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CN104837987B - 人脐带组织来源的细胞的检测 - Google Patents

人脐带组织来源的细胞的检测 Download PDF

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CN104837987B CN201280070479.5A CN201280070479A CN104837987B CN 104837987 B CN104837987 B CN 104837987B CN 201280070479 A CN201280070479 A CN 201280070479A CN 104837987 B CN104837987 B CN 104837987B
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Abstract

本发明涉及用于检测血液中的同种异体治疗细胞（例如人脐带组织来源的细胞（hUTC））的方法。该方法包括以下步骤：鉴定对于同种异体治疗细胞（例如hUTC）阳性的一种或多种标志物和对于人外周血单核细胞（PBMC）阳性的一种或多种标志物；提供来自已用同种异体治疗细胞（例如hUTC）治疗的患者的血液样本，使用测定方法来分析样本，以检测对于PBMC阳性的一种或多种标志物和对于同种异体治疗细胞（例如hUTC）阳性的一种或多种标志物；以及区别PBMC和对于同种异体治疗细胞（例如hUTC）阳性的一种或多种标志物。在一个实施例中，细胞是hUTC，并且对于hUTC阳性的标志物包括CD10和/或CD13，且对于PBMC阳性的一种或多种标志物包括CD45。

Description

人脐带组织来源的细胞的检测
相关申请的交叉引用
本申请要求美国临时申请61/579,710(提交于2011年12月23日)的优先权，所述美国临时申请以引用的方式全文并入。
技术领域
本发明涉及在来自用治疗细胞治疗的患者的样本中，检测同种异体治疗细胞例如人脐带组织来源的细胞的方法。
背景技术
同种异体细胞疗法是有希望的用于治疗许多未满足的医学需要的新技术。然而，细胞疗法是独特产品，并且对开发过程提出一些独特挑战。这种技术的一个具体实例是用于许多临床适应症的人脐带组织来源的细胞(“hUTC”)的开发。在hUTC施用于受试者后，测量在受试者的血液中检测到的细胞的存在和/或数目是与hUTC作为细胞治疗产品的药代动力学有关的期望信息。然而，这提出挑战，因为hUTC可具有类似于由受试者的血液收集的细胞的特征。因此，需要区别hUTC与其他细胞。
在药物开发过程中的临床研究包括药代动力学，以检查药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄参数。药代动力学研究的重要元素是测定药物在受试者中的暴露水平。通常，这通过分析来自血液样本的药物水平来完成；暴露水平相对于功效和安全结果进行评估。在细胞治疗产品例如hUTC的情况下，在临床试验中研究hUTC的生物分布或药代动力学呈现了挑战，因为不存在区别hUTC(或其他细胞产品)与受试者自身的细胞的确定方法。因此，难以测定hUTC的生物利用度。
目前公认的用于测定同种异体治疗细胞(例如hUTC)是否存在于循环中的方法需要使用来自男性供体的同种异体治疗细胞(例如hUTC)并且静脉内输液到女性受试者内。参见例如Bader P.等人，“How and when should we monitor chimerism after allogeneicstem cell transplantation？”Bone Marrow Transplantation，2005；35:107-119；还参见Durnam,DM等人，“Analysis of the origin of marrow cells in bone marrowtransplant recipients using a Y-chromosome-specific in situ hybridizationassay”，Blood，1989；74:2220-2226。实时PCR用于检测受试者的血液样本中的Y染色体，并且结果提供了指示血液样本中同种异体治疗细胞(例如hUTC)的存在或不存在的相对定量或二元信号。参见Bader P.等人。这种方法必须将女性细胞(例如hUTC)供体和男性受试者排除关于临床研究中的hUTC药代动力学的分析。因此，存在在细胞施用后用于检测患者中的同种异体细胞例如UTC的方法的需要。
发明内容
本发明提供了检测人外周血单核细胞的样本中的同种异体治疗细胞的存在。本发明允许检测此类治疗细胞而不受治疗细胞核型(XY相对于XX)和接受者(患者)性别约束。
本发明的一个实施例是检测血液中的同种异体治疗细胞的方法，所述方法包括：(a)测定同种异体治疗细胞和人外周血单核细胞，以鉴定对于同种异体治疗细胞阳性的一种或多种标志物和对于患者外周血单核细胞阳性的一种或多种标志物；(b)提供来自已用同种异体治疗细胞治疗的患者的血液样本；(c)使用测定方法来分析样本，以检测对于患者外周血单核细胞阳性的一种或多种标志物和对于同种异体治疗细胞阳性的一种或多种标志物；以及(d)基于对于患者外周血单核细胞阳性的一种或多种标志物和对于同种异体治疗细胞阳性的一种或多种标志物的检测，区别患者外周血单核细胞和同种异体治疗细胞。在一个实施例中，关于患者外周血单核细胞的一种或多种阳性标志物包括CD45。作为另外一种选择，用于检测血液中的同种异体治疗细胞的方法包括：(a)测定同种异体治疗细胞和人外周血单核细胞，以鉴定对于同种异体治疗细胞阳性的一种或多种标志物和对于患者外周血单核细胞阳性的一种或多种标志物；(b)比较对于同种异体治疗细胞阳性的一种或多种标志物和对于患者外周血单核细胞阳性的一种或多种标志物，以鉴定区别同种异体治疗细胞与患者外周血单核细胞的一种或多种独特标志物；(c)提供来自已用同种异体治疗细胞治疗的患者的血液样本；(d)使用测定方法来分析样本，以检测对于同种异体治疗细胞阳性的一种或多种独特标志物；以及(e)基于一种或多种独特标志物的检测，区别患者外周血单核细胞和同种异体治疗细胞。
该方法可适合于检测任何目的同种异体治疗细胞。例如，同种异体治疗细胞可选自人脐带组织来源的细胞、人脐带血来源的细胞、胎盘来源的细胞、间充质干细胞来源的细胞、肝细胞、胰岛细胞、心肌细胞和不溶性胶原骨基质细胞。该方法还可用于检测血液样本中的两种或更多种不同类型的同种异体治疗细胞。
多种不同的测定方法可用于这些方法例如流式细胞术、ELISA、免疫组织化学、核酸检测、PCR、以及它们的组合。另外，该方法可包括在步骤(a)和(b)之间的富集步骤。富集步骤可包括磁性捕获技术。区别步骤包括区分施用于患者的同种异体治疗细胞和来自患者的外周血单核细胞。患者可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、犬或猪。
本发明还提供了试剂盒，所述试剂盒可用于检测血液样本中的同种异体治疗细胞的方法中。该试剂盒可包含具有对于同种异体治疗细胞阳性的一种或多种标志物和对于患者外周血单核细胞阳性的一种或多种标志物的标志物谱。
本发明的另一个实施例是检测血液中的人脐带组织来源的细胞的方法，所述方法包括：(a)测定人脐带组织来源的细胞和人外周血单核细胞，以鉴定对于人脐带组织来源的细胞阳性的一种或多种标志物和对于人外周血单核细胞阳性的一种或多种标志物；(b)提供来自已用人脐带组织来源的细胞治疗的患者的血液样本；(c)使用测定方法来分析样本，以检测对于患者外周血单核细胞阳性的一种或多种标志物和对于人脐带组织来源的细胞阳性的一种或多种标志物；以及(d)基于对于患者外周血单核细胞阳性的一种或多种标志物和对于人脐带组织来源的细胞阳性的一种或多种标志物的检测，区别患者外周血单核细胞和人脐带组织来源的细胞。作为另外一种选择，检测血液中的人脐带组织来源的细胞的方法包括：(a)测定人脐带组织来源的细胞和人外周血单核细胞，以鉴定对于人脐带组织来源的细胞阳性的一种或多种标志物和对于患者外周血单核细胞阳性的一种或多种标志物；(b)比较对于人脐带组织来源的细胞阳性的一种或多种标志物和对于人外周血单核细胞阳性的一种或多种标志物，以鉴定区别脐带组织来源的细胞与患者外周血单核细胞的一种或多种独特标志物；(c)提供来自已用人脐带组织来源的细胞治疗的患者的血液样本；(d)使用测定方法来分析样本，以检测对于人脐带组织来源的细胞阳性的一种或多种独特标志物；以及(e)基于一种或多种独特标志物的检测，区别患者外周血单核细胞和人脐带组织来源的细胞。患者可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、犬或猪。
在一个实施例中，关于患者外周血单核细胞的阳性标志物是CD45，并且关于人脐带组织来源的细胞的阳性标志物是CD10。在另一个实施例中，关于患者外周血单核细胞和人脐带组织来源的细胞的标志物包括CD10、CD13、NRP1、CD45、LAMP1、DKK3、NRP1或LAMB1中的一种或多种。该方法可采用多种测定技术，包括流式细胞术、ELISA、免疫组织化学、核酸检测、PCR、以及它们的组合。对于人脐带组织来源的细胞阳性的一种或多种独特标志物可以是CD10、CD13、NRP1、LAMP1、DKK3、NRP1、LAMB1中的一种或多种、以及它们的组合。
该方法还可包括在步骤(a)和(b)之间执行富集步骤。富集步骤可以是磁性捕获技术。本发明的另一个实施例是用于检测血液中的人脐带组织来源的细胞的方法中的试剂盒，所述试剂盒包含具有对于人脐带组织来源的细胞阳性的一种或多种标志物和对于人外周血单核细胞阳性的一种或多种标志物的标志物谱。本发明还提供了用于与本发明的方法一起使用的系统。
本发明的另一个实施例是检测血液中的人脐带组织来源的细胞的方法，所述方法包括以下步骤：测定人脐带组织来源的细胞和人外周血单核细胞，以鉴定对于人脐带组织来源的细胞阳性的一种或多种标志物和对于人外周血单核细胞阳性的一种或多种标志物；提供含有人脐带组织来源的细胞的血液样本；从血液样本中分离人脐带组织来源的细胞/外周血单核细胞级分；针对作为关于人外周血单核细胞的阳性标志物的CD45和作为关于人脐带组织来源的细胞的阳性标志物的CD10或CD13，通过流式细胞术来分析人脐带组织来源的细胞/外周血单核细胞级分，并且基于作为对于外周血单核细胞阳性的标志物的CD45和作为对于人脐带组织来源的细胞阳性的标志物的CD10或CD13的检测，检测人外周血单核细胞和人脐带组织来源的细胞的存在。
分析步骤可包括针对作为关于外周血单核细胞的阳性标志物的CD45和作为关于人脐带组织来源的细胞的阳性标志物的CD13，通过流式细胞术来分析人脐带组织来源的细胞/外周血单核细胞级分。作为另外一种选择，分析步骤可包括针对作为关于外周血单核细胞的阳性标志物的CD45和作为关于人脐带组织来源的细胞的阳性标志物的CD10，通过流式细胞术来分析人脐带组织来源的细胞/外周血单核细胞级分。该方法还可包括在分析人脐带组织来源的细胞/外周血单核细胞级分之前执行富集步骤例如磁性捕获技术。
本发明的另一个实施例是检测血液中的人脐带组织来源的细胞的方法，
所述方法包括以下步骤：提供含有人脐带组织来源的细胞的血液样本；从血液样本中分离人脐带组织来源的细胞/外周血单核细胞级分；去除任何血浆；针对作为关于外周血单核细胞的阳性标志物的CD45和作为关于人脐带组织来源的细胞的阳性标志物的CD13，通过流式细胞术来分析人脐带组织来源的细胞/外周血单核细胞级分，并且基于作为对于人外周血单核细胞阳性的标志物的CD45和作为对于人脐带组织来源的细胞阳性的标志物的CD13的检测，检测人外周血单核细胞和人脐带组织来源的细胞的存在。该方法还可包括在分析人脐带组织来源的细胞/外周血单核细胞级分之前执行富集步骤例如磁性捕获技术。该方法还可包括检测作为对于人脐带组织来源的细胞阳性的标志物的CD10。
人脐带组织来源的细胞分离自基本上不含血液的人脐带组织、能够在培养中自我更新和扩增、并且具有分化的潜能。在一个实施例中，人脐带组织来源的细胞分离自基本上不含血液的人脐带组织、能够在培养中自我更新和扩增、具有分化的潜能、并且具有下列特征：(1)表达CD10、CD13、CD44、CD90和HLA-ABC；(2)不表达CD31、CD34、CD45、HLA-DR和CD117；以及(3)不表达hTERT或端粒酶。作为另外一种选择，人脐带组织来源的细胞可分离自基本上不含血液的人脐带组织、能够在培养中自我更新和扩增、具有分化的潜能、并且具有下列特征：(1)表达CD10、CD13、CD44、CD90和HLA-ABC；(2)不表达CD31、CD34、CD45、HLA-DR和CD117；(3)不表达hTERT或端粒酶；(4)表达氧化低密度脂蛋白受体1、浆膜蛋白、趋化因子受体配体3、和/或粒细胞趋化蛋白；以及(4)相对于人成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞，表达增加水平的白介素8或浆膜蛋白1。
本发明的另一个实施例是检测血液中的人脐带组织来源的细胞的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供来自已用人脐带组织来源的细胞治疗的患者的血液样本；(b)使用测定方法来分析样本，以检测对于人外周血单核细胞阳性的一种或多种标志物和对于人脐带组织来源的细胞阳性的一种或多种标志物；以及(c)区别人外周血单核细胞和对于人脐带组织来源的细胞阳性的一种或多种标志物。在一个实施例中，关于人外周血单核细胞的阳性标志物是CD45，并且关于人脐带组织来源的细胞的阳性标志物是CD10。分析步骤可利用流式细胞术、ELISA、免疫组织化学、核酸检测和/或PCR。该方法还可包括在步骤(a)和(b)之间执行富集步骤。富集步骤可以是磁性捕获技术。
本发明的另外一个实施例是检测血液中的人脐带组织来源的细胞的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供含有人脐带组织来源的细胞的血液样本；(b)从血液样本中分离人脐带组织来源的细胞/外周血单核细胞级分；以及(c)针对作为关于外周血单核细胞的阳性标志物的CD45和作为关于人脐带组织来源的细胞的阳性标志物的CD10，通过流式细胞术来分析人脐带组织来源的细胞/外周血单核细胞级分。
本发明的替代实施例是检测血液中的人脐带组织来源的细胞的方法，所述方法包括以下步骤：提供含有人脐带组织来源的细胞的血液样本；从血液样本中分离人脐带组织来源的细胞/外周血单核细胞级分；去除任何血浆；以及针对作为关于外周血单核细胞的阳性标志物的CD45和作为关于人脐带组织来源的细胞的阳性标志物的CD13，通过流式细胞术分析人脐带组织来源的细胞/外周血单核细胞级分。
本发明的其他特征和优点由下述具体实施方式和实例将是显而易见的。
附图说明
在结合附图阅读上述发明内容以及以下对本发明的详细说明时能够更好地进行理解。出于说明本发明的目的，附图展示了本发明的实施例。然而应当理解，本发明不局限于示出的精确布置方式、实例和工具。
