CN104812907A

CN104812907A - 研磨方法

Info

Publication number: CN104812907A
Application number: CN201380061418.7A
Authority: CN
Inventors: 龙祯; P·桑德斯; R·戴因汉默; S·R·麦克劳克林; 韩望; T·吉本斯; M·琼斯
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2012-11-27
Filing date: 2013-11-26
Publication date: 2015-07-29

Abstract

本发明提供了用于处理作物籽粒的方法，该方法包括以下步骤：a)将籽粒浸泡在水中，以产生浸泡的籽粒；b)碾磨这些浸泡的籽粒；c)在有效量的酶组合物的存在下处理这些浸泡的籽粒，该酶组合物包括：i)一种蛋白酶以及ii)一种纤维素分解组合物，其中在步骤b)之前、过程中或之后进行步骤c)。

Description

研磨方法

对序列表的引用

本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用结合在此。

发明领域

本发明涉及一种处理作物籽粒的改进方法，以提供具有高品质的适于将淀粉转化为单糖和寡糖、乙醇、甜味剂等的淀粉产品。另外，本发明还涉及一种酶组合物并且涉及本发明的组合物的用途，该酶组合物包括一种或多种适于本发明的方法的酶活性。

发明背景

作为大部分作物(例如玉米、小麦、水稻、高粱大豆、大麦或果壳)籽粒的重要成分，在可以将淀粉用于将淀粉转化为糖(例如右旋糖、果糖)、醇(例如乙醇)和增甜剂之前，必须使淀粉可供使用并以一种提供高纯度淀粉的方式加以处理。如果淀粉包含多于0.5％的杂质(包括蛋白质)，则它不适于作为淀粉转化工艺的起始材料。为了从作物籽粒开始提供这样的纯的且高品质的淀粉产品，通常研磨籽粒，如将在下文进一步所描述。

通常使用湿磨将玉米籽粒分离为其四种基本组分：淀粉、胚芽、纤维以及蛋白质。

典型地，湿磨方法包括四个基本步骤。首先，将籽粒浸泡或浸渍约30分钟至约48小时，以开始使淀粉和蛋白键断裂。该方法的下一步骤涉及粗磨，以破坏果皮并使胚芽与剩余的籽粒分离。剩余的浆液由纤维、淀粉和蛋白质组成，将其细磨并筛选，以将纤维与淀粉和蛋白质分离。在水力旋流器中将淀粉与剩余的浆液分离。然后，可以将淀粉转化为糖浆或醇，或干燥并销售为玉米淀粉，或用化学方法或物理方法修饰以产生改性玉米淀粉。

已经表明了酶对湿磨方法的浸渍步骤的用途。已经显示，商业酶产品(可获得自诺维信公司(Novozymes A/S))适于湿磨方法的第一步骤，即将玉米籽粒浸泡在水中的浸渍步骤。

最近，已经研发了“酶研磨(enzymatic milling)”，这是一种改性湿磨方法，该方法使用蛋白酶以在玉米湿磨过程中显著减少总的处理时间并消除了对作为加工剂的二氧化硫的需求。约翰斯顿(Johnston)等人，谷物化学(Cereal Chem)，81，第626-632页(2004)。

US 6,566,125披露了一种用于从玉蜀黍获得淀粉的方法，该方法涉及将玉蜀黍籽粒浸泡在水中以产生浸泡的玉蜀黍籽粒，碾磨浸泡的玉蜀黍籽粒以产生碾磨的玉蜀黍浆液并用酶(例如，蛋白酶)孵育该经碾磨的玉蜀黍浆液。

US 5,066,218披露了一种研磨谷物(尤其是玉米)的方法，该方法包括清洗谷物，将谷物浸渍在水中以将其软化，并且然后用纤维素酶研磨谷物。

WO 2002/000731披露了一种处理作物籽粒的方法，该方法包括将籽粒在水中浸泡1-12小时，湿磨浸泡的籽粒并用一种或多种酶(包括酸性蛋白酶)处理籽粒。

WO 2002/000911披露了一种分离淀粉面筋的方法，该方法包括使研磨淀粉经受酸性蛋白酶。

WO 2002/002644披露了一种洗涤获得自研磨方法的淀粉面筋分离步骤的淀粉浆液的方法，该方法包括用包括有效量的酸性蛋白酶的水溶液洗涤淀粉浆液。

仍需要改进用于提供适于转化为单糖和寡糖、乙醇、甜味剂等的淀粉的方法。

发明概述

本发明提供了一种用于处理作物籽粒的方法，该方法包括以下步骤：a)将籽粒浸泡在水中，以产生浸泡的籽粒；b)碾磨这些浸泡的籽粒；c)在有效量的酶组合物的存在下处理这些浸泡的籽粒，该酶组合物包括：i)一种蛋白酶以及ii)一种纤维素分解组合物，其中在步骤b)之前、过程中或之后进行步骤c)。

在一个实施例中，本发明提供了一种用于处理作物籽粒的方法，该方法包括以下步骤：a)将籽粒浸泡在水中，以产生浸泡的籽粒；b)碾磨这些浸泡的籽粒；c)在有效量的酶组合物的存在下处理这些浸泡的籽粒，该酶组合物包括：i)一种蛋白酶，ii)一种纤维素分解组合物，该纤维素分解组合物包括1)一种纤维素酶或一种半纤维素酶，和2)一种GH61多肽，并且其中在步骤b)之前、过程中或之后进行步骤c)。

在一个实施例中，本发明提供了一种用于处理作物籽粒的方法，该方法包括以下步骤：a)将籽粒浸泡在水中，以产生浸泡的籽粒；b)碾磨这些浸泡的籽粒；c)在有效量的酶组合物的存在下处理这些浸泡的籽粒，该酶组合物包括：i)一种蛋白酶以及ii)一种纤维素分解组合物，该纤维素分解组合物包括一种纤维素酶或一种半纤维素酶，其中在步骤b)之前、过程中或之后进行步骤c)，并且其中该蛋白酶以约10％w/w至约65％w/w的酶蛋白的总量的范围存在。

在一个实施例中，本发明提供了GH61多肽用于增强一种或多种酶的湿磨益处的用途。

发明详细说明

因此，本发明的目的在于提供处理作物籽粒的改进方法，以提供具有高品质的淀粉。

在一个实施例中，有用于本发明的方法的酶组合物提供以下益处，包括改进淀粉产量和/或纯度，改进面筋品质和/或产量，改进纤维、面筋或浸渍水过滤、脱水和蒸发，更容易地分离胚芽和/或更好的糖化后过滤及其过程能源节约。

不希望受理论约束，诸位发明人已经发现蛋白酶例如通过使二硫键破裂而在淀粉与蛋白质(来自纤维、淀粉和蛋白质相互作用的蛋白质)的相互分离中起更多作用。使用蛋白酶产生更纯的淀粉和更纯的面筋级分，而使用纤维素酶和半纤维素酶有助于从纤维级分中分离淀粉和蛋白质复合体，从而产生干净得多的纤维和更高的淀粉和面筋或研磨淀粉产量。上述半纤维素酶和/或纤维素酶之一与上述蛋白酶之一的组合带来特别的组合益处。在一些实施例中，有用于本发明的方法的酶共混物提供协同效应。

此外，诸位发明人已经出人意料地发现，由于将淀粉和蛋白质两个级分都与纤维级分更好地分离，根据本发明的酶共混物提供了最佳减少的纤维质量和蛋白含量最低的纤维。将淀粉和面筋与纤维分离对于工业而言是有价值的，因为纤维是湿磨方法中价值最低的产品，并且较高纯度的淀粉和蛋白质是令人希望的。

出人意料地，诸位发明人已经发现，替换酶组合物中的一些蛋白酶活性可以提供优于仅主要包含蛋白酶活性的另外的类似组合物的改进。这例如可以在成本和易用性的基础上为工业提供益处。

酶的定义

β-葡糖苷酶：术语“β-葡糖苷酶”意指一种β-D-葡糖苷葡糖水解酶(E.C.3.2.1.21)，其催化末端非还原性β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。出于本发明的目的，根据文丘里(Venturi)等人，2002，来自嗜热毛壳菌嗜粪变种的胞外β-D-葡糖苷酶：产生、纯化以及一些生物化学特性(Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var.coprophilum:production,purification and some biochemical properties)，基础微生物学杂志(J.Basic Microbiol.)42:55-66的程序，使用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷作为底物来测定β-葡糖苷酶活性。一个单位的β-葡糖苷酶定义为在25℃、pH 4.8下，在含有0.01％20的50mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基酚根阴离子。

β-木糖苷酶：术语“β-木糖苷酶”意指催化短β-(1→4)-寡聚木糖的外切水解，以从非还原末端除去连续的D-木糖残基的β-D-木糖苷木糖水解酶(E.C.3.2.1.37)。出于本发明的目的，一个单位的β-木糖苷酶定义为在40℃、pH 5下，在含有0.01％20的100mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基酚根阴离子。

纤维二糖水解酶：术语“纤维二糖水解酶”意指一种1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91和E.C.3.2.1.176)，其催化纤维素、纤维寡糖或任何含β-1,4-连接的葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-糖苷键水解，从该链的还原端或非还原端释放纤维二糖(泰里(Teeri)，1997，晶态纤维素降解：纤维二糖水解酶功能的新见解(Crystalline cellulose degradation:New insight into thefunction of cellobiohydrolases)，生物技术趋势(Trends in Biotechnology)15:160-167；泰里等人，1998，里氏木霉纤维二糖水解酶：为何对晶态纤维素如此有效？(Trichoderma reesei cellobiohydrolases:why so efficient on crystallinecellulose？)，生物化学学会学报(Biochem.Soc.Trans.)26:173-1780。根据里弗(Lever)等人，1972，分析生物化学(Anal.Biochem.)47:273-279；范·帝伯赫(van Tilbeurgh)等人，1982，欧洲生化学会联合会快报(FEBSLetters)，149:152-156；范·帝伯赫和克莱森斯(Claeyssens)，1985，欧洲生化学会联合会快报，187:283-288；以及汤美(Tomme)等人，1988，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)170:575-581所描述的程序来测定纤维二糖水解酶活性。在本发明中，汤美(Tomme)等人的方法可以用于测定纤维二糖水解酶活性。

纤维素分解酶组合物或纤维素酶或纤维素酶制剂：术语“纤维素分解酶组合物”、“纤维素酶”或“纤维素酶制剂”意指一种或多种(例如，若干种)水解纤维素材料的酶。这类酶包括一种或多种内切葡聚糖酶、一种或多种纤维二糖水解酶、一种或多种β-葡糖苷酶、或其组合。用于测量纤维素分解活性的两种基本方法包括：(1)测量总纤维素分解活性，和(2)测量单独的纤维素分解活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶以及β-葡糖苷酶)，如在张(Zhang)等人，纤维素酶改进的展望：筛选和选择策略(Outlook forcellulase improvement:Screening and selection strategies)，2006，生物技术进展(Biotechnology Advances)24:452-481中所综述的。通常使用不溶性底物，包括沃特曼(Whatman)№1滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、预处理的木质纤维素等，测量总纤维素分解活性。最常用的总纤维素分解活性测定是使用沃特曼№1滤纸作为底物的滤纸测定。该测定是由国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)(高斯(Ghose)，1987，纤维素酶活性的测量(Measurement of cellulase activities)，纯粹与应用化学(Pure Appl.Chem.)59:257-68)确立的。

纤维素材料：术语“纤维素材料”意指含有纤维素的任何材料。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，并且因此是一种线性β-(l-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，如具有一系列取代基以复杂支链结构存在的木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯糖基木聚糖以及甘露聚糖。尽管纤维素一般为多态的，但发现其在植物组织中主要以平行葡聚糖链的不溶性晶体基质存在。半纤维素通常氢键合至纤维素以及其他半纤维素，这有助于稳定细胞壁基质。

内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”意指一种内切-1,4-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣多糖中的1,4-β-D-糖苷键和混合β-1,3葡聚糖如谷物β-D-葡聚糖或木葡聚糖以及含有纤维素组分的其他植物材料中的β-1,4键的内切水解。可以通过测量底物粘度的降低或通过还原糖测定所确定的还原性末端的增加来确定内切葡聚糖酶活性(张(Zhang)等人，2006，生物技术进展(Biotechnology Advances)24:452-481)。出于本发明的目的，根据高斯(Ghose)，1987，纯粹与应用化学(Pure and Appl.Chem.)59:257-268的程序，在pH 5、40℃下，使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物，测定内切葡聚糖酶活性。

家族61糖苷水解酶：术语“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61”意指根据亨利萨特(Henrissat)B.，1991，基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶的分类(A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities)，生物化学杂志(Biochem.J.)280:309-316；和亨利萨特B.和贝洛赫(Bairoch)A.，1996，修正糖基水解酶的基于序列的分类(Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases)，生物化学杂志316:695-696属于糖苷水解酶家族61的多肽。这个家族中的酶最初基于在一个家族成员中测量到的非常弱的内切-1,4-β-D葡聚糖酶活性而被分类为糖苷水解酶家族。这些酶的结构和作用模式是不规范的，并且它们不能被视为真正的糖苷酶。然而，基于它们在与纤维素酶或纤维素酶的混合物结合使用时增强木质纤维素分解的能力，它们被保留在CAZy分类中。

