CN104839099B - 一种杂交、回交改良家蚕抗血液型脓病的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用杂交、回交改良家蚕抗血液型脓病的方法，采用通过抗血液型脓病家蚕品系与常规优良品种杂交、回交和自交三种方式组成的充血循环，逐步把现行优良家蚕品种的基因导入到抗血液型脓病的蚕种质中，同时采用蛾区半分法添食BmNPV病毒液的选择手段，在保持抗BmNPV主效基因不丢失的情况下，提高其经济性状，以达到现行生产用种的需求。然后再用改良的抗血液型脓病蚕品系与对应的现行优良品种杂交，生产一代杂交种。这种方法生产的一代杂交种，对血液型脓病具有高度的抵抗性，同时经济性状优良，在全国蚕区的农村推广应用，深受蚕农欢迎。

Description

一种杂交、回交改良家蚕抗血液型脓病的方法

技术领域

本发明涉及一种杂交、回交改良家蚕抗血液型脓病的方法。

背景技术

家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus，BmNPV)是危害家蚕的主要病毒，由其引发的血液型脓病位居家蚕病毒病的首位。据江苏、四川、浙江、广西等几大蚕区的调查，脓病对养蚕业的损失占蚕病总损失的50％以上，有的地方高达80％，甚至出现颗粒无收的严峻局面，严重挫伤了蚕农的积极性，阻碍了蚕桑事业的发展。针对这种现象，中、日、法等国家的蚕业科学工作者从不同角度研究BmNPV，并开展了家蚕抗BmNPV育种研究，取得了一些进展，但是这些抗病品种的实用化水平还不够，不能在生产中发挥有效的作用。江苏科技大学“中国农业科学院国家蚕种质资源保存中心”进行家蚕种质资源抗病毒筛选时，发现一个家蚕种质对BmNPV的抗病力很强，遗传分析表明其抗病性是受显性主效基因控制，但是经济现状很差，远不如我国现行蚕品种，在生产中无直接利用价值，必须对该种质进行育种改良。

发明内容

发明目的：为了克服现有家蚕实用品种抗脓病能力的不足，本发明提供一种杂交、回交改良家蚕抗血液型脓病的方法，育成的蚕品种具有对BmNPV高度抵抗性。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明的一种杂交、回交改良家蚕抗血液型脓病的方法，

1)开展家蚕种质资源的抗BmNPV调查，具体方法是：

a)将保存的不同品种蚕卵正常催青，混合蚁量收蚁，每品种收0.4g蚁量，新鲜桑叶饲养至1龄眠；待2龄起蚕时，每品种数50头×9区，置于培养皿中，待用。

b)设定5级病毒浓度梯度及一个空白对照，各级浓度梯度的倍数一般为10倍，依次向下逐级稀释；添食NPV病毒的最高浓度为1.85×10⁹PIB/ml，以10倍向下逐级稀释，最低浓度为1.85×10⁵PIB/ml，共5级浓度；每个浓度设3个重复，每个重复区50头蚕。

c)选取同品种、同叶质的桑叶，打成直径为3厘米的小圆片桑叶(避免打到大叶脉、虫眼和折叠的桑叶，保证每片叶子面积相等)。

d)用移液枪吸取0.1ml的病毒液均匀地涂抹于圆形叶片上，每区蚕喂5片添毒叶；

e)待蚕完全吃完添毒叶后再改用普通桑叶饲养，正常的眠起处理。

f)每天早上8点、下午2点观察记录蚕的生长发育情况，一旦出现病蚕要及时挑出，以免发生交叉感染。

g)用spss v16.0处理统计数据，得到每个试验品种的LC50。获得1个蚕资源(命名为R)的抗BmNPV能力非常强，其2龄起蚕对BmNPV的半致死浓度(LC50)达10⁹PIB/ml，为普通家蚕的1000倍以上；

2)对该种质R的抗BmNPV性能进行遗传分析，结果表明其抗BmNPV性能由1个显性基因控制，但是该种质的其它经济性状很差；

3)将含有抗血液型脓病基因的R雌蚕与常规优良品种的雄蚕杂交，产生F1代；

4)混合饲养F1代，将F1代的雌蚕再与常规优良品种的雄蚕回交，产生BC1代；

5)混合饲养BC1代，在收蚁时就用1×10⁷PIB/ml的BmNPV病毒液筛选，非抗个体死亡，抗病个体存活；选择BC1中经济性状优良的抗病雌蛾个体回交常规优良品种的雄蛾，产生BC2代；

