CN104876832B - 阿利吉仑的4-位差向异构体、其制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及阿利吉仑的4‑位差向异构体，其分子结构如式4R‑1所示。本发明还涉及所述阿利吉仑的4‑位差向异构体的制备方法，及其用于检测阿利吉仑及其盐的纯度、检测阿利吉仑及其盐中光学异构体的含量以及阿利吉仑及其盐的生产或制备中质量控制的用途。

Description

阿利吉仑的4-位差向异构体、其制备方法及用途

技术领域

本发明涉及一种差向异构体，具体地，本发明涉及一种阿利吉仑的4-位差向异构体。本发明还涉及所述阿利吉仑的4-位差向异构体的制备方法及其用途。

背景技术

阿利吉仑（1）是一种新型的非肽类直接肾素抑制剂，有关的药效学、药代动力学和临床研究结果在Drugs of the Future,Vol.26,No12,pp1139-1143(2001)等期刊中有详细的陈述，其特点是通过剂量依赖性地降低肾素活性，从源头上减少肾素-血管紧张素系统（RAS）的主要活性肽——血管紧张素II的生成，有效的降低轻中度高血压患者的血压水平。阿利吉仑以其富马酸盐的形式于2007年3月首次在美国上市，商品名为TEKTURNA^TM，经临床研究证实具有良好的降压作用，已成为副作用少、用药安全的全新型抗高血压的新药。

已有专利文献US5,559,111、EP0678503、WO02/02508、WO2007/045420、WO2011/019789和US7,009,078等报道了阿利吉仑的合成方法，例如，专利US7,009,078采用了以下合成路线：

专利WO2007/045420则采用了另外一种合成路线：

阿利吉仑的合成中的关键点在于采用不对称合成的方法构建分子中的四个手性中心，从而获得4位羟基为S构型、5位氨基为S构型、2位和7位异丙基为S构型的单一光学对映体。其中，对于4位羟基手性中心的构建过程，在上述已知合成方法均得到解决。如上述专利US7,009,078中所示合成方法中，将化合物7的双键与次溴酸进行立体选择性的加成反应，得到(3S,5S,1'R,3'S)构型的化合物4，并进一步的立体专一反应获得阿利吉仑；如上述专利WO2007/045420中所示合成方法中，则将化合物16的双键与次溴酸进行立体选择性的加成反应，并进一步的立体专一反应获得阿利吉仑。

众所周知，无论合成方法中采用何种化学反应进行4位羟基手性中心的构建，其立体选择性均不可能是100%的，或多或少可能产生4位R构型的异构体，从而在最终生成得到(2S,4S,5S,7S)构型的阿利吉仑时或多或少混入(2S,4R,5S,7S)构型的异构体，即化合物4R-1。该异构体2、5、7位的构型均与目标分子阿利吉仑一致，仅4位构型不一致的异构体，化学上称为“差向异构体”。

此外，4位羟基具有相对较活泼的化学反应性质，其S构型在后续化学反应、长期储存、加工成药物制剂的过程中，如何保持4位羟基构型不变，也是制备阿利吉仑过程需要考虑的一个重要因素。

与其它的化学合成药物一样，药物活性物质（API）的纯度是阿利吉仑商业化利用的一个关键指标。在API的生产过程中可能会引入起始原料、反应中间体及副产物、降解产物等称为有关物质的杂质，其中有些杂质对患者可能是有害的，为了用药安全，国际人药注册协调委会（ICH）要求API必须具有足够的纯度，其杂质的含量需控制在药物质量标准规定的限度之内。对于阿利吉仑这类单一光学对映体药物，具有4个手性中心，理论上说具有15个光学异构体，这些异构体的化学分子式与阿利吉仑相同，各项理化性质也相同或相似，但它们进入人体后的药效及对人体的毒性与阿利吉仑可能存在较大不同。ICH要求将这些可能的光学异构体作为杂质进行限度研究，以保障药物的药效和毒性。如在API生产的ICHQ7A指导原则中，对原辅料及生产条件提出规范化的要求，在生产API的某个特定阶段需要对中间体或成品中的杂质进行检验，尤其是应用高效液相色谱（HPLC）法。应用HPLC法检验样品中某杂质的含量，通常是采用外标法，或者是加校正因子的自身对照法，其前提条件是获得被测杂质的对照品。

