CN104833805A - 一种循环肿瘤细胞检测和鉴定试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种循环肿瘤细胞检测和鉴定试剂盒及其应用，属于生物技术和医学领域。该试剂盒包括了细胞富集分离和提取，肿瘤细胞鉴定的试剂和缓冲液。本发明的主要特点是可以同时观察到以荧光染色为基础的荧光染色标志物和以明视光染色为基础的细胞形态特点，提高了肿瘤细胞鉴定的准确率；通过使用细胞表面标志物和细胞质标志物来富集靶细胞，提高了富集分离和提取肿瘤细胞的灵敏度。该试剂具有细胞鉴定准确，假阳性低，检测重复性好，灵敏度高等优点，适用于科研和临床的多种应用。

Description

一种循环肿瘤细胞检测和鉴定试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域，具体涉及一种循环肿瘤细胞鉴定试剂盒及其应用。

背景技术

血液循环肿瘤细胞以较低的数量存在于血液中，一般需要富集后才能有效检测和分析。血液中的细胞种类繁多，要绝对准确地鉴定血液中的肿瘤细胞，并不容易。现在，较普遍的是，按专业领域的认可，鉴定上皮细胞来源的肿瘤细胞。市场现有的循环肿瘤细胞鉴定试剂，都是分开的用于荧光染色或明视光染色，细胞富集方法也是依赖于细胞表面的标志物。此发明介绍一种可同时或单独进行荧光染色观测和明视光染色观测的循环肿瘤细胞鉴定试剂，细胞富集时使用的标志物包括同时细胞表面的标志物和细胞质的标志物，或者只使用其中的一种。

发明内容

本发明的目的在于针对现今市场技术产品的不足，提出一个可以多功能鉴定血液循环肿瘤细胞，多种标志物富集靶细胞，并且提高循环肿瘤细胞检测的灵敏度的试剂盒。

本发明采用的技术方案是：

一种循环肿瘤细胞鉴定试剂盒，所述试剂盒包括红细胞裂解缓冲液、细胞渗透剂、细胞富集试剂、细胞固定剂、细胞鉴定试剂和缓冲液以及细胞明视光、荧光染色试剂和缓冲液，可对相同样本的细胞同时进行荧光和明视光染色观测。

一种循环肿瘤细胞检测和鉴定试剂盒的应用，所述试剂盒可以对细胞同时做荧光和明视光染色分析，依靠细胞表面标志物和细胞质标志物来富集靶细胞，高灵敏度富集和检测血液循环肿瘤细胞，可以用于荧光标记识别细胞的分子标志物以及明视光识别细胞形态结构的肿瘤细胞。

进一步地，所述明视光识别循环肿瘤细胞的形态结构的试剂，包括稀有细胞富集、分离提取试剂、红细胞裂解液、细胞渗透缓冲液、细胞固定液、清洗缓冲液、荧光标记识别抗体以及明视光染色液等。

优选地，所述稀有细胞富集，分离提取试剂包括特定细胞结合的抗体磁珠、稀释液、封闭液或称包埋液、磁柱以及磁铁装置。

优选地，所述红细胞裂解液是裂解样本中的红细胞，而不损伤其他有核细胞的试剂。

优选地，所述细胞渗透缓冲液是让细胞膜进行抗体渗透但又不破裂细胞。

优选地，所述细胞固定液指的是固定细胞，让细胞膜有裂缝，便于后续的染色处理。

优选地，所述清洗缓冲液是用于清洗细胞，转换不同的处理试剂，但又不破坏细胞。

优选地，所述荧光标记识别抗体包括各种标记的鉴定细胞的抗体试剂。

优选地，所述明视光染色液包括各种光学效果的染色液和缓冲液。本

发明的有益效果是：

本发明该试剂通过荧光标志物和明视光观测细胞结构相结合，提高了鉴定血液循环肿瘤细胞的精确度，明显减少假阳性检测的发生；通过细胞表面标志物和细胞质标志物富集靶细胞的方法，明显提高了循环肿瘤细胞检测的灵敏度，特别是成功使用多种富集抗体磁珠富集靶细胞，显著提高了肿瘤细胞检测灵敏度，同时，在科研领域和临床试验结果的基础上，以 免疫鉴定角蛋白，白细胞共同抗原CD45，细胞核加上细胞形态染色来达到有效鉴定血液中上皮细胞来源的肿瘤细胞的目的。该试剂产品弥补了市场产品不足之处，是一优化的、标准化的试剂盒，可以配合使用者的目的，配合选择相关的市场产品，达到高的稀有细胞富集，分离提取效率，有效鉴定血液、骨髓、和体液中的上皮来源的肿瘤细胞，准确率高。与一般的细胞鉴定试剂不同之处在，除了有荧光生物标记物指标外，还有明视光染色等细胞形态结构指标作为参考标准，显著地降低了假阳性率，提高了循环肿瘤细胞的鉴定准确率。而且该试剂盒的操作步骤少，简单方便。