6以BC2代为新的抗脓病品种的起点，重复上述步骤5)，进行连续回交和抗病性选择，以保证在留种继代过程中把现行品种的优良经济性状基因导入抗脓病品种的同时又不丢失抗病基因；

7)经过4次回交后，抗病品种的经济性状得到了极大的提高，此时抗病基因是杂合状态，然后按照显性单基因纯合固定方法进行抗病主效基因的纯合，选出抗病基因纯合小系(蛾区)；具体方法是：对回交4次的后代(设为B1)，采用自交的方法生产超过20个单蛾继代，即为B2代，然后所有20个蛾区均采用蛾区半分法单蛾收蚁，蚁蚕就添食1×10⁷PIB/ml的BmNPV病毒液，具体添毒方法如c)、d)、e)，观察各蛾区的蚕体发育情况；如果哪个蛾区有死亡个体，则淘汰该蛾区，如果该蛾区没有死亡个体，则保留该蛾区，且同蛾区内雌雄自交留种，至少生产10个单蛾继代，即为B3代；B3代每个蛾区再采用蛾区半分法单蛾收蚁，蚁蚕添毒，具体添毒方法如c)、d)、e)，观察各蛾区的蚕体发育情况；如果某个蛾区内有死亡个体则淘汰该蛾区，如果某个蛾区中所有个体均能存活，表明该蛾区的抗病基因是纯合的，蛾区内所有蚁蚕均能抵抗BmNPV而健康成长，此蛾区就是抗病纯合小系；一般在B4代能够获得纯合小系。

8)以抗病基因纯合小系为起点，进一步提高经济性状，完成家蚕抗病品种的改良。

有益效果：本发明相对于现有技术而言具有以下优点：

由于抗病品种的经济效益已经达到现行实用品种的水平，而且抗病基因是显性纯合的，与其它品种杂交后的杂交一代都能保持对血液型脓病的高度抵抗性，本发明通过特有的方法将不稳定的抗BmNPV性能种质R进行筛选以及通过特有的杂交方法制备出最后性能稳定的抗血液型脓病蚕虫，操作简单，选育改良的规模较小，经济性状提高很快。由该方法育成的抗血液型脓病品种制成的一代杂交种已在农村推广应用，深受蚕农欢迎。

附图说明

图1是杂交、回交改良抗BmNPV家蚕种质示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

1、抗病脓病家蚕种质的筛选

a)正常催青不同品种的蚕卵，转青后混合蚁量收蚁，每品种收0.3～0.4g，新鲜桑叶饲养至1龄眠；待2龄起蚕时，按50头为一个实验区置于培养皿中，根据需要设置一定区数，待用。

b)一般抗病品种添食BmNPV的最高浓度为10⁹PIB/ml(而非抗病品种添食BmNPV的最高浓度为10⁸PIB/ml)，以6倍向下逐级稀释，最低浓度为10⁶PIB/ml(非抗病品种最低浓度为10⁵PIB/ml)，共5级浓度，每个浓度设3个重复。

c)选取同品种、同叶质的桑叶，打成直径为3厘米的小圆片桑叶(避免打到大叶脉、虫眼和折叠的桑叶，保证每片叶子面积相等)。

d)用移液枪吸取0.1ml的病毒液均匀地涂抹于圆形叶片上，每区蚕喂5片添毒叶；

e)待蚕完全吃完添毒叶后再改用普通桑叶饲养，正常的眠起处理。

f)每天早上8点、下午2点观察记录蚕的生长发育情况，一旦出现病蚕要及时挑出，以免发生交叉感染。

g)用spss v16.0处理统计数据，得到每个试验品种的LC50，获得1个蚕资源(命名为R)，其2龄起蚕对BmNPV的LC50达10⁹PIB/ml。

筛选以后对其按以下方法实现杂交：

1)对该种质R的抗BmNPV性能进行遗传分析，结果表明其抗BmNPV性能由1个显性基因控制，但是该种质的其它经济性状很差；

2)将含有抗血液型脓病基因的R雌蚕与常规优良品种的雄蚕杂交，产生F1代；

3)混合饲养F1代，将F1代的雌蚕再与常规优良品种的雄蚕回交，产生BC1代；

4)混合饲养BC1代，在收蚁时就用1×10⁷PIB/ml的BmNPV病毒液筛选，非抗个体死亡，抗病个体存活；选择BC1中经济性状优良的抗病雌蛾个体回交常规优良品种的雄蛾，产生BC2代；