综上所述，为保障阿利吉仑上市药品的药效一致性和毒性最小，最佳的方法是采用高效液相色谱控制如4R-1杂质的含量，采用现有的高效液相色谱如外标法或者是加校正因子的自身对照法，均需要4R-1化合物作为对照品。然而，到目前为止，还没有发现有关化合物4R-1的报道。因此有必要开发化合物4R-1的制备方法以获得对照品，以及一种该异构体含量分析方法，以用于阿利吉仑或其盐的光学纯度检查，进而用于阿利吉仑或其盐的质量控制。

发明内容

本发明第一方面涉及一种阿利吉仑的4-位差向异构体，其分子结构如式4R-1所示，化学名称为：(2S,4R,5S,7S)-5-氨基-N-(2-胺甲酰基-2-甲基丙基)-4-羟基-2-异丙基-7-(4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)苄基)-8-甲基壬酰胺，或其药学上可接受的盐。

本发明第二方面涉及本发明第一方面的阿利吉仑的4-位差向异构体的制备方法，其包括以下步骤：

a)以如下所示的化合物2为合成的起始原料，其化学名称为：(2S,4S,5S,7S)-5-叠氮基-N-(2-胺甲酰基-2-甲基丙基)-4-羟基-2-异丙基-7-(4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)苄基)-8-甲基壬酰胺；

b)将化合物2与一种氧化剂反应得如下所示的化合物3，其中，所述的氧化剂选自三氧化铬-吡啶络合物、二氧化锰、三正丁氧基铝和戴斯-马丁过碘烷，优选戴斯-马丁过碘烷；

c)将化合物3与金属硼氢化物反应得到如下所示的化合物2及化合物4R-2的消旋体混合物，其中，所述的硼氢化物选自硼氢化钾、硼氢化钠、硼氢化锂；

d)将步骤c)获得的消旋体混合物通过催化氢化得到如下所示的化合物1及化合物4R-1的消旋体混合物，其中，优选采用钯碳催化氢化的方法；

e)将步骤d)中的消旋体混合物分离制备得到本发明第一方面的阿利吉仑的4-位差向异构体。

根据本发明第二方面任一项的制备方法，其特征在于以下(1)～(11)项中的一项或多项：

(1)步骤b)中，化合物2溶液的溶剂选自氯仿、二氯甲烷；

(2)步骤b)中，反应温度为-30～10℃，优选-20～0℃；

(3)步骤b)中，氧化反应完毕后加入饱和碳酸氢钠和硫代硫酸钠溶液进行萃取操作，有机层经干燥后浓缩，残余物经柱层析纯化得化合物3；

(4)步骤c)中，化合物3溶液的溶剂选自甲醇、乙醇、四氢呋喃；

(5)步骤c)中，反应温度为-10～60℃，优选0～50℃；

(6)步骤c)中，还原反应完毕后加入氯化铵溶液和二氯甲烷进行萃取操作，有机层经干燥后浓缩，残余物经柱层析(例如硅胶柱层析)纯化得化合物2及化合物4R-2的消旋体混合物；

(7)步骤d)中，所述的钯碳为含钯5%～10%的钯碳；

(8)步骤d)中，溶解化合物2及化合物4R-2的消旋体混合物的溶剂选自甲基叔丁基醚、乙醇、甲醇、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙酯异丙酯、二氯甲烷，优选甲醇、四氢呋喃；

(9)步骤d)中，其中催化氢化反应的压力为1～10bar，优选1～3bar；

(10)步骤d)中，催化氢化反应完毕后依次加入饱和碳酸氢钠溶液和盐水进行萃取操作，有机层经干燥后浓缩，残余物经柱层析纯化得化合物1及化合物4R-1的消旋体混合物；

