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CN104817641A - 新型抗人il-23受体抗体 - Google Patents

新型抗人il-23受体抗体 Download PDF

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CN104817641A CN201510185222.XA CN201510185222A CN104817641A CN 104817641 A CN104817641 A CN 104817641A CN 201510185222 A CN201510185222 A CN 201510185222A CN 104817641 A CN104817641 A CN 104817641A
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human
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seq
amino acid
acid sequence
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佐佐木孝则
佐藤照
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Yamanouchi Pharmaceutical Co Ltd
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Yamanouchi Pharmaceutical Co Ltd
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Abstract

本发明涉及新型抗人IL-23受体抗体。具体而言，本发明提供与现有的抗人IL-23R抗体相比活性和/或种属交叉反应性更优良的抗人IL-23R抗体、以及使用该抗体预防或治疗人IL-23R参与发病的各种疾病的方法。一种抗人IL-23R抗体，其分别包含由序列号5、9、13、17、21、25或29所示的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号7、11、15、19、23、27或31所示的氨基酸序列构成的轻链可变区。

Description

新型抗人IL-23受体抗体
本申请是国际申请日2012年3月30日、国际申请号PCT/JP2012/058531于2013年9月30日进入中国国家阶段、申请号201280016918.4、发明名称“新型抗人IL-23受体抗体”的申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及新型抗人IL-23受体抗体。详细而言，本发明的新型抗人IL-23受体抗体为与现有的抗人IL-23受体抗体相比活性和/或种属交叉反应性更优良的抗人IL-23受体抗体。
背景技术
白介素-23(也称为IL-23)是由树突细胞等产生的细胞因子，是由2个亚单位(即，IL-23特有的p19亚单位和在IL-12中也成为其组成部分的p40亚单位)构成的异二聚体细胞因子(非专利文献1)。IL-23通过与IL-23受体(也称为IL-23R)结合向细胞内导入信号(非专利文献2)。IL-23R是由IL-23R亚单位和在IL-12受体中成为其组成部分的IL-12Rβ1亚单位构成的异二聚体受体。另外，已知IL-12受体为IL-12Rβ1亚单位与IL-12Rβ2亚单位的复合体，且IL-23不与IL-12受体结合(非专利文献1)。
已知IL-23与银屑病、克罗恩病(CD)或溃疡性结肠炎(UC)等炎症性肠病(IBD)、系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)、强直性脊柱炎(AS)、白塞氏病和葡萄膜炎等疾病密切相关。银屑病为慢性皮肤角化疾病，患者皮肤中观察到IL-23表达的亢进(非专利文献3)。
炎症性肠病(IBD)是以克罗恩病(CD)、溃疡性结肠炎(UC)为代表的慢性复发性疾病，会导致消化道的功能和结构的变性。已知CD患者的肠道炎症部位粘膜固有层巨噬细胞旺盛地产生IL-23(非专利文献4)，认为会诱导来自免疫细胞等的IL-21、IL-22、IL-17等细胞因子从而促进IBD的炎症的发病(非专利文献5)。
系统性红斑狼疮(SLE)是由于免疫系统的亢进在全身的各个部位引起多样的症状、同时或依次产生发热、全身倦怠感等认为是炎症的症状和关节、皮肤、内脏等中的各种症状的疾病。据报道，该SLE病状与IL-23R阳性T淋巴细胞数存在正相关(非专利文献6)。另外，已知SLE患者血中的IL-23与正常人相比显著地亢进(非专利文献7)，暗示IL-23与SLE相关。
强直性脊柱炎(AS)是主要在脊柱和骶髂关节产生病变的慢性炎症性疾病。已知AS患者血液中的IL-23与正常人相比显著升高，这启示了AS的病因与IL-23有关(非专利文献8)。
白塞氏病是多发于各种大小的血管的炎症、即以血管炎为特征的慢性炎症性疾病，认为免疫系的异常、嗜中性粒细胞活化与其发病相关。这种复发性的血管异常有时会持续数日至数月，有时一年会复发数次。这种白塞氏病患者体内IL-23与疾病活动性具有显著的相关，另外，在作为相关病状的葡萄膜炎患者的血清中确认到IL-23表达的亢进(非专利文献9)，这也启示了IL-23助发这种病状。
类风湿性关节炎(RA)是慢性自身免疫性疾病，导致关节的变形、强烈的疼痛。RA患者的滑液和血清中IL-23增加(非专利文献10)，给药RA治疗剂TNF阻断剂的患者体内血清中IL-23量与病状程度相关(非专利文献11)，RA患者的滑膜中抗IL-23R抗体会抑制TNF-α和IL-6的产生(非专利文献12)，由此也启示了与该病状的关联。
因此，如果能够开发出特异性地与IL-23受体结合、具有抑制由IL-23导致的各种作用的活性的单克隆抗体，则可望用于IL-23参与发病的各种疾病的治疗、预防、诊断。
作为目前为止进行研究的对人IL-23受体显示功能抑制作用的抗体，报道了小鼠单克隆抗体m20D7(专利文献1)、其人源化单克隆抗体hum20D7(专利文献1)、大鼠单克隆抗体8B10(专利文献1)、其人源化单克隆抗体(专利文献2)。其中，对hum20D7进行了最详细的研究，由使用表达IL-23受体的建立培养细胞Kit225细胞的信号转导抑制的实验结果来看，在实际的细胞反应中已经明确了其效果。
但是，从有效性的观点来看，现有的抗体对细胞中的IL-23信号转导的中和活性还不能称为充分。
作为规定抗体药物的有效给药量的主要因素，可以列举抗体所具有的抑制配体与受体结合的活性、存在于体内的抗原量，提高结合抑制活性会减少给药量，结果可称为带来减少了患者的经济负担和医疗成本的极为有益的改良。另外，即使抗体对抗原(配体、受体等)具有高结合活性，抗体也不一定能够很强地发挥作为目标的中和活性。原因在于，为了使抗体强力地抑制配体与受体的结合，抗体必须占据抗原中与之相适的部位。即，在评价抗体药物的药效方面，抗体所具有的中和活性的强度非常重要。
另外，在开发药品上，使用动物的安全性评价极为重要。关于药品开发的国际指导方针ICH-S6中有如下记载：“安全性评价通常需要以使用两种适当的动物物种的方式来计划。但是，如果能示出正当的理由，也有仅使用一种适当的动物就足够的情况(例如，仅确认到一种适当的动物物种的情况或生物药品的生物学特性已被充分阐明的情况)”。可见，药品开发除了人以外通常需要在一种以上的适当的动物物种中进行试验，对于抗体药物的开发，为了在人以外的动物物种中进行试验，需要使该抗体对人以外的动物物种来源的抗原也具有交叉反应性。但是，一般而言，单克隆抗体的选择性高，获得保有高活性并且显示出种属交叉反应性的抗体并不容易。
基于上述情况，为了通过对人给药来用于各种疾病的治疗、预防、诊断，需要获得与现有的抗体相比中和活性更强且具有种属交叉反应性的全人抗IL-23受体抗体。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2008/106134
专利文献2：WO2010/027767
非专利文献
非专利文献1：Oppmann B et al,Immunity.2000Nov；13(5):715-25.
非专利文献2：Parham C et al,J Immunol.2002Jun 1；168(11):5699-708.
非专利文献3：Lee E et al,J Exp Med.2004Jan 5；199(1):125-30.
非专利文献4：Kamada N et al,J Clin Invest.2008；118:2269-2280.
非专利文献5：Sarra M et al,Inflamm Bowel Dis.2010Oct；16(10):1808-1813.
非专利文献6：Puwipirom H et al,Arthritis Res Ther.2010Nov 29；12(6):R215.
非专利文献7：Mok MY et al,J Rheumatol.2010Oct；37(10):2046-52.
非专利文献8：Mei Y et al,Clin Rheumatol.2011Feb；30(2):269-73.
非专利文献9：Habibagahi Z et al,Mod Rheumatol.2010Apr；20(2):154-9.
