTFPQGSRSVDIWL
X＝任何胺基酸
人PVR变异体2-N端IgV结构域(SEQ ID NO：19)
DVVVQAPTQVPGFLGDSVTLPCYLQVPNMEVTHVSQLTWARHGENGSMAVFHQTQGPSYSESKRLEFVAARLGAELRNASLRMFGLRVEDEGNYTCLFVTFPQGSRSVDIWL
人PVR变异体3-N端IgV结构域(SEQ ID NO：20)
DVVVQAPTQVPGFLGDSVTLPCYLQVPNMEVTHVSQLTWARHGESGSMAVFHQTKGPSYSESKRLEFVAARLGAELRNASLRMFGLRVEDEGNYTCLFVTFPQGSRSVDIWL
人PVR变异体4-N端IgV结构域(SEQ ID NO：21)
DVVVQAPTQVPGFLGDSVTLPCYLQVPNMEVTHVSQLTWARHGENGSMAVFHQTKGPSYSESKRLEFVAARLGAELRNASLRMFGLRVEDEGNYTCLFVTFPQGSRSVDIWL
人PVRL1-N端IgV结构域(SEQ ID NO：22)
QVVQVNDSMYGFIGTDVVLHCSFANPLPSVKITQVTWQKSTNGSKQNVAIYNPSMGVSVLAPYRERVEFLRPSFTDGTIRLSRLELEDEGVYICEFATFPTGNRESQLNLTVMA
人PVRL2-N端IgV结构域(SEQ ID NO：23)
DVRVQVLPEVRGQLGGTVELPCHLLPPVPGLYISLVTWQRPDAPANHQNVAAFHPKMGPSFPSPKPGSERLSFVSAKQSTGQDTEAELQDATLALHGLTVEDEGNYTCEFATFPKGSVRGMTWLRVIA
人PVRL3-N端IgV结构域(SEQ ID NO：24)
GPIIVEPHVTAVWGKNVSLKCLIEVNETITQISWEKIHGKSSQTVAVHHPQYGFSVQGEYQGRVLFKNYSLNDATITLHNIGFSDSGKYICKAVTFPLGNAQSSTTVTVLV
人PVRL4-N端IgV结构域(SEQ ID NO：25)
GELETSDVVTVVLGQDAKLPCFYRGDSGEQVGQVAWARVDAGEGAQELALLHSKYGLHVSPAYEGRVEQPPPPRNPLDGSVLLRNAVQADEGEYECRVSTFPAGSFQARLRLRVLVPPLP
人IgG1Fc区(SEQ ID NO：26)
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG1Fc区(SEQ ID NO：27)
KSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG1Fc区(SEQ ID NO：28)
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG2 Fc区(SEQ ID NO：29)
CVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG2 Fc区(13B链)(SEQ ID NO：30)
CVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSELTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG2 Fc区(13A链)(SEQ ID NO：31)
CVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREKMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
FLAG标签(SEQ ID NO：32)
DYKDDDDK
连接子(SEQ ID NO：33)
ESGGGGVT
连接子(SEQ ID NO：34)
LESGGGGVT
连接子(SEQ ID NO：35)
GRAQVT
连接子(SEQ ID NO：36)
WRAQVT
连接子(SEQ ID NO：37)
ARGRAQVT
人PVRL2变异体-N端IgV结构域(SEQ ID NO：38)
DVRVQVLPEVRGQLGGTVELPCHLLPPVPGLYISLVXWXRPDAPANXXXVAAFHPXXGXXFPSPKPGSERLSFVSAKQSTGQDTEAELQDATLALHGLTVEDEGNYTCEFATFPKGSVRGMTWLRVIA
X＝任何胺基酸