图1列出了用于实例1中的研究1的24份样本和每份样本的细胞培养物年龄。具体地，在图1A处的表列出了用于微阵列分析的24份样本，并且在图1B处的图表显示了这24份样本各自的细胞培养物年龄。
图2A显示了在人脐带组织来源的细胞(hUTC)和包含人PBMC的多个类型的血细胞中的PTPRC(CD45)基因的比较表达。
图2B显示了在hUTC和包含人外周血单核细胞(PBMC)的多个类型的血细胞中的MME(CD10)基因的表达比较。
图2C显示了在hUTC和包含PBMC的多个类型的血细胞中的ANPEP(CD13)基因的表达比较。
图3显示了选择基因的RT-PCR分析，所述选择基因在hUTC中的表达高于在人PBMC中的表达。
图4A显示了用于检测hUTC中的细胞表面标志物的流式细胞术测定法的结果。参考图4A，小图A1、B1、C1、D1和E1显示了未染色的对照。小图A2显示了CD13和7AAD。小图B2显示了CD10和7AAD。小图C2显示了NRP1和7AAD。小图D2显示了CD45和7AAD。小图E2显示了LAMP1和7AAD。
图4B显示了用于检测人PBMC中的细胞表面标志物的流式细胞术测定法的结果。参考图4B，小图A1、B1、C1、D1和E1显示了未染色的对照。小图A2显示了CD13和7AAD。小图B2显示了CD10和7AAD。小图C2显示了NRP1和7AAD。小图D2显示了CD45和7AAD。小图E2显示了LAMP1和7AAD。
图4C显示了用于检测PBMC和hUTC中的内部标志物DKK3和LAMP1的流式细胞术测定法的结果。
图5A显示了使用流式细胞术，在1ml人血清的存在下，在包含hUTC(范围为1,500-1,700细胞/mL)和人PBMC(1百万细胞/mL)的混合物中的hUTC检测。
图5B显示了使用流式细胞术，在1ml人血清的存在下，在包含hUTC(范围为1,700至110,000细胞/mL)和人PBMC(1百万细胞/mL)的混合物中的hUTC检测。
具体实施方式
本专利申请涉及检测患者(例如人)血液中循环的同种异体治疗细胞例如祖细胞的方法。祖细胞或其他工程细胞(其为细胞治疗产品的组分)被开发用于许多临床适应症。经由例如静脉内施用将这些细胞例如hUTC施用于患者。需要测定这些细胞在循环血液中的处置，以便评价作为细胞治疗产品的细胞的药代动力学以及更准确地测定治疗的成功。然而，人血液由多个类型的血细胞组成，所述血细胞中的一个或多个类型表达也可在祖细胞或工程细胞中表达的一些蛋白质。此外，重要的是开发足够灵敏的测定法，所述测定法可检测接受者的血液中大量过量的细胞中少量的这些细胞(例如hUTC)。因此，在人血液的存在下检测这些细胞变成需要获得足够灵敏度或特异性的挑战。因此，存在可从人血细胞中鉴定并区别祖细胞或工程细胞的测定法的需要。
I.定义
如本文所用的“样本”指可含有目的分析物的任何物质。样本可以是生物学流体，例如全血或全血组分包括红血细胞、白血细胞、血小板、血清和血浆、腹水、尿、脑脊髓液及其他机体组成成分。
可使用本发明的方法在含有外周血单核细胞的血液样本中鉴定的细胞一般被称为产后细胞或产后来源的细胞(PPDC)。该细胞更具体而言是“脐来源的细胞”或“脐带来源的细胞”(UDC)、或“脐带组织来源的细胞”(UTC)或“人脐带组织来源的细胞”(hUTC)。此外，所述细胞可被描述为干细胞或祖细胞，后面的术语在广义中使用。术语“来源的”用于指示细胞已从其生物来源获得并且在体外生长或以其他方式处理(例如，在生长培养基中培养以扩增群体和/或产生细胞系)。脐干细胞的体外操作和本发明脐来源细胞的独特特征于下文详细地描述。
干细胞是由单细胞自我更新并分化以产生后代细胞的能力定义的未分化细胞，包括自我更新的祖细胞、非更新的祖细胞和终末分化的细胞。干细胞还由它们的以下能力来表征：从多个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)体外分化成多种细胞谱系的功能细胞的能力，以及在移植后产生多个胚层的组织的能力和在注射到胚包后基本上促成大多数组织(如果不是所有的组织的话)的能力。
根据干细胞的发育潜能，将它们分类为：(1)全能的；(2)多能的；(3)多潜能的；(4)寡能的；和(5)单能的。全能细胞能够产生所有胚胎和胚胎外细胞类型。多能细胞能够产生所有胚胎细胞类型。多潜能细胞包括能够产生细胞谱系子类的那些细胞，但是所有这些细胞在特定组织、器官或生理系统内。例如，造血干细胞(HSC)可产生包括HSC(自我更新)、局限于血细胞的寡能祖细胞、以及其为血液正常组分的所有细胞类型和成分(例如血小板)的后代。寡能细胞可产生比多潜能干细胞更受限制的细胞谱系子系。单能细胞能够产生单细胞谱系(例如生精干细胞)。
干细胞也基于它们由其获得的来源进行分类。成体干细胞一般为在包括多个分化细胞类型的组织中发现的多潜能未分化细胞。成体干细胞可自我更新。在正常情况下，它也可分化产生特化的组织细胞类型(其起源于该组织)，并且可能产生其他组织类型。胚胎干细胞是来自胚泡期胚胎的内细胞团的多能细胞。胎儿干细胞是源于胎儿组织或膜的干细胞。产后干细胞是基本上源于可在分娩后获得的胚胎外组织(即脐带)的多潜能或多能细胞。已发现这些细胞具有多能干细胞的特征特性，包括快速增殖和分化成许多细胞谱系的潜能。产后干细胞可以是血液来源的(例如，从脐带血液获得的干细胞)或非血液来源的(例如，从脐带的非血液组织获得的)。
多个术语用于描述培养中的细胞。“细胞培养”一般指从活生物体取得并在受控条件下生长(“在培养中”或“培养的”)的细胞。“原代细胞培养”是在第一次继代培养之前，从一个或多个生物体直接取得的细胞、组织或器官的培养。当在利于细胞生长和/或分裂的条件下，将细胞置于生长培养基中时，细胞在培养中“扩增”，导致更大的细胞群。当细胞在培养中扩增时，有时通过细胞数目翻倍所需的时间量来测量细胞增殖率。这被称为“倍增时间”。
术语“细胞系”一般指通过原代细胞培养的一次或多次继代培养形成的细胞群。每一轮继代培养都被称为传代。当细胞进行继代培养时，它们被称为已“传代的”。特定的细胞群或细胞系，有时由它已传代的次数来指称或表征。例如，已被传代十次的培养细胞群体可称为P10培养物。原代培养物(即，在细胞从组织分离后的第一次培养物)指定为P0。在第一继代培养后，细胞被描述为次代培养物(P1或第1代)。在第二继代培养后，细胞变成三代培养物(P2或第2代)，依此类推。本领域的技术人员应当理解，在传代期间，可以有多次群体倍增；因此，培养物的群体倍增数大于传代数。细胞在传代之间的期间中的扩增(即，群体倍增数)取决于许多因素，包括但不限于种植密度、基材、培养基、生长条件和传代之间的时间。
“分化”是通过其未特化的(“未定型的”)或特化不足的细胞获得特化细胞(例如神经细胞或肌肉细胞)的特征的过程。“分化”细胞是已在细胞谱系中占据更特化的(“定型的”)位置的细胞。当应用于分化的过程时，术语“定型的”指在分化途径中已进行到这样的点的细胞：其中在正常环境下，它继续分化成特定的细胞类型或细胞类型子集，并且在正常环境下，不能分化成不同细胞类型或回复到分化程度较低的细胞类型。“去分化”指细胞通过其回复到在细胞谱系内特化(或定型)程度较低的位置的过程。如本文所用，细胞的“谱系”限定细胞的遗传关系，即它来自哪些细胞和它能产生什么细胞。细胞谱系将细胞定位于发育和分化的遗传计划内。
在广义上，“祖细胞”是具有产生比它自身更分化的后代的能力，并且仍保留补充祖先库的能力的细胞。根据此定义，因为干细胞是最终分化细胞的更直接前体，故其本身也是祖细胞。如下文更详细地描述的，在提及本发明的细胞时，可使用该祖细胞广义定义。在狭义上，祖细胞通常定义为在分化途径中间(即，其起于干细胞)并且在成熟细胞类型或细胞类型子类生产中间的细胞。该祖细胞类型一般不能够自我更新。因此，如果本文提及该细胞类型，则它将被称为“非更新的祖细胞”或“中间祖细胞或前体细胞”。
一般来讲，“营养因子”定义为促进细胞存活、生长、增殖和/或成熟，或刺激细胞活性增加的物质。
如本文所用，术语“标准生长条件”指在37℃下、在包含5％CO2的标准大气和维持在约100％的相对湿度中的细胞培养。虽然前述条件可用于培养，应当理解，此条件能够由本领域中将认识到可用选项的技术人员针对培养细胞改变。
如本文所用的术语“分离”一般指已与其天然环境分开的细胞。该术语包括与其天然环境的肉眼可见的物理分开，例如从供体动物中取出。在优选的实施例中，分离的细胞不存在于组织中，即细胞与它通常与之接触的相邻细胞分开或解离。优选地，细胞作为细胞悬浮液施用。如本文所用，短语“细胞悬浮液”包括与培养基接触并且已例如通过对组织片实施轻轻研磨而解离的细胞。
如本文所用，术语外周血单核细胞(“PBMC”)包含具有圆形核的任何血细胞。示例性外周血单核细胞包括但不限于淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞。
II.检测患者血液样本中的同种异体治疗细胞的方法
本专利申请提供了在同种异体治疗细胞已施用于患者后，检测患者血液样本中的该细胞的方法。该方法涉及下列步骤：(a)提供来自已用同种异体治疗细胞治疗的患者的血液样本；(b)使用测定方法来分析样本，以检测对于患者外周血单核细胞(“PBMC”)(例如具有圆形核的任何血细胞)阳性的一种或多种标志物和/或对于治疗细胞阳性的一种或多种标志物；以及(c)区别人外周血单核细胞和对于同种异体治疗细胞阳性的一种或多种标志物，所述标志物不由外周血单核细胞表达。为了能够区别关于患者外周血单核细胞的标志物、和不由外周血单核细胞表达的对于治疗细胞阳性的一种或多种标志物，还需要首先鉴定这些标志物。因此，该方法还可包括测定这些标志物的步骤。本发明的方法允许检测此类细胞而不受同种异体治疗细胞的核型(即XY相对于XX)和患者性别限制。因此，该方法既不受性别约束，它们也不限制于仅鉴定女性患者中的男性同种异体治疗细胞(XX)。
在一个实施例中，本发明提供了用于检测或鉴定血液样本中的人脐带组织来源的细胞的方法。该方法涉及下列步骤：(a)提供来自已用人脐带组织来源的细胞治疗的患者的血液样本；(b)使用测定方法来分析样本，以检测对于人外周血单核细胞阳性的一种或多种标志物和对于人脐带组织来源的细胞阳性的一种或多种标志物；以及(c)区别人外周血单核细胞和人脐带组织来源的细胞。为了能够区别，还需要测定独特标志物谱，以能够选择用于区别性独特标志物谱。还可采用定量hUTC量的进一步步骤。在一个实施例中，可使用实例3中所示的标志物。
在另一个实施例中，本发明描述了区别和/或测量在人中静脉内施用后的hUTC细胞治疗产品的方法。该方法鉴定与通常存在于血液中的细胞，即外周血单核细胞(“PBMC”)相比较，在hUTC中以基本上更高的水平表达的分子标志物。因为该方法依赖独特标志物谱用于鉴定hUTC，所以它们允许检测此类细胞而不受hUTC的核型(即XY相对于XX)和患者性别限制。它们既不受性别约束，它们也不限制于仅男性hUTC。因此，这些方法允许分析以任何组合的男性和女性受试者两者中的男性和女性hUTC两者。
本发明的方法适合于区别来自多种来源的患者血液中的同种异体治疗细胞。具体地，本发明的方法适合于检测在大量过量的接受者血液的存在下的少量hUTC。该方法适用于哺乳动物系统的任何成员，并且不限制于来源于人的那种。例如，本发明的方法可用于区别人中的同种异体治疗细胞例如hUTC与PBMC。作为另外一种选择，该方法可用于区别非人灵长类动物、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、犬或猪中的同种异体治疗细胞例如hUTC与PBMC。
这些方法帮助区分hUTC及其他同种异体治疗细胞与PBMC，并且可帮助监控接受细胞治疗产品的受试者中的药代动力学。
本发明的方法适合于检测来自已用同种异体治疗细胞(例如hUTC)治疗的患者的血液样本中的该细胞。因此，本发明的方法适合于检测可能已先前施用的同种异体治疗细胞(例如hUTC)。本发明的方法可适合于检测任何治疗有利的细胞，例如人脐带血来源的细胞、胎盘来源的细胞、间充质干细胞和间充质干细胞来源的细胞、hUTC、心肌细胞等或者表达特定蛋白质或目的蛋白质的任何靶细胞。用于这些方法中的其他合适细胞包括肝细胞、胰岛细胞、成纤维细胞和不溶性胶原骨基质来源的(ICBM)细胞。
该方法还可适合于检测来自已用同种异体治疗细胞(例如hUTC)治疗的患者的血液样本中的两个或更多个种类的该细胞。例如，该方法可用于检测血液样本中的人脐带组织来源的细胞和胎盘来源的细胞两者。作为另外一种选择，该方法可用于检测血液样本中的人脐带组织来源的细胞和真皮成纤维细胞。该方法还可用于检测血液样本中的人脐带组织来源的细胞、胎盘来源的细胞和真皮成纤维细胞。
A.区别性独特标志物谱的鉴定
本发明的方法包括基于含有PBMC的患者血液样本中治疗细胞(例如人脐带组织来源的细胞)的存在，鉴定区别性独特标志物谱的步骤。
为了获得该独特标志物谱，需要在细胞(例如人脐带组织来源的细胞)和PBMC之间比较基因的表达和细胞表面标志物的存在。多重技术包括基于蛋白质的技术例如ELISA和免疫组织化学，或基于核酸的技术例如原位杂交，可用于检测血液中hUTC的存在作为另外一种选择，可使用PCR技术。如下文实例中所述，在PBMC和/或同种异体治疗细胞中多种基因的表达水平还可得自可公开获得的来源。
基于这些多种基因的表达水平，可鉴定某些独特标志物基因。在特别适合于快速筛选的一个实施例中，标志物是细胞表面标志物。
如下文实例中所示，在hUTC上的分子标志物可通过比较这些细胞的表达谱与人外周血单核细胞(PBMC)的表达谱进行鉴定。通过比较hUTC和PBMC标志物的表达谱，因此对于每个患者鉴定与通常存在于循环中的细胞相比较，在hUTC中以基本上更高的水平表达并且反之亦然的标志物。鉴定的标志物包括CD45、CD13和CD10。因为hUTC和循环细胞两者均可显示动态表达水平，所以该方法依赖可区别hUTC与接受者循环中的细胞的多重标志物。
独特标志物谱可包括对于待测定其存在的同种异体细胞阳性的一种或多种标志物，和对于外周血单核细胞阳性的一种或多种标志物。因此，当测定人脐带组织来源的细胞时，标志物谱可包括对于hUTC阳性的一种或多种标志物和对于外周血单核细胞阳性的一种或多种标志物。作为另外一种选择，待测定其存在的同种异体细胞可仅使用关于同种异体细胞的一种或多种独特标志物进行鉴定，以区别这些细胞与外周血单核细胞。
在可特别用于鉴定PBMC中的hUTC的一个实施例中，独特标志物谱包括CD10、CD13、NRP1、CD45、LAMP1、DKK3、NRP1或LAMB1中的一种或多种。在一个实施例中，独特标志物谱包含对于hUTC特征性(例如阳性)的至少一种或多种标志物和对于PBMC特征性(例如阳性)的至少一种标志物(例如CD45)。
在同样可特别用于鉴定PBMC中的hUTC的另一个实施例中，独特标志物谱包括对于hUTC阳性并足以区别hUTC与外周血单核细胞的一种或多种独特标志物。这些一种或多种独特标志物可包括CD10、CD13、NRP1、LAMP1、DKK3、NRP1或LAMB1中的一种或多种。
