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CN104846008B - Gs1;2基因在调控植物根长中的应用 - Google Patents

Gs1;2基因在调控植物根长中的应用 Download PDF

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姜程曦
朱忠欣
张文明
郑文寅
赵褀
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Anhui Agricultural University AHAU
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Anhui Agricultural University AHAU
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Abstract

本发明公开了GS1；2基因在调控植物根长中的应用。本发明提供了抑制GS1；2蛋白的活性或表达的物质或抑制GS1；2蛋白编码基因表达的物质或敲除GS1；2蛋白编码基因的物质在降低植物根长中的应用；所述GS1；2蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。本发明通过干扰水稻中GS1；2基因的表达，发现抑制GS1；2基因的表达可以使水稻根尖发生卷曲，且抑制GS1；2基因的表达的转基因水稻主根长度小于未转基因的野生型水稻主根长，表明GS1；2基因调控植物根长。

Description

GS1;2基因在调控植物根长中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及GS1；2基因在调控植物根长中的应用。
背景技术
根是高等植物的重要器官,不仅对植物体具有机械支撑作用,而且在植物体从土壤中吸收正常生命活动所需水份和矿物质营养的过程中起到关键作用。根系的发育状况直接影响着植物体的生长状况,在农业生产实践中十分关键,因此对根系发生和发育的研究既具有理论价值,也具有实践意义。
谷氨酰胺合成酶(GS)是植物氮代谢的关键酶，它在谷氨酰胺合成酶循环中催化谷氨酸(Gln)与NH3缩合形成谷氨酰胺(Glu)，参与植物含氮化合物的新陈代谢。植物中GS主要分为两类，GS1为细胞质型，GS2为质体型，它们分布于植物不同的亚细胞结构中(叶绿体和细胞质)及不同的组织器官中，在不同的生长阶段发挥不同的作用。植物中所有的氮，无论是直接来源于硝酸盐、铵离子、氮固定或植物新陈代谢过程中释放的铵，都必须经过GS催化的反应途径，GS酶的生化及分子机理研究与作物生产中氮高效利用、耐逆及品质改良密切相关。GS1；2是GS1的亚型之一，研究已表明与植物氮吸收代谢有关，但其在植物根的生长中的应用未见报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供抑制GS1；2蛋白的活性或表达的物质或抑制GS1；2蛋白编码基因表达的物质或敲除GS1；2蛋白编码基因的物质的用途。
本发明提供的制GS1；2蛋白的活性或表达的物质或抑制GS1；2蛋白编码基因表达的物质或敲除GS1；2蛋白编码基因的物质在降低植物根长或使植物根尖发生卷曲中的应用；
所述GS1；2蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。
上述应用中，所述根长为主根长。
上述应用中，所述GS1；2蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1第657-1730位核苷酸；
所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
本发明的另一个目的是提供抑制GS1；2蛋白的活性或表达的物质或抑制GS1；2蛋白编码基因表达的物质或敲除GS1；2蛋白编码基因的物质的另一个用途。
本发明提供了抑制GS1；2蛋白的活性或表达的物质或抑制GS1；2蛋白编码基因表达的物质或敲除GS1；2蛋白编码基因的物质在培育根长降低和/或根尖发生卷曲转基因植物中的应用。
本发明第三个目的是提供一种培育根长降低和/或根尖发生卷曲转基因植物的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：抑制目的植物中的GS1；2蛋白的活性或表达，得到转基因植物，
所述转基因植物具有如下1)和/或2)的特征：
1)所述转基因植物根长小于所述目的植物；
2)所述转基因植物根尖发生卷曲；
所述GS1；2蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。
上述方法中，所述抑制目的植物中的GS1；2蛋白的活性或表达为将重组载体导入所述目的植物；
所述重组载体为将DNA分子1和DNA分子2均插入pTCK303载体中，得到的载体；所述DNA分子1的核苷酸序列为序列1的自第1281位-1730位核苷酸；所述DNA分子2的核苷酸序列为所述DNA分子1的反向互补序列。
上述方法中，所述根长为主根长。
上述方法中，所述GS1；2蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1第657-1730位核苷酸；
上述方法中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
本发明第四个目的是提供抑制GS1；2蛋白的活性或表达的物质或抑制GS1；2蛋白编码基因表达的物质或敲除GS1；2蛋白编码基因的物质。
本发明提供了抑制GS1；2蛋白的活性或表达的物质或抑制GS1；2蛋白编码基因表达的物质或敲除GS1；2蛋白编码基因的物质，为上述DNA分子1或上述重组载体。
本发明的实验证明，本发明通过干扰水稻中GS1；2基因的表达，发现抑制GS1；2基因的表达可以使水稻根尖发生卷曲，且抑制GS1；2基因的表达的转基因水稻主根长度小于未转基因的野生型水稻主根长，表明GS1；2基因调控植物根长。
附图说明
图1为用于敲除GS1；2基因的重组载体部分结构示意图；
图2为野生型(WT)和转基因植株(GS1；2RNAi)根中GS1；2基因表达差异；
图3为野生型(WT)和转基因植株(GS1；2RNAi)根尖表型；
图4为野生型(WT)和转基因植株(GS1；2RNAi)根长统计结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、用于敲除GS1；2基因的重组载体的构建
GS1；2基因的核苷酸序列为序列1第657-1730位核苷酸，编码的蛋白为GS1；2，该蛋白的氨基酸序列为序列2。
提取水稻品种日本晴的RNA，反转录为cDNA。以此cDNA为模板，以5′-GTCGACACTAGTgccgctgctgaccaagtgtg-3′和5′-GGTACCGAGCTC ttccacagcagcgtggtctc-3′为引物扩增，得到440bp的PCR产物，该PCR产物具有序列表中序列1自5′末端第1281位-1730位核苷酸；该PCR产物为正向片段。
用SpeI和SacI酶切该PCR产物，得到的酶切产物与经过同样酶切得到的14610bp的pTCK303载体(Wang Zhen,Chen Changbin,Xu Yunyuan,Jiang Rongxi,Han Ye,Xu Zhihongand Chong Kang.2004.A Practical Vector for Efficient Knockdown of GeneExpression in Rice(Oryza sativa L.)Plant Molecular Biology Reporter 22:409-417；公众可从安徽农大农学院获得)骨架连接，使该PCR产物正向插入pTCK303载体的SpeI、SacI位点间，得到中间载体；
再用SalI和KpnI酶切该PCR产物，得到的酶切产物与经过同样酶切得到的14612bp的中间载体骨架连接，使该PCR产物反向插入中间载体的SalI和KpnI位点间，得到重组载体，为RNA干扰载体。
经过测序，该重组载体为将序列表中序列1自5′末端第1281位-1730位核苷酸(B)插入pTCK303载体的SpeI和SacI酶切位点间，且将序列表中序列1自5′末端第1281位-1730位核苷酸的反向互补片段(A)插入pTCK303载体的SalI和KpnI酶切位点间得到的载体，命名为pTCK-GS1；2(结构示意图如图1所示)，为RNA干扰载体。该具有反向重复的重组表达载体的启动子为ubiquitin。
实施例2、敲除GS1；2基因获得转基因水稻
1、RNA干扰转基因株系的获得
1)RNA干扰转基因株系的获得
将实施例1获得的pTCK-GS1；2转入农杆菌LBA4404(Takara Bio company，Cat.9115)，得到重组菌。将该重组菌提取质粒，送去测序，该质粒为pTCK-GS1；2，将含有该质粒的重组菌命名为LBA4404/pTCK-GS1；2。
将pTCK-GS1；2转入农杆菌LBA4404(Takara Bio company，Cat.9115)，得到重组菌。将该重组菌提取质粒，送去测序，该质粒为pTCK-GS1；2，将含有该质粒的重组菌命名为LBA4404/pTCK-GS1；2。
将LBA4404/pTCK-GS1；2导入到水稻品种日本晴(以下也称为野生型水稻)中，潮霉素筛选，获得了30个T0代转GS1；2RNAi水稻，即为RNA干扰转基因株系。
2)分子鉴定
对上述获得的30个T0代转GS1；2RNAi水稻(GS1；2RNAi)和野生型水稻(WT) 进行分子鉴定，提取各种水稻根的基因组DNA，用如下引物进行RT-PCR方法鉴定：
GS1；2-F:TTTTCAAGGACCCGTTCAGGA
GS1；2-R:CGGCACTGTGCCTCTTGTTAGT
内参基因为Actin，内参引物为
Actin-F:TCCATCTTGGCATCTCTCAG
Actin-R:GTACCCGCATCAGGCATCTG
结果如图2所示，T0代转GS1；2RNAi水稻(GS1；2RNAi)中GS1；2的平均相对表达量低于野生型水稻(WT)中GS1；2的平均相对表达量，证明敲除GS1；2基因或抑制GS1；2基因表达。
采用同样的方法将空载体pTCK303转入野生型水稻中，得到T0代转pTCK水稻。
将上述T0代转GS1；2RNAi水稻和T0代转pTCK水稻均播种传代，分别得到T1代转GS1；2RNAi水稻和T1代转pTCK水稻。
2、RNA干扰转基因表型观察
将T1代转GS1；2RNAi水稻(GS1；2RNAi)和野生型水稻WT的播种在MS培养基中。以T1代转pTCK水稻为对照。
每个株系10株，实验重复3次，结果取平均值。
5天观察根形态，结果如图3所示，T1代转GS1；2RNAi水稻根尖发生卷曲。
统计各株系主根长度，结果如图4所示，T1代转GS1；2RNAi水稻主根长度小于野生型水稻。
T1代转pTCK水稻结果与野生型水稻无显著差异。

