CN104829536B - 一种具抗肿瘤活性的苯基吡唑羧酸类化合物及其合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了结构通式（I）所示的化合物，其中R1独立地选自氢、甲基、硝基、卤素。该类化合物以苯基异氰酸酯、苯甲酰乙酸乙酯或其类似物、水合肼为原料，在甲苯作为溶剂下反应得到，合成方法操作安全性高，反应条件温和，适用于工业化生产。经初步生物活性测试表明该类型化合物有较好的抗肿瘤活性，可用于抗肿瘤先导化合物的研究。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有抗肿瘤活性的苯基吡唑羧酸类化合物及其合成方法，属于医药技术领域。
背景技术
肿瘤已严重威胁到人类的健康，寻找有效安全、毒副作用小的抗肿瘤药物一直是肿瘤药物研发工作者孜孜以求的目标。随着药物化学的发展，以吡唑羧酸为结构母核的化合物在肿瘤治疗中的作用引起广泛关注。吡唑环是很多天然化合物和合成药物中的核心结构单元，作为杂环化合物中的一个重要分支，吡唑类化合物因其具有高效、低毒，以及其环上取代基可以多方位的变换而在药物领域中得到广泛应用。将羧基引入吡唑的化学结构中，可以增强其生物活性，提高选择性，具有重要的理论价值和实际应用价值。
近年来，研究合成一系列不同基团修饰的吡唑衍生物进以筛选具有高效生物活性的药物成为研究热点之一，特别是对于有抗肿瘤活性的吡唑衍生物，药物化学家和生物学家进行了大量的研究，合成筛选出各种不同基因修饰的有抗肿瘤活性的吡唑衍生物，为进一步开发有效、低毒的抗肿瘤药物打下了坚实基础。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种具有抗肿瘤活性的苯基吡唑羧酸类化合物；
本发明的另一目的在于提供一种以苯基异氰酸酯类化合物、苯甲酰乙酸乙酯或其类似物、水合肼为原料合成具有抗肿瘤活性的苯基吡唑羧酸类化合物的合成方法。
本发明的实现过程如下：
结构通式（I）所示的化合物，
（I）
其中，R1独立地选自氢、甲基、硝基、卤素。
优选的化合物为、或。
结构通式（I）所示的化合物的合成方法，
以苯基异氰酸酯类化合物、苯甲酰乙酸乙酯、水合肼为原料，甲苯作为反应溶剂。
具体地说，结构通式（I）所示的化合物的合成方法为：
（1）向反应器中加入摩尔比为1:1～1:2的苯基异氰酸酯类化合物和苯甲酰乙酸乙酯，加入甲苯加热回流至反应完全；
（2）按苯基异氰酸酯与水合肼摩尔比为1:1～1:2.5加入水合肼，回流反应；
（3）将上述反应体系的固液混合物减压浓缩后，加水稀释，用稀盐酸酸化，调pH值至中性，冷却至室温后过滤，滤饼用温水洗涤，得到苯基吡唑羧酸粗品；
（4）苯基吡唑羧酸粗品用乙醇重结晶得目标产物。
上述苯基异氰酸酯：苯甲酰乙酸乙酯：水合肼的摩尔比为1:1:1～1:1.5:2。
上述步骤（1）中的苯甲酰乙酸乙酯用苯甲酰乙酸甲酯或苯甲酰乙酸异丙酯替换进行反应。
上述步骤（1）的反应温度为90～120℃。
本发明的优点在于：生产过程较为环保，生产成本低，操作安全性高，反应条件温和，可实现反应原料的充分利用，适用于工业化生产，解决了现有技术产率低的不足，同时将羧基引入到吡唑的化学结构中，对探究该类化合物的生物活性与总结构效关系具有重要的理论价值和应用价值。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述。这些实施例仅是出于解释说明的目的，而不限制本发明的范围和实质。
本发明部分优选实施方案中的化合物结构式如下所示：
实施例1 5-苯基-3-(对-甲苯基氨基)-1H-吡唑-4-羧酸（1）的制备