技术人员将认识到使用哪些标志物的选择可取决于使用哪种技术而变。例如，使用微阵列分析(例如AffymetrixHT HG-U133+PM阵列)，ANPEP(CD13)、LAMP1和LAMB1可能不足以区别，而其他标志物中的一种或多种可能足以区别。类似地，使用RT-PCT，LAMP1可能不适合作为区别hUTC与PBMC的独特标志物谱的一部分，而其他标志物中的一种或多种可能足够。在一个实施例中，用于通过细胞表面流式细胞术筛选hUTC的独特标志物谱不包括DKK3和LAMB1。在另一个实施例中，用于细胞内细胞术的独特标志物包括LAMP1和DKK3。
使用所选技术用于鉴定PBMC样本中的hUTC的示例性合适标志物显示于下文。
因此，在一个实施例中，独特标志物谱包括作为对于hUTC阳性的一种或多种标志物的CD10和作为对于PBMC阳性的一种或多种标志物的CD45。在另一个实施例中，独特标志物谱包括作为对于hUTC阳性的一种或多种标志物的CD10和/或CD13和作为对于PBMC阳性的一种或多种标志物的CD45。
在使用流式细胞术作为测定方法的另一个实施例中，用于鉴定PBMC中的hUTC的独特标志物谱包括作为对于外周血单核细胞阳性的一种或多种标志物的CD45和作为对于人脐带组织来源的细胞阳性的一种或多种标志物的CD10。
在本发明的另一个实施例中，使用流式细胞术区别hUTC和PBMC的标志物谱包含CD45、CD10和CD13，其中CD10和CD13是对于hUTC阳性的一种或多种标志物，并且其中CD45是对于PBMC阳性的一种或多种标志物。
用于鉴定PBMC样本中的所选治疗细胞的示例性合适标志物显示于下文：
独特标志物谱可使用下述操作以及实例中所述的方法获得。下文描述的操作可包括获得独特标志物谱且验证其准确度两者。虽然验证步骤可包括样本分析，但该步骤可能有必要测定通过其检测独特标志物基因或蛋白质的特定操作的准确度并测试所述操作的限度。在该实施例中，流式细胞术可用于鉴定标志物。
获得独特标志物谱。使用AffymetrixHT HG-U133+PM生成源自多重来源的hUTC的基因表达谱。人和大鼠PBMC及其他类型血细胞的基因表达谱得自可公开获得的数据库。根据基因表达谱的结果，可鉴定在hUTC中高度表达的一组标志物和在人PBMC中高度表达的一组标志物。因此鉴定了六十一(61)种基因，更详细地研究其中的子集。根据该61种基因列表，将CD45鉴定为关于hPBMC的阳性标志物，并且将CD10和CD13鉴定为关于hUTC的两种阳性标志物。
验证用于标志物谱的测试方法。因为受试者的血液样本中的hUTC数目预期很低，所以测定使用上文鉴定的标志物是否可检测并定量在大量过量的人PBMC的存在下的少量hUTC。为此目的，将已知数量的hUTC掺料到1ml人血清中的大约一百万PBMC内。随后，针对作为关于hPBMC的阳性标志物的CD45和作为关于hUTC的阳性标志物的CD10或CD13，通过流式细胞术分析每份样本的等分试样。通过离心收获细胞，用PBS洗涤一次并且随后固定且渗透化处理。细胞的等分试样随后与下列一起温育：(1)FITC标记的抗CD45(Abeam，目录#27287)；(2)针对CD10的小鼠单克隆Ab(Abeam，目录#34175)，随后为FITC标记的山羊抗小鼠Ab(Abeam，目录#6785)；和(3)针对CD13的小鼠单克隆Ab(Abeam，目录#7417)，随后为FITC标记的山羊抗小鼠Ab(Abeam，目录#6785)。碘化丙啶(PI)包括在每份样本中用于监控活力，因为仅活细胞门控用于进一步分析。使用该操作，证实使用流式细胞术测试包含CD10、CD13和CD45的标志物谱成功鉴定hUTC和PBMC。
在一个实施例中，独特标志物谱可作为试剂盒的一部分提供，所述试剂盒含有用于测试独特标志物谱的材料。
鉴定独特标志物谱的步骤还可包括验证其正确性和独特标志物谱符合有关规定的可能验证的步骤。
B.获得患者样本
获得患者样本的步骤包括从患者取得血液样本的步骤。如上所述，在一个实施例中，患者可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、犬或猪。血液样本还可进行纯化或浓缩以分离细胞。例如，在一个实施例中，血浆可从血液中去除。血浆可使用本领域的标准技术包括离心去除。
用于进一步分析的患者样本(例如级分)包含目的同种异体治疗细胞和来自患者的外周血单核细胞。在一个实施例中，患者样本包含人脐带组织来源的细胞/外周血单核细胞级分。
在一个实施例中，获得患者样本的步骤还包括从血液样本中分离人脐带组织来源的细胞/外周血单核细胞级分。该实施例还可包括去除血浆的步骤。
在替代实施例中，获得患者样本的步骤包括使用聚蔗糖提取。
C.患者样本的分析
一般来讲，分析步骤包括取得患者血液样本，并且对于同种异体治疗细胞(例如hUTC)的区别性独特标志物谱的存在测试所述血液样本。分析步骤还可包括基于如上测定的独特标志物谱，测定PBMC的存在。例如，分析患者样本的步骤包括使用测定方法，以测试对于同种异体治疗细胞阳性的一种或多种标志物和对于外周血单核细胞阳性的一种或多种标志物。因此，分析步骤包括基于上文测定的独特标志物谱，检测细胞的存在。作为另外一种选择，分析患者样本的步骤包括使用测定方法，以测试对于同种异体治疗细胞阳性的一种或多种标志物，所述标志物足以区别这些细胞与外周血单核细胞。
在一个实施例中，分析步骤包括检测患者血液样本中对于外周血单核细胞阳性的一种或多种标志物和对于人脐带组织来源的细胞阳性的一种或多种标志物。在另一个实施例中，分析步骤包括检测对于hUTC阳性的一种或多种独特标志物，所述标志物足以区别这些细胞与患者血液样本中的PBMC。患者血液样本可以是人脐带组织来源的细胞/外周血单核细胞级分。
分析步骤可使用多种标准实验室技术进行。在一个实施例中，分析步骤可利用流式细胞术、ELISA、免疫组织化学、核酸检测、PCR、或它们的组合。
多重技术包括基于蛋白质的技术例如ELISA和免疫组织化学，或基于核酸的技术例如原位杂交，可用于检测血液中hUTC的存在。作为另外一种选择，PCR技术可有利于促进血液样本中hUTC的相对定量。
在本发明的一个优选的实施例中，本发明的方法用于区别人hUTC与人PBMC。在一个实施例中，独特标志物谱包含CD10、CD13、NRP1、CD45、LAMP1、DKK3、NRP1或LAMB1中的一种或多种，并且分析步骤可利用流式细胞术、ELISA、免疫组织化学、核酸检测、PCR、或它们的组合。在另一个实施例中，分析步骤包括流式细胞术，以测试作为关于人脐带组织来源的细胞的阳性标志物的CD10和/或CD13，和作为关于人外周血单核细胞的阳性标志物的CD45。在另一个实施例中，基于足以区别这些细胞与PBMC的一种或多种独特阳性标志物(例如CD10、CD13、NRP1、LAMP1、DKK3、NRP1或LAMB1)的存在，本发明的方法用于区别hUTC与人PBMC。
D.任选的富集步骤
本发明的方法还可包括一个或多个富集步骤。如本文所用的术语“富集”指与原始生物样本中的比率相比较，基本上增加靶生物实体(例如同种异体治疗细胞(例如hUTC))与非靶材料(例如PBMC)的比率的过程。
具体地，如果需要更多灵敏度用于检测同种异体治疗细胞(例如hUTC)，则在分析患者样本之前可能需要富集步骤。例如，当相对于血细胞数目存在如此少的同种异体治疗细胞(例如hUTC)，或同种异体治疗细胞的量低于实验室技术的检测限度时，可能需要富集步骤。使用富集，本发明的方法可鉴定并定量即使以极低浓度存在于患者的血液中的同种异体治疗细胞，并且提供有利于定量存在于任何给定样本中的细胞的机制。
多种标准技术可用于一个或多个富集步骤。这些技术包括但不限于使用选择性培养基用于富集和耗尽特定细胞类型、选择性粘附方法、细胞分离的物理和生物学方法、密度梯度电泳、离心等等。示例性富集技术包括免疫亲和柱、免疫亲和珠、通过蔗糖或聚蔗糖梯度离心。
因此，根据hUTC数目/血液ml和hUTC数目/百万PBMC，可能需要在分析前分离或富集hUTC级分。与磁珠缀合的抗CD45抗体可用于该目的(参见下文讨论)。
用磁珠的细胞分离
富集步骤可包括用磁性颗粒/磁珠的细胞分离。磁性颗粒是本领域众所周知的，如其在免疫及其他生物特异性亲和反应中的用途一样。一般来讲，有利于磁性或重力分离的任何材料均可用于该目的。使用磁珠的示例性富集操作在美国专利7,863,012和美国公开申请2011/0147180中描述，所述专利以引用的方式并入。
磁性颗粒可基于大小进行分类：大的(1.5至约50微米)；小的(约0.7-1.5微米)；或胶体的(<200nm)，其也被称为纳米颗粒。也称为铁磁流体或铁磁流体样材料且具有常规铁磁流体的许多特性的第三种在本文中有时被称为胶体、超顺磁颗粒。
上述类型的小磁性颗粒在涉及生物特异性亲和反应的分析中是相当有用的，因为它们方便地用生物功能聚合物(例如蛋白质)涂布，提供极高的表面积且给出合理的反应动力学。范围为约0.7-1.5微米的磁性颗粒已在专利文献中描述，包括例如美国专利3,970,518；4,018,886；4,230,685；4,267,234；4,452,773；4,554,088；和4,659,678。这些颗粒中的某些公开为用于免疫学试剂的有用固体载体。
磁性分离可以由其完成的效率以及磁性标记的细胞的回收和纯度将取决于许多因素。这些因素包括：待分离的细胞数目、此类细胞的受体或表位密度、磁负荷/细胞、磁性材料的非特异性结合(NSB)、诱陷的非靶细胞的携带、采用的技术、容器的性质、容器表面的性质、介质的粘度和采用的磁性分离装置。如果系统的非特异性结合水平是基本上恒定的，如通常的情况一样，则靶群体如纯度一样减少。
例如，回收80％群体的具有0.8％NSB的系统将具有25％的纯度，所述80％群体在最初混合物中处于0.25％。然而，如果初始群体处于0.01％(在106旁观者细胞中的一个靶细胞)，并且如果NSB是0.001％，则纯度将是8％。因此，样本混合物中的靶材料的高纯度导致靶材料的更特异性和有效的收集。示例性低非特异性结合对于促进罕见细胞的检测和分析是需要或有利的，所述罕见细胞例如循环中存在的上皮来源的肿瘤细胞。
靶细胞(例如hUTC)群越小，磁性标记且回收就越困难。此外，标记和回收将显著取决于采用的磁性颗粒的性质。例如，当细胞与大磁性颗粒例如磁珠(Invitrogen)一起温育时，细胞通过由系统混合产生的碰撞进行标记，因为珠太大而不能有效分散。因此，如果细胞以1细胞/ml血液或甚至更低的频率存在于群体中，则标记靶细胞的概率将与加入系统中的磁性颗粒数目和混合的时间长度有关。因为细胞与此类颗粒混合大量时期将是有害的，所以尽可能多地增加颗粒浓度变得必要。然而，存在关于可加入的磁性颗粒数量的限制，因为可用与其他血细胞混合的罕见细胞代替分离后与大量磁性颗粒混合的罕见细胞。后面一种条件不显著改善计数目的细胞或检查目的细胞的能力。
在一个实施例中，用于进行富集步骤的磁性颗粒表现如同胶体。此类颗粒的特征在于其亚微米粒子大小(这一般小于约200nm(0.20微米))，及其与溶液重力分离延长时间段的稳定性。除许多其他优点之外，该尺寸范围还使得其对于通常应用于细胞分析的分析技术基本上不可见。在约90-150nm范围内且具有约70-90％之间的磁质量的颗粒考虑用于本发明中。合适的磁性颗粒由通过分子包围的超顺磁材料的晶芯组成，所述分子与磁芯键合例如物理吸附或共价附着，并且赋予稳定胶体性质。涂层材料应优选以有效防止样本中发现的生物大分子和磁芯之间的非特异性相互作用的量应用。此类生物学大分子可包括碳水化合物例如在非靶细胞表面上的唾液酸残基、凝集素、糖蛋白及其他膜组分。此外，材料应含有尽可能多的磁质量/纳米颗粒。包含芯的磁性晶体的尺寸足够小，使得它们不含完整磁域。纳米颗粒的尺寸足够小，使得其布朗能量超过其磁矩。因此，北极、南极对齐以及这些胶体磁性颗粒的后续相互吸引/排斥看起来即使在中等强的磁场中也不发生，促成其溶液稳定性。最后，磁性颗粒应可在高磁性梯度外部场分离器中分离。这个特征有利于样本处理且提供超过装载有铁磁珠或钢丝绒的更复杂的内部梯度柱的经济优点。具有上述特性的磁性颗粒可通过修饰美国专利4,795,698；5,597,531和5,698,271中所述的基底材料进行制备，所述专利各自以引用的方式并入。
因为小纳米颗粒(30-70nm)将更容易扩散，所以与其更大的配对物相比较，它们优先标记细胞。当使用极高梯度例如在内部梯度柱中时，与大小无关，这些材料的表现差别不大。另一方面，当使用外部梯度或比微珠或钢丝绒柱上可生成的更小量级的梯度时，小纳米颗粒在细胞上的占据具有显著效应。这决定性地显示为通过分级DC纳米颗粒并研究对回收的作用的情况。基于这些研究及其他优化实验，确定用于磁性分级纳米颗粒或在柱上分级纳米颗粒的方法，其中可制备缺乏过分小或大的纳米颗粒的基料涂布的磁性颗粒。例如，可产生平均直径100nm的基料涂布的颗粒，其含有最多痕量的小于80nm或超过130nm的材料。类似地，可制备约120nm的材料，不含小于90-95nm和超过160nm的可测量材料。此类材料就回收而言表现最佳，并且可通过包括60-70nm纳米颗粒而制备为亚最佳的。在实践本发明中使用的一个优选的粒度范围为对于基料涂布的颗粒例如BSA涂布的磁石90-150nm。
基于前文所述，用采用高磁性、低非特异性结合、胶体磁性颗粒的外部场装置的高梯度磁性分离是用于从真核细胞的混合群体(例如外周血单核细胞中的同种异体治疗细胞(例如hUTC)中分离目的细胞子集的选择方法，特别当目的子集仅包含整个群体的小部分时。由于其散布特性，此类材料容易发现且磁性标记罕见事件，例如血液中的肿瘤细胞。在一个实施例中，为了同种异体治疗(例如hUTC)细胞分析的磁性分离能够成功，磁性颗粒必须对于不存在于同种异体治疗细胞(例如hUTC)上的表位是特异性的。
通过使用磁珠的富集步骤包括使用由单克隆抗体标记的磁性纳米颗粒(例如上文描述的那些)。这些单克隆抗体可以是鉴定外周血单核细胞而不是同种异体治疗细胞的抗体。附着至纳米颗粒的单克隆抗体与外周血单核细胞结合，所述外周血单核细胞随后可使用磁性方法分离。通常，此类分离经由使用高磁梯度外部场分离器来实现。通过磁性方法分离的示例性合适技术在美国专利6,365,362中描述，所述专利的公开内容并入本文。在一个实施例中，使用与磁性颗粒缀合的抗CD45抗体。作为另外一种选择，富集步骤包括使用抗CD4和抗CD8抗体，以去除T细胞。
在另一个实施例中，富集步骤包括鉴定同种异体治疗细胞的单克隆抗体。在进一步的实施例中，同种异体治疗细胞是hUTC，并且抗体包括抗CD10或抗CD13抗体中的一种或多种。
在一个实施例中，本发明的方法包括使用细胞搜索系统(Cell Search System)(Veridex,LLC(Raritan,NJ))，所述细胞搜索系统已对于hUTC和PBMC检测进行最佳化。
因为患者样本中的同种异体治疗细胞(例如hUTC)的适当量可能是未知的，所以本发明的方法还可包括保存足够的患者样本以运行另外分析的步骤。当由于同种异体治疗细胞存在的量低于使用的测定法技术的检测限度，初始分析可能无法检测同种异体治疗细胞(例如hUTC)时，这可能是特别有用的。因此，在一个实施例中，如果最初未检测到同种异体治疗细胞(例如hUTC)，则该方法还包括患者样本的另外分析。该另外分析还包括一个或多个富集步骤例如上文描述的那些。
E.测定患者血液样本中的治疗细胞和外周血单核细胞的存在