(11)步骤e)中，所述分离方法为将步骤d)获得的消旋体混合物在制备液相色谱仪上进行分离制备得化合物4R-1，其中采用ChiralpakIA或类似型号的制备柱为色谱柱，以正己烷和乙醇（含0.2%二乙胺）为流动相，其中正己烷与乙醇体积比为80:20～60:40，优选70:30。

在本发明的实施方案中，作为起始原料的化合物2可参考专利US7,009,078中的方法制备获得。具体的制备方法为：将（3S,5S)-5-[(1S,3S)-1-叠氮基-3-[[4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)苯基]甲基]-4-甲基戊基]二氢-3-异丙基-2(3H)-呋喃酮（5）与约5摩尔当量的3-氨基-2,2-二甲基丙酰胺（6）、约1摩尔当量的2-羟基吡啶、催化量的三乙胺及一种溶剂混合后，搅拌回流溶解。其中，所述的溶剂选自甲基叔丁基醚、四氢呋喃、N-甲基吡咯烷酮、甲苯等；反应温度可保持在40～120℃，优选80～110℃，更优选90～100℃的范围之内。反应完毕后加入水和一种溶剂进行萃取操作，其中所述的溶剂选自甲基叔丁基醚、二氯甲烷、乙酸乙酯等；有机层经干燥后浓缩，残余物经柱层析纯化得化合物2。

在本发明的实施方案中，在化合物2的溶液中加入一种氧化剂搅拌反应，其中所述的化合物2溶液的溶剂选自氯仿、二氯甲烷等，其中所述的氧化剂选自三氧化铬-吡啶络合物、二氧化锰、三正丁氧基铝、戴斯-马丁过碘烷等，优选戴斯-马丁过碘烷为氧化剂，反应温度为-30～10℃，优选-20～0℃，反应完毕后加入饱和碳酸氢钠和硫代硫酸钠溶液进行萃取操作，有机层经干燥后浓缩，残余物经柱层析纯化得化合物3。

在本发明的实施方案中，在化合物3的溶液中加入一种还原剂搅拌反应，其中所述的还原剂选自金属硼氢化物，比如硼氢化钾、硼氢化钠、硼氢化锂等；其中所述的化合物3溶液的溶剂选自甲醇、乙醇、四氢呋喃等；反应温度为-10～60℃，优选0～50℃。反应完毕后加入氯化铵溶液和二氯甲烷进行萃取操作，有机层经干燥后浓缩，残余物经柱层析纯化得化合物2及化合物4R-2的消旋体混合物。

在本发明的实施方案中，在上述化合物2及化合物4R-2的消旋体混合物的溶液中加入钯碳，通入氢气加压氢化，其中所述的钯碳为含钯5%～10%的钯碳；其中所述的消旋体混合物溶液的溶剂选自甲基叔丁基醚、乙醇、甲醇、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙酯异丙酯、二氯甲烷等，优选甲醇、四氢呋喃；其中加氢反应的压力为1～10bar，优选1～3bar。反应完毕后依次加入饱和碳酸氢钠溶液和盐水进行萃取操作，有机层经干燥后浓缩，残余物经柱层析纯化得化合物1及化合物4R-1的消旋体混合物；

在本发明的实施方案中，将上述化合物1及化合物4R-1的消旋体混合物在制备液相色谱仪上进行分离制备得化合物4R-1，其中采用Chiralpak IA或类似型号的制备柱为色谱柱，以正己烷:乙醇（0.2%二乙胺）为流动相，其中正己烷与乙醇体积比为80:20～60:40，优选70:30。

本发明第三方面还涉及一种检测阿利吉仑及其盐中光学异构体含量的方法，该方法采用高效液相色谱法(HPLC)中的外标法，以本发明第一方面的阿利吉仑的4-位差向异构体为对照品，计算阿利吉仑及其盐中4位差向异构体的含量。