非专利文献10：Kim HR et al,Rheumatology(Oxford).2007Jan；46(1):57-6
非专利文献11：Kageyama Y et al,Rheumatol Int.2007Dec；28(2):137-43
非专利文献12：Hillyer P et al,Rheumatology(Oxford).2009Dec；48(12):1581-9
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的课题在于提供与现有的抗人IL-23R抗体相比活性和/或种属交叉反应性更优良的抗人IL-23R抗体。
用于解决问题的手段
即，本发明包含作为医学上或产业上有用的物质、方法的以下发明。
(1)一种抗人IL-23R抗体，其选自下述1)～7)中的任何一项：
1)包含由序列号5所示的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号7所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗人IL-23R抗体；
2)包含由序列号9所示的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号11所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗人IL-23R抗体；
3)包含由序列号13所示的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号15所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗人IL-23R抗体；
4)包含由序列号17所示的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号19所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗人IL-23R抗体；
5)包含由序列号21所示的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号23所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗人IL-23R抗体；
6)包含由序列号25所示的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号27所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗人IL-23R抗体；和
7)包含由序列号29所示的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号31所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗人IL-23R抗体。
(2)如上述(1)所述的抗人IL-23R抗体，其包含由序列号5所示的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号7所示的氨基酸序列构成的轻链可变区。
(3)如上述(1)所述的抗人IL-23R抗体，其包含由序列号9所示的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号11所示的氨基酸序列构成的轻链可变区。
(4)如上述(1)所述的抗人IL-23R抗体，其包含由序列号13所示的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号15所示的氨基酸序列构成的轻链可变区。
(5)如上述(1)所述的抗人IL-23R抗体，其包含由序列号17所示的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号19所示的氨基酸序列构成的轻链可变区。
(6)如上述(1)所述的抗人IL-23R抗体，其包含由序列号21所示的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号23所示的氨基酸序列构成的轻链可变区。
(7)如上述(1)所述的抗人IL-23R抗体，其包含由序列号25所示的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号27所示的氨基酸序列构成的轻链可变区。
(8)如上述(1)所述的抗人IL-23R抗体，其包含由序列号29所示的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号31所示的氨基酸序列构成的轻链可变区。
(9)如上述(1)～(8)中任一项所述的抗人IL-23R抗体，其中，上述抗体的重链恒定区为人Igγ1恒定区。
(10)如上述(1)～(8)中任一项所述的抗人IL-23R抗体，其中，上述抗体的轻链恒定区为人Igκ恒定区。
(11)如上述(1)～(8)中任一项所述的抗人IL-23R抗体，其中，上述抗体的重链恒定区为人Igγ1恒定区，上述抗体的轻链恒定区为人Igκ恒定区。
(12)如上述(2)所述的抗人IL-23R抗体，其包含由序列号33所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号35所示的氨基酸序列构成的轻链。
(13)如上述(3)所述的抗人IL-23R抗体，其包含由序列号37所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号39所示的氨基酸序列构成的轻链。
(14)如上述(4)所述的抗人IL-23R抗体，其包含由序列号41所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号43所示的氨基酸序列构成的轻链。
(15)如上述(5)所述的抗人IL-23R抗体，其包含由序列号45所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号47所示的氨基酸序列构成的轻链。
(16)如上述(6)所述的抗人IL-23R抗体，其包含由序列号49所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号51所示的氨基酸序列构成的轻链。
(17)如上述(7)所述的抗人IL-23R抗体，其包含由序列号53所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号55所示的氨基酸序列构成的轻链。
(18)如上述(8)所述的抗人IL-23R抗体，其包含由序列号57所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号59所示的氨基酸序列构成的轻链。
(19)一种多核苷酸，其包含编码上述(1)～(18)中任一项所述的抗体的重链可变区的序列。
(20)一种多核苷酸，其包含编码上述(1)～(18)中任一项所述的抗体的轻链可变区的序列。
(21)一种表达载体，其包含上述(19)和/或(20)所述的多核苷酸。
(22)一种用上述(21)所述的表达载体进行了转化的宿主细胞。
(23)如上述(22)所述的宿主细胞，其选自由下述(a)和(b)构成的组：
(a)用含有包含编码上述(1)～(18)中任一项所述的抗体的重链可变区的序列的多核苷酸和包含编码该抗体的轻链可变区的序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；和
(b)用含有包含编码上述(1)～(18)中任一项所述的抗体的重链可变区的序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码该抗体的轻链可变区的序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
(24)生产上述(1)～(18)中任一项所述的抗人IL-23R抗体的方法，其包括：对上述(22)或(23)所述的宿主细胞进行培养而使其表达抗人IL-23R抗体的步骤。
(25)一种银屑病治疗药，其包含上述(1)～(18)中任一项所述的抗人IL-23R抗体。
(26)一种用于预防或处置银屑病的方法，其包括给药治疗有效量的上述(1)～(18)中任一项所述的抗人IL-23R抗体的步骤。
(27)上述(1)～(18)中任一项所述的抗人IL-23R抗体在银屑病的预防或处置中的使用。
发明效果
根据本发明，提供与现有的抗人IL-23R抗体相比活性和/或种属交叉反应性更优良的抗人IL-23R抗体。本发明的抗人IL-23R抗体通过抑制人IL-23R的功能而具有强力的免疫细胞抑制作用，对于人IL-23参与发病的各种疾病的预防或治疗有用。而且，这种本发明的抗人IL-23R抗体会带来给药量的减少、给药间隔的扩大、给药方法的改善(例如，皮下注射剂)等临床应用中的优良的改善，大大有助于治疗有效性和患者依从性的改善。另外，抗体对人以外的动物(特别是药品开发中使用的动物)来源的抗原具有种属交叉反应性，这一点使得将该抗体作为药品进行开发时所必需的使用动物的安全性试验成为可能，因此，也大大有助于确保作为给药对象的人的安全性。
