CN104818260B

CN104818260B - 一种耐高温的毛壳菌多聚半乳糖醛酸酶突变体及其编码基因和应用

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Publication number: CN104818260B
Application number: CN201510184441.6A
Authority: CN
Inventors: 姚斌; 罗会颖; 涂涛; 孟昆; 王亚茹; 石鹏君; 柏映国; 黄火清; 苏小运; 王苑; 马锐; 师霞
Original assignee: Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2015-04-17
Filing date: 2015-04-17
Publication date: 2018-01-30
Anticipated expiration: 2035-04-17
Also published as: CN104818260A

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种耐高温的毛壳菌多聚半乳糖醛酸酶突变体及其编码基因和应用。本发明以来源于Achaetomium sp.Xz8的多聚半乳糖醛酸酶作为母本，经理性设计和分子生物学技术而获得的热稳定性提高的多聚半乳糖醛酸酶突变体。在各突变体序列中，涉及到的氨基酸突变为Asp244Ala和Asp299Arg两点的组合突变(ASA，Asp244Ala/Asp299Arg)。突变体的最适温度、T₅₀、T_1/2均较野生酶得到了提高。最适温度从45℃提高到55℃；T₅₀从56℃提高到73℃；50℃下半衰期T_1/2从1.5h提高到10h；55℃下半衰期T_1/2从33min提高到78min；Tm值从43.8℃提高到54.1℃。除此之外，突变体保持着与野生酶相当的酶催化活力。可满足于饲料、食品等领域的应用需求。

Description

一种耐高温的毛壳菌多聚半乳糖醛酸酶突变体及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种耐高温的毛壳菌多聚半乳糖醛酸酶突变体及其编码基因和应用。

背景技术

饲料中存在相当多的非淀粉多糖(Non-starch Polysaccharides,NSPs)，是由纤维素、半纤维素、果胶和抗性淀粉四部分组成的植物组织中除淀粉以外所有碳水化合物的总称。NSPs不仅对单胃动物没有营养价值，而且还成为肠道内的抗营养因子，其在动物肠道内能够结合大量的水，增大了食糜粘度，影响了消化酶活性，刺激消化管代偿性增大，导致肠道有害菌过度繁殖，降低了肠道对养分的吸收速度。果胶作为一种非淀粉多糖，在单胃动物营养中被认为是一种抗营养因子直接影响了畜禽的营养吸收和利用等，进而甚至影响动物的生产性能(Choct,1997)。与单胃动物不同，果胶除了作为反刍动物饲料的组成成分而发挥其营养供能作用外，还对瘤胃内环境的稳定具有极强的调控作用，因此，果胶在反刍动物瘤胃中的降解对瘤胃环境的维护有非常有益的作用。

多聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)是以果胶的主链多聚半乳糖醛酸为底物，断裂α-1,4糖苷键的解聚酶。饲料用酶制剂通常需要经过质粒(瞬时高温)的加工过程，而多聚半乳糖醛酸酶属于中低温酶(多用于果汁的澄清和提取)，热稳定性差不仅限制了其应用范围，而且易于失活，增加了生产成本。

酶分子的耐热性提高可以用T₅₀、T_1/2和Tm值来体现。T₅₀，即最大酶活力的一半所对应的温度，T₅₀越大，则酶越耐热；T_1/2(亦称半衰期)，即在特定温度下，酶活力损失一半所需要的时间，半衰期越长，则酶稳定性越好；Tm值，即蛋白质解折叠一半时所对应的温度，Tm值越高，则酶越稳定。