根据本发明第三方面任一项的方法，其中所述高效液相色谱法的特征在于以下(1)～(5)项中的一项或多项：

(1)色谱柱为手性柱，优选AD-H型、IC柱或OJ-3R柱，更优选为CHIRALPAK AD-H型手性柱（4.6mm×250mm,5μm）；

(2)流动相为正己烷-无水乙醇（含0.2%～0.5%二乙胺）（90～10至10～90）为流动相，优选为正己烷-无水乙醇（含0.2%二乙胺）（90:10）；

(3)检测波长为200～300nm，优选为280nm；

(4)流速为0.5～1.5ml/min，优选为1.0ml/min；

(5)柱温为25～35℃，优选为30℃。

在本发明中，所述外标法是本领域公知的方法。在本发明的实施方案中，所述外标法是指：

1)以HPLC法测定含有一定量的化合物4R-1的对照品溶液的峰面积；

2)以HPLC法测定阿利吉仑或其盐的样品中含有的化合物4R-1的峰面积；

3)通过计算1)和2)的峰面积的比值得到阿利吉仑或其盐的样品中含有的化合物4R-1的含量。

在本发明的具体实施方案中，所述光学异构体4R-1含量的计算公式为：

式中，A_样为供试品溶液中化合物4R-1的峰面积；

W_对为化合物4R-1的称样量（mg）；

V_样为供试品溶液的定容体积（ml）；

A_对为化合物4R-1的峰面积；

V_对为化合物4R-1的定容体积（ml）；

W_样为供试品溶液的称样量（mg）。

本发明第四方面涉及一种检测阿利吉仑及其盐中光学异构体含量的方法，该方法采用高效液相色谱法中的加校正因子的自身对照法，以阿利吉仑的4-位差向异构体的校正因子，计算阿利吉仑及其盐中4位差向异构体的含量。

根据本发明第四方面任一项的方法，其中所述高效液相色谱法的特征在于以下(1)～(5)项中的一项或多项：

(1)色谱柱为手性柱，优选AD-H型、IC柱或OJ-3R柱，更优选为CHIRALPAK AD-H型手性柱（4.6mm×250mm,5μm）；

(2)流动相为正己烷-无水乙醇（含0.2%～0.5%二乙胺）（90～10至10～90），优选为正己烷-无水乙醇（含0.2%二乙胺）（90:10）；

(3)检测波长为200～300nm，优选为280nm；

(4)流速为0.5～1.5ml/min，优选为1.0ml/min；

(5)柱温为25～35℃，优选为30℃。

在本发明中，所述加校正因子的自身对照法是本领域公知的方法。在本发明的实施方案中，所述加校正因子的自身对照法是指：

1)以阿利吉仑和化合物4R-1作为样品，配制系列不同浓度的溶液，绘制标准曲线求得斜率，通过斜率计算化合物4R-1的校正因子；

2)以HPLC法测定阿利吉仑或其盐的样品中含有的阿利吉仑的峰面积和化合物4R-1的峰面积；

3)通过校正因子来计算化合物4R-1在阿利吉仑中的含量。

在本发明的具体实施方案中，所述光学异构体4R-1含量的计算公式为：

式中，A_4R-1为供试品溶液中化合物4R-1的峰面积；

f_4R-1为化合物4R-1相对于阿利吉仑半富马酸盐的校正因子；

A_对为对照溶液中阿利吉仑的峰面积。

其中，化合物4R-1相对于阿利吉仑半富马酸盐的校正因子

f=K_阿利吉仑/K_4R-1，

其中K为标准曲线的斜率值。

在本发明中，所述高效液相色谱法为本领域公知的方法。在本发明的实施方案中，所述高效液相色谱法的具体方法为：

配制一定浓度的阿利吉仑和化合物4R-1的溶液，进行高效液相色谱，采用的色谱条件为：色谱柱为手性柱，优选AD-H型、IC柱或OJ-3R柱，更优选为CHIRALPAK AD-H型手性柱（4.6mm×250mm,5μm）；流动相为正己烷-无水乙醇（含0.2%～0.5%二乙胺）（90～10至10～90），优选为正己烷-无水乙醇（含0.2%二乙胺）（90:10）；检测波长为200～300nm，优选为280nm；流速为0.5～1.5ml/min，优选为1.0ml/min；柱温为25～35℃，优选为30℃；