具体实施方式
以下，对本发明进行详细说明。
本发明人在抗人IL-23R抗体的制作方面反复进行了相当独创性的研究，结果成功地制作了与现有的抗人IL-23R抗体相比活性和/或种属交叉反应性更优良的抗人IL-23R抗体。
抗体分子的基本结构在各类中共通地由分子量5万～7万的重链和2～3万的轻链构成。重链通常由包含约440个氨基酸的多肽链构成，每类具有特征性的结构，对应于IgG、IgM、IgA、IgD、IgE称为γ、μ、α、δ、ε链。进而，IgG中存在IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，分别称为γ1、γ2、γ3、γ4。轻链通常由包含约220个氨基酸的多肽链构成，已知L型和K型这两种，分别称为λ、κ链。抗体分子的基本结构中的肽构成，为分别同源的两条重链和两条轻链通过二硫键(S-S键)和非共价键键合，分子量为15万～19万。两种轻链可以与任何一种重链成对。各个抗体分子经常由相同的两条轻链与相同的两条重链形成。
链内S-S键在重链中有四个(μ、ε链中有五个)、在轻链中有两个，每100～110个氨基酸残基形成一个环，该立体结构在各环间类似，被称为结构单元或结构域。对于重链、轻链中均位于N末端的结构域而言，即使是来自于同种动物的同一类(亚类)的标准品，其氨基酸序列也并非恒定，称为可变区，各结构域分别称为重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。由此向C末端侧的氨基酸序列在各类或亚类中基本恒定，称为恒定区(各结构域分别表示为CH1、CH2、CH3或CL)。
抗体的抗原决定部位由VH和VL构成，结合的特异性由该部位的氨基酸序列决定。另一方面，与补体或各种细胞的结合等生物学活性反映了各类Ig的恒定区结构的差异。轻链和重链的可变区的可变性大致限于两种链中均存在的3个小的高变区，将这些区域称为互补决定区(CDR；从N末端侧起分别为CDR1、CDR2、CDR3)。可变区的其余部分称为框架区(FR)，较为恒定。
本发明人成功制作的本发明的抗人IL-23R抗体为具有以下任意一个特征的抗人IL-23R抗体。
1)包含由序列号5所示的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号7所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗人IL-23R抗体。
2)包含由序列号9所示的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号11所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗人IL-23R抗体。
3)包含由序列号13所示的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号15所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗人IL-23R抗体。
4)包含由序列号17所示的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号19所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗人IL-23R抗体。
5)包含由序列号21所示的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号23所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗人IL-23R抗体。
6)包含由序列号25所示的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号27所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗人IL-23R抗体。
7)包含由序列号29所示的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号31所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗人IL-23R抗体。
具体而言，本发明人使用人单克隆抗体开发技术“VelocImmune”(VelocImmune antibody technology；Regeneron公司(美国专利6596541号))小鼠来制作抗体，通过使用各种生物学活性试验和物性试验的抗体筛选，成功地鉴定了本发明的抗人IL-23R抗体。Velocimmune技术中，用目标抗原(例如，人IL-23R)对内源性的免疫球蛋白重链和轻链的可变区被对应的人可变区置换后的转基因小鼠进行免疫，然后，获取表达抗体的小鼠的淋巴系细胞，通过与小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合而制作杂交瘤。接着，针对是否产生特异性地与目标抗原结合的抗体对将该杂交瘤细胞进行筛选。在此，产生的抗体为具有人抗体的可变区和小鼠抗体的恒定区的抗体(也称为嵌合抗体)。接着，在鉴定出特异性地与目标抗原结合的抗体的情况下，从该杂交瘤细胞中分离出编码抗体的重链和轻链的可变区的DNA，将该DNA分别与编码期望的类的人抗体重链和轻链的恒定区的DNA连接。使这样得到的编码重链和轻链的基因在细胞内(例如，CHO细胞)表达而产生抗体分子。利用该方法制作的抗体的重链和轻链是来源于人免疫球蛋白基因的“全人”抗体的重链和轻链。
对于本领域技术人员而言，本发明的抗人IL-23R抗体可以基于本申请说明书中公开的其重链可变区和轻链可变区的序列信息，使用本领域中公知的方法容易地制作。优选的是，本发明的抗人IL-23R抗体可以通过将其重链可变区和轻链可变区分别与人抗体的重链恒定区和轻链恒定区连接而制作成全人抗体。具体而言，制作具有编码本发明的抗体的重链可变区氨基酸(序列号5、序列号9、序列号13、序列号17、序列号21、序列号25或序列号29)的碱基序列的重链可变区基因片段和具有编码本发明的抗体的轻链可变区氨基酸(序列号7、序列号11、序列号15、序列号19、序列号23、序列号27或序列号31)的碱基序列的轻链可变区基因片段。然后，使该可变区基因与人抗体的适当类的恒定区基因连接而制作全人抗体基因。接着，将该抗体基因连接到适当的表达载体中，并导入培养细胞中。最后，对该培养细胞进行培养，可以从培养上清中得到单克隆抗体。
编码本发明的抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸的基因片段，例如可以基于依据该重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列而设计的碱基序列，利用本领域中公知的基因合成方法来合成。作为这样的基因合成方法，可以使用WO90/07861中记载的抗体基因的合成方法等本领域技术人员公知的各种方法。另外，一旦获得了本发明的抗体的可变区基因片段，也可以通过向该基因片段的预定部位导入突变来获得本发明的其他抗体。作为这样的突变导入方法，可以使用定点突变法(Current Protocols in Molecular Biology edit.Ausubel etal.(1987)Publish.John Wiley&Sons Section 8.1-8.5)等本领域技术人员公知的各种方法。
接着，使上述的可变区基因片段与人抗体的恒定区基因连接而制作全人抗体基因。使用的人抗体的恒定区可以选择任何亚类的恒定区(例如，重链为γ1、γ2、γ3或γ4的恒定区，轻链为λ或κ链的恒定区)，作为重链恒定区，可以优选使用人Igγ1，另外，作为轻链恒定区，可以优选使用人Igκ。
在制作该全人抗体基因之后，可以使用本领域中公知的各种方法进行抗体基因向表达载体中的导入、表达载体向培养细胞中的导入、培养细胞的培养、抗体的纯化等。
作为与以上述方式得到的抗体基因连接的表达载体，可以列举例如GS载体pEE6.4、pEE12.4(Lonza Biologics公司)，只要能够表达抗体基因则没有特别限制。另外，也可以使用AG-γ1、AG-κ(例如，参考WO94/20632)等预先具有人Ig恒定区基因的表达载体。
上述表达载体通过例如磷酸钙法、电穿孔法等导入培养细胞中。
作为导入表达载体的培养细胞，可以使用例如CHO-K1SV细胞、CHO-DG44细胞、293细胞等培养细胞，利用常规方法对其进行培养即可。
上述培养后，可以通过各种柱层析、例如使用蛋白A或蛋白G柱的各种层析对培养上清中蓄积的抗体进行纯化。
本发明的抗人IL-23R抗体为与人IL-23R结合的抗体。作为测定所得到的抗人IL-23R抗体对人IL-23R的结合活性的方法，有ELISA、FACS等方法。例如，在使用ELISA的情况下，将人IL-23R(序列号1)的细胞外结构域与免疫球蛋白Fc的融合蛋白固定到ELISA板上，对其添加抗人IL-23R抗体进行反应后，使由辣根过氧化物酶(HRP)等酶标记的抗IgG抗体等第二抗体反应，洗涤后，通过使用检测其活性的试剂(例如，HRP标记的情况下为BM-Chemiluminescence ELISA substrate(POD)(Roche Diagnostics公司))等的活性测定，对第二抗体的结合进行鉴定。另外，本发明的抗体也包含与猴IL-23R结合的抗体，可以测定对这些蛋白质的结合活性。