发明内容

本发明提供了一种耐高温的毛壳菌多聚半乳糖醛酸酶突变体。

本发明的再一目的是提供包含上述突变体基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

所述突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

MIPSVLILSLGALAAANPLPAKRASCTFTDAASAISGKKSCSTITLKDITVPAGTTLDLTKLNDGTKVIFSGKTSFGYKEWAGPLISVSGNNIHVEGAPGHVIDGNGAKWWDTKGSNGGKKKPKFFYAHSMKNSNIKGLNVKNTPVQAFSINGAENLGVYDVHLDNSAGDSQGGHNTDAFDVGSSNGVYISGAVVKNQDDCLAINSGTNITFTGGSCSGGHGLSIGSVGGRKDNTVKTVRILNSSISNSQNGVRIKTVYGAKGSVSAVEYSGITLSNISKYGIVIEQDYENGSPTGKPTNGVPITDLTVKGVTGTVKSGATRVYILCAKGACSNWKWSGVSVTGGKKSSKCSNVPSPASC

所述耐高温多聚半乳糖醛酸酶突变体核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

ATGATTCCGTCGGTCCTCATTCTTTCCCTCGGCGCCCTGGCGGCGGCCAACCCGCTCCCCGCCAAGCGCGCGAGCTGCACCTTTACCGATGCTGCCTCTGCCATCAGCGGCAAGAAGAGCTGCAGCACCATCACCCTCAAGGACATCACCGTCCCCGCCGGCACCACGTTGGACCTCACAAAGCTCAACGACGGCACCAAGGTCATCTTCTCCGGCAAGACCTCCTTCGGCTACAAGGAATGGGCCGGGCCTCTCATCTCCGTCTCCGGCAACAACATCCACGTCGAGGGCGCCCCCGGCCATGTCATCGACGGCAACGGTGCCAAGTGGTGGGACACCAAGGGTAGCAATGGCGGCAAGAAGAAGCCCAAGTTCTTCTACGCCCATAGCATGAAGAACTCCAACATCAAGGGACTCAACGTGAAGAACACGCCCGTCCAGGCCTTCAGCATCAACGGCGCTGAAAACCTCGGAGTGTACGACGTCCACCTCGACAACTCGGCCGGCGACTCCCAGGGCGGCCACAACACCGACGCGTTCGACGTCGGTTCGTCCAACGGCGTCTACATCTCGGGTGCCGTGGTCAAGAACCAGGACGACTGCCTGGCCATCAACTCCGGCACCAACATCACCTTCACCGGCGGCTCGTGCAGCGGCGGCCACGGCCTGTCCATCGGCTCGGTCGGCGGGCGCAAGGACAACACGGTCAAGACGGTGCGCATCCTCAACTCGTCCATCAGCAACTCGCAGAACGGCGTGCGCATCAAGACCGTCTACGGCGCCAAGGGCTCCGTGTCGGCTGTCGAGTACTCGGGCATCACACTGTCCAACATCAGCAAGTACGGCATCGTCATCGAGCAGGACTACGAGAACGGCTCGCCCACCGGCAAGCCCACCAACGGCGTGCCCATCACCGACCTGACCGTCAAGGGCGTCACCGGCACCGTCAAGTCGGGCGCCACCAGAGTCTACATCCTCTGCGCCAAGGGCGCCTGCTCCAACTGGAAGTGGTCTGGCGTCAGCGTCACCGGCGGCAAGAAGTCGTCCAAGTGCTCCAACGTTCCCAGCCCTGCCTCTTGCTAG

去除信号肽后成熟的毛壳菌多聚半乳糖醛酸酶突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。

NPLPAKRASCTFTDAASAISGKKSCSTITLKDITVPAGTTLDLTKLNDGTKVIFSGKTSFGYKEWAGPLISVSGNNIHVEGAPGHVIDGNGAKWWDTKGSNGGKKKPKFFYAHSMKNSNIKGLNVKNTPVQAFSINGAENLGVYDVHLDNSAGDSQGGHNTDAFDVGSSNGVYISGAVVKNQDDCLAINSGTNITFTGGSCSGGHGLSIGSVGGRKDNTVKTVRILNSSISNSQNGVRIKTVYGAKGSVSAVEYSGITLSNISKYGIVIEQDYENGSPTGKPTNGVPITDLTVKGVTGTVKSGATRVYILCAKGACSNWKWSGVSVTGGKKSSKCSNVPSPASC