附图说明

图1使用荧光和明视光鉴定分析不同细胞形态的循环肿瘤细胞图；

图2使用荧光和明视光鉴定分析不同角蛋白表达水平的循环肿瘤细胞图；

图3使用荧光和明视光鉴定分析鉴别单个循环肿瘤细胞和多个循环肿瘤细胞图；

图4骨髓中的肿瘤细胞的鉴定分析图。

具体实施方式

实施例1

下面结合附图对本发明做进一步的说明。

一种循环肿瘤细胞检测和鉴定试剂盒，试剂盒包括红细胞裂解缓冲液、细胞渗透剂、细胞富集试剂、细胞固定剂、细胞鉴定试剂和缓冲液以及细胞明视光、荧光染色试剂和缓冲液。该循环肿瘤细胞鉴定试剂盒的应用，所述试剂盒可以高灵敏度富集和检测血液循环肿瘤细胞，可以用于荧光标记识别细胞的分子标志物以及明视光识别细胞形态结构的肿瘤细胞。明视光识别细胞形态结构的肿瘤细胞包括稀有细胞富集、分离提取试剂、 红细胞裂解液、细胞渗透缓冲液、细胞固定液、清洗缓冲液、荧光标记识别抗体以及明视光染色液等。稀有细胞富集，分离提取试剂包括特定细胞结合的抗体磁珠、稀释液、封闭液、磁柱以及磁铁装置。红细胞裂解液是裂解样本中的红细胞，而不损伤其他有核细胞的试剂。细胞渗透缓冲液是让细胞膜具有渗透但又不破坏细胞。细胞固定液指的是固定细胞，让细胞膜有裂口，便于后续的染色处理。清洗缓冲液是用于清洗细胞，转换不同的处理试剂，但又不破坏细胞。荧光标记识别抗体包括各种标记的鉴定细胞的抗体试剂。明视光染色液包括各种光学结果染色液和清洗缓冲液。

染色后的细胞图像如图1-4所示。图1是利用本试剂盒检测到的血液中的稀有肿瘤细胞，应用本试剂盒的鉴定方法，从复杂的血液细胞中，有效鉴定上皮细胞来源的肿瘤细胞。除了有荧光标记物角蛋白、血细胞共同抗原和细胞核的荧光鉴定之外，同时明视光的分析显示了完整的、形状不同的细胞结构形态。

图2是利用本试剂盒，有效检测分析到不同角蛋白表达水平的血液循环肿瘤细胞。

图3是利用本试剂盒，有效检测分析单个和多个的血液循环肿瘤细胞。

图4是利用本试剂盒可有效鉴定分析骨髓中的稀有肿瘤细胞(角蛋白阳性，细胞核阳性，血细胞共同抗原阴性)。

实施例2

乳腺癌病人血液中肿瘤细胞的检测和靶细胞鉴定(参照图1至图3)

1.抽取10毫升血液于EDTA采血管中。该样本可以保存在4度下，2天有效。

2.红细胞裂解处理

2.1调节样本体积和红细胞裂解液体积，使最终红细胞裂解液浓度为1倍。

2.2轻度混合样本并室温培养5-10分钟。

2.3加入PBS缓冲液到50毫升，室温下，离心处理700g 10分钟。

2.4小心移走上清液，不丢失收集到试管底部的细胞块。

2.5加入450毫微升的稀释液，轻度处理，使细胞快成为均匀的细胞悬浮液。

3.靶细胞富集 

3.1各加入100毫微升的细胞渗透液，细胞固定液，抗体磁珠，细胞覆盖液。

3.2充分混合后,室温培养45分钟。

3.3加入稀释缓冲液至10毫升,室温下,离心300g 10分钟。

3.4用稀释液，重新悬浮细胞块。

3.5将上述细胞悬浮液加入到放入磁场中的磁柱，并通过磁柱。

3.6用0.5毫升的稀释液洗一次磁柱。

3.7将磁珠离开磁场，使磁柱释放结合的细胞。

4.细胞制片

4.1将获得的细胞通过室温，800rpm,3分钟的离心处理，离心到载玻片上。

4.2除去上清液，在离心1000rpm,1分钟。

4.3室温或37度干燥载玻片1小时。

5.细胞染色，鉴定

5.1用固定液固定上述载玻片10分钟。

5.2室温下，空气干燥载玻片30分钟。

5.3用清洗缓冲液清洗载玻片1次。

5.4除去清洗液，加上荧光标记抗体染色液，染色30-60分钟。

5.5用清洗缓冲液清洗1次。

5.6用明视光染色液，染色处理。

5.7用缓冲液洗净1次。

5.8用DAPI包埋剂封片。

5.9用荧光显微镜观测分析鉴定细胞。

实施例3

乳腺癌病人骨髓中稀有肿瘤细胞的检测和细胞鉴定(参照图4)