本发明的方法还包括测定外周血单核细胞样本中的同种异体治疗细胞的存在。测定所述细胞的存在的步骤包括比较样本分析结果与如上测定的独特标志物，其中对于同种异体治疗细胞的独特标志物的存在指示样本中的同种异体治疗细胞的存在。测定步骤还可包括比较结果与如上文鉴定的关于PBMC的独特标志物。因此，测定步骤包括比较对于同种异体治疗细胞(例如hUTC)阳性的一种或多种标志物和对于PBMC阴性的一种或多种标志物的结果与上文标志物谱。
在另一个实施例中，本发明的方法包括测定外周血单核细胞样本(例如人或啮齿类动物)中的人脐带组织来源的细胞的存在。测定所步骤包括比较样本分析结果与如上测定的独特标志物，其中对于同种异体治疗细胞的独特标志物的存在指示样本中hUTC细胞的存在。测定步骤还可包括比较结果与如上文鉴定的关于PBMC的独特标志物。测定步骤可包括如上文讨论的对于hUTC阳性的一种或多种标志物和对于PBMC阳性的一种或多种标志物。
测定步骤还包括基于对于人外周血单核细胞阳性的一种或多种标志物和对于人脐带组织来源的细胞阳性的一种或多种标志物的检测，区别人外周血单核细胞和人脐带组织来源的细胞。测定步骤还可包括区分施用于患者的人脐带组织来源的细胞和来自患者的人外周血单核细胞。
测定细胞的存在的步骤还可包括定量细胞。在一个实施例中，关于hUTC存在的测定步骤包括定量样本中的hUTC数目。
测定存在的步骤还可包括基于独特标志物谱(例如对于hUTC阳性的一种或多种标志物)的存在，选择一种或多种人脐带组织来源的细胞。
测定步骤还可包括基于作为对于人外周血单核细胞阳性的标志物的CD45和作为对于人脐带组织来源的细胞阳性的标志物的CD10或CD13的检测，检测人外周血单核细胞和人脐带组织来源的细胞的存在。
在替代实施例中，本文描述的方法可适合于区别同种异体治疗细胞与大鼠PBMC，这对于大鼠疾病模型中的监控可能是特别有用的。
在一个实施例中，本发明描述了用于鉴定血液中的hUTC的方法。该方法涉及下列步骤：(a)提供来自已用人脐带组织来源的细胞治疗的患者的血液样本；(b)使用测定方法分析样本，以检测对于人外周血单核细胞阳性的一种或多种标志物和对于人脐带组织来源的细胞阳性的一种或多种标志物；以及(c)区别人外周血单核细胞和对于人脐带组织来源的细胞阳性的一种或多种标志物。还可采用定量hUTC量的进一步步骤。在一个实施例中，使用实例3中所示的标志物中的一种或多种。
在另一个实施例中，本发明的方法适合于
使用流式细胞术鉴定在1百万人PBMC的存在下的约1,700或更多hUTC/ml，而不依赖富集步骤。
III.用于测试血液样本中的同种异体治疗细胞的试剂盒和系统
本发明的另一个实施例是使用本发明的方法用于测试血液样本中的同种异体治疗细胞例如hUTC的存在的试剂盒。
该试剂盒可包含区别性独特标志物谱和根据一种或多种分析操作用于鉴定区别性独特标志物谱的合适组分。例如，适合于通过使用RT-PCR区别独特标志物谱的试剂盒将包括适合于扩增独特标志物谱基因的PCR引物。类似地，适合于通过抗体联系的测定法(antibody-linked assay)的独特标志物谱的试剂盒将包括与标志物结合的抗体。
在一个实施例中，该试剂盒设计为检测PBMC群体中的hUTC。在另一个实施例中，该试剂盒包含独特标志物谱CD10、CD13和CD45，以及使用流式细胞术、ELISA、免疫组织化学、核酸检测、PCR、或它们的组合中的一种或多种鉴定CD10、CD13和CD45的其他合适组分。
另外一个实施例是用于检测PBMC群体中的同种异体治疗细胞(hUTC)的系统。该系统包括进行本发明的方法所需的材料。
IV.人脐带组织来源的细胞
虽然考虑本发明的方法可用于区别治疗细胞(例如祖细胞/干细胞)与宿主细胞，但在优选的实施例中，细胞可以是人脐带组织来源的细胞(“hUTC”或“UTC”)。有用的人脐带组织来源的细胞分离自基本上不含血液的人脐带组织、能够在培养中自我更新和扩增、并且具有分化的潜能。适合于通过本发明的方法鉴定的UTC和UTC群体在本文下文以及美国专利7,510,873；7,524,489；和美国公开申请2005/0058631中详细描述。
A.脐带组织来源的细胞的分离和生长
根据本文所述的方法，哺乳动物脐带是在或足月或早产妊娠结束后或不久(例如，分娩后排出之后)回收的。产后组织可在无菌容器(诸如烧瓶、烧杯、培养皿或袋)中从分娩地点运输到实验室。该容器可具有溶液或培养基，包括但不限于盐溶液，诸如达尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)(也称为达尔贝科最低必需培养基)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)，或用于运输用于移植的器官的任何溶液，诸如威斯康星大学溶液(University of Wisconsinsolution)或全氟化合物溶液。可将一种或多种抗生素和/或抗真菌剂(诸如但不限于青霉素、链霉素、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素)添加到培养基或缓冲液中。可用抗凝血剂溶液诸如含肝素溶液冲洗产后组织。优选在提取UTC之前将组织保持在约4-10℃下。甚至更优选在提取UTC之前，组织不进行冷冻。
UTC的分离优选在无菌环境中发生。脐带可通过本领域已知的方法从胎盘分离。血液和碎片优选在UTC分离前从产后组织中去除。例如，可用缓冲液溶液(包括但不限于磷酸盐缓冲盐水)洗涤产后组织。洗涤缓冲液也可包含一种或多种抗真菌剂和/或抗生素，包括但不限于青霉素、链霉素、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素。
通过机械力(切断力或剪切力)分解包含脐带或其片段或区段的产后组织。在目前优选的实施例中，分离工序也利用酶消化过程。许多酶是本领域已知用于从复合组织基质分离个体细胞以有利于在培养物中生长。消化酶范围从弱消化的(例如脱氧核糖核酸酶和中性蛋白酶、分散酶)到强消化的(例如木瓜蛋白酶和胰蛋白酶)，并且是商购可得的。随同相容的酶的不完全列表包括粘液溶解酶活性、金属蛋白酶、中性蛋白酶、丝氨酸蛋白酶(诸如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或弹性蛋白酶)和脱氧核糖核酸酶。目前优选的是选自金属蛋白酶、中性蛋白酶和溶解粘液的活性材料的酶活性材料。例如，已知胶原酶用于从组织分离多种细胞。脱氧核糖核酸酶可消化单链DNA并且可在分离期间使细胞凝聚降到最低。优选的方法涉及用例如胶原酶和分散酶，或胶原酶、分散酶和透明质酸酶的酶促处理。在某些实施例中，在解离步骤中使用胶原酶和中性蛋白酶分散酶的混合物。更具体的实施例采用在来自溶组织梭菌(Clostridium histolyticum)的至少一种胶原酶，和蛋白酶活性、分散酶和嗜热菌蛋白酶中的任一种的存在下的消化。在另一些其他实施例中，用胶原酶和分散酶的酶活性材料两者进行消化。也利用了包括用除了胶原酶和分散酶活性材料之外的透明质酸酶活性材料消化的方法。技术人员将认识到，本领域已知用于从多种组织来源中分离细胞的多种此类酶处理。例如，以商品名LIBERASE(Roche,Indianapolis,Ind.)销售的用于组织解离的酶共混物适用于本发明方法。酶的其他来源是已知的，并且技术人员还可从它们天然来源直接获得此类酶。技术人员也拥有齐全的设备来评价新的或附加的酶或酶组合在它们分离本发明细胞方面的用途。优选的酶处理为0.5、1、1.5或2小时长或更长。在其他优选的实施例中，解离步骤的酶处理期间在37℃下温育组织。
在本发明的一些实施例中，将产后组织分成包含组织的多个部分(例如诸如新生儿、新生儿/母体、以及胎盘的母体部分)的区段。然后，根据本文所述的方法通过机械和/或酶解离来解离分离的部分。新生儿或母体谱系细胞可通过本领域已知的任何方法(例如，通过针对Y染色体的核型分析或原位杂交)来鉴定。
分离的细胞或UTC由其来源的脐带组织可用于引发、或种植细胞培养物。将分离的细胞转移到无菌组织培养容器中，所述无菌组织培养容器未涂布或涂布有细胞外基质或配体，诸如层粘连蛋白、胶原(天然、变性或交联的)、明胶、纤连蛋白及其他细胞外基质蛋白。除本文公开的培养基之外，还可将UTC培养在能够维持细胞生长的任何培养基中，诸如但不限于DMEM(高或低葡萄糖)、高级DMEM、DMEM/MCDB 201、伊格尔基础培养基、Ham’s F10培养基(F10)、Ham’s F-12培养基(F12)、伊斯科夫改良达尔贝科培养基、间充质干细胞生长培养基(MSCGM)、DMEM/F12、RPMI 1640和以商品名CELL-GRO-FREE销售的不含血清/介质的培养基(Mediatch,Inc.,Herndon,Va)。培养基可补充有一种或多种组分，包括例如胎牛血清(FBS)，优选约2-15％(v/v)；马血清(ES)；人血清(HS)；β-巯基乙醇(BME或2-ME)，优选约0.001％(v/v)；一种或多种生长因子，例如血小板来源的生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、白细胞抑制因子(LIF)和促红细胞生成素(EPO)；氨基酸，包括L-缬氨酸；以及用于控制微生物污染的单独或组合的一种或多种抗生素和/或抗真菌剂，诸如青霉素G、硫酸链霉素、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素。培养基可包含如下文实例中定义的生长培养基。
将细胞以允许细胞生长的密度种植在培养容器中。在优选的实施例中，细胞在占空气约0至约5体积％的CO2下培养。在一些优选的实施例中，细胞在占空气约2至约25％的O2下，优选占空气约5至约20％的O2下培养。细胞优选在约25至约40℃的温度下培养，还更优选在37℃下培养。细胞优选在培养箱中培养。培养容器中的培养基可以是静止的，也可例如使用生物反应器搅动。UTC优选在低氧化性应激下生长(例如，伴随谷胱甘肽、维生素C、过氧化氢酶、维生素E、N-乙酰半胱氨酸的添加)。“低氧化性应激”指对培养的细胞无自由基损伤或最低限度的自由基损伤的条件。
选择最适当的培养基、培养基制剂和细胞培养技术的方法是本领域众所周知的，并且在多种来源中描述，包括Doyle等人(编辑)，1995，Cell&Tissue Culture:LaboratoryProcedures，John Wiley&Sons,Chichester；以及Ho和Wang(编辑)，1991，Animal CellBioreactors，Butterworth-Heinemann,Boston，所述参考文献以引用方式并入本文。
在将分离的细胞或组织片段培养足够时期后，UTC将由于来自产后组织的迁移或细胞分裂或两者而长出。在本发明的一些实施例中，将UTC传代或取出到分开的培养容器中，所述培养容器含有与最初使用的培养基相同或不同类型的新鲜培养基，细胞群可在所述培养容器中以有丝分裂方式扩增。本发明的细胞可在0代和衰老之间的任何时间点使用。细胞优选传代约3至约25次，更优选传代约4至约12次，并且优选传代10或11次。可进行克隆和/或亚克隆以确认已分离出无性细胞群。
在某些实施例中，产后组织中存在的不同细胞类型分级成由其可分离UTC的亚群。可使用标准细胞分离技术完成分级或选择，包括但不限于酶促处理以将产后组织解离成其组分细胞，然后克隆和选择特定的细胞类型，包括但不限于基于形态标志物和/或生物化学标志物的选择；期望细胞的选择性生长(阳性选择)、不需要细胞的选择性破坏(阴性选择)；基于例如使用大豆凝集素在混合群体中的差异细胞凝集性的分离；冻-融工序；混合群体中的细胞的附着性差异；过滤；常规和区带离心；离心淘洗(逆流离心)；单位重力分离；逆流分配；电泳；以及荧光激活细胞分选(FACS)来实现分级或选择。关于克隆选择和细胞分离技术的综述，参见Freshney，1994，Culture ofAnimal Cells：A Manual ofBasic Techniques，第3版，Wiley-Liss,Inc.,New York，所述参考文献以引用方式并入本文。
培养基根据需要进行更换，例如，通过例如用移液器小心地从培养皿中抽出培养基并且补充新鲜培养基。继续温育直至培养皿中积聚足够数量或密度的细胞。可去除原始外植入组织部分，并且剩余细胞使用标准技术或使用细胞刮刀进行胰蛋白酶消化。胰蛋白酶消化之后，收集细胞，移至新鲜培养基中并如上温育。在一些实施例中，胰蛋白酶化后大约24小时将培养基更换至少一次以去除任何漂浮的细胞。培养物中剩余的细胞视为UTC。
UTC可进行冷冻保存。因此，用于自体转移(用于母亲或孩子)的UTC可来源于孩子出生后的适当产后组织，然后冷冻保存以便可在它们以后需要移植的情况下使用。
B.脐带组织来源的细胞的特征
虽然hUTC可基于例如CD45、CD13和CD10以及上文和下文实例中讨论的其他标志物的存在与PBMC区别，但hUTC具有多种其他独特特征。
UTC可通过例如下列进行表征：生长特征(例如群体倍增能力、倍增时间、至衰老的传代次数)、核型分析(例如正常核型；母体或新生儿谱系)、流式细胞术(例如FACS分析)、免疫组织化学和/或免疫细胞化学(例如用于检测表位)、基因表达谱分析(例如基因芯片阵列；聚合酶链反应(例如，逆转录酶PCR、实时PCR和常规PCR))、蛋白质阵列、蛋白质分泌(例如，通过PDC条件培养基的血浆凝固测定法或分析，例如通过酶联免疫吸附测定(ELISA))、混合淋巴细胞反应(例如，作为PBMC刺激的量度)和/或本领域已知的其他方法。
来源于脐组织的合适UTC的例子于2004年6月10日保藏在美国典型培养物保藏中心(10801University Boulevard,Manassas,VA 20110)，并且指定如下ATCC登录号：(1)株系名称UMB 022803(P7)被指定为登录号PTA-6067；并且(2)株系名称UMB 022803(P17)被指定为登录号PTA-6068。
在各种实施例中，UTC具有下列生长特点中的一种或多种：(1)它们需要L-缬氨酸用于在培养中生长；(2)它们能够在含有约5％至至少约20％氧的大气中生长；(3)它们在培养时具有在达到衰老之前经历至少约40次倍增的潜力；以及(4)它们在涂覆或未涂覆组织培养容器上附着和扩增，其中所述涂覆组织培养容器包含明胶、层粘连蛋白、胶原、多鸟氨酸、玻连蛋白或纤连蛋白的涂层。
在某些实施例中，UTC具有在细胞传代时维持的正常核型。核型分析的方法是本领域技术人员可利用且已知的。
在其他实施例中，UTC可通过某些蛋白质的产生进行表征，包括：(1)产生组织因子、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白中的至少一种；以及(2)产生CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α、PD-L2和HLA-A,B,C细胞表面标志物中的至少一种，如通过流式细胞术检测的。在其他实施例中，UTC可通过下列进行表征：缺乏CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、CD141、CD178、B7-H2、HLA-G和HLA-DR,DP,DQ细胞表面标志物中的至少一种的产生，如通过流式细胞术检测的。特别优选的是产生组织因子、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白中的至少两种的细胞。还优选的是产生蛋白质组织因子、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白中的所有三种的那些细胞。