成熟的毛壳菌多聚半乳糖醛酸酶突变体编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

AACCCGCTCCCCGCCAAGCGCGCGAGCTGCACCTTTACCGATGCTGCCTCTGCCATCAGCGGCAAGAAGAGCTGCAGCACCATCACCCTCAAGGACATCACCGTCCCCGCCGGCACCACGTTGGACCTCACAAAGCTCAACGACGGCACCAAGGTCATCTTCTCCGGCAAGACCTCCTTCGGCTACAAGGAATGGGCCGGGCCTCTCATCTCCGTCTCCGGCAACAACATCCACGTCGAGGGCGCCCCCGGCCATGTCATCGACGGCAACGGTGCCAAGTGGTGGGACACCAAGGGTAGCAATGGCGGCAAGAAGAAGCCCAAGTTCTTCTACGCCCATAGCATGAAGAACTCCAACATCAAGGGACTCAACGTGAAGAACACGCCCGTCCAGGCCTTCAGCATCAACGGCGCTGAAAACCTCGGAGTGTACGACGTCCACCTCGACAACTCGGCCGGCGACTCCCAGGGCGGCCACAACACCGACGCGTTCGACGTCGGTTCGTCCAACGGCGTCTACATCTCGGGTGCCGTGGTCAAGAACCAGGACGACTGCCTGGCCATCAACTCCGGCACCAACATCACCTTCACCGGCGGCTCGTGCAGCGGCGGCCACGGCCTGTCCATCGGCTCGGTCGGCGGGCGCAAGGACAACACGGTCAAGACGGTGCGCATCCTCAACTCGTCCATCAGCAACTCGCAGAACGGCGTGCGCATCAAGACCGTCTACGGCGCCAAGGGCTCCGTGTCGGCTGTCGAGTACTCGGGCATCACACTGTCCAACATCAGCAAGTACGGCATCGTCATCGAGCAGGACTACGAGAACGGCTCGCCCACCGGCAAGCCCACCAACGGCGTGCCCATCACCGACCTGACCGTCAAGGGCGTCACCGGCACCGTCAAGTCGGGCGCCACCA GAGTCTACATCCTCTGCGCCAAGGGCGCCTGCTCCAACTGGAAGTGGTCTGGCGTCAGCGTCACCGGCGGCAAGAAGTCGTCCAAGTGCTCCAACGTTCCCAGCCCTGCCTCTTGCTAG

突变前的毛壳菌多聚半乳糖醛酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

MIPSVLILSLGALAAANPLPAKRASCTFTDAASAISGKKSCSTITLKDITVPAGTTLDLTKLNDGTKVIFSGKTSFGYKEWAGPLISVSGNNIHVEGAPGHVIDGNGAKWWDTKGSNGGKKKPKFFYAHSMKNSNIKGLNVKNTPVQAFSINGAENLGVYDVHL DNSAGDSQGGHNTDAFDVGSSNGVYISGAVVKNQDDCLAINSGTNITFTGGSCSGGHGLSIGSVGGRKDNTVKTVRILNSSISNSQNGVRIKTVYGAKGSVSDVEYSGITLSNISKYGIVIEQDYENGSPTGKPTNGVPITDLTVKGVTGTVKSGATDVYILCAKGACSNWKWSGVSVTGGKKSSKCSNVPSPASC