另外，本发明的抗人IL-23R抗体对人IL-23R具有中和活性。在本说明书中使用的情况下，抗体的“中和活性”是指通过对IL-23R的结合来抑制经由IL-23R带来的任意的生物活性的活性，可以将IL-23R的一种或多种生物活性作为指标来进行评价。作为这样的中和活性，可以列举例如IL-23R应答性细胞Kit225细胞的增殖抑制活性、人IL-23刺激STAT3磷酸化抑制活性，可以通过使用后述实施例中记载的方法来进行评价。
作为评价抗人IL-23R抗体的各种稳定性(例如，热稳定性、长期保存稳定性、高浓度稳定性)的方法，可以列举例如利用差示扫描量热测定或抗体保存中的聚集体形成的测定的方法。
本发明的抗人IL-23R抗体可以优选通过下述方法容易地获得：使用本领域中公知的方法，合成包含编码序列号5、9、13、17、21、25或29所示的重链可变区氨基酸序列的碱基序列的DNA和包含编码序列号7、11、15、19、23、27或31所示的轻链可变区氨基酸序列的碱基序列的DNA，将它们与适当类的人抗体恒定区基因连接，对于重链而言优选人Igγ1恒定区基因、对于轻链而言优选人Igκ恒定区基因，构建全人抗体基因，使用本领域中公知的各种方法，将该抗体基因导入表达载体，将该表达载体导入培养细胞并对该培养细胞进行培养，从得到的培养物中纯化抗体。包含编码序列号5、9、13、17、21、25或29所示的重链可变区氨基酸序列的碱基序列的DNA优选分别包含序列号4、8、12、16、20、24或28所示的碱基序列。包含编码序列号7、11、15、19、23、27或31所示的轻链可变区氨基酸序列的碱基序列的DNA优选分别包含序列号6、10、14、18、22、26或30所示的碱基序列。
包含序列号5所示的重链可变区和人Igγ1恒定区的本发明的优选的抗人IL-23R抗体重链为由序列号33所示的氨基酸序列构成的重链。包含序列号7所示的轻链可变区和人Igκ恒定区的本发明的优选的抗人IL-23R抗体轻链为由序列号35所示的氨基酸序列构成的轻链。包含编码由序列号33所示的氨基酸序列构成的抗人IL-23R抗体重链的碱基序列的DNA优选包含序列号32所示的碱基序列。包含编码由序列号35所示的氨基酸序列构成的抗人IL-23R抗体轻链的碱基序列的DNA优选包含序列号34所示的碱基序列。作为包含由序列号33所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号35所示的氨基酸序列构成的轻链的本发明的抗人IL-23R抗体，可以列举后述实施例中记载的全人25-3抗体。
包含序列号9所示的重链可变区和人Igγ1恒定区的本发明的优选的抗人IL-23R抗体重链为由序列号37所示的氨基酸序列构成的重链。包含序列号11所示的轻链可变区和人Igκ恒定区的本发明的优选的抗人IL-23R抗体轻链为由序列号39所示的氨基酸序列构成的轻链。包含编码由序列号37所示的氨基酸序列构成的抗人IL-23R抗体重链的碱基序列的DNA优选包含序列号36所示的碱基序列。包含编码由序列号39所示的氨基酸序列构成的抗人IL-23R抗体轻链的碱基序列的DNA优选包含序列号38所示的碱基序列。作为包含由序列号37所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号39所示的氨基酸序列构成的轻链的本发明的抗人IL-23R抗体，可以列举后述实施例中记载的全人30-15抗体。
包含序列号13所示的重链可变区和人Igγ1恒定区的本发明的优选的抗人IL-23R抗体重链为由序列号41所示的氨基酸序列构成的重链。包含序列号15所示的轻链可变区和人Igκ恒定区的本发明的优选的抗人IL-23R抗体轻链为由序列号43所示的氨基酸序列构成的轻链。包含编码由序列号41所示的氨基酸序列构成的抗人IL-23R抗体重链的碱基序列的DNA优选包含序列号40所示的碱基序列。包含编码由序列号43所示的氨基酸序列构成的抗人IL-23R抗体轻链的碱基序列的DNA优选包含序列号42所示的碱基序列。作为包含由序列号41所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号43所示的氨基酸序列构成的轻链的本发明的抗人IL-23R抗体，可以列举后述实施例中记载的全人30-16抗体。
包含序列号17所示的重链可变区和人Igγ1恒定区的本发明的优选的抗人IL-23R抗体重链为由序列号45所示的氨基酸序列构成的重链。包含序列号19所示的轻链可变区和人Igκ恒定区的本发明的优选的抗人IL-23R抗体轻链为由序列号47所示的氨基酸序列构成的轻链。包含编码由序列号45所示的氨基酸序列构成的抗人IL-23R抗体重链的碱基序列的DNA优选包含序列号44所示的碱基序列。包含编码由序列号47所示的氨基酸序列构成的抗人IL-23R抗体轻链的碱基序列的DNA优选包含序列号46所示的碱基序列。作为包含由序列号45所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号47所示的氨基酸序列构成的轻链的本发明的抗人IL-23R抗体，可以列举后述实施例中记载的全人30-18抗体。
包含序列号21所示的重链可变区和人Igγ1恒定区的本发明的优选的抗人IL-23R抗体重链为由序列号49所示的氨基酸序列构成的重链。包含序列号23所示的轻链可变区和人Igκ恒定区的本发明的优选的抗人IL-23R抗体轻链为由序列号51所示的氨基酸序列构成的轻链。包含编码由序列号49所示的氨基酸序列构成的抗人IL-23R抗体重链的碱基序列的DNA优选包含序列号48所示的碱基序列。包含编码由序列号51所示的氨基酸序列构成的抗人IL-23R抗体轻链的碱基序列的DNA优选包含序列号50所示的碱基序列。作为包含由序列号49所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号51所示的氨基酸序列构成的轻链的本发明的抗人IL-23R抗体，可以列举后述实施例中记载的全人32-28抗体。
包含序列号25所示的重链可变区和人Igγ1恒定区的本发明的优选的抗人IL-23R抗体重链为由序列号53所示的氨基酸序列构成的重链。包含序列号27所示的轻链可变区和人Igκ恒定区的本发明的优选的抗人IL-23R抗体轻链为由序列号55所示的氨基酸序列构成的轻链。包含编码由序列号53所示的氨基酸序列构成的抗人IL-23R抗体重链的碱基序列的DNA优选包含序列号52所示的碱基序列。包含编码由序列号55所示的氨基酸序列构成的抗人IL-23R抗体轻链的碱基序列的DNA优选包含序列号54所示的碱基序列。作为包含由序列号53所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号55所示的氨基酸序列构成的轻链的本发明的抗人IL-23R抗体，可以列举后述实施例中记载的全人34-58抗体。
包含序列号29所示的重链可变区和人Igγ1恒定区的本发明的优选的抗人IL-23R抗体重链为由序列号57所示的氨基酸序列构成的重链。包含序列号31所示的轻链可变区和人Igκ恒定区的本发明的优选的抗人IL-23R抗体轻链为由序列号59所示的氨基酸序列构成的轻链。包含编码由序列号57所示的氨基酸序列构成的抗人IL-23R抗体重链的碱基序列的DNA优选包含序列号56所示的碱基序列。包含编码由序列号59所示的氨基酸序列构成的抗人IL-23R抗体轻链的碱基序列的DNA优选包含序列号58所示的碱基序列。作为包含由序列号57所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号59所示的氨基酸序列构成的轻链的本发明的抗人IL-23R抗体，可以列举后述实施例中记载的全人32-36抗体。
本发明也包括包含本发明的抗体的重链可变区和轻链可变区且保有活性的单链可变区片段(scFv)、Fab、Fab’、F(ab’)2等抗人IL-23R抗体片段。另外，本领域技术人员也可以基于本发明来制作该抗人IL-23R抗体或抗体片段与其他肽或蛋白质的融合抗体或者制作结合有修饰剂的修饰抗体。用于融合的其他肽或蛋白质只要不使抗体的结合活性降低则没有特别限定，可以列举例如人血清白蛋白、各种标签肽、人工螺旋基序肽、麦芽糖结合蛋白质、谷胱甘肽S转移酶、各种毒素、其他能够促进多聚体化的肽或蛋白质等。用于修饰的修饰剂只要不使抗体的结合活性降低则没有特别限定，可以列举例如聚乙二醇、糖链、磷脂、核糖体、低分子化合物等。
这样得到的本发明的抗人IL-23R抗体可以在根据需要进一步纯化后，通过常规方法制剂化而用于银屑病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、克罗恩病或溃疡性结肠炎等炎症性肠病(IBD)、强直性脊柱炎(AS)、白塞氏病、葡萄膜炎、癌等IL-23R参与发病的疾病的治疗。
本发明的抗人IL-23R抗体可以优选作为银屑病治疗剂使用。作为这些治疗剂等的剂型的例子，可以制成注射剂、点滴用剂等非口服剂，优选通过静脉内给药、皮下给药等来给药。另外，制剂化时，可以在药学上容许的范围内使用与这些剂型相应的载体、添加剂。