在其他实施例中，UTC可通过下列进行表征：相对于其为成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人细胞，基因表达对于编码下列中的至少一种的基因是增加的：白介素8；浆膜蛋白1；趋化因子(C-X-C基序)配体1(黑素瘤生长刺激活性，α)；趋化因子(C-X-C基序)配体6(粒细胞趋化蛋白2)；趋化因子(C-X-C基序)配体3；以及肿瘤坏死因子，α-诱导蛋白3。
在另外其他实施例中，UTC可通过下列进行表征：相对于其为成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人细胞，基因表达对于编码下列中的至少一种的基因是增加的：矮小同源盒2；热休克27kDa蛋白2；趋化因子(C-X-C基序)配体12(基质细胞来源因子1)；弹性蛋白(主动脉瓣上狭窄，威廉斯-博伊伦综合征)；智人(Homo sapiens)mRNA；cDNADKFZp586M2022(来自克隆DKFZp586M2022)；间充质同源盒2(生长终止特异性同源盒)；sineoculis同源盒同源物1(果蝇属)晶状体蛋白，αB；形态发生紊乱关联激活因子2；DKFZP586B2420蛋白；类似于neuralin 1；四连接素(纤溶酶原结合蛋白)；src同源3(SH3)和富含半胱氨酸的结构域；胆固醇25-羟化酶runt相关转录因子3；白介素11受体，α；前胶原C-内肽酶增强子；卷曲同源物7(果蝇属)；假设基因BC008967；胶原，VIII型，α1；腱生蛋白C(hexabrachion)；易洛魁族同源盒蛋白5；膜铁转运辅助蛋白；整联蛋白，β8；突触小泡糖蛋白2；成神经细胞瘤，抑制瘤变蛋白1；胰岛素样生长因子结合蛋白2，36kDa；智人cDNAFLJ12280fis，克隆MAMMA1001744；细胞因子受体样因子1；钾中间/小电导钙活化通道，亚家族N，成员4；整联蛋白，β7；具有PDZ结合基序的转录共激活因子(TAZ)；sine oculis同源盒同源物2(果蝇属)；KIAA1034蛋白；囊泡相关膜蛋白5(肌短蛋白)；含EGF腓骨蛋白样胞外基质蛋白1；早期生长反应因子3；远端缺失同源盒5；假定蛋白FLJ20373；醛酮还原酶家族1，成员C3(3-α羟基类固醇脱氢酶，II型)；双糖链蛋白聚糖；具有PDZ结合基序的转录共激活因子(TAZ)；纤连蛋白1；前脑啡肽；整联蛋白，β样1(具有EGF样重复结构域)；智人mRNA全长插入cDNA克隆EUROIMAGE 1968422；EphA3；KIAA0367蛋白；尿钠排泄肽受体C/鸟苷酸环化酶C(利尿钠排泄肽受体C)；假定蛋白FLJ14054；智人mRNA；cDNA DKFZp564B222(来自克隆DKFZp564B222)；BCL2/腺病毒E1B 19kDa相互作用蛋白质3样；AE结合蛋白1；以及细胞色素c氧化酶VIIa亚基多肽1(肌肉)。
在其他实施例中，UTC可通过在培养时分泌下列中的至少一种进行表征：MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1b、1309、MDC RANTES和TIMPL。另外，UTC可通过在培养时缺乏下列中的至少一种的分泌进行表征：TGF-β2、ANG2、PDGFbb、MIP1A和VEGF。
在一些实施例中，UTC来源于基本上不含血液的脐带组织、能够在培养中自我更新和扩增、需要缬氨酸用于生长、可在至少约5％的氧中生长、并且包含下列特征中的至少一种：在培养中至少约40倍增的潜能；在涂覆或未涂覆组织培养容器上附着和扩增，所述组织培养容器包含明胶、层粘连蛋白、胶原、多鸟氨酸、玻连蛋白或纤连蛋白的涂层；产生波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白；产生CD10、CD13、CD44、CD73和CD90；以及相对于人细胞的基因表达对于编码白介素8和浆膜蛋白1的基因是提高的，所述人细胞是成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞。在一些实施例中，此类UTC不产生CD45和CD117。
在优选的实施例中，细胞具有上文列出的生长、蛋白质/表面标志物产生、基因表达或物质分泌特征中的两种或更多种。更优选的是包含特征中的三种、四种、五种或更多种的细胞。还更优选的是包含特征中的六种、七种、八种或更多种的UTC。更优选的是包含所有上述特征的细胞。
在目前优选与本发明多个方面一起使用的细胞中有具有上述特征的产后细胞，并且更具体地是这样的细胞：其中细胞具有正常核型并随传代进行，保持正常核型，并且进一步地，其中细胞表达标志物CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A,B,C中的每一种，其中细胞产生免疫学可检测的对应于所列标志物的蛋白质。还更优选的是这样的细胞：其除了前述之外，不产生对应于标志物CD31、CD34、CD45、CD117、CD141或HLA-DR,DP,DQ中的任何一种的蛋白，如通过流式细胞术检测。
在一个实施例中，UTC分离自基本上不含血液的人脐带组织、能够在培养中自我更新和扩增、具有分化的潜力、缺乏CD117或CD45的产生、表达CD10和CD13、并且不表达hTERT或端粒酶。这些UTC任选表达氧化低密度脂蛋白受体1、浆膜蛋白、趋化因子受体配体3、和/或粒细胞趋化蛋白；和/或不表达CD31或CD34；和/或相对于人成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞，表达增加水平的白介素8或浆膜蛋白1；和/或表达CD44、CD73和CD90。
在另一个实施例中，UTC分离自基本上不含血液的人脐带组织、能够在培养中自我更新和扩增、具有分化的潜能、表达CD10、CD13、CD90和HLA-ABC、并且不表达CD34、CD45、CD117和HLA-DR。任选地，这些细胞不表达hTERT或端粒酶。在一个实施例中，细胞还表达CD44和CD43。在另外一个实施例中，细胞还不表达CD31。这些UTC任选地：(i)表达氧化低密度脂蛋白受体1、浆膜蛋白、趋化因子受体配体3、和/或粒细胞趋化蛋白；和/或(ii)相对于人成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞，表达增加水平的白介素8或浆膜蛋白1。
在替代实施例中，UTC分离自基本上不含血液的人脐带组织、能够在培养中自我更新和扩增、具有分化的潜能、并且具有下列特征：(1)表达CD10、CD13、CD44、CD90和HLA-ABC；(2)不表达CD31、CD34、CD45、HLA-DR和CD117；以及(3)不表达hTERT或端粒酶。在另一个实施例中，UTC分离自基本上不含血液的人脐带组织、能够在培养中自我更新和扩增、具有分化的潜能、并且具有下列特征：(1)表达CD10、CD13、CD44、CD90和HLA-ABC；(2)不表达CD31、CD34、CD45、HLA-DR和CD117；(3)不表达hTERT或端粒酶；(4)表达氧化低密度脂蛋白受体1、浆膜蛋白、趋化因子受体配体3、和/或粒细胞趋化蛋白；以及(5)相对于人成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞，表达增加水平的白介素8或浆膜蛋白1。
在一个实施例中，hUTC作为细胞群提供，所述细胞群可以是同质的。在一些实施例中，细胞群可以是异质的。本发明的异质细胞群可包含至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％本发明的UTC。本发明的异质细胞群还可包含干细胞或其他祖细胞，例如成肌细胞或其他肌肉祖细胞、成血管细胞或血管前体细胞；或它还可包含完全分化的骨骼肌细胞、平滑肌细胞、外膜细胞或血管内皮细胞。在一些实施例中，群体是基本上
另外，如下列实例和说明书的其他地方中使用的，可使用筛选方法鉴定的hUTC可根据美国专利7,510,873；7,524,489；和美国公开申请2005/0058631的公开内容进行分离并表征，所述专利全文以引用方式并入，因为它们涉及hUTC的描述、分离和表征。此外，使用磁珠的富集操作在美国专利7,863,012和美国公开申请2011/0147180中描述，所述专利全文并入，因为它们涉及富集操作和磁珠。
无需进一步描述，相信本领域的普通技术人员能够利用前述说明和以下例示性实例制造和利用本发明并实践本发明所主张的方法。因此，以下工作实例具体指出本发明的优选实施例，且不应被视为以任何方式限制本公开的其余内容。
实例
实例1
hUTC的分离、维持和扩增
人脐带组织来源的细胞从四个供体中分离并且在补充有15％胎牛血清的生长培养基中繁殖，如上文美国专利7,510,873；7,524,489；和美国公开申请2005/0058631和下文实例中所述。将早期传代培养物冷冻保存，以生成开发细胞库和工作细胞库，分别称为DCB和WCB。hUTC的活培养物通过使用下列两种方法之一进行维持：1)作为组织培养瓶中的贴壁培养物；和2)作为旋转瓶或搅拌槽生物反应器中的悬浮培养物。对于后面一种方法首先将细胞种植到微载体上。
如下对三组样本实施微阵列分析：(1)研究1(供体微阵列研究)；(2)研究2(温度漂移(Temperature excursion)研究)；和(3)研究3(生物标志物研究)。
研究1(供体微阵列研究)
在该组样本中，细胞在旋转瓶中进行培养，从早期传代细胞系群体倍增PDL 5开始并以PDL44结束。典型培养物通过用约5×105细胞/ml的接种物种植新鲜的生长培养基起始，并且不受干扰4天，在这时实现峰活细胞密度(约3-4×106细胞/mL的VCD)。定期收获培养物的等分试样，总共三十二(32)份样本。下表1-1列出了研究中的样本。
细胞的收获在如图1中所示的四天生长中的任一天进行(右手侧)。根据32份样本的列表，选择24份用于微阵列分析。图1显示了当收获特定样本时的群体倍增水平(PDL)和生长曲线的区域。
研究2(温度漂移研究)
在该组样本中，细胞在收获前保持在范围为25℃至42℃的温度下高达18小时。在该研究中使用的样本显示于下表1-2中。
研究3(生物标志物研究)
对于该研究，使用一组八(8)份样本。细胞在搅拌槽生物反应器中扩增并在PDL30时收获。在该研究中使用的样本显示于下表1-3中。
数据分析
AffymetrixHT HG-U133+PM阵列用于微阵列数据生成。数据在两个阶段中进行分析。在第一步骤中，由温度漂移研究(研究2，表1-2)生成微阵列数据，以比较hUTC的表达谱与人PBMC的表达谱。PBMC中的多种基因的表达水平得自公开来源，包括由美国国家卫生研究院管理的美国国家生物技术研究中心(NCBI)数据库。在第二步骤中，使用由研究1产生的微阵列数据和来自研究3生成的八(8)份样本的存档数据(参见表1-1和1-3)。hUTC的表达谱与(1)人PBMC和(2)大鼠PBMC的表达谱进行比较。人PBMC的表达谱得自健康人受试者(NCBI数据库研究GSE14642)，而大鼠PBMC的表达谱得自NCBI数据库研究GSE11083和GSE19537。人血细胞(B细胞、NK细胞、树突状细胞、淋巴样T细胞、骨髓样单核细胞和嗜中性粒细胞)的亚型的表达谱也得自NCBI数据库(研究GSE22886和研究GSE3982)。另外，采掘Gene Ontology和Entrez数据库鉴定了3976种人质膜蛋白基因(GO:0005886)、355种细胞表面蛋白基因(GO:0009986)和349种CD抗原基因。2614种人和大鼠质膜蛋白基因和288种细胞表面蛋白基因的子集与人和大鼠微阵列上的基因匹配，并且315种CD抗原基因与人微阵列匹配，包括用于该研究。
基于表达信号的动态，即大于或等于十的log2(强度)作为用于所有数据集的高表达信号的阈值，鉴定了来自在两类样本中均高度表达的超过200种基因的314种探针集合列表。在两种情况下，选择其表达在hUTC中显著不同于在人PBMC中的表达的基因并且进行排序。表1-4显示了在研究2中生成的基因列表，其表达水平在hUTC和人PBMC之间显著不同。这些包括细胞表面和质膜蛋白以及细胞内蛋白。
在表1-4中，在所有三组样本中鉴定的基因是有下划线的。更详细地检查的基因是粗体的(它们包括DKK3、LAMB1、ANPEP(CD13)、LAMP1(CD107a)、PTPRC(CD45)、MME(CD10)和NRP1)。
表1-5显示了其表达水平在hUTC和人PBMC之间显著不同的基因列表(在研究1和研究2中生成的)。在表1-5中，下划线指示在所有三组样本即研究1、2和3中鉴定的基因(它们包括LAMB1、DKK3和CAP2)。更详细地检查的基因是粗体的(它们包括ANPEP(CD13)、LAMP1(CD107a)、PTPRC(CD45)、MME(CD10)和NRP 1)。
如表1-5中所示，通过分析包含研究2和3的样本组鉴定了十一种基因，包括在所有三组样本中鉴定的三种基因。在这十一种基因中，更详细地检查了七种基因(NRP1、DKK3、LAMP1、LAMB1、MME(CD10)、PTPRC(CD45)和ANPEP(CD13))。
在这七种基因中，NRP1、DKK3、LAMP1、LAMB1和MME(CD10)是细胞表面标志物，而表达蛋白质PTPRC(CD45)和ANPEP(CD13)是细胞内定位的。比较三种基因即PTPRC(CD45)(基因ID#207238)、MME(CD10)(基因ID#203434)、和ANPEP(CD13)(基因ID#202888)在hUTC和其为PBMC的多个类型的人血细胞中的表达水平。在hUTC和包含人PBMC的多个类型的血细胞中的该细胞表面蛋白基因PTPRC(CD45)、MME(CD10)和ANPEP(CD13)表达的比较分别显示于图2A、B和C中。
实例2
鉴定的标志物的RT-PCR证实
随后通过RT-PCR证实实例1中鉴定的所选基因在hUTC和人PBMC中的转录水平。其在hUTC中的表达与在人PBMC中的表达相比较的选择基因的RT-PCR结果显示于图3中。
为了获得这些结果，分离来自每个hUTC制剂的总RNA，随后由其制备cDNA。对于每种基因特异性的荧光探针随后用于进行使用cDNA作为模板的RT-PCR反应。
图3显示了在hUTC和PBMC中的MME(CD10)、ANPEP(CD13)、PTPRC(CD45)、DKK3、LAMB1、NRP1、GAPPD和HPRT1的RT-PCR结果。除看家基因GAPDH和HPRT外，与人PBMC相比较，所有测试的基因均显示在hUTC中的更大丰度。仅PTPRC(CD45)的表达在hUTC中较不丰富，所述PTPRC(CD45)用作阴性对照，并已知在人PBMC中高度表达。参考图3，更高的CT值指示更低量的转录物。