人IgG1重链恒定区(SEQ ID NO：39)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG2重链恒定区(SEQ ID NO：40)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG3重链恒定区(SEQ ID NO：41)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
人IgG4重链恒定区(SEQ ID NO：42)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
人IgG2Fc区(SEQ ID NO：43)
TKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG2Fc区变异体(SEQ ID NO：44)
TKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG2Fc区(变异体13A)(SEQ ID NO：45)
TKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREKMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG2Fc区变异体(变异体13A)(SEQ ID NO：46)
TKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREKMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG2Fc区(变异体13B)(SEQ ID NO：47)
TKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSELTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG2Fc区变异体(变异体13B)(SEQ ID NO：48)
TKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSELTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种包含脊髓灰质炎病毒受体(PVR)变异体的经分离的多肽，其中该PVR变异体相较于野生型PVR包含一或多种氨基酸置换，且其中该PVR变异体与人TIGIT的胞外域特异性结合且不与人CD226的胞外域结合或与之微弱结合。
2.如权利要求1所述的多肽，其亦与人CD96的胞外域结合。
3.如权利要求1或2所述的多肽，其中该一或多种氨基酸置换包含下列一或多种氨基酸的置换：
(a)对应野生型PVR(SEQ ID NO:1)的氨基酸40至143；
(b)对应野生型PVR(SEQ ID NO:1)的氨基酸60至90及/或氨基酸125至133；
(c)对应野生型PVR(SEQ ID NO:1)的氨基酸65、67、72、73、74、81、82、84及85；
(d)对应野生型PVR(SEQ ID NO:1)的氨基酸72；
(e)对应野生型PVR(SEQ ID NO:1)的氨基酸82；或
(f)对应野生型PVR(SEQ ID NO:1)的氨基酸72及氨基酸82。
4.如权利要求1或2所述的多肽，其中该PVR变异体包含选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20及SEQ ID NO:21。
5.如权利要求1至4中任一项所述的多肽，其是可溶性受体。
6.如权利要求1至5中任一项所述的多肽，其中该PVR变异体与非PVR多肽连接。
7.如权利要求6所述的多肽，其中该非PVR多肽包含人Fc区。
8.如权利要求1至7中任一项所述的多肽，其是单价或异二聚体蛋白。
9.如权利要求8所述的多肽，其中该异二聚体蛋白包含第二多肽，该第二多肽包含免疫反应刺激剂。
10.如权利要求1至9中任一项所述的多肽，其：
(a)增加细胞介导性免疫；
(b)增加T细胞活性；
(c)增加溶细胞性T细胞(CTL)活性；
(d)增加自然杀手(NK)细胞活性；
(e)是TIGIT介导性信号传导的拮抗剂；
(f)是CD96介导性信号传导的拮抗剂；
(g)抑制TIGIT信号传导；
(h)抑制CD96信号传导；
(i)增加CD226信号传导；
(j)抑制或阻断PVR与TIGIT之间的交互作用；
(k)抑制或阻断PVR与TIGIT之间的交互作用及PVR与CD96之间的交互作用；
(l)不抑制PVR与CD226之间的交互作用；
(m)抑制或阻断PVR与TIGIT之间的交互作用及PVR与CD96之间的交互作用，且不抑制PVR与CD226之间的交互作用；及/或