分别单独进样和混合进样，则分别得到阿利吉仑的保留时间、化合物4R-1的保留时间、以及两者的分离度数据。

在本发明的具体实施方案中，其中阿利吉仑的保留时间约为21.2min，化合物4R-1的保留时间约为23.7min，在该液相条件下两者的色谱峰可达到较好的分离，其分离度为1.7。

本发明还涉及本发明第一方面的阿利吉仑的4-位差向异构体用于检测阿利吉仑及其盐中光学异构体含量的用途。

本发明还涉及本发明第一方面的阿利吉仑的4-位差向异构体用于阿利吉仑及其盐的生产或制备中质量控制的用途。

本发明还涉及本发明第一方面的阿利吉仑的4-位差向异构体用于检测阿利吉仑及其盐的纯度的用途。

附图说明

图1：化合物4R-1的ESI-MS图谱

图2：化合物4R-1的¹H-NMR图谱

图3：化合物4R-1的¹³C-NMR图谱

图4：化合物4R-1的¹H-¹HCOSY图谱

图5：化合物4R-1的HSQC图谱

图6：阿利吉仑半富马酸盐的HPLC图谱

图7：化合物4R-1的HPLC图谱

图8：化合物4R-1与阿利吉仑半富马酸盐混合的HPLC图谱

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

在以下实施例中，所述分离制备，在Shimadzul C20A型制备液相色谱仪上进行，其中采用Chiralpak IA或类似型号的制备柱为色谱柱；所述的浓缩，是在R-200型旋转蒸发仪上进行；所述的HPLC色谱图，是在岛津LC-10ATvp高效液相色谱仪上测定；质谱在JEOL AccuTOF CS(JMS T100CS)型质谱仪上测定；核磁共振¹H谱和¹³C谱在BrukerAVANCEIII400型核磁共振仪上测定；所述的旋光度，是在WZZ-2S型自动旋光仪上测定，其中，样品的比旋度的计算公式为：

${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=\frac{100\×\mathrm{\α}}{l\×c}$

式中D为钠光谱的D线，l为测定管长度（dm），α为测得的旋光度。

实施例1(2S,5S,7S)-5-叠氮基-N-(2-胺甲酰基-2-甲基丙基)-2-异丙基-7-(4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)苄基)-8-甲基-4-氧壬酰胺（3）的制备

以如下所示的化合物2为合成的起始原料，其化学名称为：(2S,4S,5S,7S)-5-叠氮基-N-(2-胺甲酰基-2-甲基丙基)-4-羟基-2-异丙基-7-(4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)苄基)-8-甲基壬酰胺。化合物2通过专利US7,009,078中的实施例F1所述的方法制备。

向化合物2（4.0g，6.9mmol）的二氯甲烷（100ml）溶液中加入戴斯-马丁过碘烷（2.9g，6.9mmol），加入时保持温度在-20℃。加毕，缓慢升温至0℃并且将反应液在0℃搅拌3小时。向反应液中分别加入饱和碳酸氢钠和硫代硫酸钠水溶液（各20ml），待反应液变澄清之后向反应液中加入二氯甲烷（50ml），搅拌后分出有机相，并且再用二氯甲烷（50ml）萃取水相两次，合并所有有机相，并且将有机相用无水硫酸钠干燥后蒸干，残余物经硅胶柱层析纯化，得到如下所示的化合物3的粗品（4.4g，100%产率），为黄色油状物。ESI-MS(m/z):576.0(MH⁺)。

实施例2(2S,5S,7S)-5-叠氮基-4-羟基-N-(2-胺甲酰基-2-甲基丙基)-2-异丙基-7-(4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)苄基)-8-甲基壬酰胺（2和4R-2的混合物）的制备

将实施例1中得到的中间体3（4.4g，6.9mmol）的粗品溶于甲醇（50ml），并且加热到50℃，向溶液中分批加入硼氢化钠（0.52g，13.8mmol）。加毕，反应液在50℃继续搅拌30分钟后，冷却到室温。向反应液中加入饱和氯化铵水溶液（20ml），搅拌后分离出有机相，再用二氯甲烷（50ml）萃取水相两次。合并所有有机相，用无水硫酸钠干燥后蒸干，得到残留物，将残留物用硅胶柱层析纯化（流动相：乙酸乙酯/石油醚=1/1）得到如下所示的2和4R-2的混合物（3.0g，75%产率），为无色油状物。ESI-MS(m/z):578.1(MH⁺)。