在反应器中加入1.33g(10mmol) 4-甲基苯异氰酸酯和2.30g(12mmol)苯甲酰乙酸乙酯，加50ml甲苯作反应溶剂，置于磁力搅拌器上用电热套加热到110℃搅拌，回流反应2小时。然后在该反应体系中加入0.75g(15mmol)水合肼继续回流反应3小时。反应结束后，将上述反应体系的固液混合物减压浓缩后，加水稀释，用稀盐酸酸化，调pH值至中性，冷却至室温，然后过滤，滤饼用温水洗涤，得到5-苯基-3-(对-甲苯基氨基)-1H-吡唑-4-羧酸粗品。将该粗品加入到反应器中，加入25ml乙醇进行重结晶，过滤，干燥得到得淡黄色结晶性粉末（2.14克），总收率73.1%。
产物为淡黄色结晶粉末，M.P.187.5℃。1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):12.64(1H,s),11.0
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实施例2 3–((4-氯苯基)氨基)-5-苯基-1H-吡唑-4-羧酸（2）的制备
在反应器中加入1.53g(10 mmol) 4-氯异氰酸酯和2.30g(12mmol)苯甲酰乙酸乙酯，加50ml甲苯作反应溶剂，置于磁力搅拌器上搅拌，用电热套加热到110℃，回流反应1小时。然后在该反应体系中加入0.75g(15mmol)水合肼继续回流反应2小时。反应结束后，将上述反应体系的固液混合物减压浓缩后，加水稀释，用稀盐酸酸化，调pH值至中性，冷却至室温，然后过滤，滤饼用温水洗涤，得到3–((4-氯苯基)氨基)-5-苯基-1H-吡唑-4-羧酸粗品。将该粗品加入到反应器中，加入25ml乙醇进行重结晶，过滤，干燥得到浅黄色结晶性粉末（2.24克），总收率71.6%。
浅黄色结晶粉末，M.P.193.5℃。1H-NMR(300MHz,DMSO-d 6 )δ(ppm):12.64(1H,s),11.0(1H,
s),7.8-7.2(9H,m),5.3(1H,s);13C-NMR(75MHz,DMSO-d 6)δ(ppm):169.6,153.8,139.1,133.2,129.4,128.9,127.9,125.4,122.3,96.5;HRMS(ESI)for(M+H)+:calcd:
313.0620,found 313.0623。
实施例3 5-苯基-3-(间-甲苯基氨基)-1H-吡唑-4-羧酸（3）的制备
在反应器中加入1.33g(10 mmol) 间甲苯异氰酸酯和1.92g(10mmol)苯甲酰乙酸乙酯，加50ml甲苯作反应溶剂，置于磁力搅拌器上搅拌，用电热套加热到110℃，回流反应2小时。然后在该反应体系中加入0.5g(10mmol)水合肼继续回流反应3小时。反应结束后，将上述反应体系的固液混合物减压浓缩后，加水稀释，用稀盐酸酸化，调pH值至中性，冷却至室温，然后过滤，滤饼用温水洗涤，得到5-苯基-3-(间-甲苯基氨基)-1H-吡唑-4-羧酸粗品。将该粗品加入到反应器中，加入25ml乙醇进行重结晶，过滤，干燥得到得淡黄色结晶性粉末（2.10克），总收率68.7%。
淡黄色结晶粉末，M.P.164.3℃。1H-NMR(300MHz,DMSO-d 6)δ(ppm):12.64(1H,s),11.0
(1H,s),7.8-6.5(9H,m),4.0(1H,s),2.36(3H,s);13C-NMR(75MHz,DMSO-d 6)δ(ppm):169.5,153.9,
140.9,139.4,133.2,129.5,128.9,127.6,125.4,121.2,119.2,114.9,96.5,21.5;HRMS(ESI)for(M+H)+:calcd:293.1166,found 293.1169。
实施例4
3–((3-氯苯基)氨基)-5-苯基-1H-吡唑-4-羧酸（4）的制备。
在反应器中加入1.53g(10 mmol) 3-氯苯异氰酸酯和2.875g(15mmol)苯甲酰乙酸乙酯，加50ml甲苯作反应溶剂，置于磁力搅拌器上搅拌，用电热套加热到115℃，回流反应2小时。然后在该反应体系中加入1.0g(20mmol)水合肼继续回流反应5小时。反应结束后，将上述反应体系的固液混合物减压浓缩后，加水稀释，用稀盐酸酸化，调pH值至中性，冷却至室温，然后过滤，滤饼用温水洗涤，得到3–((3-氯苯基)氨基)-5-苯基-1H-吡唑-4-羧酸粗品。将该粗品加入到反应器中，加入25ml乙醇进行重结晶，过滤，干燥得到得灰白色结晶性粉末（1.23克），总收率39.4%。