1.抽取骨髓液于EDTA采血管中，用70毫微米过滤网过滤破碎的骨片。

2.红细胞裂解处理

2.1调节样本体积和红细胞裂解液体积，使最终红细胞裂解液浓度为1倍。

2.2轻度混合样本并室温培养5-10分钟。

2.3加入PBS缓冲液到50毫升，室温下，离心处理700g 10分钟。

2.4小心移走上清液，不丢失收集到试管底部的细胞块。

2.5加入450毫微升的稀释液，轻度处理，使细胞快成为均匀的细胞悬浮液。

3.靶细胞富集 

3.1各加入100毫微升的细胞渗透液，细胞固定液，抗体磁珠，细胞覆盖液。

3.2充分混合后,室温培养45分钟。

3.3加入稀释缓冲液至10毫升,室温下,离心300g 10分钟。

3.4用稀释液，重新悬浮细胞块。

3.5将上述细胞悬浮液加入到放入磁场中的磁柱，并通过磁柱。

3.6用0.5毫升的稀释液洗一次磁柱。

3.7将磁珠离开磁场，使磁柱释放结合的细胞。

4.细胞制片

4.1将获得的细胞通过室温，800rpm,3分钟的离心处理，离心到载玻片上。

4.2除去上清液，在离心1000rpm,1分钟。

4.2室温或37度干燥载玻片1小时。

5.细胞染色，鉴定

5.1用固定液固定上述载玻片10分钟。

5.2室温下，空气干燥载玻片30分钟。

5.3用清洗缓冲液清洗载玻片1次。

5.4除去清洗液，加上荧光标记抗体染色液，染色30-60分钟。

5.5用清洗缓冲液清洗1次。

5.6用明视光染色液，染色处理。

5.7用缓冲液洗净1次。

5.8用DAPI包埋剂封片。

5.9用荧光显微镜观测分析鉴定细胞。

本发明该试剂可以鉴定血液循环肿瘤细胞并且提高循环肿瘤细胞检测的灵敏度，特别是成功用多种富集抗体磁珠富集靶细胞，显著提高了肿瘤细胞检测灵敏度，同时，在科研领域和临床试验结果的基础上，以免疫鉴定角蛋白，白细胞共同抗原CD45，细胞核加上细胞形态染色来达到，有效鉴定血液中上皮细胞来源的肿瘤细胞的目的。同时弥补市场产品不足之处，是一优化的标准化的试剂盒，可以配合使用者的目的，配合选择相关的市场产品，达到高的稀有细胞富集，分离提取效率，有效鉴定血液和骨髓中的上皮来源的肿瘤细胞，准确率高。与一般的细胞鉴定试剂不同之处在，除了有荧光生物标记物指标外，还有明视光染色等细胞形态结构指标作为参考标准，避免了假阳性，提高了准确率。而且该试剂盒的操作步骤少，简单方便。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种循环肿瘤细胞检测和鉴定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括红细胞裂解缓冲液、细胞渗透剂、细胞富集试剂、细胞固定剂、细胞鉴定试剂和缓冲液以及细胞明视光染色试剂、荧光染色试剂和缓冲液，可对相同样本的细胞同时进行荧光和明视光染色观测。

2.一种权利要求1所述的循环肿瘤细胞检测和鉴定试剂盒的应用，其特征在于，所述试剂盒可以高灵敏度富集和检测血液循环肿瘤细胞或相关靶细胞，可以用于荧光标记识别细胞的分子标志物以及明视光识别细胞形态结构的肿瘤细胞。

3.根据权利要求2所述的循环肿瘤细胞检测和鉴定试剂盒的应用，其特征在于，可利用细胞表面和、或者细胞质的标志物来富集、分离和提取靶细胞，所含组成成分包括稀有细胞富集、分离提取试剂、红细胞裂解液、细胞渗透缓冲液、细胞固定液、清洗缓冲液、荧光标记识别抗体以及明视光染色液等。

4.根据权利要求3所述的循环肿瘤细胞检测和鉴定试剂盒的应用，其特征在于，所述稀有细胞富集，分离提取试剂包括特定细胞结合的抗体磁珠、稀释液、封闭液或称包埋液、磁柱以及磁铁装置。

5.根据权利要求3所述的循环肿瘤细胞检测和鉴定试剂盒的应用，其特征在于，所述红细胞裂解液是裂解样本中的红细胞，而不损伤其他有核细胞的试剂。

6.根据权利要求3所述的循环肿瘤细胞检测和鉴定试剂盒的应用，其特征在于，所述细胞渗透缓冲液处理是让靶细胞膜具有渗透抗体作用但又不破裂细胞。

7.根据权利要求3所述的循环肿瘤细胞检测和鉴定试剂盒的应用，其特征在于，所述细胞固定液指的是固定细胞，让细胞膜有裂缝，便于后续的染色处理。

8.根据权利要求3所述的循环肿瘤细胞检测和鉴定试剂盒的应用，其特征在于，所述清洗缓冲液是用于清洗细胞，转换不同的处理试剂，但又不破裂细胞。

9.根据权利要求3所述的循环肿瘤细胞检测和鉴定试剂盒的应用，其特征在于，所述荧光标记识别抗体包括各种荧光标记了的、用于鉴定细胞的抗体试剂。

10.根据权利要求3所述的循环肿瘤细胞检测和鉴定试剂盒的应用，其特征在于，所述明视光染色液包括各种酸碱度调试好的、具有特定化学特征、不影响荧光染色效果的、具有特定明视光效果的染色液和清洗缓冲液。