实施例3(2S,4R,5S,7S)-5-氨基-N-(2-胺甲酰基-2-甲基丙基)-4-羟基-2-异丙基-7-(4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)苄基)-8-甲基壬酰胺（4R-1）的制备

将实施例2中得到的2和4R-2的混合物（3.0g，5.2mmol）溶于甲醇（50ml）中，并向此溶液中加入钯碳（含钯10%，0.5g）。向此反应液通入氢气，保持氢气压力为2.0bar搅拌过夜。将反应混合物过滤，滤液蒸干溶剂，得到的残留物在制备液相色谱仪上进行分离制备，其中采用Chiralpak IA的制备柱为色谱柱，以正己烷:乙醇（含0.2%二乙胺）=70:30为流动相，减压蒸干溶剂得到4R-1（0.8g，35%产率），为白色固体。

对所得的化合物4R-1进行旋光度测定：取本品约0.2g，精密称定，置25ml量瓶中，加乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀得供试液。取供试液在自动旋光仪上测定旋光度，重复读数3次，取算术平均值。测定的结果如表1所示。

表1

按照比旋度的计算公式计算，化合物4R-1的比旋度为[α]_D ²⁰=0°（乙醇，C=8.05mg/ml）；作为参考，阿利吉仑的比旋度为[α]_D ²⁰=-11.4°（乙醇，C=8.21g/ml）。

对所得的化合物4R-1，进行质谱(图1)、核磁共振氢谱(图2)、碳谱(图3)、¹H-¹HCOSY谱（图4）、HSQC谱（图5）的测定，结果发现：

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃,ppm^-1)δ:0.80-0.92(m,12H),1.16-1.30(m,8H),1.41-1.44(m,1H),1.61-1.88(m,5H),2.06-2.12(m,2H),2.38-2.52(m,3H),2.68-2.70(m,1H),3.28-3.47(m,6H),3.57(t,2H),3.83(s,3H),4.09(t,2H),5.85-6.00(bs,1H),6.35-6.49(br,2H),6.68-6.79(m,3H).

¹³C-NMR(400MHz,CDCl₃,ppm^-1)δ:17.9,19.4,20.0,20.3,23.9,24.0,29.2,29.5,31.032.5,37.3,42.5,43.0,47.2,51.9,53.3,56.0,58.6,66.1,69.3,74.2,111.7,114.5,121,.2,134.2,147.6.,148.2,176.4,179.8.

ESI-MS(m/z):552.4(MH⁺)。

¹H-¹HCOSY测试的结果见图4，HSQC测试的结果见图5。

以上结果均与目标化合物的化学结构相符合。

实施例4高效液相色谱法中的外标法检测阿利吉仑及其盐中光学异构体含量

液相色谱仪型号：岛津LC-10ATvp

色谱柱类型：CHIRALPAK AD-H型手性柱（4.6mm×250mm，5μm）；

流动相：正己烷-无水乙醇（含0.2%二乙胺）（90:10）；

检测波长：280nm；

流速：1.0ml/min；

柱温：30℃；

进样量：10μl

稀释剂：正己烷：无水乙醇（1:1）

对照品溶液的制备：取实施例3所得化合物4R-1适量，精密称定，加入正己烷：无水乙醇（1:1）溶解并定容至刻度，得到每ml含化合物4R-10.1mg的溶液。

供试品溶液的制备：取阿利吉仑半富马酸盐（由华润双鹤药业股份有限公司依据专利US7,009,078中的实施例G1所述的方法制备得到并提供）适量，精密称定，加入正己烷：无水乙醇（1:1）溶解并定容至刻度，得到每ml含阿利吉仑半富马酸盐0.2mg的溶液。