半纤维素分解酶或半纤维素酶：术语“半纤维素分解酶”或“半纤维素酶”意指可对半纤维素材料进行水解的一种或多种(例如，若干种)酶。参见例如，沙洛姆(Shallom)，D.和肖汉姆(Shoham)，Y.微生物半纤维素酶(Microbial hemicellulases)，微生物学新见(Current Opinion InMicrobiology)，2003，6(3):219-228)。半纤维素酶是在植物生物质的降解中的关键组分。半纤维素酶的实例包括但不限于，乙酰基甘露聚糖酯酶、乙酰基木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶以及木糖苷酶。这些酶的底物即半纤维素是支链和线性多糖的异质群体，这些多糖经由氢与植物细胞壁中的纤维素微纤维键合，从而将它们交联成一个稳固网络。半纤维素还共价附接至木质素，从而与纤维素一起形成高度复杂的结构。半纤维素的可变结构和组织要求许多酶的协同作用以使其完全降解。半纤维素酶的催化模块是水解糖苷键的糖苷水解酶(GH)，或是水解乙酸或阿魏酸侧基的酯键的碳水化合物酯酶(CE)。这些催化模块基于它们一级序列的同源性，可以被分配到GH和CE家族中。具有总体相似的折叠的一些家族可以进一步被分组为以字母标记的氏族(例如，GH-A)。这些和其他碳水化合物活性酶的最具信息性和最新的分类可在碳水化合物活性酶(Carbohydrate-Active Enzymes)(CAZy)数据库中获得。可以根据高斯(Ghose)和比萨拉(Bisaria)，1987，纯粹与应用化学(Pure&AppI.Chem.)59:1739-1752，在适合的温度(例如50℃、55℃、或60℃)和pH(例如5.0或5.5)下测量半纤维素分解酶活性。

具有纤维素分解增强活性的多肽：术语“具有纤维素分解增强活性的多肽”意指促进具有纤维素分解活性的酶对纤维素材料的水解的增强的GH61多肽。在一个方面中，使用在总蛋白质重量的2％-3％的米曲霉β-葡糖苷酶(根据WO 02/095014在米曲霉中重组产生)或总蛋白质重量的2％-3％的烟曲霉β-葡糖苷酶(如WO 2002/095014中所描述在米曲霉中重组产生)的纤维素酶蛋白负载量存在的情况下1.5L(诺维信公司，巴格斯瓦尔德，丹麦)的混合物作为纤维素分解活性的来源。

具有纤维素分解增强活性的GH61多肽通过将达到相同的水解程度所需要的纤维素分解酶的量降低优选至少1.01倍，例如，至少1.05倍、至少1.10倍、至少1.25倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、或至少20倍，来增强由具有纤维素分解活性的酶催化的纤维素材料的水解。

蛋白酶：术语“蛋白水解酶”或“蛋白酶”意指一种或多种(例如，若干种)酶，其通过水解多肽链中将氨基酸连接在一起的肽键而分解蛋白质的酰胺键。

木聚糖降解活性或木聚糖分解活性：术语“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”意指水解含有木聚糖的材料的生物活性。用于测量木聚糖分解活性的两种基本方法包括：(1)测量总木聚糖分解活性，和(2)测量单独的木聚糖分解活性(例如内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、以及α-葡糖醛酸酯酶)。木聚糖分解酶测定的最近进展总结于若干出版物中，这些出版物包括：别雷(Biely)和普乔尔德(Puchard)，木聚糖分解酶测定的最近进展(Recentprogress in the assays of xylanolytic enzymes)，2006，食品与农业科学杂志(Journal of the Science of Food and Agriculture)86(11):1636-1647；斯帕尼科瓦(Spanikova)和别雷，2006，葡萄糖醛酸酯酶-由产生的新型碳水化合物酯酶裂褶菌(Schizophyllum commune)(Glucuronoyl esterase-Novelcarbohydrate esterase produced by Schizophyllum commune)，欧洲生化学会联合会快报(FEBS Letters)580(19):4597-4601；赫尔曼(Herrmann)、沃散斯卡(Vrsanska)、尤日奇科娃(Jurickova)、赫西(Hirsch)、别雷、以及库比切克(Kubicek)，1997，里氏木霉的β-D-木糖苷酶是一种多功能β-D-木聚糖木糖水解酶(The beta-D-xylosidase of Trichoderma reesei is a multifunctionalbeta-D-xylan xylohydrolase)，生物化学杂志(Biochemical Journal)321:375-381。

总木聚糖降解活性可以通过测定由不同类型的木聚糖(包括例如燕麦(oat spelt)木聚糖、山毛榉木木聚糖、以及落叶松木木聚糖)形成的还原糖，或通过光度法测定从不同共价染色的木聚糖释放的染色的木聚糖片段来测量。最常见的总木聚糖分解活性测定基于由聚合4-O-甲基葡糖醛酸木聚糖产生的还原糖，如描述于别雷(Bailey)，别雷，坡泰恩(Poutanen)，1992，用于木聚糖酶活性测定的多个实验室测试方法(Interlaboratory testingof methods for assay of xylanase activity)，生物技术杂志(Journal ofBiotechnology)23(3):257-270中。木聚糖酶活性还可以在37℃下，在0.01％X-100(4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇)和200mM磷酸钠缓冲液(pH 6)中用0.2％AZCL-阿拉伯糖基木聚糖作为底物来测定。一个单位的木聚糖酶定义为在200mM磷酸钠缓冲液(pH 6)中，在37℃、pH 6下，从作为底物的0.2％AZCL-阿拉伯糖基木聚糖中每分钟生成1.0微摩尔天青精。

出于本发明的目的，木聚糖降解活性通过测量由木聚糖降解酶在以下典型条件下造成的桦木木聚糖(西格玛化学有限公司(Sigma Chemical Co.,Inc.)，圣路易斯，密苏里州，美国)水解的增加来测定：1ml反应、5mg/ml底物(总固体)，5mg木聚糖分解蛋白质/g底物、50mM乙酸钠(pH 5)、50℃、24小时，如里弗(Lever)，1972，用于碳水化合物的比色测定的新反应(A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates)，分析生物化学(Anal.Biochem)47:273-279所述使用对羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)测定进行糖分析。

木聚糖酶：术语“木聚糖酶”意指1,4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(E.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中的1,4-β-D-木糖苷键的内切水解。出于本发明的目的，在37℃下，在0.01％X-100和200mM磷酸钠(pH 6)中用0.2％AZCL-阿拉伯糖基木聚糖作为底物来测定木聚糖酶活性。一个单位的木聚糖酶定义为在200mM磷酸钠缓冲液(pH 6)中，在37℃、pH 6下，从作为底物的0.2％AZCL-阿拉伯糖基木聚糖中每分钟生成1.0微摩尔天青精。

其他定义

作物籽粒：术语“作物籽粒”包括来自例如玉米(玉蜀黍)、水稻、大麦、高粱大豆、果壳以及小麦的籽粒。玉米籽粒是示例性的。已知多种玉米籽粒，包括例如马齿型玉米、硬粒玉米、有稃种玉米、具条纹玉米、甜玉米、糯玉米等。

在一个实施例中，该玉米籽粒是黄色马齿型玉米籽粒。黄色马齿型玉米籽粒具有称为“果皮(Pericarp)”的外部覆盖物，保护籽粒中的胚芽。它防水和水蒸气并且是昆虫和微生物所不希望的。

未被“果皮”覆盖的籽粒的唯一区域是“顶帽(Tip Cap)”，它是籽粒至穗轴的附着点。

胚芽：“胚芽”是玉米籽粒的唯一存活部分。它包含籽粒生长为玉米植株所必需的遗传信息、酶、维生素以及矿物质。在黄色马齿型玉米中，约25％的胚芽是玉米油。覆盖且包围胚芽的胚乳构成约82％的籽粒干重并且是种子萌发的能量(淀粉)和蛋白来源。存在两种类型的胚乳，软胚乳和硬胚乳。在硬胚乳中，淀粉被紧紧地堆积在一起。在软胚乳中，淀粉是松散的。

淀粉：术语“淀粉”意指由植物的复杂多糖构成、由广泛出现在植物组织中的呈贮藏粒形式的葡萄糖单元构成、由直链淀粉和支链淀粉组成且表示为(C6H10O5)n(其中n是任何数字)的任何材料。

研磨的：术语“研磨的”是指植物材料已经例如通过粉碎、分级、碾磨、磨碎等而被分解成更小的颗粒。

碾磨(grind或grinding)：术语“碾磨”意指破坏果皮并打开作物籽粒的任何方法。

浸渍(steep或steeping)：术语“浸渍”意指用水以及任选地SO₂浸泡作物籽粒。

干固体：术语“干固体”是在干重基础上的浆液的全固体(以百分比计)。

寡糖：术语“寡糖”是具有2至10个单糖单位的化合物。

湿磨益处：术语“湿磨益处”意指改进的淀粉产量和/或纯度，改进的面筋品质和/或产量，改进的纤维、面筋或浸渍水过滤、脱水和蒸发，更容易地分离胚芽和/或更好的糖化后过滤及其过程能源节约中的一种或多种。

等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种(例如，若干种)可替代形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。

编码序列：术语“编码序列”意指直接指定一个多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以一个终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是一种基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

片段：术语“片段”意指从成熟多肽主要部分的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽；其中该片段具有酶活性。在一个方面中，片段包含酶的成熟多肽的至少85％，例如至少90％或至少95％的氨基酸残基。

高严谨度条件：术语“高严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。

低严谨度条件：术语“低严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在50℃下洗涤三次，每次15分钟。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N末端加工、C末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。

在本领域中已知的是，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同的成熟多肽(即，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有酶活性的成熟多肽的多核苷酸。

中严谨度条件：术语“中严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在55℃下洗涤三次，每次15分钟。

中-高严谨度条件：术语“中-高严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在60℃下洗涤三次，每次15分钟。

亲本酶：术语“亲本”意指对其作出改变以产生变体的酶。亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体。

序列一致性：两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列一致性”来描述。

出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序所实施的。使用的参数是空位开放罚分10、空位扩展罚分0.5以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：

(一致的残基X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(尼德曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，见上文)来确定两个脱氧核苷酸序列之间的序列一致性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，见上文)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序所实施的。使用的参数是空位开放罚分10、空位扩展罚分0.5以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：

(一致的脱氧核糖核苷酸X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

子序列：术语“子序列”意指使一个或多个(例如，若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺少的多核苷酸，其中该子序列编码具有酶活性的片段。在一个方面中，子序列包含酶的成熟多肽编码序列的至少85％，例如至少90％或至少95％的核苷酸。

变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如，若干个)位置处包含改变，即取代、插入和/或缺失的具有酶或酶增强活性的多肽。取代意指占据一个位置的氨基酸替换不同的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指在邻接并且紧随占据一个位置的氨基酸之后添加一个氨基酸。

在一个方面中，该变体与如在此鉴定的SEQ ID NO:的成熟多肽相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸。在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失和/或插入的在此的SEQ ID NO:的成熟多肽的变体。在一个实施例中，引入在此的SEQ ID NO:的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小延伸。

野生型酶：术语“野生型”酶意指由天然存在的微生物(如在自然界中发现的细菌、酵母或丝状真菌)表达的一种酶。

研磨方法

研磨籽粒，以便打开结构并且允许进一步加工并且将籽粒分离成四种主要成分：淀粉、胚芽、纤维以及蛋白质。

在一个实施例中，使用湿磨方法。湿磨使胚芽与粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)很好分离并且时常应用于平行生产糖浆的场所。

本发明的诸位发明人已经出人意料地发现，可以通过在如在此描述的方法中处理作物籽粒而改进淀粉终产物的品质。

本发明的方法与传统方法相比，产生了更高的淀粉品质，因为淀粉终产物更纯和/或获得了更高的产量和/或使用更少的加工时间。另一种优势可以是可以减少需要使用的化学品(例如SO2和NaHSO3)的量或甚至完全除去。

湿磨

淀粉是在植物细胞内作为不溶于水的微小颗粒形式而形成。当放入冷水中时，这些淀粉颗粒可以吸收少量的液体并膨胀。在高达约50℃至75℃的温度下，膨胀可以是可逆的。然而，在更高温度下，开始不可逆膨胀，称为“胶凝化”。有待根据本发明加工的颗粒状淀粉可以是含有粗淀粉的材料，该材料包括(例如，研磨的)全谷物，这些全谷物包括非淀粉级分，如胚芽残余物和纤维。可以例如通过湿磨将原料(如全谷物)的粒度减少，以便打开结构并允许进一步加工。湿磨使胚芽与粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)很好分离并且时常应用于在例如糖浆的生产中使用淀粉水解物的场所。

在一个实施例中，该粒度被减少至0.05-3.0mm、优选0.1-0.5mm之间，或使得至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％的含淀粉的材料适合通过一个具有0.05-3.0mm筛网、优选0.1-0.5mm筛网的筛子。