因为PBMC包含多个类型的血细胞，所以比较在这些细胞类型各自中表达的选择基因的基因表达谱与hUTC的基因表达谱。如图2B中所示，虽然与在hUTC中的表达相比较时，MME(CD10)在PBMC中的相对表达很低，但它在嗜中性粒细胞中的相对表达很高。类似地，虽然ANPEP(CD13)在hUTC中的表达可与人PBMC的表达相比较(参见图2C)，但它在T细胞和巨噬细胞中的相对表达高于hUTC的表达。
实例3
通过流式细胞术检测PBMC中的hUTC
根据在hUTC和人PBMC中显示差异表达的基因列表(参见表1-4和1-5)，选择在细胞表面和/或质膜上表达基因产物的五种基因的子集。另外，选择表达细胞内表达相应蛋白质产物的两种基因。这些标志物包括NRP1、DKK3、LAMB、LAMP1、MME(CD10)、PTPRC(CD45)和ANPEP(CD13)。
对于流式细胞术测定法，细胞在指数期收获，并且随后使用购自BD Bioscience的试剂盒进行固定并渗透化处理。该制剂的等分试样随后与针对所选标志物的抗体一起温育，所述标志物鉴定为存在于hUTC表面上，即CD10、CD13、CD45、NRP1和LAMP 1。在去除过量抗体后，使细胞与荧光标记的二抗一起温育。细胞随后通过流式细胞术进行分析。
关于用于检测细胞表面、质膜和细胞内标志物的流式细胞术测定法结果显示于图4A至4C中。图4A显示了使用hUTC测试的细胞表面标志物，其中上图是对照。图4B显示了使用PBMC测试的细胞表面标志物，其中上图是对照。图4C显示了用于检测PBMC和hUTC中的内部标志物DKK3和LAMP1的流式细胞术测定法的结果。
参考图4A，观察到90％的hUTC群体是CD13阳性的(CD13+)，观察到75％的hUTC群体是CD10阳性的(CD104)，并且观察到17％的hUTC群体是NRP1阳性的(NRP1+)。观察到的hUTC群体无一是对于CD45或LAMP1阳性的。
参考图4B，观察到6％的PBMC群体是CD13阳性的(CD13+)，观察到2％的PBMC群体是CD10阳性的(CD10+)，观察到4％的PBMC群体是NRP1阳性的(NRP1+)，并且观察到72％的PBMC群体是CD45阳性的(CD45+)。观察到的PBMC群体无一是对于LAMP1阳性的。
参考图4C，显示了关于细胞内标志物DKK3和LAMP1的流式细胞术数据。观察到52％的PBMC群体是DKK3阳性的。观察到23％的PBMC群体是DKK3阳性的。图4C指示LAMP 1是用于hUTC的良好内部标志物。
除NRP1外，细胞表面蛋白基因标志物可以用检测在血清中含有PBMC的混合样本中的完整的活hUTC(参见图4A和4B)。尽管与人PBMC相比较，NRP1在hUTC中以更高水平转录(图3)，但NRP1无法通过流式细胞术在hUTC中进行检测(参见图4A)。就CD45而言，如预期的，高水平的CD45仅在活的人PBMC表面上表达(参见图4B)。另外，还检查了两种细胞内标志物LAMP1和DKK3(根据差异表达基因列表，表1-4)与人PBMC相比较，其表达在hUTC中更高)(参见图4C)。这些标志物可用作hUTC身份的另外证实。
如通过流式细胞术测定的hUTC和人PBMC之间的差异显示于下表3-1中。
下表3-2概括了如通过上文实例2中的RT-PCR和本实例中的流式细胞术测定的，在hUTC和PBMC之间的差异。在表3-2中，未测定Nd平均值。
实例4
在hUTC和人PBMC的混合物中的hUTC检测
为了证实血液中的hUTC检测，将多个浓度的hUTC与1百万人PBMC混合。随后使用CD45(关于PBMC的阳性分析物)、CD10和CD13(关于hUTC的阳性分析物)，通过流式细胞术分析该混合物。具体地，在包含hUTC(范围为1,500细胞/ml至110,000细胞/mL)和人(1百万细胞/mL)的混合物中的hUTC检测显示于图5A和5B中。
将两类细胞在1ml人血清中在室温下混合。其后立即使用作为关于hUTC的标志物的CD10和关于PBMC的标志物的CD45，通过流式细胞术分析混合物的等分试样。在图5A中，hUTC的浓度范围为1,500至1,700细胞/ml，并且人PBMC的浓度范围为1百万细胞/ml。在图5B中，hUTC的浓度范围为1,700至110,000细胞/ml，并且人PBMC的浓度范围为1百万细胞/ml。
如由图5A可见的，如果样本含有在1百万人PBMC的存在下的1,700或更多hUTC/ml，则使用流式细胞术的测定准确度更高(R2＝0.94)。如果样本含有在1百万人PBMC的存在下的1,500至1,700hUTC/ml(图5B)，则使用流式细胞术的测定准确度更低(R2＝0.51)。
实例5
hUTC的分离
脐细胞分离。脐带得自国家疾病研究交流会(NDRI,Philadelphia,PA)。在正常分娩后获得所述组织。在层流罩中无菌地进行细胞分离方案。为了去除血液和碎片，在以100U/ml的青霉素、以100mg/ml的链霉素和以0.25μg/mL的两性霉素B(Carlsbad,CA)的存在下，在磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS；Invitrogen,Carlsbad,CA)中洗涤脐带。
然后在50ml培养基(DMEM-低葡萄糖或DMEM-高葡萄糖；Invitrogen)的存在下，将组织在150cm2组织培养板中进行机械离解，直至将组织切成细浆。将切碎的组织转移到50ml锥形管(大约每管5克组织)。
随后将组织在DMEM-低葡萄糖培养基或DMEM-高葡萄糖培养基中消化，所述培养基各自含有以100U/ml的青霉素、以100mg/ml的链霉素、以0.25μg/ml的两性霉素B和消化酶。在一些实验中，使用胶原酶和分散酶的酶混合物(“C:D”)(在DMEM-低葡萄糖培养基中的胶原酶(Sigma,St Louis,MO)，500U/ml；和分散酶(Invitrogen)，50U/ml)。在其他实验中，使用胶原酶、分散酶和透明质酸酶的混合物(C:D:H)(C:D:H＝在DMEM-低葡萄糖中的胶原酶，500U/ml；分散酶；50U/ml；和透明质酸酶(Sigma)，5U/ml)。含组织、培养基和消化酶的锥形管在37℃、225rpm的轨道式摇床(Environ,Brooklyn,NY)中温育2小时。
消化后，将组织在150×g下离心5分钟，吸出上清液。将团块重悬浮于20ml生长培养基(DMEM:低葡萄糖(Invitrogen)、15％(v/v)胎牛血清(FBS；限定胎牛血清；批号AND18475；Hyclone,Logan,UT)、0.001％(v/v)2-巯基乙醇(Sigma)、以100U/ml的青霉素、以100μg/ml的链霉素和以0.25μg/ml的两性霉素B(各自来自Invitrogen,Carlsbad,CA)。通过70μm尼龙BD FALCON的细胞滤网(BD Biosciences,San Jose,CA)过滤细胞悬浮液。使另外5ml包含生长培养基的冲洗液经过滤网。然后使细胞悬浮液经过40μm尼龙细胞滤网(BDBiosciences,San Jose,CA)，并且使另外5ml包含生长培养基的冲洗液通过。
将滤液重悬浮于生长培养基(总体积为50ml)中，并在150×g下离心5分钟。抽吸上清液，并将细胞重悬浮于50ml新鲜生长培养基中。这个过程再重复两次。
在最后一次离心后，抽吸上清液，并将细胞团块重悬浮于5ml新鲜生长培养基中。使用台盼蓝染色确定活细胞数量。然后在标准条件下培养细胞。
将从脐带组织分离的细胞以5,000细胞/cm2种植到明胶涂布的T-75cm烧瓶(Corning Inc.,Corning,NY)上的生长培养基中。在两天后，从烧瓶中抽吸耗尽的培养基和非贴壁细胞。用PBS洗涤贴壁细胞三次，以去除碎片和血液来源的细胞。然后为细胞补充生长培养基，并允许细胞生长至汇合(从第0代到第1代约10天)。在后续的传代中(从第1代至第2代等)，细胞在4-5天内达到亚汇合(75-85％汇合)。对于这些后续的传代，细胞以5,000细胞/cm2种植。细胞在含5％二氧化碳的加湿培养箱中在37℃下生长。
在一些实验中，在用LIBERASE(2.5mg/ml，Blendzyme 3；Roche AppliedSciences,Indianapolis,IN)和透明质酸酶(5U/ml，Sigma)消化后，从在DMEM-低葡萄糖培养基中的产后组织中分离细胞。组织消化和细胞分离如上文对于其他蛋白酶消化描述的，然而，使用LIBERASE/透明质酸酶混合物代替C:D或C:D:H酶混合物。用LIBERASE的组织消化导致从产后组织中分离容易扩增的细胞群体。
比较使用不同酶组合从脐带中分离细胞的操作。对于消化进行比较的酶包括：i)胶原酶；ii)分散酶；iii)透明质酸酶；iv)胶原酶:分散酶混合物(C:D)；v)胶原酶:透明质酸酶混合物(C:H)；vi)分散酶:透明质酸酶混合物(D:H)；和vii)胶原酶:分散酶:透明质酸酶混合物(C:D:H)。观察到利用这些不同酶消化条件在细胞分离中的差异(参见表5-1)。
作出通过不同方法从脐带中分离细胞库的其他尝试。在一种情况下，将脐带切片并用生长培养基洗涤，以取出血块和凝胶状材料。收集血液、凝胶状材料和生长培养基的混合物，并且以150xg离心。将团块重悬浮并种植到明胶涂布的烧瓶上的生长培养基中。根据这些实验，分离容易扩增的细胞群。
细胞还已从得自NDRI的脐带血液样本中分离。使用的分离方案是由Ho等人的国际专利申请PCT/US2002/029971的分离方案。将脐带血液样本品(分别为50ml和10.5ml)(NDRI，Philadelphia PA)与裂解缓冲液(过滤灭菌的155mM氯化铵、10毫摩尔碳酸氢钾、0.1mM EDTA缓冲至pH7.2(所有组分均来自Sigma,St.Louis,MO))混合。细胞以1:20脐带血与裂解缓冲液的比率进行裂解。将所得的细胞悬浮液涡旋5秒，并且在环境温度下温育2分钟。将裂解产物离心(以200xg 10分钟)。将细胞团块重悬浮于完全最低必需培养基(Gibco,Carlsbad CA)中，所述培养基含有10％胎牛血清(Hyclone,Logan UT)、4mM谷氨酰胺(Mediatech Herndon,VA)、以100U/ml的青霉素和以100μg/ml的链霉素(Gibco,Carlsbad,CA)。将重悬浮的细胞离心(以200xg 10分钟)，抽吸上清液，并且在完全培养基中洗涤细胞团块。将细胞直接种植到T75烧瓶(Corning,NY)、T75层粘连蛋白涂布的烧瓶、或T175纤连蛋白涂布的烧瓶(两者均来自Becton Dickinson,Bedford,MA)内。
为了测定细胞群是否可在不同条件下分离并在分离后立即在多种条件下扩增，将细胞在含或不含0.001％(v/v)2-巯基乙醇(Sigma,St.Louis,MO)的生长培养基中消化，使用C:D:H的酶组合，根据上文提供的操作。所有细胞均在以100U/ml的青霉素和以100μg/ml的链霉素的存在下生长。在所有测试的条件下，细胞在第0代和第1代之间均良好贴壁并扩增(表5-2)。在条件5-8和13-16中的细胞证实在种植后良好增殖直到4次传代，在所述点下它们进行冷冻保存。
C:D:H的组合提供在分离后的最佳细胞得率，并且在培养中生成比其他条件扩增更多代的细胞(表5-1)。可扩增的细胞群无法使用单独的胶原酶或透明质酸酶获得。不作出测定该结果是否对于测试的胶原酶特异性的尝试。
细胞在对于酶消化和生长测试的所有条件下在第0代和第1代之间均良好贴壁并扩增(表5-2)。在实验条件5-8和13-16中的细胞在种植后良好增殖直到四次传代，在所述点下它们进行冷冻保存。所有细胞均冷冻保存用于进一步分析。
有核细胞快速贴壁并生长。这些细胞通过流式细胞术进行分析，并且类似于通过酶消化获得的细胞。
该制剂含有红血细胞和血小板。在前3周过程中有核细胞未贴壁并分裂。在种植后3周更换培养基，并且未观察到细胞贴壁并生长。
细胞群可使用酶组合胶原酶(金属蛋白酶)、分散酶(中性蛋白酶)和透明质酸酶(分解透明质酸的粘液分解酶)有效地从脐组织中分离。还可使用其为胶原酶和中性蛋白酶的共混物的LIBERASE。其为胶原酶(4Wunsch U/g)和嗜热菌蛋白酶(1714酪蛋白U/g)的Blendzyme 3也连同透明质酸酶一起用于分离细胞。当在明胶涂布的塑料上的生长扩增培养基中培养时，这些细胞容易地经过多次传代扩增。
细胞还从脐带中的残留血液而不是脐带血中分离。从组织中洗涤的血块中的细胞的存在可能是由于在解剖过程期间释放的细胞，所述在使用的条件下贴壁并生长。
实例6
细胞的核型分析
在细胞疗法中使用的细胞系优选是同质的并且不含任何污染细胞类型。在细胞疗法中使用的人细胞应具有含正常结构的正常数目(46)的染色体。为了鉴定脐来源的细胞系是同质的并且不含非脐组织起源的细胞，分析细胞样本的核型。
来自男性新生儿的产后组织的UTC在生长培养基中进行培养。选择来自男性新生儿(X,Y)的产后组织，以允许区别新生儿来源的细胞和母体来源的细胞(X,X)。细胞以5,000细胞/平方厘米种植到T25烧瓶(Corning,Corning,NY)中的生长培养基中，并且扩增至80％汇合。含有细胞的T25烧瓶用生长培养基填充至颈部。通过快递将样本递送至临床细胞遗传学实验室(估计的实验室至实验室运输时间为一小时)。染色体分析由New Jersey MedicalSchool,Newark,NJ的人类和分子遗传学中心(Center for Human&Molecular Genetics)进行。细胞在中期过程中进行分析，在所述中期时染色体是最佳显现的。在计数的处于中期的二十个细胞中，五个就正常同质核型数目(二)进行分析。如果观察到两个核型，则细胞样本表征为同质的。如果观察到超过两个核型，则细胞样本表征为异质的。当鉴定异质核型数目(四)时，计数并分析另外的中期细胞。
送往染色体分析的所有细胞样本均由细胞遗传学实验室人员解释为显示出正常外观。分析的十六种细胞系中的三种显示出异质表型(XX和XY)，指示来源于新生儿和母体起源的细胞的存在(表6-1)。细胞样本各自表征为同质的。(表6-1)。
染色体分析鉴定脐来源的UTC，如由临床细胞遗传学实验室解释的，所述UTC的核型看起来是正常的。核型分析还鉴定不含母体细胞的细胞系，如由同质核型测定的。
实例7
细胞表面标志物的流式细胞术评估
通过流式细胞术的细胞表面蛋白或“标志物”的表征可用于测定细胞系的身份。表达的一致性可由多个供体以及在暴露于不同处理和培养条件的细胞中进行测定。从脐中分离的产后细胞系通过流式细胞术进行表征，提供用于鉴定这些细胞系的谱。
细胞在等离子处理的T75、T150和T225组织培养瓶(Corning,Corning,NY)中的生长培养基中培养直至汇合。通过在室温下温育2％(重量体积比)明胶(Sigma,St.Louis,MO)20分钟，使烧瓶的生长表面涂布明胶。
烧瓶中的贴壁细胞在磷酸盐缓冲盐水(PBS)；(Gibco,Carlsbad,MO)中进行洗涤，并且用胰蛋白酶/EDTA(Gibco)解离。将细胞收获、离心并以1×107/ml的细胞浓度重悬浮于PBS中的3％(v/v)FBS中。根据制造商说明书，将针对目的细胞表面标志物的抗体(参见下文)添加到100μl细胞悬浮液中，并将混合物在4℃下在黑暗中温育30分钟。温育后，将细胞用PBS洗涤，并离心去除未结合抗体。将细胞重悬浮于500μl PBS中，并通过流式细胞术进行分析。用FACS calibur仪器(Becton Dickinson,San Jose,CA)进行流式细胞术分析。