Claims (6)

1.抑制GS1;2蛋白的活性或表达的物质或抑制GS1;2蛋白编码基因表达的物质或敲除GS1;2蛋白编码基因的物质在使植物根尖发生卷曲中的应用；
所述GS1;2蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2；
所述植物为单子叶植物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述GS1;2蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1第657-1730位核苷酸。
3.抑制GS1;2蛋白的活性或表达的物质或抑制GS1;2蛋白编码基因表达的物质或敲除GS1;2蛋白编码基因的物质在培育根尖发生卷曲转基因植物中的应用；
所述植物为单子叶植物。
4.一种培育根尖发生卷曲转基因植物的方法，包括如下步骤：抑制目的植物中的GS1;2蛋白的活性或表达，得到转基因植物，
所述转基因植物
根尖发生卷曲；
所述GS1;2蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2；
所述植物为单子叶植物。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述抑制目的植物中的GS1;2蛋白的活性或表达为将重组载体导入所述目的植物；
所述重组载体为将DNA分子1和DNA分子2均插入pTCK303载体中，得到的载体；所述DNA分子1的核苷酸序列为序列1的自第1281位-1730位核苷酸；所述DNA分子2的核苷酸序列为所述DNA分子1的反向互补序列。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述GS1;2蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1第657-1730位核苷酸。
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Accumulated Expression Level of Cytosolic Glutamine Synthetase 1 Gene (OsGS1;1 or OsGS1;2) Alter Plant Development and the Carbon-Nitrogen Metabolic Status in Rice;Aili Bao等;《PLOS ONE》;20140417;第9卷(第4期);第4页图1 *
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