更具体而言，将玉米籽粒以及其他作物籽粒降解为适于将淀粉转化为单糖和寡糖、乙醇、甜味剂等的淀粉基本由四个步骤组成：

1.浸渍并分离胚芽，

2.洗涤纤维并干燥，

3.分离淀粉面筋，并且

4.洗涤淀粉。

1.浸渍并分离胚芽

通过在约50℃的温度(例如约45℃至60℃之间)下，在水中浸泡约30分钟至约48小时之间(优选30分钟至约15小时)而软化玉米籽粒。在浸渍过程中，籽粒吸水，从而将其水分含量从15％增加至45％并使大小加倍。任选地向水中添加例如0.1％二氧化硫(SO2)和/或NaHSO3以防止细菌在温暖环境中生长。随着玉米膨胀并软化，浸渍水的温和酸度开始使玉米内的面筋键松散并释放淀粉。在将玉米籽粒浸渍后，它们裂了开来，以释放胚芽。胚芽包含有价值的玉米油。基本上通过使不含其他物质的胚芽段在密切受控的条件下“漂浮(floating)”而将胚芽与淀粉、外壳和纤维的较重密度的混合物分离。这一方法用于消除痕量的玉米油在后面的加工步骤中的任何不利影响。

在本发明的一个实施例中，于范围在40℃与60℃之间的温度(优选大约50℃)下，将籽粒在水中浸泡2-10小时，优选约3-5小时。

在一个实施例中，在浸泡过程中可以添加0.01％-1％，优选0.05％-0.3％，尤其是0.1％SO2和/或NaHSO3。

2.洗涤纤维并干燥

为了得到最大的淀粉回收同时将终产物中的任何纤维保持至绝对最小值，在加工过程中必须从纤维中洗涤出游离淀粉。收集纤维、并使其成浆并过筛，以回收任何残留的淀粉或蛋白质。

3.分离淀粉面筋

将来自纤维洗涤步骤的淀粉-面筋悬浮液(称作研磨淀粉)分离成淀粉和面筋。与淀粉相比，面筋具有较低的密度。通过使研磨淀粉穿过离心机而容易地旋出面筋。

4.洗涤淀粉。

来自淀粉分离步骤的淀粉浆液包含一些不溶性蛋白质和许多的可溶物。在可以生产顶级品质的淀粉(高纯度淀粉)之前，必须将其除去。在水力旋流器中，将仅仅剩余1％或2％蛋白质的淀粉稀释，洗涤8至14次，重新稀释并再次洗涤，以除去最后痕量的蛋白质并产生高品质淀粉，典型地纯度大于99.5％。

产物

可以使用湿磨生产(但不限于)玉米浆、玉米面筋饲料、胚芽、玉米油、玉米面筋粉、玉米淀粉、改性玉米淀粉、糖浆(例如玉米糖浆)、以及玉米乙醇。

酶

下面描述的一种或多种酶和多肽有待以“有效量”用于本发明的方法中。下文应在上文的“定义”部分中的酶披露的背景下加以阅读。

蛋白酶

该蛋白酶可以是任何蛋白酶。适合的蛋白酶包括微生物蛋白酶，如真菌和细菌蛋白酶。优选的蛋白酶是酸性蛋白酶，即由在低于pH 7的酸性条件下水解蛋白质的能力表征的蛋白酶。优选的蛋白酶是酸性内切蛋白酶。酸性真菌蛋白酶是优选的，但是也可以使用其他蛋白酶。

酸性真菌蛋白酶可以来源于曲霉属、假丝酵母属、革盖菌属、内座壳属(Endothia)、Enthomophtra、耙齿菌属、毛霉属、青霉属、根霉属、小核菌属以及球拟酵母菌属。具体而言，该蛋白酶可以来源于棘孢曲霉(WO95/02044)、泡盛曲霉(林田(Hayashida)等人，1977，农业、生物学与化学(Agric.Biol.Chem.)42(5),927-933)、黑曲霉(参见例如，快禅(Koaze)等人，1964，日本农业、生物学与化学(Agr.Biol.Chem.Japan)28:216)、斋藤曲霉(参见例如，吉田(Yoshida)，1954，日本农业、化学与社会学杂志(J.Agr.Chem.Soc.Japan)28:66)、或米曲霉，如pepA蛋白酶；以及来自米黑毛霉或微小毛霉的酸性蛋白酶。

在一个实施例中，该酸性蛋白酶是一种来自米曲霉的在商品名(来自诺维信公司)下销售的蛋白酶复合体或来自米黑根毛霉的天冬氨酸蛋白酶或来自杰能科公司(Genencor Int.)的FAN或GC106。

在一个优选实施例中，该酸性蛋白酶是一种天冬氨酸蛋白酶，例如来源于曲霉属的菌株(特别是棘孢曲霉，尤其是棘孢曲霉CBD 101.43)的天冬氨酸蛋白酶。

优选的酸性蛋白酶是天冬氨酸蛋白酶，其在选自下组的抑制剂的存在下保留活性，该组由以下各项组成：胃酶抑素、Pefabloc、PMSF、或EDTA。来源于棘孢曲霉CBS 101.43的蛋白酶I是这样的一种酸性蛋白酶。

在一个优选实施例中，在有效量的来源于棘孢曲霉CBS 101.43的酸性蛋白酶I的存在下进行本发明的方法。

在另一个实施例中，该蛋白酶来源于曲霉属的菌株，例如棘孢曲霉的菌株，例如棘孢曲霉CBS 101.43，例如披露于WO 95/02044中的棘孢曲霉，或以下蛋白酶，该蛋白酶与WO 95/02044的蛋白酶具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％，优选95％，例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％一致性。在一个方面中，该蛋白酶与WO 95/02044的成熟多肽相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸。在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失和/或插入的WO 95/02044的成熟多肽的变体。在一个实施例中，引入WO 95/02044的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小延伸。

该蛋白酶可以是一种中性或碱性蛋白酶，如来源于芽孢杆菌属的菌株的蛋白酶。一种具体蛋白酶来源于解淀粉芽孢杆菌并且具有作为登录号P06832可在Swissprot获得的序列。这些蛋白酶与披露于Swissprot数据库中的氨基酸序列(登录号P06832)可以具有至少90％序列一致性，例如至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或特别是至少99％一致性。

该蛋白酶与WO 2003/048353中披露为序列1的氨基酸序列可以具有至少90％序列一致性，例如至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或特别是至少99％一致性。

该蛋白酶可以是一种选自由EC 3.4.22.*内的蛋白酶(半胱氨酸蛋白酶)组成的组的木瓜蛋白酶样蛋白酶，例如EC 3.4.22.2(木瓜蛋白酶)、EC3.4.22.6(木瓜凝乳蛋白酶)、EC 3.4.22.7(萝蘼蛋白酶(asclepain))、EC3.4.22.14(猕猴桃蛋白酶)、EC 3.4.22.15(组织蛋白酶L)、EC 3.4.22.25(甘氨酰内肽酶)以及EC 3.4.22.30(caricain)。

在一个实施例中，该蛋白酶是一种来源于曲霉属的菌株(例如米曲霉)的蛋白酶制剂。在另一个实施例中，该蛋白酶来源于根毛霉属的菌株，优选是米黑根毛霉。在另一个实施例中，该蛋白酶是一种蛋白酶制剂，优选是一种来源于曲霉属的菌株(例如米曲霉)的蛋白质分解制剂和一种来源于根毛霉属的菌株(优选米黑根毛霉)的蛋白酶的混合物。

天冬氨酸蛋白酶描述于例如蛋白水解酶手册(Handbook of ProteolyticEnzymes)中，由A.J.巴雷特(Barrett)、N.D.罗林斯(Rawlings)和J.F.沃森纳(Woessner)编辑，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥，1998，第270章。天冬氨酸蛋白酶的实例包括例如披露于以下各项中的那些：贝尔卡(Berka)等人，1990，基因(Gene)96:313；贝尔卡等人，1993，基因125:195-198；和戈米(Gomi)等人，1993，生物科学、生物科技与生物化学(Biosci.Biotech.Biochem.)57:1095-1100，将其通过引用而特此结合。

该蛋白酶还可以是一种金属蛋白酶，将其定义为一种选自下组的蛋白酶，该组由以下各项组成：

(a)属于EC 3.4.24的蛋白酶(金属内肽酶)；优选EC 3.4.24.39(酸性金属蛋白酶)；

(b)属于以上手册的M组的金属蛋白酶；

(c)尚未指定族的金属蛋白酶(指定：族MX)，或属于族MA、MB、MC、MD、ME、MF、MG、MH中的任一种的金属蛋白酶(如在以上手册的第989-991页所定义)；

(d)其他家族的金属蛋白酶(如以上手册的第1448-1452页所定义)；

(e)具有一个HEXXH基序的金属蛋白酶；

(f)具有一个HEFTH基序的金属蛋白酶；

(g)属于家族M3、M26、M27、M32、M34、M35、M36、M41、M43或M47中的任一种的金属蛋白酶(如以上手册的第1448-1452页所定义)；

(h)属于M28E家族的金属蛋白酶；以及

(i)属于家族M35的金属蛋白酶(如以上手册的第1492-1495页所定义)。

在其他具体实施例中，金属蛋白酶是其中肽键上的亲核攻击由被二价金属阳离子活化的水分子介导的水解酶。二价阳离子的实例是锌、钴或锰。可以通过氨基酸配体将金属离子保持在适当位置。配体的数目可以是五、四、三、二、一或零。在一个具体实施例中，数目是二或三，优选是三。

对于在本发明的方法中使用的金属蛋白酶的起源没有限制。在一个实施例中，将该金属蛋白酶分类为EC 3.4.24，优选EC 3.4.24.39。在一个实施例中，该金属蛋白酶是一种酸稳定的金属蛋白酶，例如一种真菌稳定的金属蛋白酶，如来源于嗜热子嚢菌属的菌株，优选金黄色嗜热子囊菌的菌株，特别是金黄色嗜热子囊菌CGMCC号0670的金属蛋白酶(分类为EC 3.4.24.39)。在另一个实施例中，该金属蛋白酶来源于曲霉属的菌株，优选米曲霉的菌株。

在一个实施例中，该金属蛋白酶与WO 2010/008841的SEQ ID NO:1(一种金黄色嗜热子囊菌金属蛋白酶)的氨基酸159至177，或优选氨基酸1至177(成熟多肽)具有至少80％、至少82％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性程度；并且该金属蛋白酶具有金属蛋白酶活性。

金黄色嗜热子囊菌金属蛋白酶是适于在本发明的方法中使用的金属蛋白酶的一个优选实例。另一种金属蛋白酶来源于米曲霉并且包括披露于WO2003/048353中的SEQ ID NO:11，或其氨基酸23-353；23-374；23-397；1-353；1-374；1-397；177-353；177-374；或177-397，以及披露于WO2003/048353中的SEQ ID NO:10。

另一种适于在本发明的方法中使用的金属蛋白酶是包括WO 2010/008841的SEQ ID NO:SEQ ID NO:5的米曲霉金属蛋白酶，或一种作为分离的多肽的金属蛋白酶，该多肽与SEQ ID NO:5具有至少约80％、至少82％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性程度；并且该多肽具有金属蛋白酶活性。在具体实施例中，该金属蛋白酶由SEQ ID NO:55的氨基酸序列组成。

在一个具体实施例中，金属蛋白酶具有以下氨基酸序列，该氨基酸序列与金黄色嗜热子囊菌或米曲霉金属蛋白酶的氨基酸序列的氨基酸159至177或+1至177相差四十个、三十五个、三十个、二十五个、二十个或相差十五个氨基酸。

在另一个实施例中，金属蛋白酶具有以下氨基酸序列，该氨基酸序列与这些金属蛋白酶的氨基酸序列的氨基酸159至177或+1至177相差十个、或相差九个、或相差八个、或相差七个、或相差六个、或相差五个氨基酸，例如，相差四个、相差三个、相差两个或相差一个氨基酸。

在具体实施例中，该金属蛋白酶a)包括以下各项或b)由以下各项组成

i)WO 2010/008841的SEQ ID NO:1的氨基酸159至177或+1至177的氨基酸序列；

ii)WO 2010/008841的SEQ ID NO:3的氨基酸23-353、23-374、23-397、1-353、1-374、1-397、177-353、177-374或177-397的氨基酸序列；

iii)WO 2010/008841的SEQ ID NO:5的氨基酸序列；或

i)、ii)和iii)的具有蛋白酶活性的序列等位基因变体或片段。

WO 2010/008841的SEQ ID NO:1的氨基酸159至177或+1至177或WO2010/008841的SEQ ID NO:3的氨基酸23-353、23-374、23-397、1-353、1-374、1-397、177-353、177-374或177-397的片段是一种自这些氨基酸序列的氨基和/或羧基端缺失一个或多个氨基酸的多肽。在一个实施例中，片段包含至少75个氨基酸残基、或至少100个氨基酸残基、或至少125个氨基酸残基、或至少150个氨基酸残基、或至少160个氨基酸残基、或至少165个氨基酸残基、或至少170个氨基酸残基、或至少175个氨基酸残基。

在另一个实施例中，该金属蛋白酶与另一种蛋白酶组合，该蛋白酶是例如真菌蛋白酶，优选是酸性真菌蛋白酶。

在一个优选实施例中，该蛋白酶是来自大型亚灰树花菌、披露于PCT/EP2013/068361(将其通过引用结合在此)的实例1和2以及在此的实例5和6中的S53蛋白酶3。

可商购产品包括ESPERASE^TM、FLAVOURZYME^TM、NOVOZYM^TMFM 2.0L及iZyme BA(可获得自诺维信公司，丹麦)以及来自美国的杰能科国际公司(GenencorInternational,Inc.)的GC106^TM和SPEZYME^TMFAN。

