CN104830903B - 一种基于多肽k12的转基因载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种多肽K12及由K12修饰的基因载体，所述多肽K12序列为：Lys‑Lys‑Lys‑Arg‑Lys‑Cys‑Gly‑Asn‑Lys‑Arg‑Thr‑Arg。首先选用泊洛沙姆407(P407)连接PEI，得到多分枝状或网状结构的高分子量PEI衍生物，选择tLyP‑1短肽，与核定位信号肽NLS连接，合成具有靶向于NRP和提高核递送能力的多肽K12，利用交联技术将K12与PEI衍生物偶联，构建了新型非病毒基因载体P407‑PEI‑K12。细胞毒性及转染实验结果表明，本发明提供的新型非病毒基因载体系统P407‑PEI‑K12不仅毒性低，且具有更强的靶向性，细胞及体内转染效果均优于对照组。

Description

一种基于多肽K12的转基因载体及其应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体地说，是多肽K12修饰的PEI衍生物P407-PEI转基因载体及其应用。

背景技术

基因治疗是近年来建立在基因工程技术和分子遗传学原理上的新型治疗方法，因肿瘤发生于发展的生物学基础是基因突变，所以基因治疗现已成为功克肿瘤最具希望的领域。基因治疗有三个重要环节，即目的基因、转基因载体和靶细胞。基因倒入系统是基因治疗的核心技术，现阶段面临的最大难题在于尚未找到理想的基因载体。目前应用的载体包括病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体转染效率较高但存在运载能力低、有潜在安全威胁等问题，而非病毒载体近年来发展迅速，尤其是阳离子聚合物。

聚乙烯亚胺(polyethylenimine PEI)是近年来研究最为广泛的阳离子多聚物非病毒基因载体，富含阳离子，具有强大的缓冲能力，有较强结合DNA和黏附细胞的能力。然而，聚乙烯亚胺作为基因载体使用存在两个突出问题：第一、转染效率与细胞毒性存在矛盾。小分子PEI虽细胞毒性低，但在生理的离子浓度下与DNA易发生解离，造成转染效果差；分子量在20kd以上的PEI虽具有较理想的转染率，但由于PEI表面富含阳性电荷以及体内不可降解性，致使高分子量PEI表现出较强的细胞毒性。第二，聚乙烯亚胺靶向性差：它是利用自身所带的正电荷，与细胞表面带负电荷的受体通过静电作用相结合，所以细胞的选择特异性差，解决靶向性问题已成为非病毒载体中最为关注的问题。另外，聚合物/DNA复合物是需要进入到细胞核中，并被RNA解离从而发挥作用。因此，如何提高阳离子复合物在体内靶细胞的细胞核递送能力成为其能否应用于临床的关键之一。泊洛沙姆poloxame是一类由聚氧乙烯(PEO)、聚氧丙烯(PPO)组成的PEO-PPO-PEO型非离子三嵌段共聚物。泊洛沙姆407(简称P407)由约70％乙烯氧化物和30％丙烯氧化物组成，平均分子量11500，是泊洛沙姆系列中研究最为广泛、也是最常用到的一种聚合物。

核定位信号NLS是核内功能蛋白进入细胞核的结构基础，是介导某些蛋白入核的一段充分而必要的信息片段，大分子物质可通过NLS的介导经核孔复合物主动运转至细胞核内，其中研究最多的NLS是来自SV40的T抗原，主要功能序列为KKKRKV。借助NLS可将PEI的复合物由细胞核转运到核内，提高复合物的转染效率。NPR是脑胶质瘤肿瘤细胞膜和新生血管内皮细胞膜上存在的跨膜蛋白，在肿瘤的生物学方面起着十分关键的作用，目前已证实NRP受体在胰腺癌、胃癌、结肠癌、黑色素瘤、卵巢癌等细胞上均存在高表达，可作为恶性肿瘤的标志之一。tLyP-1是新发现的靶向多肽，氨基酸序列为CGNKRTR，能特异性的靶向并与NRPs受体高效结合，同时能产生跨血管渗透和肿瘤穿膜作用，对NPR受体有特异性和高亲和性。研究显示tLyP-1能选择性的归巢与肿瘤靶位，高效的从血管内渗到血管外，均匀性地浸润到肿瘤间质内，并能穿过肿瘤细胞的细胞膜进入核细胞内。