5)以BC2代为新的抗脓病品种的起点，重复上述步骤4)，进行连续回交和抗病性选择，以保证在留种继代过程中把现行品种的优良经济性状基因导入抗脓病品种的同时又不丢失抗病基因；

6)经过4次回交后，抗病品种的经济性状得到了极大的提高，此时抗病基因是杂合状态，然后按照显性单基因纯合固定方法进行抗病主效基因的纯合，选出抗病基因纯合小系(蛾区)；具体方法是：对回交4次的后代(设为B1)，采用自交的方法生产超过20个单蛾继代，即为B2代，然后所有20个蛾区均采用蛾区半分法单蛾收蚁，蚁蚕就添食1×10⁷PIB/ml的BmNPV病毒液，具体添毒方法如c)、d)、e)，观察各蛾区的蚕体发育情况；如果哪个蛾区有死亡个体，则淘汰该蛾区，如果该蛾区没有死亡个体，则保留该蛾区，且同蛾区内雌雄自交留种，至少生产10个单蛾继代，即为B3代；B3代每个蛾区再采用蛾区半分法单蛾收蚁，蚁蚕添毒，具体添毒方法如c)、d)、e)，观察各蛾区的蚕体发育情况；如果某个蛾区内有死亡个体则淘汰该蛾区，如果某个蛾区中所有个体均能存活，表明该蛾区的抗病基因是纯合的，蛾区内所有蚁蚕均能抵抗BmNPV而健康成长，此蛾区就是抗病纯合小系；一般在B4代能够获得纯合小系。

7)以抗病基因纯合小系为起点，进一步提高经济性状，完成家蚕抗病品种的改良。

2、抗病系蚕种质的遗传分析模型

将抗病系蚕种质(设为R)与敏感系蚕种质(设为S)，配置成下列F1、F2、BC1等，然后采用定量添食法，对所有群体用BmNPV病毒液进行筛选，得到各群体对BmNPV的抵抗性(用半致死浓度取对数值表示)，如表1：

表1抗病种质及其杂交、回交后代对BmNPV的抵抗性分析

根据以上实验值及其前人研究的结果，可以推断该抗病家蚕种质R对BmNPV的抗病性受常染色体上一对显性基因控制，假设该基因为A，则该抗病种质R的基因型为AA；敏感系种质S的基因型则为aa，杂交一代的基因型为Aa。

3、回交方法改良抗BmNPV家蚕的经济性状

3.1改良方法

用抗病系种质R的雌与现行品种的雄杂交，然后再用现行品种的雄连续回交3代，这样回交后代群体中现行品种的遗传成分占90％以上。假设现行品种为M，其杂交、回交示意图如图1所示。

每个回交世代(基因型为Aa、aa)均用1×10⁷PIB/ml的BmNPV病毒液进行筛选，所有基因型为aa的个体均死亡，而基因型为Aa的个体则存活，选择经济性状好的个体留种继代；从B1(基因型为Aa)世代开始，进行耐病基因纯合固定，经过初检、复检、鉴定纯合固定耐病基因。至B4世代，经检测并验证确定，检出耐病基因纯合小系，此时纯合小系的基因型为AA。之后进行经济性状提高，强化茧质、丝质性状，增加饲养蛾区和留种蛾区，扩大选择范围，在蛾区选择的基础上进行个体选择。及至目标经济性状稳定，育成的耐病品系表现出对BmNPV的高度抵抗性，且茧、丝质均达到现行品种水平。

3.2生物实例

如前所述用抗病种质R对现行生产用家蚕品种“871”(871、872是中国农业科学院蚕业研究所在“九五”期间育成的春秋兼用蚕品种，现在四川、云南、山东、山西等大面积推广，为西南地区推广量最多的春秋兼用品种。)作了4次充血改良后，接着进行自交选择，在自交选择的时候采用蛾区办分法单蛾区收蚁，且蚁蚕就添食病毒液的办法，选择抗性不分离的蛾区留种，再在留种蛾区内进行个体选择，提高原种的茧丝性状。经4代自交选择后，形成经济性状稳定且达到实用化水平的抗病新品种，取名871R。2009年春起，用871R与现行生产用家蚕品种“872”配制成杂交组合，其养蚕、缫丝成绩见表2，从表2可见新杂交组合“871R×872”的结果与原杂交组合“871×872”的结果相当，各项指标互有高低，已经达到实用化水平。

