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CN104870473A - Bmp-6抗体 - Google Patents

Bmp-6抗体 Download PDF

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CN104870473A
CN104870473A CN201380066174.1A CN201380066174A CN104870473A CN 104870473 A CN104870473 A CN 104870473A CN 201380066174 A CN201380066174 A CN 201380066174A CN 104870473 A CN104870473 A CN 104870473A
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Abstract

本发明涉及结合至人BMP-6的抗体或其抗原结合片段、包含此类抗体或其抗原结合片段的组合物，和使用它们治疗慢性疾病的贫血的方法。

Description

BMP-6抗体
本发明涉及医药领域。更具体而言，本发明涉及结合人BMP-6且可用于治疗慢性疾病的贫血(ACD)诸如癌症的贫血或慢性肾病的贫血(CKD)的抗体或其抗原结合片段。
BMP-6是骨形态发生蛋白(BMP)家族的成员；在BMP家族中存在多于20个成员。BMP家族成员是起始SMAD途径中的信号传导从而导致细胞中的转录调节的配体。BMP-6敲除小鼠被报导为活的且可育的，并且显示正常骨和软骨发育，而密切相关的BMP-7的敲除小鼠在出生后即死亡且伴随肾、眼和骨缺陷。已显示，BMP-6或BMP-7的单独敲除不改变心脏生成，但BMP-6和BMP-7的双敲除确实显示心脏的几种缺陷和延迟，且胚胎由于心功能不全而死亡。也已显示，小鼠模型中BMP-7的存在在防止与纤维化相关的慢性心脏病的进展中是重要的。因此，当用BMP-6抗体抑制人BMP-6时，针对BMP-7的交叉反应性可能并不期望。
当过度活化的炎性细胞因子引起铁稳态失调、红细胞生成减少和红细胞寿命减少时，某些慢性疾病诸如癌症、肾病和自体免疫病症可导致ACD。已将铁调素(Hepcidin)鉴定为参与铁稳态的关键激素；高水平的铁调素与见于ACD中的铁限制性红细胞生成相关。已显示BMP-6增加铁调素表达。
WO 2010/056981公开在小鼠中施用针对人BMP-6产生的小鼠抗体；已报道，在使用可购自R&D Systems的该小鼠抗体MAB507的三天方案后的一个时间点，铁调素的减少和铁的增加。还公开针对BMP的选择性，且显示施用某些剂量的BMP-6抗体MAB507抑制BMP-7。然而，迄今为止，没有靶向BMP-6的抗体经批准用于治疗应用。
仍需要提供替代性BMP-6抗体。具体而言，仍需要提供对BMP-6的选择性高于对其它BMP家族成员(包括BMP-7)的有效BMP-6抗体。也仍需要提供以下有效BMP-6抗体：其对BMP-6的选择性高于对其它BMP家族成员(包括BMP-7)且产生延长的药效动力学反应。也仍需要提供以下有效BMP-6抗体：其对BMP-6的选择性高于对其它BMP家族成员(包括BMP-7)，其用于治疗ACD。
因此，本发明提供结合至人BMP-6 (SEQ ID NO: 1)的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中LCVR包含互补决定区(CDR) LCDR1、LCDR2和LCDR3，且HCVR包含CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中LCDR1是多肽RSSENIYRNLA (SEQ ID NO: 2)，LCDR2是多肽AATNLAD (SEQ ID NO: 3)，LCDR3是多肽QGIWGTPLT (SEQ ID NO: 4)，HCDR1是多肽GYTFTSYAMH (SEQ ID NO: 5)，HCDR2是多肽YINPYNDGTKYNENFKG (SEQ ID NO: 6)或YINPYNRGTKYNENFKG (SEQ ID NO: 7)，且HCDR3是多肽RPFGNAMDI (SEQ ID NO: 8)。
在一个实施方案中，本发明提供结合至人BMP-6 (SEQ ID NO: 1)的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中LCVR包含互补决定区(CDR) LCDR1、LCDR2和LCDR3，且HCVR包含CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中LCDR1是多肽RSSENIYRNLA (SEQ ID NO: 2)，LCDR2是多肽AATNLAD (SEQ ID NO: 3)，LCDR3是多肽QGIWGTPLT (SEQ ID NO: 4)，HCDR1是多肽GYTFTSYAMH (SEQ ID NO: 5)，HCDR2是多肽YINPYNDGTKYNENFKG (SEQ ID NO: 6)，且HCDR3是多肽RPFGNAMDI (SEQ ID NO: 8)。
在一个实施方案中，本发明提供结合至人BMP-6 (SEQ ID NO: 1)的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中LCVR包含互补决定区(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，且HCVR包含CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中LCDR1是多肽RSSENIYRNLA (SEQ ID NO: 2)，LCDR2是多肽AATNLAD (SEQ ID NO: 3)，LCDR3是多肽QGIWGTPLT (SEQ ID NO: 4)，HCDR1是多肽GYTFTSYAMH (SEQ ID NO: 5)，HCDR2是多肽YINPYNRGTKYNENFKG (SEQ ID NO: 7)，且HCDR3是多肽RPFGNAMDI (SEQ ID NO: 8)。