因此，理论上可将tLyP-1(序列为CGNKRTR)引入NLS序列(KKKRK)，合成含tLyP-1、NLS的多肽tLyP-1-1-NLS(序列为KKKRKCGNKRTR，命名为K12)，用于修饰P407-PEI衍生物，增强其在体内对肿瘤细胞选择性，并提高核递送能力，从而增加DNA的体内转染效率。

中国专利文献CN201110372844.5，公开了一种双功能肽修饰的基因载体及其制备方法和应用，该发明的基因载体是由双功能肽(RGDCTAT)和普朗尼克P123修饰的聚乙烯亚胺衍生物偶联而成的。中国专利文献CN201410766122.1公开了一种由功能肽R11修饰的基因载体及其制备方法和应用，该发明的基因载体是由双功能肽(RGDCNLS)和普郎尼克P123修饰的聚乙烯亚胺衍生物偶联而成。但是关于多肽tLyP-1-NLS修饰的泊洛沙姆407-聚乙烯亚胺，目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种多肽。

本发明的再一的目的是，提供一种基因载体。

本发明的另一的目的是，提供上述基因载体的制备方法。

本发明的第四个目的是，提供一种基因复合物。

本发明的第五个目的是，提供上述多肽及基因载体的用途。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

一种多肽，所述的多肽氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供的多肽由核定位信号肽NLS(KKKRK)与具有靶向于NRP跨膜蛋白受体的tLyP-1组成，多肽序列为KKKRKCGNKRTR。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

一种基因载体，它是由如上所述的多肽和聚乙烯亚胺衍生物偶联而成，所述的聚乙烯亚胺衍生物是泊洛沙姆407修饰的聚乙烯亚胺即P407-聚乙烯亚胺，所述的泊洛沙姆407与聚乙烯亚胺的摩尔比为1:1-20；所述的聚乙烯亚胺的分子量范围为600-70000Da。

所述的泊洛沙姆407与聚乙烯亚胺摩尔比为1:1-10。

所述的泊洛沙姆407与聚乙烯亚胺摩尔比为1:10。

所述的多肽与聚乙烯亚胺衍生物的摩尔比为1-20:1；优选为2:1。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

如上任一所述的基因载体的制备方法，包括如下步骤：

(a)合成如上所述的多肽；

(b)泊洛沙姆407除水后，加入两倍摩尔量的三光气，磁力搅拌反应后加入N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌条件下逐滴加入无水三乙胺，待反应完全后除去溶剂，所得残渣溶于乙酸乙酯，离心取上清液，旋蒸除去乙酸乙酯，冷却固化后得活化的泊洛沙姆407；

(c)活化的泊洛沙姆407与聚乙烯亚胺PEI分别溶于无水二氯甲烷，将所得的两液同时加入无水二氯甲烷底液中，充氮气饱和后磁力搅拌过夜，透析，冻干，得P407-PEI；

(d)将表面活性剂溶解于二甲基亚砜溶液中，步骤(a)所制备的多肽和步骤(c)所制备的P407-PEI分别溶解于PBS溶液，将表面活性剂溶液加入到P407-PEI液中得到马来酰亚胺化的P407-PEI液，将制备好的多肽溶液加入到马来酰亚胺化的P407-PEI液中，4℃摇动反应过夜，离心冻干，既得。

所述的表面活性剂为SMCC，是一类含有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯和马来酰亚胺的双功能偶联剂。

本发明首先选用泊洛沙姆407连接PEI，得到多分枝状或网状结构的高分子量PEI衍生物，然后利用跨膜蛋白受体NRP在人肿瘤细胞和肿瘤新生血管高表达的特点，选择特异亲和该受体的tLyP-1短肽，与核定位信号肽NLS连接，合成具有靶向于NRP和提高核递送能力的多肽K12，利用交联技术将K12与PEI衍生物偶联，从而构建新型非病毒基因载体系统P407-PEI-K12。

为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：

如上任一所述的基因载体与DNA形成的复合物。

所述的DNA含报告基因、抗癌基因和/或细胞因子基因。

为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是：

如上所述的多肽以及基因载体在制备基因治疗的药物中的应用。

本发明优点在于：

本发明首先选用泊洛沙姆407连接PEI，得到多分枝状或网状结构的高分子量PEI衍生物，然后利用跨膜蛋白受体NRP在人肿瘤细胞和肿瘤新生血管高表达的特点，选择特异亲和该受体的tLyP-1短肽，与核定位信号肽NLS连接，合成具有靶向于NRP和提高核递送能力的多肽K12，利用交联技术将K12与PEI衍生物偶联，从而构建新型非病毒基因载体系统P407-PEI-K12。细胞毒性及转染实验结果表明，本发明提供的新型非病毒基因载体系统P407-PEI-K12不仅毒性低，且具有更强的靶向性，细胞及体内转染效果均优于对照组。