加化合物4R-1的混合溶液的配制：分别精密称取阿利吉仑半富马酸盐及化合物4R-1适量，按照1:1的等比例混合，加入正己烷：无水乙醇（1:1）溶解并定容至刻度。

操作：分别精密吸取10μl对照品溶液、供试品溶液和加化合物4R-1的混合溶液注入液相色谱仪，记录色谱图（图6、图7、图8）。化合物4R-1、阿利吉仑在上述色谱图中的保留时间分别约为21.2min、23.7min，两者的分离度约为1.7。

外标法计算供试品溶液中化合物4R-1的含量：若供试品溶液在化合物4R-1的位置出现相应的色谱峰，根据对照品溶液对应的峰面积，采用外标法计算供试品溶液中化合物4R-1的含量。

计算公式：

式中，A_样为供试品溶液中化合物4R-1的峰面积；

W_对为化合物4R-1的称样量（mg）；

V_样为供试品溶液的定容体积（ml）；

A_对为化合物4R-1的峰面积；

V_对为化合物4R-1的定容体积（ml）；

W_样为供试品溶液的称样量（mg）。

具体数据如表2所示。

表2

项目	数值
		W对	10.36mg
W样	10.24mg
		A对	107689
A样	116203
		V对	100ml
V样	50ml
		供试品溶液中化合物4R-1含量%	未检出
混合溶液中化合物4R-1含量%	54.6%

实施例5高效液相色谱法中加校正因子的自身对照法法检测阿利吉仑及其盐中光学异构体含量

液相色谱仪型号：岛津LC-10ATvp

色谱柱类型：CHIRALPAK AD-H型手性柱（4.6mm×250mm，5μm）；

流动相：正己烷-无水乙醇（含0.2%二乙胺）（90:10）；

检测波长：280nm；

流速：1.0ml/min；

柱温：30℃；

进样量：10μl

稀释剂：正己烷：无水乙醇（1:1）

化合物4R-1系列线性溶液的制备：取化合物4R-1适量，精密称定，加入正己烷：无水乙醇（1:1）溶解并定容至刻度，得到每ml含化合物4R-10.5mg的线性贮备液。逐级稀释得到浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml的系列线性溶液。

阿利吉仑半富马酸盐系列线性溶液的制备：取阿利吉仑半富马酸盐（由华润双鹤药业股份有限公司依据专利US7,009,078中的实施例G1所述的方法制备得到并提供）适量，精密称定，加入正己烷：无水乙醇（1:1）溶解并定容至刻度，得到每ml含阿利吉仑及其盐0.5mg的线性贮备液。逐级稀释得到浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml的系列线性溶液。

供试品溶液的制备：取阿利吉仑半富马酸盐适量，精密称定，加入正己烷：无水乙醇（1:1）溶解并定容至刻度，得到每ml含阿利吉仑0.2mg的溶液。

对照溶液的制备：精密量取供试品溶液5ml，置于10ml量瓶中，加入正己烷：无水乙醇（1:1）溶解并定容至刻度。

加化合物4R-1的混合溶液：分别精密称取阿利吉仑半富马酸盐及化合物4R-1适量，按照1:1的等比例混合，加入正己烷：无水乙醇（1:1）溶解并定容至刻度。

色谱操作：精密吸取各线性溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图。以系列线性溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到化合物4R-1及阿利吉仑及其盐对应的斜率值K。

化合物4R-1相对于阿利吉仑半富马酸盐的校正因子

f=K_阿利吉仑/K_4R-1

经计算得到化合物4R-1相对于阿利吉仑及其盐的校正因子f值为0.9974。

分别精密吸取供试品溶液和对照溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图。若在对应的化合物4R-1位置出现色谱峰，则其含量为：

式中，A_4R-1为供试品溶液中化合物4R-1的峰面积；

f_4R-1为化合物4R-1相对于阿利吉仑半富马酸盐的校正因子（0.9974）；

A_对为对照溶液中阿利吉仑的峰面积。

具体数据如表3所示。

表3

项目	数值
		A4R-1	116203
A对	106532
		供试品溶液中化合物4R-1含量%	未检出
化合物4R-1含量%	54.4%

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (7)