灰白色结晶粉末，M.P.183.1℃。1H-NMR(300MHz,DMSO-d 6)δ(ppm):12.64(1H,s),11.0
(1H,s),7.8-6.7(9H,m),4.0(1H,s);13C-NMR(75MHz,DMSO-d 6)δ(ppm):169.5,153.9,142.9,135.3,
131.0,129.6,128.9,127.6,125.4,122.5,116.8,116.1,96.5;HRMS(ESI)for(M+H)+:calcd:313.0616,found 313.0619。
实施例5 3-((4-硝基苯基)氨基)-5-苯基-1H-吡唑-4-羧酸（5）的制备
在反应器中加入1.64g(10 mmol) 4-硝基苯异氰酸酯和2.30g(12mmol)苯甲酰乙酸乙酯，加50ml甲苯作反应溶剂，置于磁力搅拌器上搅拌，用电热套加热到110℃，回流反应2小时。然后在该反应体系中加入0.75g(15mmol)水合肼继续回流反应3小时。反应结束后，将上述反应体系的固液混合物减压浓缩后，加水稀释，用稀盐酸酸化，调pH值至中性，冷却至室温，然后过滤，滤饼用温水洗涤，得到3-((4-硝基苯基)氨基)-5-苯基-1H-吡唑-4-羧酸粗品。将该吡唑羧酸粗品加入到反应器中，加入25ml乙醇进行重结晶，过滤，干燥得到棕黄色结晶性粉末（2.17克），总收率67.1%。
棕黄色结晶粉末，M.P.191.0℃。1H-NMR(300MHz,DMSO-d 6)δ(ppm):12.64(1H,s),11.0
(1H,s),8.2-6.7(9H,m ),4.0(1H,s);13C-NMR(75MHz,DMSO-d 6)δ(ppm):169.5,153.9,147.2,138.1,
125.4,129.4,128.8,127.7,125.4,124.8,119.4,96.5;HRMS(ESI)for(M+Na)+:calcd:324.0858,found 324.0861。
实施例6 3- (( 4-溴苯基)氨基)-5-苯基-1H-吡唑-4-羧酸（6）的制备
在反应器中加入1.97g(10 mmol) 4-溴苯异氰酸酯和3.83g(20mmol)苯甲酰乙酸乙酯，加50ml甲苯作反应溶剂，置于磁力搅拌器上搅拌，用电热套加热到105℃，回流反应2小时。然后在该反应体系中加入1.25g(25mmol)水合肼继续回流反应3小时。反应结束后，将上述反应体系的固液混合物减压浓缩后，加水稀释，用稀盐酸酸化，调pH值至中性，冷却至室温，然后过滤，滤饼用温水洗涤，得到3- (( 4-溴苯基)氨基)-5-苯基-1H-吡唑-4-羧酸粗品。将该吡唑羧酸粗品加入到反应器中，加入25mL乙醇进行重结晶，过滤，干燥得到得红褐色结晶性粉末（1.91克），总收率53.6%。
红褐色结晶粉末，M.P.196.8℃。1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):12.64(1H,s),11.0
(1H,s),7.9-7.1(9H,m),4.0(1H,s);13C-NMR(75MHz,DMSO-d 6)δ(ppm):169.5,153.8,140.1,133.2,
132.6,129.3,128.9,127.125.4,118.6,116.9,96.5;HRMS(ESI)for(M+Na)+:calcd:357.0115,found 357.0116。
实施例7 3-((4-氟苯基)氨基)-5-苯基-1H-吡唑-4-羧酸（7）的制备