上述制剂化时的本发明的抗人IL-23R抗体的添加量根据患者的症状的程度和年龄、使用的制剂的剂型或抗体的结合效价等而不同，使用例如约0.001mg/kg至约100mg/kg即可。
本发明还提供包含编码本发明的抗人IL-23R抗体的序列的多核苷酸及包含该多核苷酸的表达载体。本发明还提供包含编码本发明的抗人IL-23R抗体的重链可变区的序列的多核苷酸、包含编码本发明的抗人IL-23R抗体的轻链可变区的序列的多核苷酸以及包含上述任何一种多核苷酸或两种多核苷酸的表达载体。本发明的表达载体只要是在原核细胞和/或真核细胞的各种宿主细胞中表达编码本发明的抗体或其重链可变区和/或轻链可变区的基因并能够产生这些多肽的表达载体则没有特别限制。可以列举例如质粒载体、病毒载体(例如，腺病毒、逆转录病毒)等。本发明的表达载体优选含有前述的包含编码本发明的抗体的重链或轻链的序列的多核苷酸，或者含有包含编码本发明的抗体的重链的序列的多核苷酸和包含编码本发明的抗体的轻链的序列的多核苷酸。
本发明的表达载体可以含有编码本发明的抗人IL-23R抗体的基因、或者编码本发明的抗人IL-23R抗体的重链可变区的基因和/或编码本发明的抗人IL-23R抗体的轻链可变区的基因、以及可与该基因功能性连接的启动子。作为用于在细菌中表达编码本发明的抗体的基因或编码其重链可变区的基因和/或编码轻链可变区的基因的启动子，在宿主为埃希氏菌属细菌的情况下，可以列举例如Trp启动子、lac启动子、recA启动子、λPL启动子、lpp启动子、tac启动子等。作为酵母中的表达用启动子，可以列举例如PH05启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子，作为芽孢杆菌属细菌中的表达用启动子，可以列举SL01启动子、SP02启动子、penP启动子等。另外，在宿主为哺乳动物细胞等真核细胞的情况下，可以列举SV40来源的启动子、逆转录病毒的启动子、热激启动子等。
使用细菌、特别是大肠杆菌作为宿主细胞的情况下，本发明的表达载体可以进一步含有起始密码子、终止密码子、终止子区和可复制单元。另一方面，使用酵母、动物细胞或昆虫细胞作为宿主的情况下，本发明的表达载体可以含有起始密码子、终止密码子。另外，这种情况下，可以含有增强子序列、编码本发明的抗体或其重链可变区或轻链可变区的基因的5’侧和3’侧的非翻译区、分泌信号序列、剪接位点、多聚腺苷酸化位点或可复制单元等。另外，可以根据目的含有通常使用的选择标记(例如，四环素耐性基因、氨苄青霉素耐性基因、卡那霉素耐性基因、新霉素耐性基因、二氢叶酸还原酶基因)。
本发明还提供导入有编码本发明的抗体的基因或编码本发明的抗体的重链可变区的基因和/或编码本发明的抗体的轻链可变区的基因的转化体。这样的转化体例如可以通过用本发明的表达载体转化宿主细胞来制作。作为转化体的制作中使用的宿主细胞，只要是适合前述的表达载体且能够进行转化的宿主细胞则没有特别限定，可以例示本发明的技术领域中通常使用的天然细胞或人工建立的细胞等各种细胞(例如，细菌(埃希氏菌属细菌、芽孢杆菌属细菌)、酵母(酵母菌属、毕赤酵母菌属等)、动物细胞或昆虫细胞(例如，Sf9)等)。转化可以通过本身公知的方法进行。
优选的是，本发明的转化体为使用含有包含编码本发明的抗体的重链可变区的序列的多核苷酸和包含编码本发明的抗体的轻链可变区的序列的多核苷酸的表达载体转化后的宿主细胞，或者为使用含有包含编码本发明的抗体的重链可变区的序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码本发明的抗体的轻链可变区的序列的多核苷酸的表达载体转化后的宿主细胞。更优选的是，本发明的转化体为使用含有包含编码前述本发明的抗体的重链的序列的多核苷酸和包含编码本发明的抗体的轻链的序列的多核苷酸的表达载体转化后的宿主细胞，或者为使用含有包含编码前述本发明的抗体的重链的序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码本发明的抗体的轻链的序列的多核苷酸的表达载体转化后的宿主细胞。
本发明还提供本发明的抗人IL-23R抗体的生产方法，包括使编码本发明的抗体的基因或编码本发明的抗体的重链可变区的基因和/或编码本发明的抗体的轻链可变区的基因在宿主细胞中表达的步骤、即包括使用上述转化体的步骤。优选的是，该方法中使用的宿主细胞为使用前述本发明的表达载体转化后的宿主细胞，该表达载体可以分别含有或者同时含有包含编码本发明的抗体的重链可变区的序列的多核苷酸和包含编码本发明的抗体的轻链可变区的序列的多核苷酸。
本发明的抗人IL-23R抗体的生产中，转化体可以在营养培养基中培养。营养培养基优选含有转化体的生长所需的碳源、无机氮源或有机氮源。作为碳源，可以例示例如葡萄糖、葡聚糖、可溶性淀粉、蔗糖等，作为无机氮源或有机氮源，可以例示例如铵盐类、硝酸盐类、氨基酸、玉米浆、蛋白胨、酪蛋白、肉膏、大豆粕、马铃薯提取液等。另外，也可以根据需要含有其他营养素(例如，无机盐(例如，氯化钙、磷酸二氢钠、氯化镁)、维生素类、抗生素(例如，四环素、新霉素、氨苄青霉素、卡那霉素等)等)。
转化体的培养通过本身公知的方法进行。培养条例如温度、培养基的pH和培养時间可适当选择。例如，在宿主为动物细胞的情况下，作为培养基，可以使用含有约5～20％的胎牛血清的MEM培养基(Science,Vol.122,p.501,1952)、DMEM培养基(Virology,Vol.8,p.396,1959)、RPMI1640培养基(J.Am.Med.Assoc.,Vol.199,p.519,1967)、199培养基(proc.Soc.Exp.Biol.Med.,Vol.73,p.1,1950)等。培养基的pH优选为约6～8，培养通常在约30～40℃下进行约15～72小时，也可以根据需要进行通气、搅拌。在宿主为昆虫细胞的情况下，可以列举例如含有胎牛血清的Grace’s培养基(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.82,p.8404,1985)等，其pH优选为约5～8。培养通常在约20～40℃下进行15～100小时，也可以根据需要进行通气、搅拌。在宿主为细菌、放线菌、酵母、丝状真菌的情况下，例如含有上述营养源的液体培养基是适当的。优选pH为5～8的培养基。在宿主为大肠杆菌的情况下，作为优选的培养基，可以例示LB培养基、M9培养基(Miller等、Exp.Mol.Genet,冷泉港实验室,p.431,1972)等。该情况下，培养通常可以在14～43℃下进行约3～24小时，根据需要同时可进行通气、搅拌。在宿主为芽孢杆菌属细菌的情况下，通常可在30～40℃下进行约16～96小时，根据需要可同时进行通气、搅拌。在宿主为酵母的情况下，作为培养基，可以列举例如Burkholder基本培养基(Bostian,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.77,p.4505,1980)，pH优选为5～8。培养通常在约20～35℃下进行约14～144小时，也可以根据需要进行通气、搅拌。
本发明的抗人IL-23R抗体可以通过对如上所述的转化体进行培养而从该转化体中回收，优选进行分离、纯化。作为分离、纯化方法，可以列举例如盐析、溶剂沉淀法等利用溶解度的方法、透析、超滤、凝胶过滤、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳等利用分子量差异的方法、离子交换层析、羟基磷灰石层析等利用带电的方法、亲和层析等利用特异的亲和性的方法、反相高效液相色谱等利用疏水性差异的方法、等电聚焦等利用等电点差异的方法等。
以上对本发明进行了全面记载，在此提供用于深化理解而参照的特定实施例，但这些实施例的目的在于例示，并不限定本发明。
实施例
关于使用市售的试剂盒或试剂等的部分，只要没有特别说明，则依照随附的操作规程进行实验。
(实施例1：人和猴IL-23R-小鼠Fc融合蛋白的获取)
为了作为用于制作抗IL-23R抗体的抗原和筛选系统材料使用，本发明人制作了人IL-23R序列的细胞外部分序列(非专利文献1、序列号1的第24位至第353位氨基酸)与小鼠免疫球蛋白Fc段的融合蛋白。具体而言，通过PCR法使用引物ED14-1(序列号2)和ED14-2(序列号3)扩增人IL-23R的细胞外部分序列，将其插入到小鼠Fc融合蛋白表达用载体pFUSE-mIgG2A-Fc2(InvivoGen公司)的EcoRI和BglII位点，制成小鼠Fc融合IL-23R表达载体。在此，通过PCR法扩增得到的基因内存在引物ED14-1序列内和人IL-23R基因序列内的两处EcoRI位点，通过部分酶切和琼脂糖凝胶切出得到人IL-23R基因序列内的EcoRI位点未被切断的基因片段，将其插入该表达载体中。使用基因导入试剂293fectin(Invitrogen公司)将制作好的载体基因导入到FreeStyle 293细胞(Invitrogen公司)中，将该细胞在使用FreeStyle 293表达培养基(Invitrogen公司)的无血清培养体系中培养后，获取含有人IL-23R-小鼠Fc融合蛋白的培养上清。使用HiTrapA柱(GE Healthcare Japan公司)和蛋白纯化装置AKTA系统(GE Healthcare Japan公司)从获取的培养上清中纯化出蛋白质，用于以下的实验。对于猴IL-23R-小鼠Fc融合蛋白，也使用同样的方法来获取。