突变前的毛壳菌多聚半乳糖醛酸酶的编码序列如SEQ ID NO.6所示。

ATGATTCCGTCGGTCCTCATTCTTTCCCTCGGCGCCCTGGCGGCGGCCAACCCGCTCCCCGCCAAGCGCGCGAGCTGCACCTTTACCGATGCTGCCTCTGCCATCAGCGGCAAGAAGAGCTGCAGCACCATCACCCTCAAGGACATCACCGTCCCCGCCGGCACCACGTTGGACCTCACAAAGCTCAACGACGGCACCAAGGTCATCTTCTCCGGCAAGACCTCCTTCGGCTACAAGGAATGGGCCGGGCCTCTCATCTCCGTCTCCGGCAACAACATCCACGTCGAGGGCGCCCCCGGCCATGTCATCGACGGCAACGGTGCCAAGTGGTGGGACACCAAGGGTAGCAATGGCGGCAAGAAGAAGCCCAAGTTCTTCTACGCCCATAGCATGAAGAACTCCAACATCAAGGGACTCAACGTGAAGAACACGCCCGTCCAGGCCTTCAGCATCAACGGCGCTGAAAACCTCGGAGTGTACGACGTCCACCTCGACAACTCGGCCGGCGACTCCCAGGGCGGCCACAACACCGACGCGTTCGACGTCGGTTCGTCCAACGGCGTCTACATCTCGGGTGCCGTGGTCAAGAACCAGGACGACTGCCTGGCCATCAACTCCGGCACCAACATCACCTTCACCGGCGGCTCGTGCAGCGGCGGCCACGGCCTGTCCATCGGCTCGGTCGGCGGGCGCAAGGACAACACGGTCAAGACGGTGCGCATCCTCAACTCGTCCATCAGCAACTCGCAGAACGGCGTGCGCATCAAGACCGTCTACGGCGCCAAGGGCTCCGTGTCGGACGTCGAGTACTCGGGCATCACACTGTCCAACATCAGCAAGTACGGCATCGTCATCGAGCAGGACTACGAGAACGGCTCGCCCACCGGCAAGCCCACCAACGGCGTGCCCATCACCGACCTGACCGTCAAGGGCGTCACCGGCACCGTCAAGTCGGGCGCCACCGACGTCTACATCCTCTGCGCCAAGGGCGCCTGCTCCAACTGGAAGTGGTCTGGCGTCAGCGTCACCGGCGGCAAGAAGTCGTCCAAGTGCTCCAACGTTCCCAGCCCTGCCTCTTGCTAG

本发明还是提供一种制备所述多聚半乳糖醛酸酶突变体的方法，其技术方案如下：

1)采用over-lap PCR的方法扩增所述突变体序列片段；

2)将上述突变体序列片段克隆到表达载体pPIC 9r上，重组载体命名pPIC9r-ASA；

3)将突变体重组载体转化毕赤酵母GS115，诱导表达，获得突变株，优选为GS115/ASA。

本发明还提供了一种制备所述突变体的方法，包括以下步骤：

1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组多聚半乳糖醛酸酶表达；

3)回收并纯化所表达的突变酶。

本发明提供的耐高温的毛壳菌多聚半乳糖醛酸酶突变体，最适pH值不变，突变体的最适温度、T₅₀、T_1/2均较野生酶得到了提高。最适温度从45℃提高到55℃；T₅₀从56℃提高到73℃；50℃下半衰期T_1/2从1.5h提高到10h；55℃下半衰期T_1/2从33min提高到78min；Tm值从43.8℃提高到54.1℃。除此之外，突变体保持着与野生酶相当的酶催化活力。完全符合饲料用酶制剂工艺生产要求。相对于盲目筛菌或人工(自然)诱变等手段，酶分子改良缩短了酶学性质改造时间。

本发明还提供了包含上述突变体基因的重组载体，优选为pPIC9r-ASA。将本发明的多聚半乳糖醛酸酶突变体基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将多聚半乳糖醛酸酶基因插入到质粒pPIC9r上的SnaB I和Not I限制性酶切位点之间，得到重组表达质粒pPIC9r-ASA。