(n)抑制或阻断PVRL2与TIGIT之间的交互作用、PVRL3与TIGIT之间的交互作用、及/或PVRL4与TIGIT之间的交互作用。
11.一种医药组合物，其包含如权利要求1至10中任一项所述的多肽。
12.一种细胞，其包含或产生如权利要求1至10中任一项所述的多肽。
13.一种多核苷酸，其包含编码如权利要求1至10中任一项所述的多肽的多核苷酸。
14.一种载体，其包含如权利要求13所述的多核苷酸。
15.一种如权利要求1至10中任一项所述的多肽在制备用于活化或增强受试者的免疫反应的药物中的用途。
16.一种如权利要求1至10中任一项所述的多肽在制备用于治疗受试者的癌的药物中的用途。
17.如权利要求16所述的用途，其中该癌是选自结直肠癌、卵巢癌、胰癌、肺癌、肝癌、乳癌、肾癌、前列腺癌、胃肠道癌、黑色素瘤、子宫颈癌、膀胱癌、神经胶母细胞瘤或头颈癌。
18.包含PVR变异体的可溶性受体在制备用于增强受试者的免疫反应的药物中的用途，其中该可溶性受体：
(i)抑制TIGIT与PVR之间的交互作用；
(ii)抑制CD96与PVR之间的交互作用；
(iii)抑制TIGIT与PVR之间的交互作用且抑制CD96与PVR之间的交互作用；或
(iv)抑制TIGIT与PVR之间的交互作用、抑制CD96与PVR之间的交互作用且不抑制CD226与PVR之间的交互作用。
19.包含PVR变异体的可溶性受体在制备用于抑制受试者的肿瘤生长的药物中的用途，其中该可溶性受体：
(i)抑制TIGIT与PVR之间的交互作用；
(ii)抑制CD96与PVR之间的交互作用；
(iii)抑制TIGIT与PVR之间的交互作用且抑制CD96与PVR之间的交互作用；或
(iv)抑制TIGIT与PVR之间的交互作用、抑制CD96与PVR之间的交互作用且不抑制CD226与PVR之间的交互作用。
20.如权利要求15-19中任一项所述的用途，其中该药物与至少一种额外治疗剂联合应用。
21.如权利要求20所述的用途，其中该额外治疗剂是免疫反应刺激剂。
22.如权利要求20或21所述的用途，其中该额外治疗剂是化学治疗剂。
23.如权利要求20或21所述的用途，其中该额外治疗剂是抗体。
24.一种增加T细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞、B细胞及/或溶细胞性T细胞(CTL)的活性的方法，该方法包含使所述细胞与有效量的如权利要求1至10中任一项所述的多肽接触。
25.一种抑制肿瘤生长的方法，该方法包含使该肿瘤或肿瘤细胞与有效量的如权利要求1至10中任一项所述的多肽接触。

Claims (96)

1.一种包含脊髓灰质炎病毒受体(PVR)变异体的经分离的可溶性受体，其中该PVR变异体相较于野生型PVR包含一或多种氨基酸置换，且其中该PVR变异体特异性结合人TIGIT的胞外域且不与人CD226的胞外域结合或与之微弱结合。
2.如权利要求1所述的可溶性受体，其还结合人CD96的胞外域。
3.如权利要求1或2所述的可溶性受体，其中所述PVR变异体包含一或多种人PVR的免疫球蛋白(Ig)样结构域。
4.如权利要求1-3中任一项所述的可溶性受体，其中所述PVR变异体包含人PVR的N端IgV结构域，以及其中所述IgV结构域包含一或多种氨基酸置换。
5.如权利要求1-4中任一项所述的可溶性受体，其中所述PVR变异体实质上由人PVR的N端IgV结构域组成，以及其中所述IgV结构域包含一或多种氨基酸置换。
6.如权利要求1-5中任一项所述的可溶性受体，其中所述一或多种氨基酸置换包含对应野生型PVR的氨基酸40至143的一或多种氨基酸的置换。
7.如权利要求1-5中任一项所述的可溶性受体，其中所述一或多种氨基酸置换包含对应野生型PVR的氨基酸60至90及/或氨基酸125至133的一或多种氨基酸的置换。
8.如权利要求1-5中任一项所述的可溶性受体，其中所述一或多种氨基酸置换包含对应野生型PVR的氨基酸65、67、72、73、74、81、82、84及85的一或多种氨基酸的置换。
9.如权利要求1-8中任一项所述的可溶性受体，其中所述一或多种氨基酸置换包含对应野生型PVR的氨基酸72的氨基酸置换。
10.如权利要求1-8中任一项所述的可溶性受体，其中所述一或多种氨基酸置换包含对应野生型PVR的氨基酸82的氨基酸置 换。
11.如权利要求1-10中任一项所述的可溶性受体，其中所述一或多种氨基酸置换包含对应野生型PVR的氨基酸72及氨基酸82的氨基酸置换。
12.如权利要求1-5中任一项所述的可溶性受体，其中所述PVR变异体包含选自SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