(实施例2：人IL-23R表达293细胞的获取)
为了作为用于抗IL-23R抗体的结合性试验和抗体获取的细胞抗原使用，本发明人获取了全长人IL-23R表达细胞。通过PCR法使用引物AA26-Fw(序列号60)和引物AA10-4(序列号61)扩增人IL-23R基因全长(非专利文献1、序列号1的全长)，将该基因片段插入克隆载体pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen公司)中。确认序列后，将该基因片段重组到哺乳类细胞表达用载体pcDNA3.1载体(Invitrogen公司)中。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)将该载体基因导入到人建立培养细胞293细胞中。将该细胞用含有G418的RPMI1640培养基进行选择培养后，利用有限稀释法进行单克隆化。然后，通过利用使用荧光色素标记的抗人IL-23R抗体(R&D system公司)的流式细胞术测定筛选出显示高蛋白表达的克隆来获取人IL-23R表达细胞。
(实施例3：抗IL-23R抗体产生杂交瘤的制作)
为了获取抗人IL-23R抗体，本发明人将实施例1和2中分别获取的人IL-23R-Fc融合蛋白或人IL-23R表达细胞与激起免疫反应的佐剂一起对VelocImmune小鼠进行免疫。对小鼠进行数次免疫，确认血中抗体效价的升高，进行最终免疫。依照常规方法摘除免疫后的小鼠的脾脏、淋巴结等来收集淋巴细胞，将其与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，由此制作杂交瘤。制作杂交瘤的有限稀释样品，进行单克隆化。对各克隆进行扩大培养后，将培养基变更成作为无血清培养基的CD杂交瘤培养基(Invitrogen公司)，培养约5天。使用蛋白G离心柱(Pro-Chem公司)从所得到的培养上清中纯化抗体。
(实施例4：ELISA分析)
为了测定抗体的抗原特异结合活性，本发明人使用了抗原ELISA。将人或猴IL-23R-Fc融合蛋白以500ng/mL的浓度固相化到NuncMaxisorp白色384孔板(Maxisorp 384plate；Nunc公司)上。添加封闭剂(Blocking One；Nacalai Tesque公司)并在室温下静置1小时后，用洗涤液(TPBS；含有0.05％Tween-20的磷酸缓冲生理盐水(PBS))洗涤2次，制作纯化抗体样品的适当稀释系列并进行添加。在室温下孵育1小时后，用TPBS洗涤4次，添加用稀释液稀释至2000倍的辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠Ig抗体(HRP-rabbit anti-mouse Ig antibody；DAKO公司)。在室温下孵育1小时后，用洗涤液洗涤4次。加入化学发光检测试剂BM-Chemiluminescence ELISA substrate(POD)(RocheDiagnostics公司)，使用EnVision计数仪(Perkin Elmer公司)测定其化学发光量。以复孔对各抗体进行试验，通过曲线拟合分析EC50。本试验中，作为比较抗体，使用将公知的人源化抗人IL-23R抗体hum20D7(专利文献1)的Fc段用小鼠Fc段置换而得到的融合抗体(以下，称为hum20D7-mFc)。需要说明的是，在此将hum20D7制成与小鼠Fc段的融合抗体是因为本评价体系中使用抗小鼠Ig抗体作为第二抗体，通过抗小鼠Ig抗体识别小鼠Fc段能够进行活性测定。
结果，确认到命名为25-3、30-15、30-16、30-18、32-28、34-58、32-36的抗体(嵌合抗体)与hum20D7-mFc同样地具有对人IL-23R的高结合活性(表1)。另外，关于对猴IL-23R的结合，hum20D7-mFc不显示对猴IL-23R的结合活性，与此相对，确认到上述7种抗体均对猴IL-23R具有高结合活性(表2)。
表1：抗人IL-23R抗体对人IL-23R的结合活性
      
EC50(ng/mL)
25-3(嵌合) 21
30-15(嵌合) 17
30-16(嵌合) 19
30-18(嵌合) 14
32-28(嵌合) 18
34-58(嵌合) 17
32-36(嵌合) 23
hum20D7-mFc 14
      
表2：抗人IL-23R抗体对猴IL-23R的结合活性
      
EC50（ng/mL)
25-3(嵌合) 28
30-15(嵌合) 16
30-16(嵌合) 69
30-18(嵌合) 14
32-28(嵌合) 24
34-58(嵌合) 13
32-36(嵌合) 28
hum20D7-mFc >10000
(实施例5：抗体的定序)
对于通过前述的分析鉴定后的7种抗体，本发明人由杂交瘤克隆出编码抗体的重链和轻链的基因。由各杂交瘤提取RNA，使用cDNA扩增试剂盒(SMARTer RACE cDNA Amplification kit；Clontech公司)制作cDNA。接着，使用PCR对重链和轻链的可变区进行延伸和扩增。使用直接测序仪(ABI PRISM 3100；Applied Biosystems公司)对该PCR产物进行序列分析。另外，将PCR产物重组到pCR3.1-TOPO(Invitrogen公司)等PCR产物亚克隆用载体中后，通过分析基因序列进行定序。
将确定的25-3的重链可变区的碱基序列示于序列号4中，将氨基酸序列示于序列号5中，将25-3的轻链可变区的碱基序列示于序列号6中，将氨基酸序列示于序列号7中。
将确定的30-15的重链可变区的碱基序列示于序列号8中，将氨基酸序列示于序列号9中，将30-15的轻链可变区的碱基序列示于序列号10中，将氨基酸序列示于序列号11中。
将确定的30-16的重链可变区的碱基序列示于序列号12中，将氨基酸序列示于序列号13中，将30-16的轻链可变区的碱基序列示于序列号14中，将氨基酸序列示于序列号15中。
将确定的30-18的重链可变区的碱基序列示于序列号16中，将氨基酸序列示于序列号17中，将30-18的轻链可变区的碱基序列示于序列号18中，将氨基酸序列示于序列号19中。
将确定的32-28的重链可变区的碱基序列示于序列号20中，将氨基酸序列示于序列号21中，将32-28的轻链可变区的碱基序列示于序列号22中，将氨基酸序列示于序列号23中。
将确定的34-58的重链可变区的碱基序列示于序列号24中，将氨基酸序列示于序列号25中，将34-58的轻链可变区的碱基序列示于序列号26中，将氨基酸序列示于序列号27中。
将确定的32-36的重链可变区的碱基序列示于序列号28中，将氨基酸序列示于序列号29中，将32-36的轻链可变区的碱基序列示于序列号30中，将氨基酸序列示于序列号31中。
(实施例6：全人抗体的制作)
上述的各抗体为可变区来源于人、恒定区来源于小鼠的抗体。因此，本发明人使用GS载体(Lonza Biologics公司)构建了含有重链和轻链这两种基因的表达载体，制作了全人抗体。具体而言，在抗体的重链可变区基因的5’侧连接信号序列，然后在3’侧连接人Igγ1的恒定区基因(Man Sung Co等,(1992)J Immunol.Vol.148(4):1149-1154)，将该重链基因插入GS载体pEE6.4中。另外，在抗体的轻链可变区基因的5’侧连接信号序列，然后在3’侧连接人κ链的恒定区基因(Man Sung Co等，出处同上)，将该轻链基因插入GS载体pEE12.4中。
将制作的全人25-3的重链的碱基序列示于序列号32中，将氨基酸序列示于序列号33中，将该抗体的轻链的碱基序列示于序列号34中，将氨基酸序列示于序列号35中。
将制作的全人30-15的重链的碱基序列示于序列号36中，将氨基酸序列示于序列号37中，将该抗体的轻链的碱基序列示于序列号38中，将氨基酸序列示于序列号39中。
将制作的全人30-16的重链的碱基序列示于序列号40中，将氨基酸序列示于序列号41中，将该抗体的轻链的碱基序列示于序列号42中，将氨基酸序列示于序列号43中。
将制作的全人30-18的重链的碱基序列示于序列号44中，将氨基酸序列示于序列号45中，将该抗体的轻链的碱基序列示于序列号46中，将氨基酸序列示于序列号47中。
将制作的全人32-28的重链的碱基序列示于序列号48中，将氨基酸序列示于序列号49中，将该抗体的轻链的碱基序列示于序列号50中，将氨基酸序列示于序列号51中。
将制作的全人34-58的重链的碱基序列示于序列号52中，将氨基酸序列示于序列号53中，将该抗体的轻链的碱基序列示于序列号54中，将氨基酸序列示于序列号55中。
将制作的全人32-36的重链的碱基序列示于序列号56中，将氨基酸序列示于序列号57中，将该抗体的轻链的碱基序列示于序列号58中，将氨基酸序列示于序列号59中。