在一个实施方案中，本发明提供结合至人BMP-6 (SEQ ID NO: 1)的抗体或其抗原结合片段，其包含LCVR和HCVR，其中LCVR是多肽SEQ ID NO: 9，且HCVR是多肽SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11。在又一个实施方案中，本发明提供结合至人BMP-6 (SEQ ID NO: 1)的抗体或其抗原结合片段，其包含LCVR和HCVR，其中LCVR是多肽SEQ ID NO: 9，且HCVR是多肽SEQ ID NO: 10。在另一个实施方案中，本发明提供结合至人BMP-6 (SEQ ID NO: 1)的抗体或其抗原结合片段，其包含LCVR和HCVR，其中LCVR是多肽SEQ ID NO: 9，且HCVR是多肽SEQ ID NO: 11。
在一个实施方案中，本发明提供结合至人BMP-6 (SEQ ID NO: 1)的抗体，其包含LCVR和HCVR，其中LCVR是多肽SEQ ID NO: 9，且HCVR是多肽SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11。在又一个实施方案中，本发明提供结合至人BMP-6 (SEQ ID NO: 1)的抗体，其包含LCVR和HCVR，其中LCVR是多肽SEQ ID NO: 9，且HCVR是多肽SEQ ID NO: 10。在另一个实施方案中，本发明提供结合至人BMP-6 (SEQ ID NO: 1)的抗体，其包含LCVR和HCVR，其中LCVR是多肽SEQ ID NO: 9，且HCVR是多肽SEQ ID NO: 11。
在一个实施方案中，本发明提供结合至人BMP-6 (SEQ ID NO: 1)的抗体，其包含轻链(LC)和重链(HC)，其中LC是多肽SEQ ID NO: 12，且HC是多肽SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14。在又一个实施方案中，本发明提供结合至人BMP-6 (SEQ ID NO: 1)的抗体，其包含LC和HC，其中LC是多肽SEQ ID NO: 12，且HC是多肽SEQ ID NO: 13。在另一个实施方案中，本发明提供结合至人BMP-6 (SEQ ID NO: 1)的抗体，其包含LC和HC，其中LC是多肽SEQ ID NO: 12，且HC是多肽SEQ ID NO: 14。
在一个实施方案中，本发明提供结合至人BMP-6 (SEQ ID NO: 1)的抗体，其包含两条轻链和两条重链，其中每条轻链是多肽SEQ ID NO: 12，且每条重链是多肽SEQ ID NO: 13。在一个实施方案中，本发明提供结合至人BMP-6 (SEQ ID NO: 1)的抗体，其包含两条轻链和两条重链，其中每条轻链是多肽SEQ ID NO: 12，且每条重链是多肽SEQ ID NO: 14。
本发明还涉及编码上述本发明抗体或其抗原结合片段的多核苷酸，所述多核苷酸可呈RNA形式或呈DNA形式，该DNA包括cDNA和合成DNA。DNA可以是双链或单链。编码本发明的抗体或其抗原结合片段的编码序列可由于遗传密码的冗余度或简并性而变化。
在一个实施方案中，本发明提供包含编码重链多肽的多核苷酸序列的DNA分子，该重链多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO: 13或氨基酸序列SEQ ID NO: 14。在一个实施方案中，本发明提供包含编码轻链多肽的多核苷酸序列的DNA分子，所述轻链多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO: 12。
在一个实施方案中，本发明提供了DNA分子，其包含编码重链多肽的多核苷酸序列，该重链多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO: 13；且包含编码轻链多肽的多核苷酸序列，该轻链多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO: 12。在一个实施方案中，本发明提供了DNA分子，其包含编码重链多肽的多核苷酸序列，该重链多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO: 14；且包含编码轻链多肽的多核苷酸序列，该轻链多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO: 12。
在所述序列可操作地连接至表达控制序列之后，本发明的多核苷酸将在宿主细胞中表达。表达载体通常可作为游离基因体(episome)或作为宿主染色体DNA的组成部分而在宿主生物体中复制。通常，表达载体将含有选择标记(例如四环素(tetracycline)、新霉素(neomycin)和二氢叶酸还原酶)，以容许检测用期望DNA序列转化的那些细胞。
本发明的抗体或其抗原结合片段可容易地在以下细胞中产生：哺乳动物细胞，诸如CHO、NS0、HEK293或COS细胞；细菌细胞，诸如大肠杆菌(E. coli)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)或荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescence)；或真菌或酵母细胞。所述宿主细胞使用本领域众所周知的技术来培养。