13.一种包含人脊髓灰质炎病毒受体(PVR)的一或多种Ig样结构域的多肽，其中Ig样结构域相较于野生型PVR包含一或多种氨基酸置换，以及其中该多肽与人TIGIT的胞外域特异性结合且不与人CD226的胞外域结合或与之微弱结合。
14.一种包含PVR变异体的多肽，其中所述PVR变异体相较于野生型PVR包含一或多种氨基酸置换，以及其中所述PVR变异体与人TIGIT的胞外域特异性结合且不与人CD226的胞外域结合或与之微弱结合。
15.如权利要求13或14所述的多肽，其还结合人CD96的胞外域。
16.如权利要求14或15所述的多肽，其包含人PVR的一或多种Ig样结构域。
17.如权利要求13-15中任一项所述的多肽，其包含人PVR的N端IgV结构域，其中所述IgV结构域包含所述一或多种氨基酸置换。
18.如权利要求13-17中任一项所述的多肽，其中所述一或多种氨基酸置换包含对应野生型PVR的氨基酸40-143的一或多种氨基酸的置换。
19.如权利要求13-17中任一项所述的多肽，其中所述一或多种氨基酸置换包含对应野生型PVR的氨基酸60-90和/或氨基酸125-133的一或多种氨基酸的置换。
20.如权利要求13-17中任一项所述的多肽，其中所述一或多 种氨基酸置换包含对应野生型PVR的氨基酸65、67、72、73、74、81、82、84及85的一或多种氨基酸的置换。
21.如权利要求13-20中任一项所述的多肽，其中所述一或多种氨基酸置换包含对应野生型PVR的氨基酸72的氨基酸的置换。
22.如权利要求13-20中任一项所述的多肽，其中所述一或多种氨基酸置换包含对应野生型PVR的氨基酸82的氨基酸的置换。
23.如权利要求13-22中任一项所述的多肽，其中所述一或多种氨基酸置换包含对应野生型PVR的氨基酸72及82的氨基酸的置换。
24.如权利要求13-17中任一项所述的多肽，其包含选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:21。
25.一种TIGIT结合剂，其包含人脊髓灰质炎病毒受体(PVR)的一或多种Ig样结构域，其中PVR的IgV结构域包含对应野生型PVR的氨基酸65、67、72、73、74、81、82、84或85的一或多种氨基酸的置换。
26.如权利要求1-25中任一项所述的可溶性受体、多肽或结合剂，其中所述PVR变异体与非PVR多肽连接。
27.如权利要求1-26中任一项所述的可溶性受体、多肽或结合剂，其中所述PVR变异体与非PVR多肽直接连接。
28.如权利要求1-26中任一项所述的可溶性受体、多肽或结合剂，其中所述PVR变异体通过肽连接子与非PVR多肽连接。
29.如权利要求26-28中任一项所述的可溶性受体、多肽或结合剂，其中所述非PVR多肽包含人Fc区。
30.如权利要求29所述的可溶性受体、多肽或结合剂，其中所述人Fc区选自：SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47及SEQ ID NO:48。
31.如权利要求29所述的可溶性受体、多肽或结合剂，其中所述人Fc区选自：SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27及SEQ ID NO:28。
32.如权利要求29所述的可溶性受体、多肽或结合剂，其中所述人Fc区选自：SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30及SEQ ID NO:30。
33.如权利要求29所述的可溶性受体、多肽或结合剂，其中所述人Fc区选自：SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45及SEQ ID NO:47。
34.如权利要求29所述的可溶性受体、多肽或结合剂，其中所述人Fc区选自：SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46及SEQ ID NO:48。
35.如权利要求1-34中任一项所述的可溶性受体、多肽或结合剂，其为单价。
36.如权利要求1-35中任一项所述的可溶性受体、多肽或结合剂，其为异二聚体蛋白。
37.如权利要求36所述的可溶性受体、多肽或结合剂，其中所述异二聚体蛋白的第一多肽结合TIGIT，以及所述异二聚体蛋白的第二多肽结合第二标靶。
38.如权利要求36所述的可溶性受体、多肽或结合剂，其中所述异二聚体蛋白的第一多肽结合TIGIT，以及所述异二聚体蛋白的第二多肽是免疫反应刺激剂。
39.如权利要求1-38中任一项所述的可溶性受体、多肽或结合剂，其增加细胞介导性免疫。
40.如权利要求1-39中任一项所述的可溶性受体、多肽或结合剂，其增加T细胞活性。