使用分别插入有各抗体的重链和轻链的基因的上述GS载体，通过瞬时表达和组成性表达两种方法进行抗体表达。关于瞬时表达，使用293fectin(Invitrogen公司)以上述的重链和轻链的两种表达载体对在FreeStyle 293表达培养基(Invitrogen公司)中培养至约100万个/mL的FreeStyle 293细胞(Invitrogen公司)进行转染，培养3～7天。使用Proteus蛋白A或蛋白G纯化其培养上清，得到各全人抗体的纯化抗体。关于组成性表达，将分别插入有各抗体的重链和轻链的基因的上述GS载体用NotI和PvuI进行限制性酶切割，使用Ligation-Convenience试剂盒(NIPPONGENE公司)或Ligation-high(TOYOBO公司)进行连接，构建了插入有重链和轻链这两种基因的GS载体。该表达载体编码全长的重链和轻链及谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase)，通过转染在CHO-K1SV细胞中表达抗体。将培养上清用蛋白A或蛋白G柱(GEHealthcare Japan公司)纯化，得到各全人抗体的纯化抗体。
(实施例7：ELISA分析)
为了测定实施例6中制作的全人抗体的抗原特异结合活性，本发明人使用了抗原ELISA。将人或猴IL-23R-Fc融合蛋白以500ng/mL的浓度固相化到Nunc Maxisorp白色384孔板(Maxisorp 384孔板；Nunc公司)上。添加封闭剂(Blocking One；Nacalai Tesque公司)并在室温下静置1小时后，用洗涤液(TPBS；含有0.05％Tween-20的磷酸缓冲生理盐水(PBS))洗涤2次，制作纯化抗体样品的适当稀释系列并进行添加。在室温下孵育1小时后，用TPBS洗涤4次，添加用稀释液稀释至2000倍的辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体(anti-human IgG antibody；DAKO公司)作为第二抗体。在室温下孵育1小时后，用洗涤液洗涤4次。加入化学发光检测试剂BM-Chemiluminescence ELISAsubstrate(POD)(Roche Diagnostics公司)，使用EnVision计数仪(PerkinElmer公司)测定其化学发光量。以复孔对各抗体进行试验，通过曲线拟合分析EC50。
结果，关于实施例4中鉴定的7种抗体，确认到对各个抗体的全人抗体具有对人IL-23R的高结合活性(表3)。另外，关于对猴IL-23R的结合，hum20D7不显示对猴IL-23R的结合活性，与此相对，确认到上述7种全人抗体均对猴IL-23R具有高结合活性(表4)。
表3：全人抗人IL-23R抗体对人IL-23R的结合活性
      
EC50(ng/mL)
25-3(全人) 19.5
30-15(全人) 11.8
30-16(全人) 16.5
30-18(全人) 13.6
32-28(全人) 13.1
34-58(全人) 14.6
32-36(全人) 21.8
hum20D7 48.5
表4：全人抗人IL-23R抗体对猴IL-23R的结合活性
      
FC50(ng/mL)
25-3(全人) 11.2
30-15(全人) 7.6
30-16(全人) 10.8
30-18(全人) 8.4
32-28(全人) 17.1
34-58(全人) 14.8
32-36(全人) 33.1
hum20D7 >10000
(实施例8：抑制人IL-23诱导Kit225细胞增殖分析)
为了测定全人抗体的抗原特异中和活性，本发明人使用与IL-23反应而显示增殖应答的Kit225细胞(非专利文献1)进行了细胞增殖抑制活性研究。该分析中，将在IL-2存在下进行传代培养的Kit225细胞用含有10％FBS和1％氨苄青霉素-链霉素的RPMI1640培养基洗涤3次来除去IL-2后，使用该培养基以75000个/mL制备成细胞悬液，以100μL/孔分注到96孔板中。关于纯化抗体样品，使用上述的培养基以2000ng/mL为最高浓度制作4倍稀释系列后，添加到细胞中，用微孔板混合器进行搅拌。以2ng/mL的终浓度添加人IL-23(Humanzyme公司)，搅拌后，在37℃、5％CO2的条件下孵育5天。设定仅添加上述培养基来代替抗体样品的组作为对照组，将IL-23添加组作为100％对照，将IL-23未添加组作为0％对照。然后，使用细胞增殖数测定试剂CellTiter-Glo(Promega公司)进行定量，通过曲线拟合分析其IC50值。
结果可知，与m20D7和hum20D7相比，上述7种全人抗体均对人IL-23诱导性细胞增殖具有高的中和活性(表5)。
表5：全人抗人IL-23R抗体抑制人IL-23诱导Kit225细胞增殖的活性
      
IC50(ng/mL)
25-3(全人) 3.5
30-15(全人) 1.4
30-16(全人) 2.3
30-18(全人) 3.3
32-28(全人) 1.4
34-58(全人) 3.7
32-36(全人) 6.7
m20D7 24
hum20D7 55
(实施例9：人全血IL-23刺激STAT3磷酸化分析)
本发明人对抑制由IL-23和IL-23R介导的信号转导分子STAT3的活化的能力进行了评价。根据本试验，能够通过使用采自正常人的生物试样更准确地算出临床使用时的中和活性。
向人全血中添加纯化抗体并在37℃下孵育10分钟。然后，添加人IL-23(Humanzyme公司；终浓度10ng/mL)或溶剂并在37℃下孵育20分钟。添加冰冷却的FACS缓冲液(含有2％FCS的PBS)使反应停止，离心后除去上清。添加APC标记的抗CD4抗体(BD Bioscience公司)对血细胞进行染色后，添加Phosflow Lyse/Fix buffer(BD Bioscience公司)进行溶血和细胞固定。洗涤血细胞后，添加甲醇对细胞进行透化处理。接着，洗涤血细胞，添加PE标记的抗磷酸化STAT3抗体(BDBioscience公司)对细胞进行染色。洗涤细胞后悬浮到FACS缓冲液中，使用测定装置FACSCalibur(BD Bioscience公司)将门设定于CD4淋巴细胞级分，测定由磷酸化STAT3识别抗体带来的荧光。算出从添加IL-23时的磷酸化STAT3阳性细胞比率中减去不添加IL-23时的比率而得到的值作为IL-23诱发磷酸化STAT3阳性细胞比率。
结果可知，上述的全人抗体对人全血具有高的信号转导抑制作用，这些全人抗体中，特别是25-3、32-28、34-58与hum20D7相比具有高的信号转导抑制活性(表6)。
表6：人全血IL-23刺激STAT3磷酸化分析
      
IC50(ng/mL)
25-3(全人) 0.70
30-15(全人) 13
30-16(全人) 4.5
32-28(全人) 0.16
34-58(全人) 0.51
32-36(全人) 8.2
hum20D7 10
产业上的可利用性
本发明的抗人IL-23R抗体对人IL-23参与发病的各种疾病的预防或治疗有用。

Claims (43)

1.一种抗人IL-23R抗体或抗人IL-23R抗体片段，其选自下述(1)～(6)中的任何一项：
(1)包含由序列号9所示的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号11所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗人IL-23R抗体或抗人IL-23R抗体片段；
(2)包含由序列号13所示的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号15所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗人IL-23R抗体或抗人IL-23R抗体片段；
(3)包含由序列号17所示的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号19所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗人IL-23R抗体或抗人IL-23R抗体片段；
(4)包含由序列号21所示的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号23所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗人IL-23R抗体或抗人IL-23R抗体片段；
(5)包含由序列号25所示的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号27所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗人IL-23R抗体或抗人IL-23R抗体片段；和
(6)包含由序列号29所示的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号31所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗人IL-23R抗体或抗人IL-23R抗体片段。
2.如权利要求1所述的抗人IL-23R抗体或抗人IL-23R抗体片段，其包含由序列号9所示的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号11所示的氨基酸序列构成的轻链可变区。
3.如权利要求1所述的抗人IL-23R抗体或抗人IL-23R抗体片段，其包含由序列号13所示的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号15所示的氨基酸序列构成的轻链可变区。