本发明还提供了包含上述突变体基因的重组菌株，优选为重组菌株GS115/ASA。

1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组多聚半乳糖醛酸酶的表达；

3)回收并纯化所表达的突变酶。

其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞GS115，得到重组菌株GS115/ASA。

本发明还提供了上述突变体的应用。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，以来源于Achaetomiumsp.Xz8的多聚半乳糖醛酸酶作为母本，经理性设计和分子生物学技术而获得的热稳定性提高的多聚半乳糖醛酸酶突变体。在各突变体序列中，涉及到的氨基酸突变为Asp244Ala和Asp299Arg两点的组合突变(ASA，Asp244Ala/Asp299Arg)。本发明的突变酶最适pH为5.5，与野生型(6.0)的相近，但是T₅₀从56℃提高到73℃；50℃下半衰期T_1/2从1.5h提高到10h；55℃下半衰期T_1/2从33min提高到78min；Tm值从43.8℃提高到54.1℃。在80℃处理30min后，剩余酶活保持在35％以上，完全满足饲料用酶制剂的质粒(瞬时高温)处理过程的需求，有着非常广阔的应用前景。

附图说明

图1：在毕赤酵母中表达的重组高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体的SDS-PAGE分析，其中，M:低分子量蛋白质Marker；1:野生酶；2:去糖基化后的野生酶；3:突变酶；4:去糖基化后的野生酶。

图2:所述突变体与野生型的最适pH。

图3：所述突变体与野生型的最适温度。

图4：所述突变体与野生型的T₅₀。

图5：所述突变体与野生型的在50℃下的T_1/2。

图6：所述突变体与野生型的在55℃下的T_1/2。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：表达宿主Pichia pastoris GS115，表达质粒载体pPIC9r为本实验室保存。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自Fermentas公司，连接酶购自Promaga公司，多聚半乳糖醛酸购自Sigma公司。其它都为国产分析纯试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

(1)LB培养基：0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，1％NaCl，pH 7.0

(2)YPD培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖

(3)MD固体培养基：2％葡萄糖，1.5％琼脂糖，1.34％YNB，0.00004％Biotin

(4)MM固体培养基：1.5％琼脂糖，1.34％YNB，0.00004％Biotin，0.5％甲醇

(5)BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％甘油(V/V)，1.34％YNB，0.00004％Biotin

(6)BMMY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，0.5％甲醇(V/V)

4、本实施例中未做详细具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1定点突变

对多聚半乳糖醛酸酶PG8fn(Tu et al.,2013)进行同源建模，并将突变位点设计为第244位天冬氨酸突变为丙氨酸且第299位天冬氨酸突变为精氨酸。设计所用引物如表1所示：

表1.所述突变体特异性引物

实施例2所述突变体的制备。

将表达载体pPIC9r进行双酶切(SnaB I+Not I)，同时将编码所述突变体的基因ASA双酶切(SnaB I+Not I)，切好的编码成熟所述突变体的基因片段(去除信号肽片段)与表达载体pPIC9r连接，获得含有所述突变体基因ASA的重组质粒pPIC9r-ASA并转化毕赤酵母GS115，获得重组酵母菌株GS115/ASA。

取含有重组质粒的GS115菌株，接种于300mL BMGY培养基的1L三角瓶中，置于30℃，220rpm摇床培养48h；后将培养液3000g离心5min，弃上清，沉淀用100mL含有0.5％甲醇的BMMY培养基重悬，并再次置于30℃，220rpm条件下诱导培养。每隔12h补加0.5mL甲醇，使菌液中的甲醇浓度保持在0.5％，同时取上清用于酶活性检测。

以同样的方法制备含有信号肽序列突变体重组质粒，并检测酶活。

所述突变酶最适pH为5.5，与野生型(6.0)的相近，且酶活力与野生酶相当；但是热稳定性方面得到显著提高：T₅₀从56℃提高到73℃；50℃下半衰期T_1/2从1.5h提高到10h；55℃下半衰期T_1/2从33min提高到78min；Tm值从43.8℃提高到54.1℃。SDS-PAGE结果(图1)表明，所述突变体在毕赤酵母中得到了表达。所表达的多聚半乳糖醛酸酶经过纯化之后，其蛋白质的含量达到总蛋白的95％以上。