41.如权利要求1-40中任一项所述的可溶性受体、多肽或结合剂，其增加溶细胞性T细胞(CTL)活性。
42.如权利要求1-39中任一项所述的可溶性受体、多肽或结合剂，其增加自然杀手(NK)细胞活性。
43.如权利要求1-42中任一项所述的可溶性受体、多肽或结合剂，其是TIGIT介导信号传导的拮抗剂。
44.如权利要求1-43中任一项所述的可溶性受体、多肽或结合剂，其是CD96介导信号传导的拮抗剂。
45.如权利要求1-44中任一项所述的可溶性受体、多肽或结合剂，其抑 制TIGIT信号传导。
46.如权利要求1-45中任一项所述的可溶性受体、多肽或结合剂，其抑制CD96信号传导。
47.如权利要求1-46中任一项所述的可溶性受体、多肽或结合剂，其增加CD226信号传导。
48.如权利要求1-47中任一项所述的可溶性受体、多肽或结合剂，其抑制或阻断PVR与TIGIT之间的交互作用。
49.如权利要求1-47中任一项所述的可溶性受体、多肽或结合剂，其抑制或阻断PVR与TIGIT之间的交互作用及PVR与CD96之间的交互作用。
50.如权利要求1-49中任一项所述的可溶性受体、多肽或结合剂，其不抑制PVR与CD226之间的交互作用。
51.如权利要求1-50中任一项所述的可溶性受体、多肽或结合剂，其抑制或阻断PVRL2与TIGIT之间的交互作用、PVRL3与TIGIT之间的交互作用、及/或PVRL4与TIGIT之间的交互作用。
52.一种细胞，其包含或产生如权利要求1-51中任一项所述的可溶性受体、多肽或结合剂。
53.一种医药组合物，其包含如权利要求1-51中任一项所述的可溶性受体、多肽或结合剂。
54.一种多核苷酸，其包含编码如权利要求1-51中任一项所述的可溶性受体、多肽或结合剂的多核苷酸。
55.一种载体，其包含如权利要求54所述的多核苷酸。
56.一种细胞，其包含如权利要求54所述的多核苷酸。
57.一种细胞，其包含如权利要求55所述的载体。
58.一种增强受试者的免疫反应的方法，其包含：对该受试者投予治疗有效量的如权利要求1-51中任一项所述的可溶性受体、多肽或结合剂。
59.一种活化受试者的免疫反应的方法，其包含：对该受试者投予治疗有效量的如权利要求1-51中任一项所述的可溶性受体、多肽或 结合剂。
60.如权利要求58或59所述的方法，其中所述免疫反应是抗原刺激引起。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述抗原刺激是肿瘤或肿瘤细胞。
62.一种抑制受试者的肿瘤生长的方法，该方法包含：对该受试者投予治疗有效量的如权利要求1-51中任一项所述的可溶性受体、多肽或结合剂。
63.如权利要求61或62所述的方法，其中所述肿瘤选自：结直肠肿瘤、卵巢肿瘤、胰肿瘤、肺肿瘤、肝肿瘤、乳房肿瘤、肾肿瘤、前列腺肿瘤、胃肠道肿瘤、黑色素瘤、子宫颈肿瘤、膀胱肿瘤、神经胶母细胞瘤和头颈肿瘤。
64.一种受试者的癌的方法，该方法包含：对该受试者投予治疗有效量的如权利要求1-51中任一项所述的可溶性受体、多肽或结合剂。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述癌选自：结直肠癌、卵巢癌、胰癌、肺癌、肝癌、乳癌、肾癌、前列腺癌、胃肠癌、黑色素瘤、子宫颈癌、膀胱癌、神经胶母细胞瘤和头颈癌。
66.一种增加CD226阳性细胞的活性的方法，该方法包含：使所述细胞与有效量的如权利要求1-51中任一项所述的可溶性受体、多肽或结合剂接触。
67.如权利要求66所述的方法，其中所述CD226阳性细胞是T细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞或B细胞。
68.一种增强受试者NK细胞活性的方法，该方法包含：对该受试者投予治疗有效量的如权利要求1-51中任一项所述的可溶性受体、多肽或结合剂。
69.一种增强受试者的T细胞活性的方法，该方法包含：对该受试者投予治疗有效量的如权利要求1-51中任一项所述的可溶性受体、多肽或结合剂。
70.一种增强受试者的T细胞及/或NK细胞活化的方法，该方法包含：对该受试者投予治疗有效量的如权利要求1-51中任一项所述的可溶性受体、多肽或结合剂。
71.一种增强受试者的T细胞反应的方法，该方法包含：对该受试者投予治疗有效量的如权利要求1-51中任一项所述的可溶性受体、多肽或结合剂。
72.一种增强受试者的溶细胞性T细胞(CTL)活性的方法，该方法包含：对该受试者投予治疗有效量的如权利要求1-51中任一项所述的可溶性受体、多肽或结合剂。
73.一种增强受试者的免疫反应的方法，该方法包含：对该受试者投予治疗有效量的包含PVR变异体的可溶性受体，其中该可溶性受体：
(i)抑制TIGIT与PVR之间的交互作用，且