该蛋白酶能以0.0001-1mg酶蛋白/g干固体(DS)籽粒，优选0.001至0.1mg酶蛋白/g DS籽粒的量存在。

在一个实施例中，该蛋白酶是一种按以下量添加的酸性蛋白酶：1-20,000HUT/100g DS籽粒，例如1-10,000HUT/100g DS籽粒，优选300-8,000HUT/100g DS籽粒，尤其是3,000-6,000HUT/100g DS籽粒，或4,000-20,000HUT/100g DS籽粒酸性蛋白酶，优选5,000-10,000HUT/100g，尤其是从6,000-16,500HUT/100g DS籽粒。

纤维素分解组合物

在一个实施例中，该纤维素分解组合物来源于木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株；腐质霉属的菌株，例如特异腐质霉的菌株，和/或金孢子菌属的菌株，例如卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)的菌株。

在一个优选实施例中，该纤维素分解组合物来源于里氏木霉的菌株。

该纤维素分解组合物可以包括以下多肽(包括酶)中的一种或多种：具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，β-葡糖苷酶，β-木糖苷酶，CBHI和CBHII，内切葡聚糖酶，木聚糖酶或其两种、三种或四种的混合物。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽以及一种β-葡糖苷酶。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽以及一种β-木糖苷酶。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽以及一种内切葡聚糖酶。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽以及一种木聚糖酶。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、一种内切葡聚糖酶以及一种木聚糖酶。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、一种β-葡糖苷酶以及一种β-木糖苷酶。在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、一种β-葡糖苷酶以及一种内切葡聚糖酶。在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、一种β-葡糖苷酶以及一种木聚糖酶。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、一种β-木糖苷酶以及一种内切葡聚糖酶。在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、一种β-木糖苷酶以及一种木聚糖酶。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、一种β-葡糖苷酶、一种β-木糖苷酶以及一种内切葡聚糖酶。在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、一种β-葡糖苷酶、一种β-木糖苷酶以及一种木聚糖酶。在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、一种β-葡糖苷酶、一种内切葡聚糖酶以及一种木聚糖酶。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、一种β-木糖苷酶、一种内切葡聚糖酶以及一种木聚糖酶。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、一种β-葡糖苷酶、一种β-木糖苷酶、一种内切葡聚糖酶以及一种木聚糖酶。

在一个实施例中，该内切葡聚糖酶是一种内切葡聚糖酶I。

在一个实施例中，该内切葡聚糖酶是一种内切葡聚糖酶II。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、一种内切葡聚糖酶I以及一种木聚糖酶。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、一种内切葡聚糖酶II以及一种木聚糖酶。

在另一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、一种β-葡糖苷酶以及一种CBHI。

在另一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、一种β-葡糖苷酶、一种CBHI以及一种CBHII。

该纤维素分解组合物可以进一步包括一种或多种选自下组的酶，该组由以下各项组成：酯酶、扩张蛋白、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、膨胀蛋白以及植酸酶。

具有纤维素分解增强活性的GH61多肽

在一个实施例中，该纤维素分解组合物可以包括一种或多种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。

在一个实施例中，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽来源于嗜热子嚢菌属，例如金黄色嗜热子囊菌的菌株，例如在WO 2005/074656中描述为SEQID NO:2或在此的SEQ ID NO:1的多肽，或以下具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，该多肽与WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:1具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％，优选95％，例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％一致性。在一个方面中，该蛋白酶与SEQ ID NO:1的成熟多肽相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸。在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:1的成熟多肽的变体。在一个实施例中，引入SEQ ID NO:1的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小延伸。

在一个实施例中，具有纤维素分解增强活性的该GH61多肽来源于来自青霉属的菌株，例如埃默森青霉菌的菌株，例如在WO 2011/041397或在此SEQID NO:2的中披露的多肽，或以下具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，该多肽与WO 2011/041397中的SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:2具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％，优选95％，例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％一致性。在一个方面中，该蛋白酶与SEQ IDNO:2的成熟多肽相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸。在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体。在一个实施例中，引入SEQ ID NO:2的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小延伸。

在一个实施例中，具有纤维素分解增强活性的该GH61多肽来源于梭孢壳属，例如土生梭孢壳霉的菌株，例如在WO 2005/074647中披露为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的多肽；或来源于曲霉属的菌株的多肽，例如烟曲霉的菌株，例如在WO 2010/138754中描述为SEQ ID NO:2的多肽，或以下具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，该多肽与其具有至少80％，例如至少85％，例如至少90％，优选95％，例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％一致性。

内切葡聚糖酶

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种内切葡聚糖酶，例如一种内切葡聚糖酶I或内切葡聚糖酶II。

可以在本发明的方法中使用的细菌内切葡聚糖酶的实例包括但不限于：解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)内切葡聚糖酶(WO 91/05039；WO 93/15186；美国专利号5,275,944；WO 96/02551；美国专利号5,536,655；WO 00/70031；WO 05/093050)；褐色高温双歧菌(Thermobifida fusca)内切葡聚糖酶III(WO 05/093050)；以及褐色高温双歧菌内切葡聚糖酶V(WO05/093050)。

可以用于本发明的真菌内切葡聚糖酶的实例包括但不限于：里氏木霉内切葡聚糖酶I(彭蒂莱(Penttila)等人，1986，基因(Gene)45:253-263，里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶I(GENBANK^TM登录号M15665)；里氏木霉内切葡聚糖酶II(萨洛黑莫(Saloheimo)等人，1988，基因63:11-22)，里氏木霉Cel5A内切葡聚糖酶II(GENBANK^TM登录号M19373)；里氏木霉内切葡聚糖酶III(奥卡达(Okada)等人，1988，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)64:555-563，GENBANK^TM登录号AB003694)；里氏木霉内切葡聚糖酶V(萨洛黑莫等人，1994，分子微生物学(Molecular Microbiology)l3:219-228，GENBANK^TM登录号Z33381)；棘孢曲霉内切葡聚糖酶(黄(Ooi)等人，1990，核酸研究(Nucleic Acids Research)18:5884)；川地曲霉(spergillus kawachii)内切葡聚糖酶(坂元(Sakamoto)等人，1995，当代遗传学(Current Genetics)27:435-439)；胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovara)内切葡聚糖酶(萨里拉赫蒂(Saarilahti)等人，1990，基因90:9-14)；尖镰孢内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号L29381)；灰腐质霉高温变种内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号AB003107)；热白丝菌(Melanocarpus albomyces)内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号MAL515703)；粗糙链孢菌内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号XM_324477)；特异腐质霉内切葡聚糖酶V；嗜热毁丝霉CBS 117.65内切葡聚糖酶；担子菌纲(basidiomycete)CBS 495.95内切葡聚糖酶；担子菌纲CBS494.95内切葡聚糖酶；土生梭孢壳霉NRRL 8126CEL6B内切葡聚糖酶；土生梭孢壳霉NRRL 8126CEL6C内切葡聚糖酶；土生梭孢壳霉NRRL 8126CEL7C内切葡聚糖酶；土生梭孢壳霉NRRL 8126CEL7E内切葡聚糖酶；土生梭孢壳霉NRRL 8126CEL7F内切葡聚糖酶；Cladorrhinum foecundissimum ATCC62373CEL7A内切葡聚糖酶；以及里氏木霉菌株号VTT-D-80133内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号M15665)。

在一个实施例中，该内切葡聚糖酶是一种内切葡聚糖酶II，例如来源于木霉属的内切葡聚糖酶，例如里氏木霉的菌株，例如在WO 2011/057140中描述为SEQ ID NO:22或在此的SEQ ID NO:3的内切葡聚糖酶，或以下内切葡聚糖酶，该内切葡聚糖酶与WO 2011/057140中的SEQ ID NO:22或在此的SEQ IDNO:3具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％，优选95％，例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％一致性。在一个方面中，该蛋白酶与SEQ ID NO:3的成熟多肽相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸。在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:3的成熟多肽的变体。在一个实施例中，引入SEQ ID NO:3的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小延伸。

木聚糖酶

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种木聚糖酶。在一个优选方面中，该木聚糖酶是一种家族10木聚糖酶。

有用于本发明的方法的木聚糖酶的实例包括但不限于来自以下各项的木聚糖酶：棘孢曲霉(GeneSeqP:AAR63790；WO 94/21785)、烟曲霉(WO2006/078256)、嗜松青霉菌(WO 2011/041405)、青霉菌属种(WO2010/126772)、土生梭孢壳霉NRRL 8126(WO 2009/079210)以及褐孢长毛盘菌GH10(WO 2011/057083)。

在一个实施例中，该GH10木聚糖酶来源于曲霉属，例如棘孢曲霉的菌株，例如在WO 94/021785中描述为SEQ ID NO:5(称为Xyl II)或在此的SEQID NO:4的木聚糖酶，或以下GH10木聚糖酶，该木聚糖酶与WO 94/021785中的SEQ ID NO:5或在此的SEQ ID NO:4具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％，优选95％，例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％一致性。在一个方面中，该木聚糖酶与SEQ ID NO:4的成熟多肽相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸。在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:4的成熟多肽的变体。在一个实施例中，引入SEQ ID NO:4的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小延伸。

在一个实施例中，该GH10木聚糖酶来源于曲霉属，例如烟曲霉的菌株，例如在WO 2006/078256中描述为SEQ ID NO:6(作为Xyl III)或在此的SEQID NO:5，或以下GH10木聚糖酶，该木聚糖酶与WO 2006/078256中的SEQ IDNO:6(Xyl III)或在此的SEQ ID NO:5具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％，优选95％，例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％一致性。在一个方面中，该木聚糖酶与SEQ ID NO:5的成熟多肽相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸。在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:5的成熟多肽的变体。在一个实施例中，引入SEQ ID NO:5的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小延伸。

β-木糖苷酶

有用于本发明的方法的β-木糖苷酶的实例包括但不限于来自以下各项的β-木糖苷酶：粗糙链孢菌(SwissProt登录号Q7SOW4)、里氏木霉(UniProtKB/TrEMBL登录号Q92458)以及埃默森踝节菌(Talaromycesemersonii)(SwissProt登录号Q8X212)。

在一个实施例中，该β-木糖苷酶来源于曲霉属，例如烟曲霉的菌株，例如在WO 2011/057140中描述为SEQ ID NO:206或在此的SEQ ID NO:6的β-木糖苷酶，或以下β-木糖苷酶，该β-木糖苷酶与WO 2011/057140中的SEQ IDNO:206或在此的SEQ ID NO:6具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％，优选95％，例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％一致性。在一个方面中，该β-木糖苷酶与SEQ ID NO:6的成熟多肽相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸。在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:6的成熟多肽的变体。在一个实施例中，引入SEQ ID NO:6的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小延伸。

在一个实施例中，该β-木糖苷酶来源于曲霉属的菌株，例如烟曲霉的菌株，例如在美国临时号61/526,833或PCT/US 12/052163中或WO 2013/028928(参见实例16和17)的SEQ ID NO:16中披露的β-木糖苷酶，或来源于木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株，例如WO 2011/057140中的SEQ ID NO:58的成熟多肽或以下β-木糖苷酶，该β-木糖苷酶与其具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％，优选95％，例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％一致性。

β-葡糖苷酶

在一个实施例中，该纤维素分解组合物可以包括一种或多种β-葡糖苷酶。在一个实施例中，该β-葡糖苷酶可以是一种来源于曲霉属的菌株的β-葡糖苷酶，例如米曲霉，例如披露于WO 2002/095014中的β-葡糖苷酶或例如如在WO 2008/057637中披露为SEQ ID NO:74或76的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白，或烟曲霉，例如在WO 2005/047499中披露为SEQ ID NO:2的β-葡糖苷酶或烟曲霉β-葡糖苷酶变体，例如披露于PCT申请PCT/US 11/054185或WO2012/044915(或美国临时申请号61/388,997)中的β-葡糖苷酶变体，例如具有以下取代的β-葡糖苷酶变体：F100D，S283G，N456E，F512Y。

在一个实施例中，该β-葡糖苷酶来源于曲霉属，例如烟曲霉的菌株，例如在WO 2005/047499中描述为SEQ ID NO:2的β-葡糖苷酶，或以下β-葡糖苷酶，该β-葡糖苷酶与其具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％，优选95％，例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％一致性。

在一个实施例中，该β-葡糖苷酶来源于曲霉属，例如烟曲霉的菌株，例如在WO 2005/047499中或在WO 2012/044915中描述为SEQ ID NO:2的β-葡糖苷酶，或以下β-葡糖苷酶，该β-葡糖苷酶与其具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％，优选95％，例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％一致性。

纤维二糖水解酶I

在一个实施例中，该纤维素分解组合物可以包括一种或多种CBH I(纤维二糖水解酶I)。在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种纤维二糖水解酶I(CBHI)，例如来源于曲霉属的菌株的纤维二糖水解酶I，例如烟曲霉的菌株，例如在WO 2011/057140中披露为SEQ ID NO:2的Cel7A CBHI，或来源于木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株。

在一个实施例中，该纤维二糖水解酶I来源于曲霉属，例如烟曲霉的菌株，例如在WO 2011/057140中描述为SEQ ID NO:6的纤维二糖水解酶I，或以下CBH I，该CBH I与其具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％，优选95％，例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％一致性。