在反应器中加入1.37g(10 mmol) 4-氟苯异氰酸酯和2.30g(12mmol)苯甲酰乙酸乙酯，加50ml甲苯作反应溶剂，置于磁力搅拌器上搅拌，用电热套加热到110℃，回流反应2小时。然后在该反应体系中加入0.75g(15mmol)水合肼继续回流反应3小时。反应结束后，将上述反应体系的固液混合物减压浓缩后，加水稀释，用稀盐酸酸化，调pH值至中性，冷却至室温，然后过滤，滤饼用温水洗涤，得到3-((4-氟苯基)氨基)-5-苯基-1H-吡唑-4-羧酸粗品。将该吡唑羧酸粗品加入到反应器中，然后加入25mL乙醇进行重结晶，过滤，干燥得到得红色粉末（1.92克），总收率64.6%。
红色粉末，M.P.178.5℃。1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):12.64(1H,s),11.0(1H,s),
7.9-7.4(9H,m),4.0(1H,s);13C-NMR(75MHz,DMSO-d 6)δ(ppm):169.5,157.5,153.8,136.7,133.2,129.4,128.9,127.6, 125.4,120.8, 116.5, 96.4;HRMS(ESI)for(M+Na)+:calcd:297.0916,found 297.0918。
实施例8 3- (( 3,5-二氯苯基)氨基)-5-苯基-1H-吡唑-4-羧酸（8）的制备
在反应器中加入1.87g(10 mmol) 3,5-二氯苯异氰酸和2.30g(12mmol)苯甲酰乙酸乙酯，加50ml甲苯作反应溶剂，置于磁力搅拌器上搅拌，用电热套加热到80℃，回流反应3小时。然后在该反应体系中加入0.75g(15mmol)水合肼继续回流反应3小时。反应结束后，将上述反应体系的固液混合物减压浓缩后，加水稀释，用稀盐酸酸化，调pH值至中性，冷却至室温，然后过滤，滤饼用温水洗涤，得到3- (( 3,5-二氯苯基)氨基)-5-苯基-1H-吡唑-4-羧酸粗品。将该吡唑羧酸粗品加入到反应器中，然后加入25mL乙醇进行重结晶，过滤，干燥得到得白色结晶性粉末（1.74克），总收率50.2%。
白色结晶粉末，M.P.210.6℃。1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):12.64(1H,s),11.0
(1H,s),7.9-6.7(8H,m),4.0(1H,s);13C-NMR(75MHz,DMSO-d 6)δ(ppm):169.5,153.9,145.4,133.1,
129.9,129.4,128.9,127.6,125.5,119.4,115.0,115.0,96.5;HRMS(ESI)for(M+H)+:calcd:347.0229,found 347.0231。
实施例9 5-苯基-3(苯基氨基)-1H-吡唑-4-羧酸（9）的制备
在反应器中加入1.19g(10 mmol) 苯基异氰酸酯和2.30g(12mmol)苯甲酰乙酸乙酯，加50ml甲苯作反应溶剂，置于磁力搅拌器上搅拌，用电热套加热到120℃，回流反应2小时。然后在该反应体系中加入0.75g(15mmol)水合肼继续回流反应4小时。反应结束后，将上述反应体系的固液混合物减压浓缩后，加水稀释，用稀盐酸酸化，调pH值至中性，冷却至室温，然后过滤，滤饼用温水洗涤，得到5-苯基-3(苯基氨基)-1H-吡唑-4-羧酸粗品。将该吡唑羧酸粗品加入到反应器中，然后加入25mL乙醇进行重结晶，过滤，干燥得到得白色结晶性粉末（1.42克），总收率50.9%。
白色结晶粉末，M.P.204.5℃。1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):12.64(1H,s),11.0
(1H,s),7.9-6.9(10H,m),4.0(1Hs);13C-NMR(75MHz,DMSO-d 6)δ(ppm):169.5,153.8,141.0,133.2,
129.7, 129.4,128.8,127.7, 125.4,122.5,117.9,96.5;HRMS(ESI)for(M+H)+:calcd:
279.1004,found 279.1008。
实施例10 本发明化合物的抗肿瘤活性测试