(ii)抑制CD96与PVR之间的交互作用。
74.一种增强受试者的免疫反应的方法，该方法包含：对该受试者投予治疗有效量的包含PVR变异体的可溶性受体，其中该可溶性受体：
(i)抑制TIGIT与PVR之间的交互作用，
(ii)抑制CD96与PVR之间的交互作用，且
(iii)不抑制CD226与PVR之间的交互作用。
75.一种抑制受试者的肿瘤生长的方法，该方法包含：使细胞与有效量的包含PVR变异体的可溶性受体接触，其中所述可溶性受体：
(i)抑制TIGIT与PVR之间的交互作用，且
(ii)抑制CD96与PVR之间的交互作用。
76.一种抑制受试者的肿瘤生长的方法，该方法包含：使细胞与有效量的包含PVR变异体的可溶性受体接触，其中所述可溶性受体：
(i)抑制TIGIT与PVR之间的交互作用，
(ii)抑制CD96与PVR之间的交互作用，且
(iii)不抑制CD226与PVR之间的交互作用。
77.一种抑制受试者的肿瘤生长的方法，该方法包含：对该受试者投予治疗有效量的如权利要求1-51中任一项所述的可溶性受体、多肽或结合剂，其中所述多肽、结合剂或可溶性受体特异性结合人TIGIT的胞外域、抑制TIGIT信号传导以及不抑制CD226信号传导。
78.如权利要求77所述的方法，其中所述多肽、结合剂或可溶性受体还特异性结合人CD96的胞外域以及抑制CD96信号传导。
79.如权利要求58-78中任一项所述的方法，其中所述受试者被投予免疫反应刺激剂。
80.如权利要求79所述的方法，其中所述免疫反应刺激剂选自：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、白介素3(IL-3)、白介素12(IL-12)、白介素1(IL-1)、白介素2(IL-2)、白介素15(IL-15)、CD80、CD86、抗CD3抗体、抗-CTLA-4抗体和抗CD28抗体。
81.一种异二聚体蛋白，其包含：
包含PVR变异体的多肽；以及
包含免疫反应刺激剂的多肽。
82.如权利要求81所述的异二聚体蛋白，其中所述PVR变异体相较于野生型PVR包含一或多种氨基酸置换。
83.如权利要求81或82所述的异二聚体蛋白，其中各多肽包含人IgG2CH3结构域，且其中一个IgG2CH3结构域中在对应SEQ ID NO:40的位置249及288的位置的氨基酸是经谷氨酸盐或天冬氨酸盐置换，且其中另一个IgG2CH3结构域中在对应SEQ ID NO:40的位置236及278的位置的氨基酸是经赖氨酸置换。
84.如权利要求81-83中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述免疫反应刺激剂选自：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞 集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、白介素3(IL-3)、白介素12(IL-12)、白介素1(IL-1)、白介素2(IL-2)、白介素15(IL-15)、CD80、CD86、抗CD3抗体、抗CTLA-4抗体和抗CD28抗体。
85.一种选择人受试者以使用如权利要求1-51中任一项所述的多肽、结合剂或可溶性受体治疗的方法，该方法包括：测定该受试者是否具有上升的PVR表达量的肿瘤，其中若该肿瘤具有上升的PVR表达量，则选择该受试者为适合治疗。
86.一种抑制人受试者的肿瘤生长的方法，该方法包括：
(a)测定该肿瘤是否具有表达量上升的PVR，及
(b)对该受试者投予治疗有效量的如权利要求1-51中任一项所述的可溶性受体、多肽或结合剂。
87.一种多肽，其包含PVR变异体，其中该变异体特异性结合人TIGIT的胞外域以及抑制TIGIT信号传导。
88.一种多肽，其包含PVRL2变异体，其中该变异体特异性结合人TIGIT的胞外域以及抑制TIGIT信号传导。
89.一种多肽，其包含PVRL3变异体，其中该变异体特异性结合人TIGIT的胞外域以及抑制TIGIT信号传导。
90.一种多肽，其包含PVRL4变异体，其中该变异体特异性结合人TIGIT的胞外域以及抑制TIGIT信号传导。
91.一种细胞，其包含或产生如权利要求87-90中任一项所述的多肽。
92.一种医药组合物，其包含如权利要求87-90中任一项所述的多肽。
93.一种多核苷酸，其包含编码如权利要求87-90中任一项所述的多肽的多核苷酸。
94.一种载体，其包含如权利要求93所述的多核苷酸。
95.一种细胞，其包含如权利要求93所述的多核苷酸。
96.一种细胞，其包含如权利要求94所述的载体。
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