附图说明

附图1是P407-PEI-K12细胞毒性实验结果。其中，左起第一簇的3根柱子从左至右分别代表P123-PEI-K12、PEI 2KDa、PEI 25KDa。

附图2是P407-PEI-K12体外转染实验结果。其中，左起第一簇的3根柱子从左至右分别代表P123-PEI-K12、PEI 25KDa、PEI 2KDa。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明，但本发明的实施例不仅限于此。

本文中，SMCC是一类含有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯和马来酰亚胺的双功能偶联剂，可以将分别含有巯基和氨基的化合物键接在一起，其分子结构为如下。

实施例1多肽K12修饰的P407-PEI的制备和功能验证(一)

1、P407-PEI的制备

称取适量除水后的泊洛沙姆407(P407，0.6mmol)，溶于无水甲苯和无水二氯甲烷的混合溶液中，加入1.2mmol的三光气，室温下磁力搅拌反应过夜。真空旋蒸除去溶剂，再用适量无水甲苯和无水二氯甲烷溶解，然后加入2.0mmol N-羟基琥珀酰亚胺，磁力搅拌下，将2.0mmol无水三乙胺逐滴加入反应液中，继续搅拌反应约4h。待反应完全后，将反应液过滤并再次真空旋蒸除去溶剂，所得残渣溶解于乙酸乙酯中，高速离心后取上清液，旋转蒸发，挥去乙酸乙酯，冷却固化反应物，既得活化后的P407。PEI 2K(0.20g，0.10mmol)除水后溶于10mL无水二氯甲烷中，活化后的P407(0.01mmol)溶于无水二氯甲烷中，同时将上述两液缓慢的滴入10mL无水二氯甲烷底液中，氮气饱和后室温磁力搅拌过夜，透析，冻干，得P407-PEI。

2、多肽K12的合成Lys Lys-Lys-Arg-Lys-Cys-Gly-Asn-Lys-Arg-Thr-Arg

根据tLyP-1的氨基酸序列：Cys-Gly-Asn-Lys-Arg-Thr-Arg，NLS的氨基酸序列：Lys-Lys-Lys-Arg-Lys，由上海吉尔生化有限公司采用固相法合成多肽tLyP-1-NLS，其氨基酸序列为:Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Cys-Gly-Asn-Lys-Arg-Thr-Arg(SEQ ID NO.1)并命名为K12。

3、多肽K12对P407-PEI的修饰

SMCC溶解于DMSO溶液中，NLS-tLyP-1(多肽K12)与P407-PEI分别溶解于PBS溶液中，将SMCC液按摩尔比2:1逐滴加入PEI液中，边加边搅拌，在室温下反应30mim，通过凝胶色谱柱除去未结合的SMCC，即得马来酰亚胺化的P407-PEI液(maleimided P407-PEI)。将K12液按摩尔比2:1加入maleimided P407-PEI液中，4℃摇动反应过夜。然后用超滤离心管离心，冻干，即得P407-PEI-K12。

4、P407-PEI-K12的细胞毒性试验

将B16细胞接种于96孔板上，培养48h，使细胞汇合度达到70％-80％。试验前，吸去培养基，每孔加入不同浓度阳离子聚合物(4，6，8，16，24，32μg/mL，无血清1640作为溶剂)，继续培养72h，MTT法检测细胞毒性，从图1可看出，未修饰的PEI 25K细胞毒性较强，而P407-PEI-K12几乎无毒，保证了P407-PEI-K12作为基因载体的可行性。

表1 细胞毒性试验结果

5、P407-PEI-K12的体外转染实验

将B16细胞接种于24孔板上，培养48h，使细胞汇合度达到70％-80％。将P407-PEI-K12与虫荧光素酶报告基因按质量比5:1、10:1、20:1和30:1制成复合物，加入24孔板上，培养4h，替换含血清培养基继续培养48h，检测虫荧光素酶表达，从图2可看出，P407-PEI-K12显示了很强转染效率，远远高于对照组PEI 2K，也比PEI 25K的最佳表达高1000倍，说明P407-PEI-K12可以很好的靶向于细胞进行转染。