使用针对细胞表面标志物的下列抗体：
脐来源的细胞在第8、15和20代时进行分析。
为了比较在供体中的差异，来自不同供体的脐带组织来源的细胞彼此进行比较。在明胶涂布的烧瓶上培养的脐来源的细胞也与在无涂布的烧瓶上培养的脐来源的细胞进行比较。
比较了用于细胞分离和制备的四种处理。比较通过用下列处理的来源于产后组织的细胞：1)胶原酶；2)胶原酶/分散酶；3)胶原酶/透明质酸酶；和4)胶原酶/透明质酸酶/分散酶。
通过流式细胞术分析的在第8、15和20代时的脐带来源的细胞均表达CD10、CD13、CD44、CD73、CD 90、PDGFr-α和HLA-A、B、C，通过相对于IgG对照增加的荧光指示的。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ是阴性的，如与IgG对照一致的荧光值所指示。
通过流式细胞术分析的从分开供体分离的脐带来源的细胞各自显示对于CD10、CD13、CD44、CD73、CD 90、PDGFr-α和HLA-A、B、C产生是阳性的，反映相对于IgG对照增加的荧光值。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ产生是阴性的，其中荧光值与1gG对照一致。
通过流式细胞术分析的在明胶涂布的烧瓶和未涂布的烧瓶上扩增的脐带来源的细胞对于CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A、B、C产生均为阳性的，具有相对于IgG对照增加的荧光值。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ产生是阴性的，其中荧光值与IgG对照一致。
通过流式细胞术分析脐带来源的细胞已确定这些细胞系的身份。这些脐带来源的细胞对于CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A,B,C是阳性的；并且对于CD31、CD34、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ是阴性的。该身份与变量中的变化一致，所述变化包括供体、传代、培养容器表面涂层、消化酶和胎盘层。观察到单独荧光值直方曲线平均值和范围中的一些变化，但在测试的所有条件下的所有阳性曲线均为正态的，并且表达大于IgG对照的荧光值，从而证实了细胞包含具有标志物的阳性表达的同质群体。
实例8
通过寡核苷酸阵列的细胞分析
寡核苷酸阵列用于比较脐来源的细胞和胎盘来源的细胞与成纤维细胞、人间充质干细胞和源自人骨髓的另一种细胞系的基因表达谱。该分析提供了产后来源的细胞和这些细胞经鉴定的独特分子标志物的表征。
产后组织来源的细胞。经患者同意在正常足月分娩后从国家疾病研究交流会(NDRI,Philadelphia,PA)获得人脐带和胎盘。接受组织，并且在用C:D:H混合物消化后，如实例5中所述分离细胞。细胞在明胶涂布的塑料组织培养瓶上的生长培养基中进行培养。将培养物在37℃和5％CO2下温育。
成纤维细胞。人表皮成纤维细胞购自Cambrex Incorporated(Walkersville,MD；批号9F0844)和ATCC CRL-1501(CCD39SK)。两种细胞系均在具有10％(v/v)胎牛血清(Hyclone)和青霉素/链霉素(Invitrogen)的DMEM/F12培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中培养。细胞在标准组织培养处理的塑料上生长。
人间充质干细胞(hMSC)。hMSC购自Cambrex Incorporated(Walkersville,MD；批号2F1655、2F1656和2F1657)，并根据制造商说明书在MSCGM培养基(Cambrex)中培养。细胞在37℃和5％CO2下生长于标准组织培养的塑料上。
人髂嵴骨髓细胞(ICBM)。经患者同意，从NDRI收到人髂嵴骨髓。根据由Ho等人(WO03/025149)概述的方法处理骨髓。以1份骨髓对20份裂解缓冲液的比率，将骨髓与裂解缓冲液(155mM NH4Cl、10mM KHCO3和0.1mM EDTA，pH 7.2)混合。对细胞悬浮液进行涡旋，在环境温度下温育2分钟，并在500×g下离心10分钟。弃去上清液，将细胞团块重悬浮于补充有10％(v/v)胎牛血清和4mM谷氨酰胺的最低必需培养基α(Invitrogen)中。再次离心细胞，并将细胞团块重悬浮于新鲜培养基中。使用台盼蓝染色排除法(Sigma,St.Louis,MO)计算存活的单核细胞。将单核细胞以5x104细胞/cm2种植到塑料组织培养瓶中。在标准大气O2或在5％O2下，在37℃和5％CO2下温育细胞。将细胞培养5天而不更换培养基。在培养5天后，去除培养基和非贴壁细胞。在培养中维持贴壁细胞。
用细胞刮刀将活跃生长的细胞培养物从烧瓶取出到冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。以300×g将细胞离心5分钟。除去上清液，并将细胞重悬浮于新鲜PBS中，再次离心。去除上清液，并且将细胞团块立即冷冻并贮存于-80℃下。提取细胞mRNA并转录成cDNA。随后将cDNA转录成cRNA并进行生物素标记。将生物素标记的cRNA与Affymetrix GENECHIP HG-U133A寡核苷酸阵列(Affymetrix,Santa Clara,CA)杂交。杂交和数据收集根据制造商的说明书进行。数据分析使用“Significance Analysis of Microarrays”(SAM)版本1.21计算机软件(Tusher,V.G.等人，2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:5116-5121)进行。分析软件的授权可通过斯坦福大学的技术授权办公室(Office of Technology Licensing,Stanford University)获得，并且更多信息可在万维网上的斯坦福大学统计系的Tibshirani教授网站处获得。
在该研究中分析了十四个不同的细胞群。细胞连同传代信息、培养基底和培养基一起列于表8-1中。细胞系通过其标识代码连同在分析时的传代、细胞生长基底和生长培养基一起列出。
数据通过用如上所述的SAM软件的主成分分析进行评估。分析揭示在测试的细胞中以相对不同的量表达的290种基因。该分析提供了在群体之间的相对比较。
表8-2显示了计算用于比较细胞对的欧氏距离。欧氏距离基于按照不同细胞类型间差异表达的290个基因得出的细胞比较结果。欧氏距离与290种基因的表达之间的相似性成反比。使用在细胞类型之间差异表达的这290种基因，对于细胞类型计算欧氏距离。细胞之间的相似性与欧氏距离成反比。
表8-3、8-4和8-5显示了在胎盘来源的细胞中增加的基因表达(表8-3)、在脐带来源的细胞中增加的基因表达(表8-4)、以及在脐带和胎盘来源的细胞中减少的基因表达(表8-5)。
表8-6、8-7和8-8显示了在人成纤维细胞(表8-6)、ICBM细胞(表8-7)和MSC(表8-8)中增加的基因表达。
表8-7：与测定的其他细胞系相比较，表达在ICBM来源的细胞中增加的基因。
·心锚重复蛋白
·MHC I类ORF区
·整联蛋白，α10
·假定蛋白FLJ22362
·UDP-N-乙酰-α-D-半乳糖胺:多肽N-乙酰半乳糖胺基转移酶3(GalNAc-T3)
·干扰素诱导蛋白44
·SRY(性别决定区Y)-框9(短指发育不良，常染色体性逆转)
·角蛋白相关蛋白1-1
·海马钙结合蛋白样1
·锯齿状1(Alagille综合征)
·蛋白聚糖1，分泌颗粒
进行该实例以提供来源于脐带和胎盘的细胞的分子表征。该分析包括来源于三个不同脐带和三个不同胎盘的细胞。该研究还包括两个种同的真皮成纤维细胞系、三种间充质干细胞系和三种髂嵴骨髓细胞系。由这些细胞表达的mRNA在GENECHIP寡核苷酸阵列上进行分析，所述GENECHIP寡核苷酸阵列含有关于22,000种基因的寡核苷酸探针。
该分析揭示290种基因的转录物在这五种不同细胞类型中以不同量存在。这些基因包括在胎盘来源的细胞中特异性增加的十种基因和在脐带来源的细胞中特异性增加的七种基因。发现五十四种基因在胎盘来源的细胞和脐带组织来源的细胞中具有特异性更低的表达水平。
实例9
细胞表型的免疫组织化学表征
通过免疫组织化学分析在人脐带组织内发现的细胞的表型。
收获人脐带组织并在4℃下在4％(w/v)多聚甲醛中浸泡固定过夜。免疫组织化学使用针对下列表位的抗体进行(参见表8-1)：波形蛋白(1:500；Sigma,St.Louis,MO)、结蛋白(1:150，通过免疫兔制备；Sigma；或1:300，通过免疫小鼠制备；Chemicon,Temecula,CA)、α-平滑肌肌动蛋白(SMA；1:400；Sigma)、细胞角蛋白18(CK18；1:400；Sigma)、血管性血友病因子(vWF；1:200；Sigma)和CD34(人CD34III类；1:100；DAKOCytomation,Carpinteria,CA)。此外，测试了下列标志物：抗人GROα-PE(1:100；Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、抗人GCP-2(1:100；Santa Cruz Biotech,Santa Cruz,CA)、抗人氧化LDL受体1(ox-LDL R1；1:100；Santa Cruz Biotech)和抗人NOGO-A(1:100；Santa Cruz Biotech)。用手术刀修剪固定的样本，然后放置于含乙醇的干冰浴上的OCT包埋化合物(Tissue-Tek OCT；Sakura,Torrance,CA)内。然后使用标准冰冻切片机(徕卡显微系统(Leica Microsystems))对冰冻块进行切片(10μm厚)，并安装于载玻片上进行染色。
免疫组织化学类似于先前研究进行。(例如，Messina等人，Exper.Neural.，2003；184:816-829)。简言之，用磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)洗涤组织切片，并将其暴露于含PBS、4％(v/v)山羊血清(Chemicon,Temecula,CA)和0.3％(v/v)Triton(Triton X-100；Sigma)的蛋白质阻断溶液1小时以接近细胞内抗原。在所关注表位位于细胞表面上(CD34、ox-LDLR1)的情况下，在流程的所有步骤中省略Triton以防止表位丢失。此外，在一抗通过免疫山羊制备(GCP-2、ox-LDL R1、NOGO-A)的情况下，在整个流程中使用3％(体积比)驴血清替代山羊血清。一抗在阻断溶液中稀释后，施加到切片上并在室温下保持4小时。去除一抗溶液，并且在施加含阻断剂连同山羊抗小鼠IgG德克萨斯红(1:250；Molecular Probes,Eugene,OR)和/或山羊抗兔IgG-Alexa 488(1:250；MolecularProbes)或驴抗山羊IgG FITC(1:150；Santa Cruz Biotech)的二抗溶液前(在室温下1小时)，用PBS洗涤培养物。清洗培养物，施加10微摩尔DAPI(Molecular Probes)10分钟，使细胞核显色。
在免疫染色后，使用在奥林巴斯倒置表面荧光显微镜(Olympus,Melville,NY)上的适当荧光滤光器显现荧光。阳性染色表示为超过对照染色的荧光信号。使用彩色数码摄像机和ImagePro软件(Media Cybernetics,Carlsbad,CA)捕获代表性图像。对于三染样本，每幅图像每次仅用一个发射滤片拍摄。使用Adobe Photoshop软件(Adobe,San Jose,CA)制作分层剪辑。
波形蛋白、结蛋白、SMA、CK18、vWF和CD34标志物在脐带内发现的细胞子集中表达(数据未示出)。具体地讲，vWF和CD34表达局限于脐带内所含的血管。CD34阳性的(CD34+)细胞在最内层(腔侧)上。在脐带的所有基质和血管中存在波形蛋白表达。SMA限制于基质以及动脉和静脉的外壁上，但不包含在血管自身内。CK18和结蛋白仅在血管中观察到，结蛋白局限于中层和外层。
这些标志物无一在脐带内观察到(数据未示出)。
波形蛋白、结蛋白、α-平滑肌肌动蛋白、细胞角蛋白18、血管性血友病因子和CD 34在人脐带内的细胞中表达。基于显示仅表达波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白的体外表征研究，数据提示脐带来源的细胞分离的目前过程收获表达波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白的细胞亚群，或分离的细胞改变标志物的表达，以表达波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白。
实例10
营养因子的分泌
测量来自UTC的所选营养因子的分泌。选择具有血管生成活性的因子(例如肝细胞生长因子(HGF)(Rosen等人，Ciba Found.Symp，1997；212:215-26)；单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)(Salcedo等人，Blood，2000；96；34-40)；白介素-8(IL-8)(Li等人，J.Immunol.，2003；170:3369-76)；角质细胞生长因子(KGF)；碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)；血管内皮生长因子(VEGF)(Hughes等人，Ann.Thorac.Surg.2004；77:812-8)；基质金属蛋白酶的组织抑制剂1(TIMP1)；促血管生成素2(ANG2)；血小板来源的生长因子(PDGFbb)；促血小板生成素(TPO)；肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)；基质来源的因子1α(SDF-1α)、神经营养/神经保护活性(脑来源的神经营养因子)(BDNF)(Cheng等人，Dev.Biol.,2003；258；319-33)；白介素-6(IL-6)；粒细胞趋化蛋白-2(GCP-2)；转化生长因子β2(TGFβ2)；或趋化因子活性(巨噬细胞炎症蛋白质lα(MlPlα)；巨噬细胞炎症蛋白质1β(MIP1β)；单核细胞化学吸引剂-1(MCP-1)；Rantes(在活化时调节，通常T细胞表达并分泌的)；1309；胸腺和活化作用调节性趋化因子(TARC)；嗜酸细胞活化趋化因子；巨噬细胞来源的趋化因子(MDC)；和(IL-8)。