可通过众所周知的方法将含有目标多核苷酸序列(例如抗体或其抗原结合片段的多肽和表达控制序列)的载体转移至宿主细胞中，所述方法根据细胞宿主的类型而变化。例如，氯化钙转化通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其它细胞宿主。
在一个实施方案中，本发明提供包含一个或多个本发明DNA分子的哺乳动物细胞，该细胞能够表达包含具有氨基酸序列SEQ ID NO: 13的重链和具有氨基酸序列SEQ ID NO: 12的轻链的抗体。在一个实施方案中，本发明提供包含本发明DNA分子的哺乳动物细胞，该细胞能够表达包含具有氨基酸序列SEQ ID NO: 14的重链和具有氨基酸序列SEQ ID NO: 12的轻链的抗体。
在一个实施方案中，本发明提供产生包含重链和轻链的本发明抗体的方法，所述重链的氨基酸序列是SEQ ID NO: 13，所述轻链的氨基酸序列是SEQ ID NO: 12，该方法包括在使抗体表达的条件下培养本发明的哺乳动物细胞，和回收所表达的抗体。在一个实施方案中，本发明提供产生包含重链和轻链的本发明抗体的方法，所述重链的氨基酸序列是SEQ ID NO: 14，所述轻链的氨基酸序列是SEQ ID NO: 12，该方法包括在使抗体表达的条件下培养本发明的哺乳动物细胞，和回收所表达的抗体。在又一个实施方案中，本发明提供通过本发明方法产生的抗体。
在一个实施方案中，本发明提供包含本发明抗体或其抗原结合片段和可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。更具体地，本发明的组合物进一步包含一种或多种其它治疗剂。
在一个实施方案中，本发明提供治疗贫血的方法，该方法包括向有此需要的患者施用有效量的本发明抗体或其抗原结合片段。在又一个实施方案中，本发明提供治疗贫血的方法，该方法包括施用有效量的本发明抗体或其抗原结合片段，其中贫血为慢性疾病的贫血。在另一个实施方案中，本发明提供治疗贫血的方法，该方法包括施用有效量的本发明抗体或其抗原结合片段，其中慢性疾病的贫血选自癌症的贫血和慢性肾病的贫血。
在一个实施方案中，本发明提供治疗铁调素相关的铁限制性贫血的方法，该方法包括向有此需要的患者施用有效量的本发明抗体或其抗原结合片段。在又一个实施方案中，本发明提供治疗铁调素相关的铁限制性贫血的方法，该方法包括施用有效量的本发明抗体或其抗原结合片段，其中铁调素相关的铁限制性贫血选自癌症的贫血和慢性肾病的贫血。
在一个实施方案中，本发明提供治疗铁难治性缺铁性贫血(IRIDA)的方法，该方法包括向有此需要的患者施用有效量的本发明抗体或其抗原结合片段。在又一个实施方案中，本发明提供治疗IRIDA的方法，该方法包括向有此需要的患者施用有效量的本发明抗体或其抗原结合片段，其中IRIDA由TMPRSS6基因缺陷引起。
在一个实施方案中，本发明提供治疗斯耶格伦氏综合症(Sjogren's syndrome)的方法，该方法包括向有此需要的患者施用有效量的本发明抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方案中，本发明提供增加血清铁水平、网状红细胞计数、红细胞计数、血红蛋白和/或血细胞比容的方法，该方法包括向有此需要的患者施用有效量的本发明抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，本发明提供增加血清铁水平的方法，该方法包括向有此需要的患者施用有效量的本发明抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，本发明提供增加网状红细胞计数的方法，该方法包括向有此需要的患者施用有效量的本发明抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，本发明提供增加红细胞计数的方法，该方法包括向有此需要的患者施用有效量的本发明抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，本发明提供增加血红蛋白的方法，该方法包括向有此需要的患者施用有效量的本发明抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，本发明提供增加血细胞比容的方法，该方法包括向有此需要的患者施用有效量的本发明抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方案中，本发明提供本发明抗体或其抗原结合片段，其用于治疗中。在又一个实施方案中，本发明提供本发明抗体或其抗原结合片段，其用于治疗贫血。在另一个实施方案中，本发明提供本发明抗体或其抗原结合片段，其用于治疗慢性疾病的贫血。在另一个实施方案中，本发明提供本发明抗体或其抗原结合片段，其用于治疗癌症的贫血或慢性肾病的贫血。
在一个实施方案中，本发明提供本发明抗体或其抗原结合片段，其用于治疗铁调素相关的铁限制性贫血。在另一个实施方案中，本发明提供本发明抗体或其抗原结合片段，其用于治疗铁调素相关的铁限制性癌症的贫血。在另一个实施方案中，本发明提供本发明抗体或其抗原结合片段，其用于治疗铁调素相关的铁限制性慢性肾病的贫血。
在一个实施方案中，本发明提供本发明抗体或其抗原结合片段，其用于治疗IRIDA。在又一个实施方案中，本发明提供本发明抗体或其抗原结合片段，其用于治疗IRIDA，其中IRIDA由TMPRSS6基因缺陷引起。
在一个实施方案中，本发明提供本发明抗体或其抗原结合片段，其用于治疗斯耶格伦氏综合症。