对本发明的化合物进行了肿瘤细胞增殖抑制试验，试验方法采用常规的MTT法。
细胞株选用：人肝癌细胞(HepG2)，人肺癌细胞(A-549)，人宫颈癌细胞(Hela)。培养液为DMEM+15%NBS+双抗。
样品液的配制：用DMSO(Merck)溶解后，加入PBS(-)配成的100 μmol/L的溶液或者均匀的混悬液，然后用DMSO的PBS(-)稀释，最终浓度分别为0.1，1，10，20，40，60，80，100 μmol/L。
将上市的抗肿瘤药物阿糖胞苷(Ara-C)以同样的条件配成对照品溶液。
细胞培养：贴壁生长肿瘤细胞细胞培养于含10% 灭活新生牛血清和青霉素、链霉素（各100万U/L）的1640培养液中，置于37℃，5% CO2，饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养。细胞贴壁生长，每2～3 天传代1 次，传代时首先倒出培养液，PBS洗2次，胰酶消化后，加入新鲜的培养液吹打均匀，调整细胞至适当浓度移入新的培养瓶中，添加培养液至适量。取对数生长期细胞用于实验。
MTT法检测细胞活性及IC50的测定：
实验原理：活细胞线粒体中脱氢酶能将黄色的MTT还原成不溶于水的蓝紫色产物甲臜 (MTT formazan)，并沉积在细胞中，生成的量与活细胞数目成正比，而死细胞没有这种功能。DMSO能溶解蓝紫色结晶物，颜色深浅与所含的量成正比，因此用酶标仪测定的光吸收值可反映细胞存活率。
实验方法：取对数生长期细胞，消化、计数，以 2×104/mL 的密度接种于 96 孔培养板中，每孔100 μl。培养 24小时后，将待测化合物以0.1，1，10，20，40，60，80，100 μmol/L浓度处理细胞。实验组每个浓度设5个复孔，以含0.4% DMSO的培养液作对照。药物作用 48小时后，去上清，每孔加入100 μl MTT（2-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-3，5-二苯基-2H-四唑氢溴酸盐）(1mg/mL)，继续培养 4小时，弃上清，每孔加入100μl DMSO，振荡混匀，用酶标仪在570 nm处测定吸光度值，采用 IC50计算软件求出半数抑制浓度(IC50)。
试验结果详见表1，其中，样品是指相应实施例中制备的苯基吡唑羧酸类化合物，样品编号对应制备实施例中所得到的化合物的具体编号。
表1 化合物对不同肿瘤细胞的半数抑制浓度IC50（单位：μmol/L）
化合物8在所测试的5种细胞株中均表现出了良好的抗肿瘤活性，化合物6和2次之，在不同的细胞株中也表现出了良好的抗肿瘤活性。以上实验结果表明，本发明的化合物具有良好的抗肿瘤活性，特别是部分苯基吡唑羧酸类化合物的活性在特定细胞株中抗肿瘤活性优于或等同于阿糖胞苷，可作为抗肿瘤先导化合物进行研究。
Claims (4)
1.结构通式（I）所示化合物的合成方法，其特征在于：
（I）
其中，R1独立地选自氢、甲基、硝基、卤素；
（1）向反应器中加入摩尔比为1:1～1:2的苯基异氰酸酯类化合物和苯甲酰乙酸乙酯，加入甲苯加热回流至反应完全；
（2）按苯基异氰酸酯与水合肼摩尔比为1:1～1:2.5加入水合肼，回流反应；
（3）将上述反应体系的固液混合物减压浓缩后，加水稀释，用稀盐酸酸化，调pH值至中性，冷却至室温后过滤，滤饼用温水洗涤，得到苯基吡唑羧酸粗品；
（4）苯基吡唑羧酸粗品用乙醇重结晶得目标产物。
2.根据权利要求1所述化合物的合成方法，其特征在于：苯基异氰酸酯：苯甲酰乙酸乙酯：水合肼的摩尔比为1:1:1～1:1.5:2。
3.根据权利要求1所述化合物的合成方法，其特征在于：步骤（1）中的苯甲酰乙酸乙酯用苯甲酰乙酸甲酯或苯甲酰乙酸异丙酯替换进行反应。
4.根据权利要求1所述化合物的合成方法，其特征在于：步骤（1）的反应温度为90～120℃。
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