1.一种阿利吉仑的4-位差向异构体或其药学上可接受的盐的制备方法，其分子结构如式4R-1所示，化学名称为：(2S,4R,5S,7S)-5-氨基-N-(2-胺甲酰基-2-甲基丙基)-4-羟基-2-异丙基-7-(4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)苄基)-8-甲基壬酰胺，

包括以下步骤：

a)以如下所示的化合物2为合成的起始原料，其化学名称为：(2S,4S,5S,7S)-5-叠氮基-N-(2-胺甲酰基-2-甲基丙基)-4-羟基-2-异丙基-7-(4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)苄基)-8-甲基壬酰胺；

b)将化合物2与一种氧化剂反应得如下所示的化合物3，其中，所述的氧化剂选自三氧化铬-吡啶络合物、二氧化锰、三正丁氧基铝和戴斯-马丁过碘烷；

c)将化合物3与金属硼氢化物反应得到如下所示的化合物2及化合物4R-2的消旋体混合物，其中，所述的硼氢化物选自硼氢化钾、硼氢化钠、硼氢化锂；

d)将步骤c)获得的消旋体混合物通过催化氢化得到如下所示的化合物1及化合物4R-1的消旋体混合物；

e)将d)中的消旋体混合物分离制备得到权利要求1的阿利吉仑的4-位差向异构体。

2.权利要求1的阿利吉仑的4-位差向异构体的制备方法，其中步骤b)中所述的氧化剂为戴斯-马丁过碘烷。

3.权利要求1的阿利吉仑的4-位差向异构体的制备方法，其中步骤d)中所述催化氢化采用钯碳催化氢化的方法。

4.权利要求1的制备方法，其特征在于以下(1)～(11)项中的一项或多项：

(1)步骤b)中，化合物2溶液的溶剂选自氯仿、二氯甲烷；

(2)步骤b)中，反应温度为-30～10℃；

(3)步骤b)中，氧化反应完毕后加入饱和碳酸氢钠和硫代硫酸钠溶液进行萃取操作，有机层经干燥后浓缩，残余物经柱层析纯化得化合物3；

(4)步骤c)中，化合物3溶液的溶剂选自甲醇、乙醇、四氢呋喃；

(5)步骤c)中，反应温度为-10～60℃；

(6)步骤c)中，还原反应完毕后加入氯化铵溶液和二氯甲烷进行萃取操作，有机层经干燥后浓缩，残余物经柱层析纯化得化合物2及化合物4R-2的消旋体混合物；

(7)步骤d)中，所述的钯碳为含钯5％～10％的钯碳；

(8)步骤d)中，溶解化合物2及化合物4R-2的消旋体混合物的溶剂选自甲基叔丁基醚、乙醇、甲醇、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙酯异丙酯、二氯甲烷；

(9)步骤d)中，其中催化氢化反应的压力为1～10bar；

(10)步骤d)中，催化氢化反应完毕后依次加入饱和碳酸氢钠溶液和盐水进行萃取操作，有机层经干燥后浓缩，残余物经柱层析纯化得化合物1及化合物4R-1的消旋体混合物；

(11)步骤e)中，所述分离方法为将步骤d)获得的消旋体混合物在制备液相色谱仪上进行分离制备得化合物4R-1，其中采用ChiralpakIA或类似型号的制备柱为色谱柱，以正己烷:乙醇为流动相，其中正己烷与乙醇体积比为80:20～60:40。

5.权利要求1的制备方法，其特征在于以下(1)～(4)项中的一项或多项：

(1)步骤b)中，反应温度为-20～0℃；

(2)步骤c)中，反应温度为0～50℃；

(3)步骤d)中，溶解化合物2及化合物4R-2的消旋体混合物的溶剂选自甲醇、四氢呋喃；

(4)步骤d)中，其中催化氢化反应的压力为1～3bar。

6.权利要求4的制备方法，其中，步骤e)中，流动相乙醇中含0.2％二乙胺。

7.权利要求4的制备方法，其中，步骤e)中，正己烷与乙醇体积比为70:30。