在一个实施方案中，本发明提供本发明抗体或其抗原结合片段用于制备药物的用途。在又一个实施方案中，本发明提供本发明抗体或其抗原结合片段用于制备用来治疗贫血的药物的用途。在另一个实施方案中，本发明提供本发明抗体或其抗原结合片段用于制备用来治疗慢性疾病的贫血的药物的用途。在另一个实施方案中，本发明提供本发明抗体或其抗原结合片段用于制备用来治疗慢性肾病的贫血的药物的用途。在另一个实施方案中，本发明提供本发明抗体或其抗原结合片段用于制备用来治疗癌症的贫血的药物的用途。
在一个实施方案中，本发明提供本发明抗体或其抗原结合片段用于制备用来治疗IRIDA的药物的用途。在又一个实施方案中，本发明提供本发明抗体或其抗原结合片段用于制备用来治疗IRIDA的药物的用途，其中IRIDA由TMPRSS6基因缺陷引起。
在一个实施方案中，本发明提供本发明抗体或其抗原结合片段用于制备用来治疗斯耶格伦氏综合症的药物的用途。
“抗体”的一般结构是本领域众所周知的。对于IgG型抗体，存在四条经由链内和链间二硫键交联的氨基酸链(两条“重”链和两条“轻”链)。对于抗体，重链之一与轻链之一形成链间二硫键，且另一重链与另一轻链形成链间二硫键，且重链之一与另一重链形成两个链间二硫键。抗原结合片段是抗体的片段，诸如Fab、Fab'、F(ab')2、单链可变片段(scFv)或二-scFv。
当在某些生物系统中表达时，具有人Fc序列的抗体在Fc区被糖基化。抗体也可在其它位置处被糖基化。本领域技术人员将理解，本发明的抗体可含有此类糖基化。通常，糖基化发生在抗体Fc区中高度保守的N-糖基化位点处。N-聚糖通常附接至天冬酰胺。预测依序编号的天冬酰胺295是本发明抗体的糖基化位点。
本发明的抗体是经设计具有与源自人基因组序列的框架和恒定区相同或实质上相同的人来源的框架、铰链区和恒定区的工程改造的抗体。完全人框架、铰链区和恒定区是人种系序列以及具有天然存在的体细胞突变的序列和/或具有工程改造的突变的那些。本发明的抗体可包含源自其中含有一个或多个氨基酸取代、缺失或添加的完全人框架、铰链或恒定区的框架、铰链或恒定区。此外，本发明抗体在人中实质上是非免疫原性的。
抗体I包含两条轻链和两条重链，其中每条轻链由多肽SEQ ID NO: 12组成且每条重链由多肽SEQ ID NO: 13组成。抗体II包含两条轻链和两条重链，其中每条轻链由多肽SEQ ID NO: 12组成且每条重链由多肽SEQ ID NO: 14组成。编码抗体I的每条重链的具体DNA分子为SEQ ID NO: 16，且编码抗体I的每条轻链的具体DNA分子为SEQ ID NO: 15。编码抗体II的每条重链的具体DNA分子为SEQ ID NO: 17，且编码抗体II的每条轻链的具体DNA分子为SEQ ID NO: 15。
本发明抗体或其抗原结合片段可使用本领域众所周知的技术来产生，所述技术例如重组技术、噬菌体展示技术、合成技术或此类技术的组合或本领域易知的其它技术。用于产生并纯化抗体的方法为本领域众所周知且可参见例如Harlow和Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, chapters 5-8 and 15, ISBN 0-87969-314-2。
CKD的贫血是一种为患有CKD的患者中的早期且常见并发症的贫血。癌症的贫血是由血液恶性肿瘤和一些实体肿瘤引起的贫血；而化学治疗诱导的贫血是用化学治疗剂治疗癌症患者引起的贫血。CKD中的贫血加重糖尿病性神经病变、心血管疾病和视网膜病变，以及其它病况。癌症相关性贫血与死亡的相对风险增加相关。癌症相关性贫血的当前治疗选择限于输血，因为红细胞生成刺激剂仅适用于化学治疗引起的贫血。
除非另有说明，否则如本文关于BMP-6抗体或其抗原结合片段对人BMP-6的亲和力所使用的"结合"欲指如通过本领域已知的常用方法所测量的KD小于约1 x 10-8 M，优选小于约1 x 10-9 M，所述方法包括基本上如本文所述在37℃下使用表面等离子共振(SPR)生物传感器来测量。本文关于本发明抗体使用的术语“选择性”是指抗体结合人BMP-6的KD比所述抗体结合至少一个BMP家族成员(包括，但不限于人BMP-5或人BMP-7)的KD低约1000-、500-、200-、100-、50-、10-或约5-倍，如在37℃下通过表面等离子共振所测量。此外或可替代地，在通过本文下文实施例2-3中所述的方法测定时，本发明的BMP-6选择性抗体或其抗原结合片段结合人BMP-6，但不结合或仅最小水平结合至人BMP家族的至少一个成员，包括但不限于人BMP-5或人BMP-7。
“有效量”意指将对组织、系统、动物、哺乳动物或人引发研究者、医师或其它临床医师所寻求的生物或医学反应或期望治疗效应的本发明抗体或包含本发明抗体的药物组合物的量。抗体的有效量可根据诸如以下的因素而变化：个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及抗体在该个体中引发期望反应的能力。有效量也是治疗有益效应胜过抗体的任何毒性或有害效应的量。
术语“治疗(treatment、treat、treating)”等意欲包括减慢或逆转病症的进展。这些术语还包括缓解、改善、减弱、消除或减轻病症或病况的一种或多种症状，即使实际上并不消除所述病症或病况且即使所述病症或病况本身的进展并没有减慢或逆转。患者是指患有将受益于抑制BMP-6活性的疾病、病症或病况的哺乳动物，优选人。
本发明抗体或其抗原结合片段或包含其的药物组合物可通过肠胃外途径(例如，皮下、静脉内、腹膜内、肌内或经皮)来施用。本发明抗体或其抗原结合片段可单独或与药学上可接受的载体和/或稀释剂组合以单一或多剂量施用于患者。本发明的药物组合物可通过本领域众所周知的方法来制备(例如，Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th ed. (1995), A. Gennaro等人, Mack Publishing Co.)，且包含如本文所公开的抗体和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