表2新种质871R的饲养结果(实验室)

2009年秋，对新种质871R及其杂交组合进行抗病性检测，检测结果见表3，由表3可见，不管是原种871R或者一代杂交种871R×872的抗病性均已达到或超过原抗病种质R的抗病性，对BmNPV具有高度抵抗性，满足了生产需求。

表3新种质871R的抗病性检测(实验室)

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种用杂交、回交改良抗BmNPV家蚕种质的方法，其特征在于：

1)开展家蚕种质资源的抗BmNPV调查，获得抗BmNPV能力非常强的蚕资源的种质R；

2)用抗BmNPV的家蚕种质R的雌蚕与常规优良品种的雄蚕杂交，产生F1代；

3)混合饲养F1代，选择经济性状优良的F1代个体的雌蚕再与常规品种杂交，产生BC1代，完成一个回交充血循环；

4)BC1代混合收蚁，蚁蚕经口添食BmNPV病毒液，感病个体死亡，抗病个体存活；选择经济性状优良的BC1抗病个体的雌蚕再与常规品种杂交，产生BC2；

5)以BC2为起点，重复上述步骤4) ，进行连续改良，以保证现行品种的优良经济性状导入抗病种质的同时不丢失抗病基因；

6)连续回交4次后经添食BmNPV病毒液留下的个体设为B1代，将B1自交产生B2代，B2代产生至少20个单蛾；

7)B2代所有蛾区采用蛾区半分法收蚁，即所有蛾区一分为二取半蛾单独饲养，蚁蚕用BmNPV病毒液筛选，发生死亡的蛾区一律淘汰，个体全部存活的蛾区取同蛾区内的雌雄自交制种，产生B3代，每蛾区至少留10个单蛾；

8)B3代继续采用步骤7)所示方法，对每1个蛾区进行抗BmNPV筛选，留下每个个体都抗病的蛾区，此时蛾区所有个体的抗病基因纯合，设立抗病基因纯合的抗病小系，其它有死亡个体的蛾区则全部淘汰；

9)基因纯合的抗病小系再经过经济性状的选择，择优留种；与相应的常规优良品种对交种进行杂交，生产的一代杂交种携带杂合抗病基因，对血液型脓病具有高度抵抗性；

所述种质R的筛选步骤为：

a)将保存的不同品种蚕卵正常催青，混合蚁量收蚁，每品种收0.4g蚁量，新鲜桑叶饲养至1龄眠；待2龄起蚕时，每品种数50头×9区，置于培养皿中，待用；

b)设定5级病毒浓度梯度及一个空白对照，各级浓度梯度的倍数一般为10倍，依次向下逐级稀释；添食NPV病毒的最高浓度为1.85×10⁹PIB/ml，以10倍向下逐级稀释，最低浓度为1.85×10⁵PIB/ml，共5级浓度；每个浓度设3个重复，每个重复区50头蚕；

c)选取同品种、同叶质的桑叶，打成直径为3厘米的小圆片桑叶；

d)用移液枪吸取0.1ml的病毒液均匀地涂抹于圆形叶片上，每区蚕喂5片添毒叶；

e)待蚕完全吃完添毒叶后再改用普通桑叶饲养，正常的眠起处理；

f)每天早上8点、下午2点观察记录蚕的生长发育情况，一旦出现病蚕要及时挑出，以免发生交叉感染；

g)用spss v16.0处理统计数据，得到每个试验品种的LC50，获得BmNPV的半致死浓度(LC50)达10⁹PIB/ml，为普通家蚕的1000倍以上即为种质R。

2.根据权利要求1所述的杂交、回交改良抗BmNPV家蚕种质的方法，其特征在于：对种质R的抗BmNPV性能进行遗传分析，抗BmNPV性能由1个显性基因控制。

3.根据权利要求1所述的杂交、回交改良抗BmNPV家蚕种质的方法，其特征在于：所述BmNPV病毒液浓度为1×10⁷PIB/ml。