4.如权利要求1所述的抗人IL-23R抗体或抗人IL-23R抗体片段，其包含由序列号17所示的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号19所示的氨基酸序列构成的轻链可变区。
5.如权利要求1所述的抗人IL-23R抗体或抗人IL-23R抗体片段，其包含由序列号21所示的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号23所示的氨基酸序列构成的轻链可变区。
6.如权利要求1所述的抗人IL-23R抗体或抗人IL-23R抗体片段，其包含由序列号25所示的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号27所示的氨基酸序列构成的轻链可变区。
7.如权利要求1所述的抗人IL-23R抗体或抗人IL-23R抗体片段，其包含由序列号29所示的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号31所示的氨基酸序列构成的轻链可变区。
8.如权利要求1～7中任一项所述的抗人IL-23R抗体或抗人IL-23R抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段的重链恒定区为人Igγ1恒定区。
9.如权利要求1～7中任一项所述的抗人IL-23R抗体或抗人IL-23R抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段的轻链恒定区为人Igκ恒定区。
10.如权利要求1～7中任一项所述的抗人IL-23R抗体或抗人IL-23R抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段的重链恒定区为人Igγ1恒定区，并且所述抗体或抗体片段的轻链恒定区为人Igκ恒定区。
11.如权利要求2所述的抗人IL-23R抗体，其包含由序列号37所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号39所示的氨基酸序列构成的轻链。
12.如权利要求3所述的抗人IL-23R抗体，其包含由序列号41所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号43所示的氨基酸序列构成的轻链。
13.如权利要求4所述的抗人IL-23R抗体，其包含由序列号45所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号47所示的氨基酸序列构成的轻链。
14.如权利要求5所述的抗人IL-23R抗体，其包含由序列号49所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号51所示的氨基酸序列构成的轻链。
15.如权利要求6所述的抗人IL-23R抗体，其包含由序列号53所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号55所示的氨基酸序列构成的轻链。
16.如权利要求7所述的抗人IL-23R抗体，其包含由序列号57所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号59所示的氨基酸序列构成的轻链。
17.如权利要求1～7中任一项所述的抗人IL-23R抗体片段，其中，所述片段是单链可变区片段、Fab、Fab’或F(ab’)2。
18.如权利要求17所述的抗人IL-23R抗体片段，其中，所述片段与另一种肽或蛋白质融合或者用修饰剂进行修饰。
19.一种多核苷酸，其包含编码权利要求1～7中任一项所述的抗体或抗体片段的重链可变区的序列。
20.一种多核苷酸，其包含编码权利要求1～7中任一项所述的抗体或抗体片段的轻链可变区的序列。
21.一种表达载体，其包含权利要求19和/或20所述的多核苷酸。
22.一种用权利要求21所述的表达载体进行了转化的宿主细胞，其中，所述宿主细胞选自由下述(a)和(b)构成的组：
(a)用含有包含编码权利要求1～7中任一项所述的抗体或抗体片段的重链可变区的序列的多核苷酸和包含编码该抗体或抗体片段的轻链可变区的序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；和
(b)用含有包含编码权利要求1～7中任一项所述的抗体或抗体片段的重链可变区的序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码该抗体或抗体片段的轻链可变区的序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
23.一种用权利要求21所述的表达载体进行了转化的宿主细胞，其中，所述宿主细胞选自由下述(a)和(b)构成的组：
(a)用含有包含编码权利要求11～16中任一项所述的抗体的重链的序列的多核苷酸和包含编码该抗体的轻链的序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；和
(b)用含有包含编码权利要求11～16中任一项所述的抗体的重链的序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码该抗体的轻链的序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
24.生产抗人IL-23R抗体或抗体片段的方法，其包括：对权利要求22所述的宿主细胞进行培养而使其表达抗人IL-23R抗体或抗体片段的步骤。
25.生产抗人IL-23R抗体的方法，其包括：对权利要求23所述的宿主细胞进行培养而使其表达抗人IL-23R抗体的步骤。
26.由生产抗人IL-23R抗体或抗体片段的方法生产的抗人IL-23R抗体或抗体片段，所述方法包括：对权利要求22所述的宿主细胞进行培养而使其表达抗人IL-23R抗体或抗体片段的步骤。
27.如权利要求26所述的抗人IL-23R抗体片段，其中，所述片段是单链可变区片段、Fab、Fab’或F(ab’)2。
28.如权利要求27所述的抗人IL-23R抗体片段，其中，所述片段与另一种肽或蛋白质融合或者用修饰剂进行修饰。
29.由生产抗人IL-23R抗体的方法生产的抗人IL-23R抗体，所述方法包括：对权利要求23所述的宿主细胞进行培养而使其表达抗人IL-23R抗体的步骤。
30.一种抗人IL-23R抗体片段，其包含由序列号5所示的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号7所示的氨基酸序列构成的轻链可变区。
31.如权利要求30所述的抗人IL-23R抗体片段，其中，所述抗体片段的重链恒定区为人Igγ1恒定区。
32.如权利要求30所述的抗人IL-23R抗体片段，其中，所述抗体片段的轻链恒定区为人Igκ恒定区。
33.如权利要求30所述的抗人IL-23R抗体片段，其中，所述抗体片段的重链恒定区为人Igγ1恒定区，并且所述抗体片段的轻链恒定区为人Igκ恒定区。
34.如权利要求30所述的抗人IL-23R抗体片段，其中，所述片段是单链可变区片段、Fab、Fab’或F(ab’)2。
35.如权利要求34所述的抗人IL-23R抗体片段，其中，所述片段与另一种肽或蛋白质融合或者用修饰剂进行修饰。
36.一种多核苷酸，其包含编码权利要求30所述的抗体片段的重链可变区的序列。
37.一种多核苷酸，其包含编码权利要求30所述的抗体片段的轻链可变区的序列。
38.一种表达载体，其包含权利要求36和/或37所述的多核苷酸。
39.一种用权利要求38所述的表达载体进行了转化的宿主细胞，其中，所述宿主细胞选自由下述(a)和(b)构成的组：
(a)用含有包含编码权利要求30所述的抗体片段的重链可变区的序列的多核苷酸和包含编码该抗体片段的轻链可变区的序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；和
(b)用含有包含编码权利要求30所述的抗体片段的重链可变区的序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码该抗体片段的轻链可变区的序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
40.生产抗人IL-23R抗体片段的方法，其包括：对权利要求39所述的宿主细胞进行培养而使其表达抗人IL-23R抗体片段的步骤。
41.由生产抗人IL-23R抗体片段的方法生产的抗人IL-23R抗体片段，所述方法包括：对权利要求39所述的宿主细胞进行培养而使其表达抗人IL-23R抗体片段的步骤。
42.如权利要求41所述的抗人IL-23R抗体片段，其中，所述片段是单链可变区片段、Fab、Fab’或F(ab’)2。
43.如权利要求42所述的抗人IL-23R抗体片段，其中，所述片段与另一种肽或蛋白质融合或者用修饰剂进行修饰。
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