实施例1：抗体表达和纯化
重链和轻链可变区的多肽、抗体I和抗体II的完全重链和轻链氨基酸序列以及编码其的核苷酸序列列于下文标题为"氨基酸和核苷酸序列"的部分中。此外，轻链和重链CDR多肽显示于表1中。
本发明抗体或其抗原结合片段(包括，但不限于，抗体I和抗体II)可基本上如下制备和纯化。可使用最佳预定HC：LC载体比率或编码HC和LC二者的单一载体系统，由用于分泌抗体的表达系统瞬时或稳定转染适宜宿主细胞，诸如HEK 293 EBNA或CHO。可使用许多常用技术中的任一者来纯化抗体已经被分泌到其中的澄清培养基。例如，可将培养基方便地施加至已经用相容缓冲液诸如磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)平衡的针对Fab片段的MabSelect柱(GE Healthcare)或KappaSelect柱(GE Healthcare)。可以洗涤所述柱以去除非特异性结合组分。可例如通过pH梯度(诸如20mM Tris缓冲液(pH 7)至10mM柠檬酸钠缓冲液(pH 3.0)或磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)至100mM甘氨酸缓冲液(pH 3.0))来洗脱所结合抗体。可诸如通过SDS-PAGE检测抗体级分，且然后可合并。根据预期用途，进一步纯化是任选的。可使用常用技术将抗体浓缩和/或无菌过滤。可通过常用技术有效地去除可溶性聚集物和多聚物，所述技术包括体积排阻、疏水性相互作用、离子交换、多模式(multimodal)或羟磷灰石层析。在这些层析步骤后抗体的纯度大于95%。可将产物立即冷冻于-70℃下或可冻干。
实施例2：抗BMP6抗体的结合动力学、亲和力和特异性
本发明抗体或其抗原结合片段对人BMP-6以及人BMP-5和人BMP-7的结合动力学、亲和力和选择性可根据本领域已知的方法，通过使用表面等离子共振(SPR)生物传感器(诸如BIAcore? 2000、BIAcore? 3000或BIAcore? T100 (GE HealthCare))来测定。
人BMP-5、人BMP-6、人BMP-7和MAB507可购自R&D Systems (Minneapolis, MN)。MAB507是声称对BMP-6具有特异性的商业抗体。食蟹猴BMP-6和大鼠BMP-6可使用标准程序来制备。可使用EDC/NHS胺偶联方法(BIAcore编号BR-1000-50)进行配体在CM4芯片(BIAcore编号BR-1005-34)上的固定。简而言之，可通过以10μL/分钟经7分钟注射EDC/NHS的1：1混合物来活化所有四种流动室的表面。可将人BMP-5、BMP-6和BMP-7在10mM乙酸盐缓冲液(pH 4.5)中稀释至1-2μg/mL，且在10μL/分钟的流速下，将约200个共振单位(RU)固定至流动室(Fc)2、3或4上。Fc1可保持为空白。可以10μL/分钟经7分钟注射乙醇胺来封闭未反应位点。可使用以30μL/分钟以3×30秒注射甘氨酸(pH 1.5)来去除任何非共价结合蛋白。所有测量都可在25℃和37℃下实施。运行缓冲液可以是HBS-EP+ (BIAcore编号BR-1006-69)。可使用BIAcore T100评估软件2.0.3版用于分析。
为了测定抗体I和MAB 507在不同BMP家族成员之间的特异性，可在运行缓冲液HBS-EP+中制备以下最终浓度的抗体：1000、100、10、1、0.1、0.01、0.001和0 (空白) nM。每一循环可由下述组成：以50μL/分钟经300秒对所有流动室注射稀释抗体，然后以50μL/分钟经1200秒解离。可通过以50μL/分钟经60秒注射10mM甘氨酸(pH 1.5)并以30μL/分钟经30秒注射HBS-EP缓冲液来再生芯片表面。可收集减去参考的数据，且可在BIA评估分析软件中使用1：1结合模型来评估每一配体的结合速率(k on )和解离速率(k off )。可根据关系KD = k off /k on 从结合动力学计算亲和力(KD )。
在基本上如本实施例2中所述实施的实验中，抗体I以0.020nM亲和力结合至人BMP-6。在37℃下没有可检测的与人BMP-5和人BMP-7的结合，抗体I显示高于对与BMP-6具有最近序列同源性的两个BMP家族成员的选择性。
R&D抗体MAB507以1nM亲和力结合人BMP-6，且与抗体I不同，MAB507对人BMP-7具有23nM亲和力(表2)。在37℃下MAB507不具有可检测的与人BMP-5的结合(表2)。
抗体I和抗体II的Fab在37℃下以范围为0.08-0.09nM的相似亲和力结合至人BMP-6 (表3)。MAB507的Fab (Fab507)在37℃下以12.2nM的亲和力结合至人BMP-6 (表3)。
抗体I和抗体II Fab表现的对人BMP-6的亲和力是MAB507的Fab对人BMP-6亲和力的135-150倍。抗体I表现的对人BMP-6的亲和力是MAB507对人BMP-6亲和力的50倍。
抗体I的Fab在37℃下以范围为79.6pM至88.0pM的相似亲和力结合至人、食蟹猴和大鼠BMP-6 (表4)。抗体I对食蟹猴BMP-6和大鼠BMP-6的高亲和力允许抗体I直接用于食蟹猴和大鼠动物模型中而无需采用替代抗体。
表2：通过使用SPR测量的抗体I和MAB507的选择性
表3：通过SPR测量的BMP6抗体与人BMP-6的结合动力学和亲和力
表4：通过SPR测量的抗体I与人、食蟹猴和大鼠BMP-6的结合动力学和亲和力