纤维二糖水解酶II

在一个实施例中，该纤维素分解组合物可以包括一种或多种CBH II(纤维二糖水解酶II)。在一个实施例中，该纤维二糖水解酶II(CBHII)，例如来源于曲霉属的菌株的纤维二糖水解酶II，例如烟曲霉的菌株；或木霉属的菌株，例如里氏木霉，或梭孢壳属的菌株，例如土生梭孢壳霉的菌株，例如来自土生梭孢壳霉的纤维二糖水解酶II CEL6A。

在一个实施例中，该纤维二糖水解酶II来源于曲霉属，例如烟曲霉的菌株，例如在WO 2011/057140中描述为SEQ ID NO:18的纤维二糖水解酶II，或以下CBH II，该CBH II与其具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％，优选95％，例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％一致性。

示例性纤维素分解组合物

如以上提及的，该纤维素分解组合物可以包括多种不同的多肽(例如酶)。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物包含米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(例如，WO 2008/057637中的SEQ ID NO:74或76)以及金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(例如，WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2)。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括棘孢曲霉GH10木聚糖酶(例如，WO 94/021785中的SEQ ID NO:5(Xyl II))和一种里氏木霉纤维素分解酶组合物的共混物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物包含烟曲霉β-葡糖苷酶(例如，WO 2005/047499中的SEQ ID NO:2)和金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(例如，WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2)。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括烟曲霉GH10木聚糖酶(例如，WO 2006/078256中的SEQ ID NO:6(Xyl III))和烟曲霉β-木糖苷酶(例如，WO 2011/057140中的SEQ ID NO:206)与一种里氏木霉纤维素分解酶组合物的共混物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物包含烟曲霉纤维二糖水解酶I(例如，WO 2011/057140中的SEQ ID NO:6)、烟曲霉纤维二糖水解酶II(例如，WO 2011/057140中的SEQ ID NO:18)、烟曲霉β-葡糖苷酶变体(例如，披露于WO 2012/044915中的具有F100D、S283G、N456E、F512Y取代的变体)以及青霉属(埃默森青霉菌)GH61多肽(例如，WO 2011/041397中的SEQ ID NO:2)。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物进一步包括具有纤维素分解增强活性的金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(例如，WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2)以及米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(例如，WO 2008/057637的SEQ ID NO:74或76)。

在另一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物进一步包括具有纤维素分解增强活性的金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(例如，WO 2005/074656中的SEQ IDNO:2)以及烟曲霉β-葡糖苷酶(例如，WO 2005/047499的SEQ ID NO:2)。

在另一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物进一步包括例如在WO2011/041397中披露为SEQ ID NO:2的具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌GH61A多肽、烟曲霉β-葡糖苷酶(例如，WO 2005/047499中的SEQ ID NO:2)或其具有以下取代的变体：F100D，S283G，N456E，F512Y。

本发明的酶组合物可以处于任何适于使用的形式，例如像除去或未除去细胞的粗发酵液、具有或不具有细胞碎片的细胞裂解液、半纯化或纯化的酶组合物、或作为酶的来源的宿主细胞(例如，木霉属宿主细胞)。

该酶组合物可以是干粉或颗粒、非尘颗粒、液体、稳定化的液体或稳定化的受保护的酶。可以根据已建立的方法例如通过添加稳定剂(如糖、糖醇或其他多元醇)、和/或乳酸或另一种有机酸，对液体酶组合物进行稳定化。酶量

在具体实施例中，蛋白酶以酶蛋白的总量的约10％w/w至约65％w/w的范围存在于酶组合物中。在其他实施例中，蛋白酶以约10％w/w至约60％w/w、约10％w/w至约55％w/w、约10％w/w至约50％w/w、约15％w/w至约65％w/w、约15％w/w至约60％w/w、约15％w/w至约55％w/w、约15％w/w至约50％w/w、约20％w/w至约65％w/w、约20％w/w至约60％w/w、约20％w/w至约55％w/w、约20％w/w至约50％w/w、约25％w/w至约65％w/w、约25％w/w至约60％w/w、约25％w/w至约55％w/w、约25％w/w至约50％w/w、约30％w/w至约65％w/w、约30％w/w至约60％w/w、约30％w/w至约55％w/w、约30％w/w至约50％w/w、约35％w/w至约65％w/w、约35％w/w至约60％w/w、约35％w/w至约55％w/w或约35％w/w至约50％w/w存在。

可以按有效量添加酶，可以根据从业者和具体过程需要调节该有效量。通常，酶能以0.0001-1mg酶蛋白/g干固体(DS)籽粒，例如0.001-0.1mg酶蛋白/g DS籽粒的量存在。在具体实施例中，酶可以按以下量存在，例如1μg、2.5μg、5μg、10μg、20μg、25μg、50μg、75μg、100μg、125μg、150μg、175μg、200μg、225μg、250μg、275μg、300μg、325μg、350μg、375μg、400μg、450μg、500μg、550μg、600μg、650μg、700μg、750μg、800μg、850μg、900μg、950μg、1000μg酶蛋白/g DS籽粒。

其他酶活性

根据本发明，以下活性中的一种或多种的有效量可以在处理籽粒的过程中存在或添加：戊聚糖酶、果胶酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶(arabinofurasidase)、木葡聚糖酶、植酸酶活性。

据信在将籽粒分为更细的颗粒后，该一种或多种酶可以更直接地作用于籽粒的细胞壁和蛋白基质并且因此更有效。因而，在随后的步骤中，更加容易地将淀粉洗出。

优选实施例

本发明的以下实施例是示例性的。

1.一种用于处理作物籽粒的方法，该方法包括以下步骤：

a)将籽粒浸泡在水中，以产生浸泡的籽粒；

b)碾磨这些浸泡的籽粒；

c)在有效量的酶组合物的存在下处理这些浸泡的籽粒，该酶组合物包括：

i)一种蛋白酶，

ii)一种纤维素分解组合物，包括

1)一种纤维素酶或一种半纤维素酶，以及

2)一种GH61多肽，并且

其中在步骤b)之前、过程中或之后进行步骤c)。

2.如实施例1所述的方法，其中该蛋白酶以酶蛋白的总量的约10％w/w至约65％w/w，例如约25％w/w至约50％w/w的范围存在。

3.如以上实施例中任一项所述的方法，其中该蛋白酶以小于约60％w/w的该酶组合物，例如小于约55％w/w、小于约50％w/w、小于约45％w/w、小于约40％w/w、小于约35％w/w、小于约30％w/w、小于约25％w/w、小于约20％w/w、或小于约15％w/w的酶蛋白的总量存在。

4.如以上实施例中任一项所述的方法，其中该蛋白酶以酶蛋白的总量的约50％w/w存在。

5.如以上实施例中任一项所述的方法，其中该蛋白酶以酶蛋白的总量的约25％w/w存在。

6.如以上实施例中任一项所述的方法，其中该酶组合物以0.0001-1mg酶蛋白/g干固体(DS)籽粒，例如0.001-0.1mg酶蛋白/g DS籽粒的量存在。

7.如以上实施例中任一项所述的方法，其中该酶组合物按以下量存在，例如1μg、2.5μg、5μg、10μg、20μg、25μg、50μg、75μg、100μg、125μg、150μg、175μg、200μg、225μg、250μg、275μg、300μg、325μg、350μg、375μg、400μg、450μg、500μg、550μg、600μg、650μg、700μg、750μg、800μg、850μg、900μg、950μg、1000μg酶蛋白/g DS籽粒。

8.如以上实施例中任一项所述的方法，其中该GH61多肽是一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。

9.如以上实施例中任一项所述的方法，其中该酶组合物包括一种纤维素酶以及一种半纤维素酶。

10.如以上实施例中任一项所述的方法，其中该酶组合物包括一种内切葡聚糖酶。

11.如以上实施例中任一项所述的方法，其中该酶组合物包括一种木聚糖酶。

12.如以上实施例中任一项所述的方法，其中该纤维素分解组合物包括一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物包含米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(例如，WO 2008/057637中的SEQ ID NO:74或76)以及金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(例如，WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2)。

13.如以上实施例中任一项所述的方法，其中该纤维素分解组合物包括棘孢曲霉GH10木聚糖酶(例如，WO 94/021785中的SEQ ID NO:5(XylII))和一种里氏木霉纤维素分解酶组合物的共混物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物包含烟曲霉β-葡糖苷酶(例如，WO 2005/047499中的SEQ ID NO:2)和金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(例如，WO 2005/074656中的SEQ IDNO:2)。

14.如以上实施例中任一项所述的方法，其中该纤维素分解组合物包括烟曲霉GH10木聚糖酶(例如，WO 2006/078256中的SEQ ID NO:6(XylIII))和烟曲霉β-木糖苷酶(例如，WO 2013/028928中的SEQ ID NO:16-参见实例16和17或WO 2011/057140中的SEQ ID NO:206)与一种里氏木霉纤维素分解酶组合物的共混物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物包含烟曲霉纤维二糖水解酶I(例如，WO 2011/057140中的SEQ ID NO:6)、烟曲霉纤维二糖水解酶II(例如，WO 2011/057140中的SEQ ID NO:18)、烟曲霉β-葡糖苷酶变体(例如，描述于WO 2012/044915中的具有F100D、S283G、N456E、F512Y取代的变体)以及青霉属(埃默森青霉菌)GH61多肽(例如，WO2011/041397中的SEQ ID NO:2)。

15.如以上实施例中任一项所述的方法，其中该纤维素分解组合物包括一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物进一步包括具有纤维素分解增强活性的金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(例如，WO2005/074656中的SEQ ID NO:2)以及米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(例如，WO2008/057637的SEQ ID NO:74或76)。

16.如以上实施例中任一项所述的方法，其中该纤维素分解组合物包括一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物进一步包括具有纤维素分解增强活性的金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(例如，WO2005/074656中的SEQ ID NO:2)以及烟曲霉β-葡糖苷酶(例如，WO2005/047499的SEQ ID NO:2)。

17.如以上实施例中任一项所述的方法，其中该纤维素分解组合物包括一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物进一步包括例如在WO 2011/041397中披露为SEQ ID NO:2的具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌GH61A多肽、烟曲霉β-葡糖苷酶(例如，WO 2005/047499中的SEQ ID NO:2)或其具有以下取代的变体：F100D，S283G，N456E，F512Y(披露于WO 2012/044915中)。

18.如以上实施例中任一项所述的方法，该方法进一步包括用戊聚糖酶、果胶酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木葡聚糖酶和/或植酸酶处理这些籽粒。

19.如以上实施例中任一项所述的方法，其中将这些籽粒在水中浸泡约2-10小时，优选约3小时。

20.如以上实施例中任一项所述的方法，其中在约40℃与约60℃之间的温度，优选约50℃下进行该浸泡。

21.如以上实施例中任一项所述的方法，其中在酸性pH，优选约3-5，例如约3-4下进行该浸泡。

22.如以上实施例中任一项所述的方法，其中在0.01-1％之间，优选0.05-0.3％，尤其是0.1％SO₂和/或NaHSO₃的存在下进行该浸泡。

23.如以上实施例中任一项所述的方法，其中这些作物籽粒来自玉米(玉蜀黍)、水稻、大麦、高粱大豆、或果壳或小麦。

24.如以上权利要求中任一项所述的方法，该方法进一步包括用来自大型亚灰树花菌的蛋白酶S53蛋白酶3处理这些籽粒。

25.一种用于处理作物籽粒的方法，该方法包括以下步骤：

a)将籽粒浸泡在水中，以产生浸泡的籽粒；

b)碾磨这些浸泡的籽粒；

i)一种蛋白酶，以及

ii)一种纤维素分解组合物，包括一种纤维素酶或一种半纤维素酶，

其中在步骤b)之前、过程中或之后进行步骤c)，并且

其中该蛋白酶以酶蛋白的总量的约10％w/w至约65％w/w的范围存在。

26.如以上实施例中任一项所述的方法，其中该酶组合物以0.0001-1mg酶蛋白/g干固体(DS)籽粒，例如0.001-0.1mg酶蛋白/g DS籽粒的量存在。

27.如以上实施例中任一项所述的方法，其中该酶组合物按以下量存在，例如1μg、2.5μg、5μg、10μg、20μg、25μg、50μg、75μg、100μg、125μg、150μg、175μg、200μg、225μg、250μg、275μg、300μg、325μg、350μg、375μg、400μg、450μg、500μg、550μg、600μg、650μg、700μg、750μg、800μg、850μg、900μg、950μg、1000μg酶蛋白/g DS籽粒。

28.如以上实施例中任一项所述的方法，其中该纤维素分解组合物包括一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物包含米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(例如，WO 2008/057637中的SEQ ID NO:74或76)以及金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(例如，WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2)。

29.如以上实施例中任一项所述的方法，其中该纤维素分解组合物包括棘孢曲霉GH10木聚糖酶(例如，WO 1994/021785中的SEQ ID NO:5(XylII))和一种里氏木霉纤维素分解酶组合物的共混物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物包含烟曲霉β-葡糖苷酶(例如，WO 2005/047499中的SEQ ID NO:2)和金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(例如，WO 2005/074656中的SEQ IDNO:2)。