表2 体外转染实验结果

6、P407-PEI-K12的体内转染实验

选择ICR实验鼠建立B16小鼠黑色素瘤移植模型，并将实验动物分为2组：P407-PEI-K12，w/w＝30；P123-PEI-R11(由多肽R11与普郎尼克P123-聚乙烯亚胺偶联而成，合成方法参见专利201410766122.1)，w/w＝30。以质粒PGL3-Control(购于Promega)为报告基因，评价静脉给药24h后小鼠心、肝、脾、肺、肾等器官荧光素酶表达情况。其中，w/w＝30表示阳离子聚合物与虫荧光素酶报告基因的质量比为30，结果如表3所示。从表3可以看出，P407-PEI-K12显示了很强的转染效率，荧光素酶的表达强度远远高于对照组P123-PEI-R11，在心、肝、脾、肺、肾处分别是P123-PEI-R11表达强度的15倍。

表3 体内转染效率实验结果

实施例2多肽K12修饰的P407-PEI的制备和功能验证(二)

P407-PEI-K12的制备及体外转染实验步骤同实施例1，不同之处在于：本实施例中PEI分子量为70KDa，制备P407-PEI时所用的P407与PEI摩尔比为1:1，合成P407-PEI-K12时所用的多肽K12与P407-PEI的摩尔比为5:1。体内转染实验结果表明：P407-PEI-K12荧光霉素的表达强度远远高于P123-PEI-R11，在心、肝、脾、肺、肾处分别是P123-PEI-R11表达强度的12、13、12、11、11倍。

实施例3多肽K12修饰的P407-PEI的制备和功能验证(三)

P407-PEI-K12的制备及体外转染实验步骤同实施例1，不同之处在于：本实施例中PEI分子量为4KDa，制备P407-PEI时所用的P407与PEI摩尔比为1:5，合成P407-PEI-K12时所用的多肽K12与P407-PEI的摩尔比为1:1。体内转染实验结果表明：P407-PEI-K12荧光霉素的表达强度远远高于P123-PEI-R11，在心、肝、脾、肺、肾处分别是P123-PEI-R11表达强度的13、14、11、12、12倍。

实施例4多肽K12修饰的P407-PEI的制备和功能验证(四)

P407-PEI-K12的制备及体外转染实验步骤同实施例1，不同之处在于：本实施例中PEI分子量为600Da，制备P407-PEI时所用的P407与PEI摩尔比为1:20，合成P407-PEI-K12时所用的多肽K12与P407-PEI的摩尔比为20:1。体内转染实验结果表明：P407-PEI-K12荧光霉素的表达强度远远高于P123-PEI-R11，在心、肝、脾、肺、肾处分别是P123-PEI-R11表达强度的10、11、13、11、12倍。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种基因载体，其特征在于，它是由多肽和聚乙烯亚胺衍生物偶联而成，所述的聚乙烯亚胺衍生物是泊洛沙姆407修饰的聚乙烯亚胺即P407-聚乙烯亚胺，所述的泊洛沙姆407与聚乙烯亚胺的摩尔比为1:10；所述的聚乙烯亚胺的分子量为2KDa，所述多肽氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的多肽与聚乙烯亚胺衍生物的摩尔比为2:1。

2.权利要求1所述的基因载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(a)合成如权利要求1所述的多肽；

(b)泊洛沙姆407除水后，加入两倍摩尔量的三光气，磁力搅拌反应后加入N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌条件下逐滴加入无水三乙胺，待反应完全后除去溶剂，所得残渣溶于乙酸乙酯，离心取上清液，旋蒸除去乙酸乙酯，冷却固化后得活化的泊洛沙姆407；

(c)活化的泊洛沙姆407与聚乙烯亚胺PEI分别溶于无水二氯甲烷，将所得的两液同时加入无水二氯甲烷底液中，充氮气饱和后磁力搅拌过夜，透析，冻干，得P407-PEI；

(d)将表面活性剂溶解于二甲基亚砜溶液中，步骤(a)所制备的多肽和步骤(c)所制备的P407-PEI分别溶解于PBS溶液，将表面活性剂溶液加入到P407-PEI液中得到马来酰亚胺化的P407-PEI液，将制备好的多肽溶液加入到马来酰亚胺化的P407-PEI液中，4℃摇动反应过夜，离心冻干，即得。

3.权利要求1所述的基因载体与DNA形成的复合物。

4.根据权利要求3所述的复合物，其特征在于，所述的DNA含报告基因、抗癌基因和/或细胞因子基因。

5.权利要求1所述的基因载体在制备基因治疗的药物中的应用。