实施例3：抗BMP6抗体抑制BMP-6诱导的铁调素表达
可在BMP-6诱导铁调素表达的基于细胞的测定中，测量本发明抗体或其抗原结合片段对人BMP-6的基于体外细胞的抑制。也可使用基于细胞的体外测定来评估BMP-6抗体针对其它BMP (诸如BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-7、BMP-9和BMP-10)对铁调素诱导的选择性。在上述基于细胞的体外测定中，BMP配体与铁调素启动子上BMP反应元件的结合诱导HepProm_Luc细胞中荧光素酶报告子活性。该测定极端敏感，且因此并不适于显示何种BMP家族成员参与铁稳态。但该测定有效地显示抑制剂在细胞环境中对不同BMP家族成员的选择性。
HepProm_Luc细胞系可通过使用含有克隆的铁调素启动子DNA序列的荧光素酶报告子载体(HepProm 0.3 + 1.0kb)稳定转染Hep3B2.1-7细胞(ATCC, Manassas, VA, 编号HB-8064)来产生。可将HepProm_Luc细胞在添加了5%热灭活FBS (Invitrogen, Grand Island, NY, 编号10082-147)与1X MEM NEAA (Invitrogen, Carlsbad, CA)和200μg/ml G418硫酸盐(Invitrogen, Grand Island, NY, 编号30-234-CI)的DMEM/高葡萄糖的完全培养基(Hyclone, Logan, UT, 编号SH30243.01)中培养。
为了测定，可将HepProm_Luc细胞在不含抗生素的完全培养基中重悬至150,000个细胞/mL。可将0.1mL重悬的HepProm_Luc细胞以15,000个细胞/孔添加至96孔微量滴定板(Corning, Lowell, MA, 编号3917)中，且然后可在37℃下在5% (v/v) CO2下将细胞孵育24小时。然后可去除培养基且在37℃下在5% (v/v) CO2下将细胞在含有0.1% (w/v) BSA (Invitrogen, Grand Island, NY, 编号15260)的80 μL OptiMEM I (Invitrogen, Grand Island,NY, 编号31985)中饥饿5小时。
可将10μL的含有0.1% (w/v) BSA的OptiMEM I中的BMP6抗体(10×最终浓度)添加至细胞中，使最终剂量范围为0.2nM至20nM，用于BMP-6诱导；使最终剂量范围为7.8nM至1000nM，用于BMP-5和BMP-7诱导；和高至1000nM的单点剂量，用于BMP-2、BMP-4、BMP-9和BMP-10诱导。然后可添加10μL BMP配体(10×最终浓度)，使每一孔中的最终浓度为BMP-2 (3.8nM)、BMP-4 (3.8nM)、BMP-5 (12.8nM)、BMP-6 (3.4 nM)、BMP-7 (3.2 nM)、BMP-9 (0.8 nM)或BMP-10 (4.1nM)；可在37℃下在5% (v/v) CO2下将细胞孵育22-24小时。可从细胞去除培养基，且可将50μL Glo裂解缓冲液(Promega, Madison, WI, 编号E2661)添加至细胞中并在振荡2分钟后在室温下孵育5分钟。然后可将50μL Bright GloTM 荧光素酶试剂(Promega, Madison,WI, 编号E2620)添加至细胞中且在振荡30秒后在室温下孵育5分钟。可在Wallac Victor仪器上以1秒/孔测量发光。
为了计算BMP-6抗体的抑制百分比，可将0%抑制设定为不添加BMP-6抗体的情况下的BMP配体处理的平均发光，且可将100%抑制设定为不添加BMP-6抗体的情况下的无BMP配体处理的平均发光。可使用GraphPad Prism软件(San Diego, CA)实施三或四参数曲线拟合分析。
在基本上如本实施例3中所述实施的实验中，抗体I和抗体II有效地抑制HepProm_Luc细胞的BMP-6诱导的铁调素启动子荧光素酶活性(表5)；该抑制的有效性比MAB507高约22倍。
表6中的数据显示，当在1000nM单点浓度下测试时，与人IgGPAA4对照相比，抗体I和抗体II不显著抑制BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-7、BMP-9和BMP-10对铁调素启动子荧光素酶活性的诱导。抗体I和抗体II在该测定中显示遍及所测试的BMP组的选择性。然而，MAB507不显示针对BMP-6的选择性，且与在1000 nM (N=6)下具有-1.7%抑制的平均值的人IgGPAA4对照相比，其在1000 nM (N=2)下针对BMP-7具有54.2%抑制的平均值。
表5：在BMP-6诱导的Hep_Luc测定中BMP-6抗体的IC50
表6：在BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-7、BMP-9、BMP-10诱导的Hep_Luc测定中在1000 nM测试的BMP-6抗体的选择性
实施例4：在向雄性食蟹猴单一静脉内给药后BMP-6抗体的药代动力学/药效动力学研究
本发明抗体或其抗原结合片段的血清药代动力学/药效动力学(PK/PD)可在向正常雄性食蟹猴单一静脉内给药后进行测试。可以1mL/kg的剂量体积向雄性食蟹猴注射抗体的单一静脉内(IV)推注剂量(bolus dose)。可从在不同时间点采集的血清样品，测量血清铁浓度、BMP-6抗体水平和铁调素水平。