30.如以上实施例中任一项所述的方法，其中该纤维素分解组合物包括烟曲霉GH10木聚糖酶(例如，WO 2006/078256中的SEQ ID NO:6(XylIII))和烟曲霉β-木糖苷酶(例如，WO 2013/028928中的SEQ ID NO:16-参见实例16和17或WO 2011/057140中的SEQ ID NO:206)与一种里氏木霉纤维素分解酶组合物的共混物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物包含烟曲霉纤维二糖水解酶I(例如，WO 2011/057140中的SEQ ID NO:6)、烟曲霉纤维二糖水解酶II(例如，WO 2011/057140中的SEQ ID NO:18)、烟曲霉β-葡糖苷酶变体(例如，描述于WO 2012/044915中的具有F100D、S283G、N456E、F512Y取代的变体)以及青霉属(埃默森青霉菌)GH61多肽(例如，WO2011/041397中的SEQ ID NO:2)。

31.如以上实施例中任一项所述的方法，其中该纤维素分解组合物包括一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物进一步包括具有纤维素分解增强活性的金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(例如，WO2005/074656中的SEQ ID NO:2)以及米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(例如，WO2008/057637的SEQ ID NO:74或76)。

32.如以上实施例中任一项所述的方法，其中该纤维素分解组合物包括一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物进一步包括具有纤维素分解增强活性的金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(例如，WO2005/074656中的SEQ ID NO:2)以及烟曲霉β-葡糖苷酶(例如，WO2005/047499的SEQ ID NO:2)。

33.如以上实施例中任一项所述的方法，其中该纤维素分解组合物包括一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物进一步包括例如在WO 2011/041397中披露为SEQ ID NO:2的具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌GH61A多肽、烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499中的SEQ ID NO:2)或其具有以下取代的变体：F100D，S283G，N456E，F512Y(参见WO 2012/044915中)。

34.如以上实施例中任一项所述的方法，该方法进一步包括用戊聚糖酶、果胶酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木葡聚糖酶和/或植酸酶处理这些籽粒。

35.如以上实施例中任一项所述的方法，该方法进一步包括用来自大型亚灰树花菌的蛋白酶S53蛋白酶3处理这些籽粒。

36.一种GH61多肽用于增强一种或多种酶的湿磨益处的用途。

37.如以上实施例中任一项所述的用途，其中该酶组合物以0.0001-1mg酶蛋白/g干固体(DS)籽粒，例如0.001-0.1mg酶蛋白/g DS籽粒的量存在。

38.如以上实施例中任一项所述的用途，其中该酶组合物按以下量存在，例如1μg、2.5μg、5μg、10μg、20μg、25μg、50μg、75μg、100μg、125μg、150μg、175μg、200μg、225μg、250μg、275μg、300μg、325μg、350μg、375μg、400μg、450μg、500μg、550μg、600μg、650μg、700μg、750μg、800μg、850μg、900μg、950μg、1000μg酶蛋白/g DS籽粒。

39.如以上实施例中任一项所述的用途，其中该纤维素分解组合物包括一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物包含米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(例如，WO 2008/057637中的SEQ ID NO:74或76)以及金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(例如，WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2)。

40.如以上实施例中任一项所述的用途，其中该纤维素分解组合物包括棘孢曲霉GH10木聚糖酶(例如，WO 94/021785中的SEQ ID NO:5)和一种里氏木霉纤维素分解酶组合物的共混物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物包含烟曲霉β-葡糖苷酶(例如，WO 2005/047499中的SEQ ID NO:2)和金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(例如，WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2)。

41.如以上实施例中任一项所述的用途，其中该纤维素分解组合物包括烟曲霉GH10木聚糖酶(例如，WO 2006/078256中的SEQ ID NO:6(XylIII))和烟曲霉β-木糖苷酶(例如，WO 2013/028928中的SEQ ID NO:16-参见实例16和17或WO 2011/057140中的SEQ ID NO:206)与一种里氏木霉纤维素分解酶组合物的共混物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物包含烟曲霉纤维二糖水解酶I(例如，WO 2011/057140中的SEQ ID NO:6)、烟曲霉纤维二糖水解酶II(例如，WO 2011/057140中的SEQ ID NO:18)、烟曲霉β-葡糖苷酶变体(例如，描述于WO 2012/044915中的具有F100D、S283G、N456E、F512Y取代的变体)以及青霉属(埃默森青霉菌)GH61多肽(例如，WO2011/041397中的SEQ ID NO:2)。

42.如以上实施例中任一项所述的用途，其中该纤维素分解组合物包括一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物进一步包括具有纤维素分解增强活性的金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(例如，WO2005/074656中的SEQ ID NO:2)以及米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(例如，WO2008/057637的SEQ ID NO:74或76)。

43.如以上实施例中任一项所述的用途，其中该纤维素分解组合物包括一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物进一步包括具有纤维素分解增强活性的金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(例如，WO2005/074656中的SEQ ID NO:2)以及烟曲霉β-葡糖苷酶(例如，WO2005/047499的SEQ ID NO:2)。

44.如以上实施例中任一项所述的用途，其中该纤维素分解组合物包括一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物进一步包括例如在WO 2011/041397中披露为SEQ ID NO:2的具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌GH61A多肽、烟曲霉β-葡糖苷酶(例如，WO 2005/047499中的SEQ ID NO:2)或其具有以下取代的变体：F100D，S283G，N456E，F512Y(披露于WO 2012/044915中)。

45.如以上实施例中任一项所述的用途，该用途进一步包括用来自大型亚灰树花菌的蛋白酶S53蛋白酶3处理这些籽粒，例如披露于PCT/EP2013/068361中的实例1和2以及下文的实例5和6中的蛋白酶。

46.如以上实施例中任一项所述的用途，该用途进一步包括用戊聚糖酶、果胶酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木葡聚糖酶和/或植酸酶处理这些籽粒。

在此描述和要求的本发明不由在此披露的具体实施例限制范围，这是因为这些实施例旨在作为本发明的若干方面的说明。任何等价的实施例都旨在处于本发明的范围之内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员而言从前述描述将变得清楚。这类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在有冲突的情况下，以包括定义的本披露为标准。

在此引用了不同的参考，其披露通过引用以其全部内部结合在此。

实例

材料与方法

酶：

蛋白酶I：来自披露于WO 95/02044中的棘孢曲霉CBS 101.43的酸性蛋白酶。

蛋白酶A：米曲霉曲霉蛋白酶(aspergillopepsin)A，披露于基因(Gene)，第125卷，第2期，第195-198页(1993年3月30日)。

蛋白酶B：来自金黄色嗜热子囊菌(AP025)的具有如WO 2003/048353-A1中的SEQ ID NO:2的氨基酸1-177所示的成熟酸序列的金属蛋白酶。

蛋白酶C：产生于米曲霉中的可获得自丹麦的诺维信公司的米黑根毛霉衍生的天冬氨酸内肽酶(Novoren^TM)。

蛋白酶D：如披露于下文实例5和6制备的并且可获得自丹麦的诺维信公司的来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3。

纤维素酶A：棘孢曲霉GH10木聚糖酶(WO 1994/021785中的SEQ ID NO:5或在此的SEQ ID NO:4)和一种里氏木霉纤维素分解酶组合物的共混物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物包含烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499中的SEQ ID NO:2)和金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQID NO:2)。

纤维素酶B：一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物包含米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)以及金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2)。

纤维素酶C：烟曲霉GH10木聚糖酶(WO 2006/078256中的SEQ ID NO:6(Xyl III))和烟曲霉β-木糖苷酶(WO 2013/028928中的SEQ ID NO:16-参见实例16和17)与一种里氏木霉纤维素分解酶组合物的共混物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物包含烟曲霉纤维二糖水解酶I(WO 2011/057140中的SEQID NO:6)、烟曲霉纤维二糖水解酶II(WO 2011/057140中的SEQ ID NO:18)、烟曲霉β-葡糖苷酶变体(具有F100D、S283G、N456E、F512Y取代，披露于WO 2012/044915中)以及青霉属(埃默森青霉菌)GH61多肽(WO2011/041397中的SEQ ID NO:2)。

纤维素酶D：棘孢曲霉GH10木聚糖酶(WO 1994/021785中的SEQ ID NO:5(Xyl II)或在此的SEQ ID NO:4)。

纤维素酶E：一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物包含棘孢曲霉GH10木聚糖酶(WO 1994/021785中的SEQ ID NO:5(Xyl II)或在此的SEQ ID NO:4)。

纤维素酶F：一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物包含烟曲霉GH10木聚糖酶(WO 2006/078256中的SEQ ID NO:6(Xyl III))和烟曲霉β-木糖苷酶(WO 2013/028928中的SEQ ID NO:16)。

纤维素酶G：一种纤维素分解酶组合物，该纤维素分解酶组合物包含棘孢曲霉家族10木聚糖酶(WO 1994/021785中的SEQ ID NO:5(Xyl II)或在此的SEQ ID NO:4)以及一种来源于里氏木霉RutC30的纤维素分解酶组合物。

纤维素酶H：一种来源于里氏木霉RutC30的纤维素分解组合物。

菌株

菌株大型亚灰树花菌分离自诺维信公司于1993年在丹麦收集的子实体。

方法

蛋白酶HUT活性的测定：

1HUT是在40℃和pH 4.7下经30分钟在275nm处的吸光度下将变性的血红蛋白等效物消化为吸光度为0.0084的1.10μg/ml酪氨酸于0.006N HCl中的溶液而形成水解物的酶量。在给定条件下，在0.5M乙酸盐缓冲液中通过酶消化变性的血红蛋白底物。将未消化的血红蛋白用三氯乙酸加以沉淀并且测量上清液中的水解物在275nm下的吸光度。

实例1.在蛋白酶A和/或纤维素酶A的存在下的湿磨

进行两个相同的实验，其中根据以下程序，使玉米的五个处理经受模拟玉米湿磨方法。四个处理涉及施用酶(浸渍B、C、D和E)，而一个处理无酶(浸渍A)。纤维素酶A包括GH61组分。

对于酶处理的浸渍(浸渍B至E)，配制包含0.06％(w/v)SO₂和0.5％(w/v)乳酸的浸渍溶液。针对每个烧瓶，清洗100克的干燥整齐的(黄色马齿型)玉米，以除去破碎籽粒，并且将其放入200mL上述浸渍水中。然后，将所有烧瓶放入设置为52℃同时轻轻振荡的定轨空气加热摇床中并允许在此温度下混合16小时。16小时后，将所有烧瓶从空气摇床中移出。

以类似方式制作无酶的对照浸渍(浸渍A)；除了将它浸渍于0.15％(w/v)SO₂溶液中并且在碾磨之前浸渍30小时之外。

将玉米混合物倾倒在布氏漏斗上，以使其脱水，并且然后向原浸渍烧瓶中添加100mL的淡自来水并旋涡，用于冲洗目的。然后，将其作为洗涤液倾倒在玉米上并捕获在与原玉米导液(draining)相同的烧瓶中。这一洗涤步骤的目的在于保留含有尽可能多的可溶物的滤液。将包含可溶物的滤液称为“轻浸渍水(light steep water)”(“LSW”)。然后，将收集的总轻浸渍水级分烘干，以确定存在的干物质的量。通过以下方式完成干燥：在设置为105℃的烘箱中过夜干燥。

然后，将玉米放置在具有反向叶片的瓦林实验室搅拌器(WaringLaboratory Blender)中(所以前缘是钝的)。向该搅拌器中的玉米中添加200mL的水，并且然后将玉米在低速设置下碾磨一分钟，以有助于释放胚芽。碾磨后，立即将浆液转移回烧瓶，用于酶孵育步骤。使用50mL淡水冲洗搅拌器并且还向烧瓶中添加洗涤水。在酶处理烧瓶(浸渍B、C、D和E)中加入酶并将其返回至定轨摇床中，以在52℃下以更高的混合速率再孵育4小时。如下表1所示加酶。

表1.实验设计(每克的玉米干物质施用的剂量)

孵育后，将浆液转移至较大的烧杯中，用于除去释放的胚芽。对照浸渍不经历行这一孵育步骤，但是被碾磨并且然后如下所述地被立即加工。

对于脱胚，使用漏勺轻轻地简单地搅拌混合物。停止搅拌后，大量的胚芽片浮至表面。使用漏勺手动地将这些胚芽片从液面上撇出。将胚芽片放置于在其下方具有托盘的US No.100(150μm)筛网上。重复这一混合与撇出过程，直到可忽略不计的量的胚芽上浮至表面供撇出。对漏勺中的浆醪的检查也未显示出在此时有大量的胚芽留在混合物中的证据，所以停止脱胚。然后，将已经积聚在No.100筛网上的胚芽片添加至烧瓶中，在该烧瓶中，将它们与125mL的淡水组合并旋涡，以模拟胚芽洗罐。然后，再次将烧瓶的内容物倾倒在筛网上，确保轻敲烧瓶并且完全清除出其中的胚芽。然后，将撇出烧杯中的脱胚浆液倾倒回搅拌器中，并且使用在筛网的下方的托盘中的胚芽洗涤水将胚芽从烧杯冲洗至搅拌器中。然后，再使用125mL的淡水第二次冲洗烧杯并将其添加至搅拌器中。在分析之前，将筛网上的经洗涤的胚芽在105℃下过夜烘干。