实施例3突变体和野生型的活性分析

一、DNS法：具体方法如下：在给定的pH、温度条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应10min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下，每分钟分解多聚半乳糖醛酸生成1μmolD-(+)-半乳糖醛酸所需的酶量。

二、突变体和野生型的性质测定

1、突变体和野生型的最适pH测定方法如下:

将实施例2纯化的突变酶和野生型在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物多聚半乳糖醛酸用不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中45℃下进行多聚半乳糖醛酸酶活力测定。结果(图2)表明，突变体和野生型的最适反应pH相近，且在pH3.0-8.0范围内有相同的作用趋势。

2、突变体和野生型的最适温度测定方法如下:

突变体和野生型的最适温度的测定为在0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH6.0)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。酶反应最适温度测定结果(图3)表明,所述突变体(55℃)较野生型(45℃)的最适温度提高10℃。

3、突变体和野生型的T₅₀测定方法如下:

突变体和野生型的T₅₀的测定为在0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 6.0)缓冲液体系及不同温度下(20、30、40、45、50、55、60、70、80℃)处理30min，再在最适条件下进行剩余酶活性测定。酶的T₅₀试验表明(图4)，所述突变酶与野生酶的T₅₀分别为73和56℃，提高17℃。

4、突变体和野生型的半衰期(T_1/2)测定方法如下:

突变体和野生型的半衰期的测定为在0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH6.0)缓冲液体系及不同温度下(50和55℃)处理不同时间，再在最适条件下进行剩余酶活性测定。酶的半衰期试验表明，所述突变酶与野生酶在50℃时的T_1/2分别为10h和1.5h(图5)，提高8.5h；在55℃时的T_1/2分别为78min和33min(图6)，提高45min。

5、突变体和野生型的Tm测定方法如下:

所述突变体和野生型的Tm测定采用差示扫描量热仪(DSC)测定。扫描范围为25-90℃，速率为1℃/min。所述突变酶与野生酶的T_m值分别为54.1和43.8℃，提高10.3℃。

6、突变体和野生型的比活力测定方法如下:

以多聚半乳糖醛酸(0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液)为底物，突变体和野生型在最适条件下的比活力分别为23201U/mg和28122U/mg；在50℃下处理1h后，剩余酶活分别为22273U/mg和18279U/mg；在55℃下处理1h后，剩余酶活分别为15080U/mg和7311U/mg。

Claims

1.一种耐高温多聚半乳糖醛酸酶突变体，其特征在于，所述多聚半乳糖醛酸酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1或3所示。

2.一种耐高温多聚半乳糖醛酸酶突变体编码基因，其特征在于，编码权利要求1所述的耐高温多聚半乳糖醛酸酶突变体。

3.根据权利要求2所述的耐高温多聚半乳糖醛酸酶突变体编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2或4所示。

4.包含权利要求2所述的耐高温多聚半乳糖醛酸酶突变体编码基因的重组载体。

5.包含权利要求2所述的耐高温多聚半乳糖醛酸酶突变体编码基因的重组菌株。

6.根据权利要求5所述的重组菌株，其特征在于，宿主细胞为毕赤酵母Pichiapastoris GS115。

7.制备权利要求1所述耐高温多聚半乳糖醛酸酶突变体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

包含权利要求2所述的耐高温多聚半乳糖醛酸酶突变体编码基因的重组载体转化宿主细胞，制备获得重组菌株；

培养重组菌株，诱导表达耐高温多聚半乳糖醛酸酶突变体；

将表达后的耐高温多聚半乳糖醛酸酶突变体回收。

8.权利要求1所述的耐高温多聚半乳糖醛酸酶突变体在饲料工业中的应用。