对于药代动力学、血清铁调素和BMP-6定量，可在多个时间点从每一动物收集约1.5mL血液至不含抗凝剂的管中。可允许样品在环境条件下凝块，然后离心以获得血清；可将样品维持在湿冰上，然后在约-70℃储存。对于临床病理分析，可在多个时间点经由股静脉从每一动物收集约0.5mL血液至不含抗凝剂的管中。可使用标准方法将该血液用于测量血清铁、不饱和铁结合能力、总铁结合能力、铁饱和百分比和标准血液学测量。铁调素浓度可如Murphy等人, Blood, 110(3):1048 (2007)中所述来测量。
可使用人总IgG ELISA来分析血清样品的BMP-6抗体浓度。可将血清中的BMP-6抗体结合至96孔微量滴定板(Nunc Immobilizer Amino 目录号436006)的抗人κ轻链抗体包被的孔且使用抗人IgG4-HRP缀合物抗体(Southern Biotech, 编号9200-05)来检测。测定中的检测上限和下限可分别为200ng/mL和10ng/mL。可使用4/5-参数算法(StatLIA, 3.2版)从大鼠血清中已知量的化合物制备的标准曲线来测定免疫反应性BMP-6抗体的浓度。药代动力学参数可使用Watson (7.4版生物分析LIMS)软件包(Thermo Scientific)来计算。计算的参数可包括曲线下面积(AUC0-∞)、表观清除率(C1)和消除半衰期。
在基本上如本实施例4中所述实施的实验中，研究I具有作为单一静脉内推注施用的0.3、1.0、3.0和10mg/kg剂量的抗体I。对照人IgG4以10mg/kg给药。研究I中的媒介物是磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)。在给药前(第-1天)和给药后1、6、12、24、48、72、120、168、240、336、432、528和672小时以及研究第36、43、50和57天，从每一动物测量施用抗体I后的药代动力学、血清铁和血清铁调素反应的数据，用于药代动力学、血清铁调素和BMP-6定量。
在基本上如本实施例4中所述实施的实验中，研究II具有作为单一静脉内推注的施用的0.05、0.3和3.0mg/kg剂量的抗体I。对照人IgG4以3mg/kg给药。研究II中的媒介物是磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)加上0.02% Tween80。在给药前(第-1天)和给药后1、6、12、24、48、72、120、168、240、336、432、528、672、840、1008、1176、1344、1512、1680和1848小时，从每一动物测量施用抗体I后的药代动力学、血清铁和血清铁调素反应的数据。
在研究I和研究II中，在所检查的0.05mg/kg至10mg/kg的范围内，抗体I的最大血清浓度(Cmax)以大致剂量比例的方式增加。在所检查的剂量范围内，抗体I显示随剂量增加清除率减小和消除半衰期增加的非线性药代动力学。在所检查的剂量内，清除率从约0.57 mL/hr/kg减小至约0.17 mL/hr/kg。在所研究的时段和剂量范围内，半衰期范围为约58小时至约295小时。
表8和表9中的药效动力学数据显示，抗体I的施用与血清铁的初始立即增加相关，给药后血清铁的峰值在24小时，然后在120-240小时返回至接近基线(给药前)水平。在3mg/kg和10mg/kg剂量组中，血清铁在240小时后以更依赖剂量的方式再次升高；观察到至研究结束时血清铁持续升高。
抗体I施用也与早在给药后6小时至12小时出现的食蟹猴血清铁调素的快速减少相关。在研究II中，血清铁调素以剂量依赖性方式返回至基线，但铁调素返回至基线的这种剂量依赖性在研究I中并不明显。研究I中的人IgG4对照抗体显示血清铁调素减少，这在研究II中并未重复。两个研究还显示在抗体I存在的情况下血清铁水平的显著变化，这与所观察到的低血清铁调素水平不相关。
表8：研究I
表9：研究II
在向雄性食蟹猴单一静脉内给药后HuA507的药代动力学/药效动力学研究
在基本上如本实施例4中所述实施的实验中，在向正常雄性食蟹猴单一静脉内给药后测试HuA507的血清PK/PD。HuA507是通过用人IgG4PAA骨架替代来自R&D Systems的MAB507抗体的小鼠恒定区而制备的嵌合抗体。HuA507抗体或对照人IgG4的单一静脉内推注10mg/kg剂量以1mL/kg的体积给出。研究中的媒介物是磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)。在给药前(第1天)和给药后1、6、12、24、48、72、96、168、264、336、432、528和624小时，从每一动物收集血液用于分析。在10mg/kg剂量的HuA507抗体的情况下，平均血清铁浓度从给药前的约150μg/ml增加至给药后12小时的约210μg/ml，但然后到48小时降回至基线。与本实施例4中所显示的抗体I延长的药效动力学效应不同，用HuA507治疗仅显示血清铁浓度在48小时内的短期的初始增加，但没有见于使用抗体I的延长反应。
实施例5：在大鼠ACD模型中的功效
可在大鼠ACD模型中测量本发明抗体或其抗原结合片段的功效。在8至10周龄雌性Lewis大鼠中，可在第0天通过5mg/kg一次腹膜内剂量的革兰氏阳性细菌细胞壁提取物(Lee Labs, 编号PG-PS 10S)来诱导炎症。在无进一步处理的情况下，可在用细胞壁提取物处理10天内在该模型中观察到血红蛋白浓度降低。可在第8天用静脉内给药开始用10mg/kg本发明抗体的治疗且持续每周静脉内给药该抗体。可测量血红蛋白、血清铁和铁调素浓度且与使用HuIgG4对照治疗所见的值进行比较。
对于临床病理分析，可在多个时间点经由尾夹从每一动物收集约0.2mL血液至含有EDTA的管中。可使用标准方法将该血液用于测量血清铁、不饱和铁结合能力、总铁结合能力、铁饱和百分比和标准血液学测量。对于所有其它分析，可在多个时间点经由尾夹从每一动物收集约0.75mL血液至不含抗凝剂的管中。