然后，将已经脱胚的纤维、淀粉和面筋浆液在高速下在搅拌器中碾磨3分钟。利用这一增加的速度从纤维中释放尽可能多的淀粉和面筋。将搅拌器中的所得碾磨浆液用下方具有托盘的No.100振动筛(莱驰(Retsch)型号AS200摇筛装置)过筛。将莱驰装置的振荡频率设为大约60HZ。一旦停止过滤，便将托盘中的淀粉和面筋滤液(称作“研磨淀粉”)转移进烧瓶中，直到进一步加工。然后，使筛网上的纤维在500mL的淡水中成浆并且然后重新倾倒在振动筛上，以从纤维中洗去未结合的淀粉。再一次，将托盘中的淀粉和面筋滤液添加至先前的研磨淀粉烧瓶中。

然后，以此方式连续三次洗涤纤维并使其过筛，每次使用240mL的淡洗涤水。然后是单次125mL洗涤同时振动，以实现从纤维级分释放最大量的淀粉和面筋。完成所有洗涤后，将纤维轻轻地按在筛网上以在将它转移至用于在105℃下(过夜)烘干的铝制秤盘中之前将其脱水。将来自洗涤和按压的所有滤液添加至研磨淀粉烧瓶中。

使用淀粉台分离淀粉和包括研磨淀粉的面筋。使用的淀粉台是不锈钢U形通道，2.5cm宽x 5cm深x 305cm长。该台的坡度是1”升至66”延伸。使用蠕动泵以大约48mL/分钟的速率将浆液泵进台的凸起端。将面筋流出物捕获在台的末端的烧杯中。应该注意的是，该台的出口端具有一个抵靠它而撑起的搅拌棒，用于充当表面张力破碎机，并且允许面筋浆液稳定地从该台流出，在此处它被收集在烧杯中。一旦整个淀粉面筋浆液已经被泵送越过该台，将100mL的淡水放入泵给料烧瓶中并将其泵送到该台上，以确保从给料烧瓶中捕获所有淀粉。允许使来自该台的流完全停止，并且将已经从该台的末端流出的所有液体收集为面筋浆液。然后，使用2,500mL的淡水将留在台上的淀粉从该台洗出进入新的容器中。在过滤面筋之前，测量面筋溶液的总体积。然后，真空过滤淀粉和面筋不溶物两者。将两个级分都在105℃烘箱中加以干燥，用于测量产量。然而，首先将它们在50℃烘箱中过夜预干燥，以从其中除去大部分水，以使胶凝化和不完全干燥最小化。烘干后，对每个级分称重，以获得干物质重量。

为了计算在该方法中产生的可溶物，收集面筋滤液并且通过在105℃下烘干250mL部分的滤液而测量滤液的总固体含量。通过将面筋溶液的体积乘以面筋滤液的总固体而计算这一级分的总可溶性固体含量。

下表2和3示出了两个实验中的对照和酶运行的产物产量(每个级分的干固体/100g玉米干物质的百分比)。

表2.实验1中的实验对照和所有共混物的级分产量。

表3.实验2中的实验对照和所有共混物的级分产量。

实例2.在蛋白酶I和/或纤维素酶A的存在下的湿磨

根据以下程序，使玉米的五个处理经受模拟玉米湿磨方法。四个处理涉及施用酶(浸渍B、C、D和E)，而一个处理无酶(浸渍A)。纤维素酶A包括GH61组分。

对于酶处理的浸渍(浸渍B至E)，配制包含0.06％(w/v)SO2和0.5％(w/v)乳酸的浸渍溶液。针对每个烧瓶，清洗100克的干燥整齐的(黄色马齿型)玉米，以除去破碎籽粒，并且将其放入200mL上述浸渍水中。然后，将所有烧瓶放入设置为52℃同时轻轻振荡的定轨空气加热摇床中并允许在此温度下混合16小时。16小时后，将所有烧瓶从空气摇床中移出。以类似方式制作无酶的对照浸渍(浸渍A)；除了将它浸渍于0.15％(w/v)SO2溶液中并且在碾磨之前浸渍30小时之外。将玉米混合物倾倒在布氏漏斗上，以使其脱水，并且然后向原浸渍烧瓶中添加100mL的淡自来水并旋涡，用于冲洗目的。然后，将其作为洗涤液倾倒在玉米上并捕获在与原玉米导液相同的烧瓶中。这一洗涤步骤的目的在于保留含有尽可能多的可溶物的滤液。将包含可溶物的滤液称为“轻浸渍水”。然后，将收集的总轻浸渍水级分烘干，以确定存在的干物质的量。通过以下方式完成干燥：在设置为105℃的烘箱中过夜干燥。

然后，将玉米放置在具有反向叶片的瓦林实验室搅拌器中(所以前缘是钝的)。向该搅拌器中的玉米中添加200mL的水，并且然后将玉米在低速设置下碾磨一分钟，以有助于释放胚芽。碾磨后，立即将浆液转移回烧瓶，用于酶孵育步骤。使用50mL淡水冲洗搅拌器并且还向烧瓶中添加洗涤水。在酶处理烧瓶(浸渍B、C、D和E)中加入酶并将其返回至定轨摇床中，以在52℃下以更高的混合速率再孵育4小时。如下表4所示加酶。

表4.实验设计(每克的玉米干物质施用的剂量)

然后，以此方式连续三次洗涤纤维并使其过筛，每次使用240mL的淡洗涤水。然后是单次125mL洗涤同时振动，以实现从纤维级分释放最大量的淀粉和面筋。完成所有洗涤后，将纤维轻轻地按在筛网上以在将它转移至用于在105℃下(过夜)烘干的铝制秤盘中之前将其脱水。将来自洗涤和按压的所有滤液添加至碾磨淀粉烧瓶中。

使用布氏漏斗过滤研磨淀粉浆液，并且将所得固体滤饼连同滤纸一起放入预称重的玻璃皿中，用于干燥。通过以下方式测量每个滤液样品的总固体含量：在105℃下烘干250mL部分的滤液，以确定固体含量。通过将滤液的体积乘以滤液的总固体而计算这一级分的总可溶性固体含量。

在105℃烘箱中过夜之前，同样将研磨淀粉固体在50℃下过夜烘干。完全烘干后，对每个级分称重，以获得干物质重量。

下表2-5示出了对照和酶运行的产物产量(每个级分的干固体/100g玉米干物质的百分比)。

表5.实验对照和所有共混物的级分产量。

淀粉和面筋产量数据表明，包含一些量的纤维素酶A(其包括GH61组分(与蛋白酶I组合或单独地))的处理产生比全部为蛋白酶的处理多的淀粉和面筋。

实例3.用纤维素酶F、纤维素酶G和蛋白酶进行的湿磨

进行两个实验(指定为实验3和实验4)，以比较与蛋白酶共混的纤维素酶F和纤维素酶G的性能，其中分别配制并碾磨三个玉米浸渍，以模拟工业玉米湿磨方法。使用相同的设备和方法单独地对其进行加工。每个实验都包括三个酶步骤(实验3，浸渍3A、3B、3C和3D；实验4，浸渍4A、4B、4C和4D)。下文描述了不同的加工步骤。

通过在烘干过程中的重量损失确定在该实验中使用的玉米的水份。为使用的玉米称重并将其在105℃烘箱中放置72小时。然后，在烘干后，为玉米重新称重。使用重量损失确定玉米的初始固体含量。

浸渍：在研磨之前，将酶样品(浸渍A至D)在0.06％(w/v)SO2和0.5％(w/v)乳酸溶液中浸渍16小时。将100克的干玉米放入200mL上述浸渍水中。然后，在52℃下，将整个混合物放入设置为175RPM的定轨空气加热摇床中并允许在此温度下混合希望的时间。在浸渍过程结束时，将玉米混合物倾倒在布氏漏斗上，用于脱水，并且向原浸渍烧瓶中添加100mL的淡自来水，用于冲洗目的。然后，将其作为洗涤液倾倒在玉米上并捕获在与原玉米导液相同的烧瓶中。这一洗涤步骤的目的在于保留含有尽可能多的可溶物的滤液。将总的轻浸渍水级分放入配衡烧瓶中并在105℃下完全烘干24小时。在干燥后，为烧瓶称重，以确定存在的干物质的量。

第一次碾磨：然后，将玉米放置在具有反向叶片的瓦林实验室搅拌器中(所以前缘是钝的)。向搅拌器中的玉米中添加200mL的水连同来自以上的玉米冲洗水，并且将玉米碾磨一分钟，以有助于释放胚芽。使用50mL的淡水冲洗搅拌器并且然后将其连同第一次碾磨材料一起倾倒进塑料桶中。然后，将浆液转移回每个烧瓶并如下表6所示的比率添加酶(标记的A至D，3A和4A是相关对照)。将具有玉米浆液的烧瓶转移至定轨摇床中并在52℃下孵育4小时。孵育后，将浆液倾倒进5L塑料桶中，用于手动除去胚芽。

表6.实验设计

脱胚：使用漏勺轻轻地简单地搅拌混合物。停止搅拌后，大量的胚芽片浮至表面。使用漏勺将这些胚芽片从液面上撇出。

将胚芽片放置于在其下方具有托盘的US No.100筛网上。重复这一混合与撇出过程，直到可忽略不计的胚芽上浮至表面供撇出。对漏勺中的沉降浆醪的检查也未显示出在此时有大量的胚芽留在混合物中的证据，所以停止脱胚。

将已经积聚在No.100筛网上的胚芽片转移至较小的烧杯中并用大约125mL的淡自来水旋涡，以从胚芽中洗出尽可能多的淀粉。

将烧杯中的胚芽和水倾倒回该100目筛网上，用于脱水。然后，将桶中的脱胚浆液倾倒回搅拌器中，用于第二次碾磨。然后，使用来自第一次胚芽洗涤的穿过100目筛网的水冲洗塑料桶并使冲洗后的水进入该搅拌器中。然后，将第二个125mL等分部分的自来水倾倒在筛网上的胚芽片上，以有助于进一步洗涤。再次将该水收集在托盘中并用于第二次冲洗该塑料桶并使冲洗后的水进入该搅拌器中。然后，用刮刀按压筛网上的胚芽并将其转移至配衡重量托盘中并在分析之前，在105℃下烘干24小时。

第二次碾磨：然后，将已经脱胚的纤维、淀粉和面筋浆液在搅拌器中高速碾磨3分钟。利用这一增加的速度从纤维中释放尽可能多的淀粉和面筋。

纤维洗涤：伴随第二次碾磨完成，将搅拌器中的浆液用No.100振动筛(莱驰型号A200摇筛装置)过筛。将莱驰装置的振荡频率设为大约60HZ。一旦已经停止过滤，将淀粉和面筋滤液部分转移进烧瓶中，用于存储直到置于台上。然后，第二次碾磨后，使用500mL的淡水冲洗该搅拌器冲洗并使冲洗后的水进入一个塑料桶中。然后，将纤维筛网顶上的纤维添加至该塑料桶中，在大约500mL的淡水中旋涡并且然后重新过筛。然后，将来自此次洗涤的滤液连同第一批滤液一起转移至存储烧瓶中。

然后，以此方式连续三次洗涤纤维并使其过筛，每次使用240mL的淡洗涤水。然后是单次125mL洗涤同时振动，以实现从纤维级分释放最大量的淀粉和面筋。完成所有洗涤后，将纤维轻轻地按在筛网上以在称重之前，在将它转移至用于在105℃下烘干24小时的铝制秤盘中之前将其脱水。

将来自洗涤和按压的所有滤液添加至存储烧瓶中，从而产生体积大约1,800mL的总淀粉和面筋浆液体积。

然后，在烘干之前，通过布氏漏斗中的沃特曼滤纸真空过滤淀粉和面筋浆液。测量来自真空烧瓶的总滤液体积。将250ml滤液转移至塑料瓶中，用于在105℃下烘干48小时。通过将面筋溶液的体积乘以面筋滤液的总固体而计算这一级分的总可溶性固体含量。将滤饼转移至不锈钢皿中，用于首先在50℃下过夜干燥，以使胶凝化最小化并且然后在105℃下过夜干燥，以获得干重。

下表7和8示出了两个实验中的对照和酶运行的产物产量(每个级分的干固体/100g玉米干物质的百分比)。

表7.实验3中的常规样品和酶样品的级分产量。

表8.实验4中的常规样品和酶样品的级分产量。

将两个实验的淀粉+面筋产量除以相关对照(3A，4A)，以比较不同蛋白酶对纤维素酶F或纤维素酶G(其中对照分别是单独的纤维素酶F或单独的纤维素酶G)的促进作用。表9的结果显示，与纤维素酶G和蛋白酶的共混物相比，纤维素酶F与蛋白酶的共混物可以实现更高的淀粉+面筋产量。

表9.实验III&IV中酶样品相对于对照的淀粉+面筋产量(％)

实例4：来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3(SEQ ID NO:9)的重组表达

为了获得用于测试并表征来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3的材料，将来自SEQ ID NO:7的DNA序列克隆进曲霉属表达载体中并在米曲霉中加以表达。

通过使用以下引物，用标准PCR技术扩增来自cDNA质粒克隆pA2PR22的在Seq ID NO:7中没有DNA的终止密码子的编码区而将来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3基因亚克隆进曲霉属表达载体pMStr100(WO 10/009400)中：