在明胶涂布的T75烧瓶上的生长培养基中培养来源于脐带的细胞以及来源于人新生儿包皮的人成纤维细胞。冻存11代的细胞并保存在液氮中。在解冻后，将生长培养基加入所述细胞，随后转移至15ml离心管，并以150×g将细胞离心5分钟。将细胞团块重悬浮于4ml生长培养基中，并对细胞进行计数。细胞以5,000细胞/cm2种植到各自含有15ml生长培养基的T75烧瓶中，并且培养24小时。将培养基换成无血清培养基(DMEM-低葡萄糖(Gibco)、0.1％(w/v)牛血清白蛋白(Sigma)、青霉素(50U/ml)和链霉素(50μg/ml,Gibco))，共8小时。在温育结束时通过在14,000xg下离心5分钟收集条件无血清培养基，并贮存于-20℃下。
为了估计每个烧瓶中的细胞数目，将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤并且使用2ml胰蛋白酶/EDTA(Gibco)解离。通过添加8ml生长培养基来抑制胰蛋白酶活性。以150×g将细胞离心5分钟。去除上清液，并将细胞重悬浮于1ml生长培养基中。用血球计估计细胞数目。
细胞在37℃下在5％CO2和大气氧中生长。通过ELISA(R&D Systems,Minneapolis,Mn.)测定由每份细胞样本产生的MCP-1、IL-6、VEGF、SDF-lα、GCP-2、IL-8和TGF-β2的量。所有测定法均根据制造商的说明书进行。呈现的值是皮克/ml/百万细胞(n＝2,sem)。
使用SearchLight蛋白质组阵列(Pierce Biotechnology Inc.)测定趋化因子(MIPlα、MIPlβ、MCP-1、Rantes、1309、TARC、嗜酸细胞活化趋化因子、MDC、IL8)、BDNF和血管生成因子(HGF、KGF、bFGF、VEGF、TIMP1、ANG2、PDGFbb、TPO、HB-EGF)。蛋白质组阵列是用于定量测量每孔的二至十六种蛋白的多重夹心ELISA。通过以2×2、3×3或4×4的模式将4至16种不同捕获抗体点样于96孔板的每孔来产生阵列。在夹心ELISA操作后，使整块板成像以捕获在板的每孔内的每个点样处生成的化学发光信号。每个点样处生成的信号与原始标准或样本中的靶蛋白的量成比例。
MCP-1和IL-6由脐来源的PPDC和真皮成纤维细胞分泌(表10-1)。SDF-lα和GCP-2由成纤维细胞分泌。GCP-2和IL-8由脐来源的PPDC分泌。通过ELISA，TGF-β2不由任一细胞类型分泌。
SearchlightTM多重ELISA测定法。TIMP1、TPO、KGF、HGF、FGF、HBEGF、BDNF、M1P 1β、MCP1、RANTES、1309、TARC、MDC和IL-8由脐来源的PPDC分泌(表10-2和10-3)。未检测到Ang2、VEGF或PDGFbb。
脐来源的细胞分泌多种营养因子。这些营养因子中的一些例如HGF、bFGF、MCP-1和IL-8在血管生成中起重要作用。其他营养因子例如BDNF和IL-6在神经再生或保护方面具有重要作用。
实例11
用于端粒酶活性的测定法
端粒酶作用于合成端粒重复序列，所述端粒重复序列用于保护染色体的完整性并延长细胞的复制寿命(Liu,K，等人，PNAS，1999；96:5147-5152)。端粒酶由两个组分组成：端粒酶RNA模板(hTER)和端粒酶逆转录酶(hTERT)。端粒酶的调控通过hTERT而非hTER的转录进行测定。因此hTERT mRNA的实时聚合酶链反应(PCR)为测定细胞的端粒酶活性的可接受方法。
细胞分离
进行实时PCR实验以测定人脐带组织来源的细胞的端粒酶产生。人脐带组织来源的细胞依照上文实例和美国专利7,510,873中所述的实例进行制备。一般来讲，在正常分娩后洗涤从国家疾病研究交流会(Philadelphia,Pa.)获得的脐带以去除血液和细胞碎片，并进行机械离解。然后将组织与消化酶(包括胶原酶、分散酶和透明质酸酶)一起在培养基中在37℃下温育。人脐带组织来源的细胞根据‘012申请的实例中所示的方法进行培养。从Cambrex,Walkersville,Md获得间充质干细胞和正常表皮成纤维细胞(cc-2509批号9F0844)。多能人睾丸胚胎癌(畸胎瘤)细胞系nTera-2细胞(NTERA-2cl.D1)(参见，Plaia等人，Stem Cells，2006；24(3):531-546)购自ATCC(Manassas,Va.)，并且根据美国专利7,510,873中所示的方法进行培养。
总RNA分离
使用试剂盒(Qiagen,Valencia,Ca.)从细胞提取RNA。RNA用50gl经DEPC处理的水洗脱并贮存于-80℃下。使用随机六聚物与TaqMane逆转录试剂(AppliedBiosystems,Foster City,Ca.)，以25℃10分钟、37℃60分钟和95℃10分钟，对RNA进行逆转录。将样本贮存于-20℃下。
实时PCR
根据制造商的说明书(Applied Biosystems)，使用Applied Biosystems的Assays-On-DemandTM(也称为基因表达测定法)，对cDNA样本进行PCR。这种商业试剂盒广泛用于测定人细胞中的端粒酶。简而言之，使用具有ABI prism 7000SDS软件(Applied Biosystems)的7000序列检测系统，将hTert(人端粒酶基因)(Hs00162669)和人GAPDH(内对照)与cDNA和Universal PCR预混液混合。热循环条件为最初50℃2分钟和95℃10分钟，接着95℃15秒和60℃1分钟进行40个循环。根据制造商的说明书分析PCR数据。
就hTert和18S RNA测定人脐带组织来源的细胞(ATCC登录号PTA-6067)、成纤维细胞和间充质干细胞。如表11-1所示，hTert和因此的端粒酶未在人脐带组织来源的细胞中检测到。
测定人脐带组织来源的细胞(分离株022803，ATCC登录号PTA-6067)和nTera-2细胞，并且结果显示两个批次的人脐带组织来源的细胞均未表达端粒酶，而畸胎瘤细胞系揭示高水平的表达(表11-2)。
因此，可得出如下结论：如本文公开的人脐带组织来源的细胞不表达端粒酶。
尽管已结合各种具体材料、程序和例子描述和例示了本发明，然而应当理解，本发明并不限于所选材料和程序的特定组合。本领域的技术人员将理解，可对这些细节作出多种改变。说明书和实例应被认为仅为示例性的，本发明的真实范围和实质由随附权利要求书限定。本申请中所提到的所有参考文献、专利和专利申请均全文以引用方式并入本文中。

Claims (28)

1.一种检测血液中的同种异体治疗细胞的方法，包括：
a. 测定同种异体治疗细胞和人外周血单核细胞，以鉴定关于同种异体治疗细胞阳性的一种或多种标志物和关于患者外周血单核细胞阳性的一种或多种标志物；
b. 比较所述关于同种异体治疗细胞阳性的一种或多种标志物和所述关于患者外周血单核细胞阳性的一种或多种标志物，以鉴定区别所述同种异体治疗细胞与所述患者外周血单核细胞的一种或多种独特标志物；
c. 提供来自已用同种异体治疗细胞治疗的患者的血液样本；
d. 使用测定方法来分析所述样本，以检测所述关于同种异体治疗细胞阳性的一种或多种独特标志物；以及
e. 基于所述一种或多种独特标志物的检测，区别所述患者外周血单核细胞和同种异体治疗细胞，
其中所述同种异体治疗细胞选自人脐带组织来源的细胞、间充质干细胞来源的细胞、肝细胞、胰岛细胞、心肌细胞和不溶性胶原骨基质细胞，
其中所述关于患者外周血单核细胞的阳性标志物包括CD45，和
其中所述方法检测同种异体治疗细胞而不受同种异体治疗细胞核型约束和患者性别约束。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤d中的测定方法选自流式细胞术、ELISA、免疫组织化学、核酸检测、PCR以及它们的组合。
3.根据权利要求1所述的方法，还包括在步骤a和b之间执行富集步骤。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述富集步骤是磁性捕获技术。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述区别步骤包括区分施用于所述患者的同种异体治疗细胞和来自所述患者的外周血单核细胞。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述患者是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、犬或猪。
7.一种检测血液中的人脐带组织来源的细胞的方法，包括：
a. 测定人脐带组织来源的细胞和人外周血单核细胞，以鉴定关于人脐带组织来源的细胞阳性的一种或多种标志物和关于患者外周血单核细胞阳性的一种或多种标志物；
b. 比较所述关于人脐带组织来源的细胞阳性的一种或多种标志物和所述关于人外周血单核细胞阳性的一种或多种标志物，以鉴定区别所述脐带组织来源的细胞与所述患者外周血单核细胞的一种或多种独特标志物；
c. 提供来自已用人脐带组织来源的细胞治疗的患者的血液样本；
d. 使用测定方法来分析所述样本，以检测关于人脐带组织来源的细胞阳性的一种或多种独特标志物；以及
e. 基于所述一种或多种独特标志物的检测，区别所述患者外周血单核细胞和人脐带组织来源的细胞，
其中所述关于患者外周血单核细胞的阳性标志物包括CD45，
其中所述关于人脐带组织来源的细胞的一种或多种独特标志物包括CD10、CD13、NRP1、LAMP1、DKK3或LAMB1，和
其中所述方法检测人脐带组织来源的细胞而不受人脐带组织来源的细胞核型约束和患者性别约束。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述关于人脐带组织来源的细胞的阳性标志物是CD10。
9.根据权利要求8所述的方法，还包括作为所述关于人脐带组织来源的细胞的阳性标志物的CD13。
10.根据权利要求8所述的方法，还包括作为所述关于人脐带组织来源的细胞的阳性标志物的NRP1、DKK3和LAMP1中的一种或多种。
11.根据权利要求7所述的方法，其中步骤d中的测定方法选自流式细胞术、ELISA、免疫组织化学、核酸检测、PCR以及它们的组合。
12.根据权利要求7所述的方法，还包括在步骤c和d之间执行富集步骤。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述富集步骤是磁性捕获技术。
14.根据权利要求7所述的方法，其中所述区别步骤包括区分施用于所述患者的人脐带组织来源的细胞和来自所述患者的外周血单核细胞。
15.根据权利要求7所述的方法，其中所述患者是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、犬或猪。
16.根据权利要求7所述的方法，其中所述人脐带组织来源的细胞分离自基本上不含血液的人脐带组织、能够在培养中自我更新和扩增、具有分化的潜能、并且具有下列特征：(1)表达CD10、CD13、CD44、CD90和HLA-ABC；(2)不表达CD31、CD34、CD45、HLA-DR和CD117；以及(3)不表达hTERT或端粒酶。
17.一种检测血液中的人脐带组织来源的细胞的方法，包括以下步骤：
a. 测定人脐带组织来源的细胞和人外周血单核细胞，以鉴定关于人脐带组织来源的细胞阳性的一种或多种标志物和关于人外周血单核细胞阳性的一种或多种标志物；
b. 提供含有人脐带组织来源的细胞的血液样本；
c. 从所述血液样本中分离所述人脐带组织来源的细胞/外周血单核细胞级分；以及
d. 针对作为关于外周血单核细胞的阳性标志物的CD45和作为关于人脐带组织来源的细胞的阳性标志物的CD10或CD13，通过流式细胞术来分析所述人脐带组织来源的细胞/外周血单核细胞级分；
e. 基于作为关于人外周血单核细胞阳性的标志物的CD45和作为关于人脐带组织来源的细胞阳性的标志物的CD10或CD13的检测，检测所述人外周血单核细胞和人脐带组织来源的细胞的存在，
其中所述方法检测人脐带组织来源的细胞而不受人脐带组织来源的细胞核型约束和患者性别约束。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述分析步骤包括针对作为关于外周血单核细胞的阳性标志物的CD45和作为关于人脐带组织来源的细胞的独特阳性标志物的CD10，通过流式细胞术来分析所述人脐带组织来源的细胞/外周血单核细胞级分。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述分析步骤包括针对作为关于外周血单核细胞的阳性标志物的CD45和作为关于人脐带组织来源的细胞的独特阳性标志物的CD13，通过流式细胞术来分析所述人脐带组织来源的细胞/外周血单核细胞级分。
20.根据权利要求17所述的方法，还包括在分析所述人脐带组织来源的细胞/外周血单核细胞级分之前执行富集步骤。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述富集步骤是磁性捕获技术。
22.根据权利要求17所述的方法，其中所述检测步骤包括区分施用于所述患者的人脐带组织来源的细胞和来自所述患者的人外周血单核细胞。
23.一种检测血液中的人脐带组织来源的细胞的方法，包括以下步骤：
a. 提供含有人脐带组织来源的细胞的血液样本；
b. 从所述血液样本中分离所述人脐带组织来源的细胞/外周血单核细胞级分；
c. 去除任何血浆；
d. 针对作为关于外周血单核细胞的阳性标志物的CD45和作为关于人脐带组织来源的细胞的阳性标志物的CD13，通过流式细胞术来分析所述人脐带组织来源的细胞/外周血单核细胞级分；以及
e. 基于作为关于人外周血单核细胞阳性的标志物的CD45和作为关于人脐带组织来源的细胞阳性的标志物的CD13的检测，检测所述人外周血单核细胞和人脐带组织来源的细胞的存在，
其中所述方法检测人脐带组织来源的细胞而不受人脐带组织来源的细胞核型约束和患者性别约束。
24.根据权利要求23所述的方法，还包括分析作为关于人脐带组织来源的细胞阳性的标志物的CD10。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述人脐带组织来源的细胞分离自基本上不含血液的人脐带组织、能够在培养中自我更新和扩增、具有分化的潜能、并且具有下列特征：(1)表达CD10、CD13、CD44、CD90和HLA-ABC；(2)不表达CD31、CD34、CD45、HLA-DR和CD117；(3)不表达hTERT或端粒酶；(4)表达氧化低密度脂蛋白受体1、浆膜蛋白、趋化因子受体配体3和/或粒细胞趋化蛋白；以及(4)相关于人成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞，表达增加水平的白介素8或浆膜蛋白1。
26.根据权利要求23所述的方法，还包括在分析所述人脐带组织来源的细胞/外周血单核细胞级分之前执行富集步骤。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述富集步骤是磁性捕获技术。
28.根据权利要求23所述的方法，其中所述检测步骤包括区分施用于所述患者的人脐带组织来源的细胞和来自所述患者的人外周血单核细胞。
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