在基本上如本实施例5中所述实施的实验中，抗体I显示延长的药效动力学反应且在至第60天研究结束时的大部分天数，显示在统计学上显著高于hIgG4同种型对照的血红蛋白和铁。与对照相比，血红蛋白浓度增加约0.82-1.5g/dL。一旦开始抗体I治疗，治疗组中的红细胞的小红细胞性变少且低色素性变小。基于红细胞特征的变化，可以得出结论，在研究中所观察到的血红蛋白的增加源自红细胞大小和细胞血红蛋白水平的正常化增加而非红细胞产生的增加。
氨基酸和核苷酸序列

Claims (20)

1.结合至人BMP-6 (SEQ ID NO: 1)的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中所述LCVR包含互补决定区(CDR) LCDR1、LCDR2和LCDR3，且所述HCVR包含CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中所述LCDR1是多肽RSSENIYRNLA (SEQ ID NO: 2)，所述LCDR2是多肽AATNLAD (SEQ ID NO: 3)，所述LCDR3是多肽QGIWGTPLT (SEQ ID NO: 4)，所述HCDR1是多肽GYTFTSYAMH (SEQ ID NO: 5)，所述HCDR2是多肽YINPYNDGTKYNENFKG (SEQ ID NO: 6)或YINPYNRGTKYNENFKG (SEQ ID NO: 7)，且所述HCDR3是多肽RPFGNAMDI (SEQ ID NO: 8)。
2.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中所述LCDR1是多肽RSSENIYRNLA (SEQ ID NO: 2)，所述LCDR2是多肽AATNLAD (SEQ ID NO: 3)，所述LCDR3是多肽QGIWGTPLT (SEQ ID NO: 4)，所述HCDR1是多肽GYTFTSYAMH (SEQ ID NO: 5)，所述HCDR2是多肽YINPYNDGTKYNENFKG (SEQ ID NO: 6)，且所述HCDR3是多肽RPFGNAMDI (SEQ ID NO: 8)。
3.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中所述LCDR1是多肽RSSENIYRNLA (SEQ ID NO: 2)，所述LCDR2是多肽AATNLAD (SEQ ID NO: 3)，所述LCDR3是多肽QGIWGTPLT (SEQ ID NO: 4)，所述HCDR1是多肽GYTFTSYAMH (SEQ ID NO: 5)，所述HCDR2是多肽YINPYNRGTKYNENFKG (SEQ ID NO: 7)，且所述HCDR3是多肽RPFGNAMDI (SEQ ID NO: 8)。
4.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其包含LCVR和HCVR，其中所述LCVR是多肽SEQ ID NO: 9，且所述HCVR是多肽SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11。
5.权利要求4的抗体或其抗原结合片段，其中所述LCVR是多肽SEQ ID NO: 9，且所述HCVR是多肽SEQ ID NO: 10。
6.权利要求4的抗体或其抗原结合片段，其中所述LCVR是多肽SEQ ID NO: 9，且所述HCVR是多肽SEQ ID NO: 11。
7.权利要求1或4的抗体，其包含轻链(LC)和重链(HC)，其中所述LC是多肽SEQ ID NO: 12，且所述HC是多肽SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14。
8.权利要求7的抗体，其中所述LC是多肽SEQ ID NO: 12，且所述HC是多肽SEQ ID NO: 13。
9.权利要求7的抗体，其中所述LC是多肽SEQ ID NO: 12，且所述HC是多肽SEQ ID NO: 14。
10.权利要求1、4或7中任一项的抗体，其包含两条轻链和两条重链，其中每条轻链是多肽SEQ ID NO: 12，且每条重链是多肽SEQ ID NO: 13。
11.权利要求1、4或7中任一项的抗体，其包含两条轻链和两条重链，其中每条轻链是多肽SEQ ID NO: 12，且每条重链是多肽SEQ ID NO: 14。
12.药物组合物，其包含权利要求1-11中任一项的抗体或其抗原结合片段，和可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
13.治疗贫血的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的权利要求1-11中任一项的抗体或其抗原结合片段。
14.根据权利要求13的方法，其中所述贫血是慢性疾病的贫血。
15.根据权利要求14的方法，其中所述慢性疾病的贫血选自癌症的贫血和慢性肾病的贫血。
16.增加血清铁水平、网状红细胞计数、红细胞计数、血红蛋白和/或血细胞比容的方法，其包括施用有效量的权利要求1-11中任一项的抗体或其抗原结合片段。
17.权利要求1-11中任一项的抗体或其抗原结合片段，其用于治疗中。
18.权利要求1-11中任一项的抗体或其抗原结合片段，其用于治疗贫血。
19.权利要求18的抗体或其抗原结合片段，其中所述贫血是慢性疾病的贫血。
20.权利要求19的抗体或其抗原结合片段，其中所述慢性疾病的贫血选自癌症的贫血和慢性肾病的贫血。
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