597 TAGGGATCCTCACGATGGTCGCCACCAGCT(SEQ ID NO:11)

598 CAGGCCGACCGCGGTGAG(SEQ ID NO:12)

用BamHI限制性酶切PCR产物并将其连接进pMStr100的BamHI和NruI位点，从而在表达载体中形成具有C-末端标签序列RHQHQHQH(终止序列)的框内融合。对所得曲霉属表达构建体pMStr121中的S53蛋白酶3基因测序，并且确认该序列的蛋白酶编码部分与SEQ ID NO:7的原编码序列一致。还确认了标签编码序列的框内融合，从而产生SEQ ID NO:9的序列，该序列编码SEQ ID NO:10的肽序列。

使用由克里斯滕森(Christensen)等人，1988，生物技术(Biotechnology)6,1419-1422和WO 04/032648描述的标准技术，用pMStr121转化米曲霉菌株BECh2(WO 00/39322)。为了鉴定产生重组蛋白酶的转化体，将这些转化体和BECh2在30℃和200RPM下在10ml的YP+2％葡萄糖培养基中进行培养。在3天生长之后取出样品并用SDS-PAGE分析，以鉴定重组蛋白酶产生。在转化体的培养物中观察到一个35与50kDa之间的新带，在未转化的BECh2的培养物中并未观察到该新带。将似乎以较高水平表达重组蛋白酶的若干转化体在30℃和200RPM下在500ml摇瓶中的100ml的YP+2％葡萄糖培养基中进一步培养。在2、3和4天生长之后取出样品并且通过用SDS-PAGE分析样品而比较表达水平。选择以相对较高的水平表达重组蛋白酶的单个转化体并将其指定为EXP01737。通过在包含0.01％X-100的选择培养基上稀释划线分生孢子而将EXP01737分离两次，以限制菌落大小，并将其如上所述地在摇瓶中的YP+2％葡萄糖培养基中进行发酵，以提供供纯化用的材料。4天生长之后收获摇瓶培养物并且通过Miracloth(卡尔生化公司(Calbiochem))过滤发酵液而除去真菌菌丝体，然后如实例4中所描述加以纯化。

YP+2％葡萄糖培养基

10g酵母提取物

20g蛋白胨

水补至1L

在121℃下高压灭菌20分钟

添加100ml 20％无菌葡萄糖溶液

实例5：从大型亚灰树花菌中纯化具有N-末端HQ标签的S53蛋白酶3

将培养液离心(20000x g，20min)并且将上清液小心地与沉淀物滗析分开。上清液通过耐洁(Nalgene)0.2μm过滤装置过滤，以除去剩余的曲霉属宿主细胞。将0.2μm滤液转移至G25交联葡聚糖柱(来自GE医疗集团(GEHealthcare))上的10mM丁二酸/NaOH(pH 3.5)。将G25交联葡聚糖转移的酶施加至在10mM丁二酸/NaOH(pH 3.5)中平衡的Q-交联葡聚糖FF柱(来自GE医疗集团)上。收集10mM丁二酸/NaOH(pH 3.5)的贯通流(run-through)和洗涤物并包含S53蛋白酶(使用pH 4下的动力学Suc-AAPF-pNA测定确认活性)。在将贯通流和洗涤物级分充分混合的同时用1M HCl将该级分的pH调节至pH 3.25。将经pH调节的溶液施加至在10mM丁二酸/NaOH(pH3.25)中平衡的SP-交联葡聚糖FF柱(来自GE医疗集团)上。在将柱用平衡缓冲液充分地洗涤之后，将蛋白酶用在相同的缓冲液中的线性NaCl梯度(0-->0.5M)洗脱超过十个柱体积。将来自柱的级分针对蛋白酶活性进行分析(使用pH 4下的动力学Suc-AAPF-pNA测定法)，并且合并峰级分。向合并物中添加固体硫酸铵，至2.0M最终(NH4)2SO4浓度。将酶溶液施加至在10mM丁二酸/NaOH、2.0M(NH4)2SO4(pH 3.25)中平衡的苯基-Toyopearl柱(来自东曹公司(TosoHaas)公司)上。在将柱用平衡缓冲液充分地洗涤之后，将S53蛋白酶用在平衡缓冲液与10mM丁二酸/NaOH(pH 3.25)之间的线性梯度洗脱超过十个柱体积。分析来自该柱的级分的蛋白酶活性(使用pH 4下的动力学Suc-AAPF-pNA测定法)。合并具有较高活性的级分并且将其转移至G25交联葡聚糖柱(来自GE医疗集团)上的10mM丁二酸/NaOH(pH 3.5)。将G25交联葡聚糖转移的蛋白酶施加至在10mM丁二酸/NaOH(pH 3.5)中平衡的SP-交联葡聚糖HP柱(来自GE医疗集团)上。在将柱用平衡缓冲液充分地洗涤之后，将蛋白酶用在相同的缓冲液中的线性NaCl梯度(0-->0.5M)洗脱超过五个柱体积。将来自该柱的构成主峰的级分合并为纯化产物。通过SDS-PAGE分析纯化产物并且在凝胶上看到一个主带和三个次带。这些带的埃德曼(EDMAN)N-末端测序显示，所有这些带均与S53蛋白酶相关并且因此我们预期这些次带代表一些S53蛋白酶分子的切口。将纯化产物用于进一步表征。

实例6.在蛋白酶D和纤维素酶F的存在下的湿磨

根据以下程序，使玉米的三个类型的处理经受模拟玉米湿磨方法。两类处理涉及施用蛋白酶和纤维素酶F的组合、蛋白酶I和纤维素酶F的组合(浸渍1B、2B、3B、4B)和蛋白酶D和纤维素酶F的组合(浸渍1C、2C)，而一类处理是无酶的(浸渍1A、2A)。

对于酶处理的浸渍(浸渍1B至4B和浸渍1C、2C)，配制包含0.06％(w/v)SO₂和0.5％(w/v)乳酸的浸渍溶液。针对每个烧瓶，清洗100克的干燥整齐的(黄色马齿型)玉米，以除去破碎籽粒，并且将其放入200mL上述浸渍水中。然后，将所有烧瓶放入设置为52℃同时轻轻振荡的定轨空气加热摇床中并允许在此温度下混合16小时。16小时后，将所有烧瓶从空气摇床中移出。

以类似方式制作无酶的对照浸渍(浸渍1A、2A)；除了将它浸渍于0.15％(w/v)SO2和0.5％(w/v)乳酸溶液中并且在碾磨之前浸渍28小时之外。

将玉米混合物倾倒在布氏漏斗上，以使其脱水，并且然后向原浸渍烧瓶中添加100mL的淡自来水并旋涡，用于冲洗目的。然后，将其作为洗涤液倾倒在玉米上并捕获在与原玉米导液相同的烧瓶中。这一洗涤步骤的目的在于保留含有尽可能多的可溶物的滤液。将包含可溶物的滤液称为“轻浸渍水(light steep water)”(“LSW”)。然后，将收集的总轻浸渍水级分烘干，以确定存在的干物质的量。通过以下方式完成干燥：在设置为105℃的烘箱中过夜干燥。

然后，将玉米放置在具有反向叶片的瓦林实验室搅拌器中(所以前缘是钝的)。向该搅拌器中的玉米中添加200mL的水，并且然后将玉米在低速设置下碾磨一分钟，以有助于释放胚芽。碾磨后，立即将浆液转移回烧瓶，用于酶孵育步骤。使用50mL淡水冲洗搅拌器并且还向烧瓶中添加洗涤水。在酶处理烧瓶(浸渍B和浸渍C)中加入酶并将其返回至定轨摇床中，以在52℃下以更高的混合速率再孵育4小时。如下表1所示加酶。

表1.实验设计(每克的玉米干物质施用的剂量)

下表2-5示出了这些实验中的对照和酶运行的产物产量(每个级分的干固体/100g玉米干物质的百分比)。

表2.实验I中的常规样品和酶样品的级分产量

浸渍	1A	1B
				常规的	25μg纤维素酶F+2.5μg蛋白酶I
淀粉+面筋	75.41％	76.30％
			纤维	10.68％	9.99％
胚芽	5.39％	5.52％
			轻浸渍水可溶物	5.11％	3.57％
滤液可溶物	1.93％	2.52％

表3.实验II中的常规样品和酶样品的级分产量

浸渍	2A	2B
				常规的	25μg纤维素酶F+2.5μg蛋白酶I
淀粉+面筋	75.10％	75.47％
			纤维	11.63％	10.62％
胚芽	5.55％	5.58％
			轻浸渍水可溶物	4.49％	3.48％
滤液可溶物	1.11％	2.32％

表4.实验III中的酶样品的级分产量

表5.实验IV中的酶样品的级分产量

表6中的来自这四个实验的淀粉和面筋的平均产量显示，分别与常规方法(1500ppm)和较低的SO₂浓度(600ppm)下的蛋白酶I和纤维素酶F的组合相比，蛋白酶D和纤维素酶F的组合在较低的SO₂浓度(600ppm)下可以实现额外的1.55％和0.76％淀粉+面筋产量。

表6.实验I-IV中的酶样品的淀粉&面筋产量

实例7.在不同蛋白酶和纤维素酶F、纤维素酶H的存在下的湿磨

根据以下程序，使玉米的四个处理经受模拟玉米湿磨方法。四个处理涉及施用酶(浸渍B、C和D)，而一个处理无酶(浸渍A)。

对于对照(浸渍A)和酶处理的浸渍(浸渍B至D)两者，配制包含0.15％(w/v)SO₂和0.5％(w/v)乳酸的浸渍溶液。针对每个烧瓶，清洗100克的干燥整齐的(黄色马齿型)玉米，以除去破碎籽粒，并且将其放入200mL上述浸渍水中。然后，将所有烧瓶放入设置为52℃同时轻轻振荡的定轨空气加热摇床中并允许在此温度下混合48小时。48小时后，将玉米混合物倾倒在布氏漏斗上，以使其脱水，并且然后向原浸渍烧瓶中添加100mL的淡自来水并旋涡，用于冲洗目的。然后，将其作为洗涤液倾倒在玉米上并捕获在与原玉米导液(draining)相同的烧瓶中。这一洗涤步骤的目的在于保留含有尽可能多的可溶物的滤液。将包含可溶物的滤液称为“轻浸渍水”。然后，将收集的总轻浸渍水级分烘干，以确定存在的干物质的量。通过以下方式完成干燥：在设置为105℃的烘箱中过夜干燥。

然后，将玉米放置在具有反向叶片的瓦林实验室搅拌器中(所以前缘是钝的)。向该搅拌器中的玉米中添加200mL的水，并且然后将玉米在低速设置下碾磨一分钟，以有助于释放胚芽。碾磨后，立即将浆液转移回烧瓶，用于酶孵育步骤。使用50mL淡水冲洗搅拌器并且还向烧瓶中添加洗涤水。在酶处理烧瓶(浸渍B至D)中加入酶并将其返回至定轨摇床中，以在52℃下以更高的混合速率再孵育0.5小时。如下表1所示加酶。

表1.实验设计(每克的玉米干物质施用的剂量)

下表2示出了对照和酶运行的产物产量(每个级分的干固体/100g玉米干物质的百分比)。

表2.实验对照和所有共混物的级分产量。

淀粉和面筋产量数据表明，包含纤维素酶F、纤维素酶H和不同蛋白酶(蛋白酶D、蛋白酶B和蛋白酶C)的组合的处理产生比常规对照多的淀粉和面筋。

Claims

1.一种用于处理作物籽粒的方法，该方法包括以下步骤：

a)将籽粒浸泡在水中，以产生浸泡的籽粒；

b)碾磨这些浸泡的籽粒；

i)一种蛋白酶，

ii)一种纤维素分解组合物包括

1)一种纤维素酶或一种半纤维素酶，以及

2)一种GH61多肽，并且

其中在步骤b)之前、过程中或之后进行步骤c)。

2.如权利要求1所述的方法，其中该蛋白酶以酶蛋白的总量的约10％w/w至约65％w/w，例如约25％w/w至约50％w/w的范围存在。

3.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中该蛋白酶以小于约60％w/w的该酶组合物，例如小于约55％w/w、小于约50％w/w、小于约45％w/w、小于约40％w/w、小于约35％w/w、小于约30％w/w、小于约25％w/w、小于约20％w/w、或小于约15％w/w的酶蛋白的总量存在。

4.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中该蛋白酶以酶蛋白的总量的约50％w/w存在。

5.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中该蛋白酶以酶蛋白的总量的约25％w/w存在。

6.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中该GH61多肽是一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。

7.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中该酶组合物包括一种纤维素酶以及一种半纤维素酶。

8.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中该酶组合物包括一种内切葡聚糖酶。

9.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中该酶组合物包括一种木聚糖酶。

10.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中将这些籽粒在水中浸泡约2-10小时，优选约3小时。

11.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中在约40℃与约60℃之间的温度，优选约50℃下进行该浸泡。

12.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中在酸性pH，优选约3-5，例如约3-4下进行该浸泡。

13.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中在0.01％-1％之间，优选0.05％-0.3％，尤其是0.1％SO₂和/或NaHSO₃的存在下进行该浸泡。

14.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中这些作物籽粒来自玉米(玉蜀黍)、水稻、大麦、高粱大豆、或果壳、或小麦。

15.一种用于处理作物籽粒的方法，该方法包括以下步骤：

a)将籽粒浸泡在水中，以产生浸泡的籽粒；

b)碾磨这些浸泡的籽粒；

i)一种蛋白酶，以及

其中在步骤b)之前、过程中或之后进行步骤c)，并且

16.一种GH61多肽用于增强一种或多种酶的湿磨益处的用途。