CN104814928A - 一种载二氢杨梅素三元复合脂质体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种载二氢杨梅素三元复合脂质体的制备方法，包括以下步骤：(1)制备阴离子脂质体；(2)制备阴-阳离子二元复合脂质体混悬液；(3)制备载二氢杨梅素三元复合脂质体。本发明采用层层自组装技术制备载二氢杨梅素三元复合脂质体，主要利用带相反电荷的物质在液固界面通过静电作用交替沉积而形成多层超薄膜，并提出“阴离子脂质-阳离子脂质-羧甲基壳聚糖”这一全新多层自组装体系。组装完成的三元复合脂质体粒径为204.8±6.2nm，电位为-8.1±2.5mV，具有明显的层状结构，在血浆中具有良好的稳定性，细胞毒性小于阳离子脂质体，同时具有pH敏感性，可在不同介质中选择性释放二氢杨梅素。
Description
技术领域
本发明涉及二氢杨梅素技术领域，具体地，涉及一种载二氢杨梅素三元复合脂质体的制备方法。
背景技术
显齿蛇葡萄(Ampelopsis grossedentata)，俗名藤茶，是国家卫计委公布的新食品原料。二氢杨梅素是一种多酚羟基双氢黄酮醇，是显齿蛇葡萄的主要活性成分。医学研究表明，二氢杨梅素具有广泛的药理作用，如抗肿瘤、抗血栓、抗菌、降血糖、降血压、保肝护肝以及减轻乙醇中毒等功效。但由于二氢杨梅素自身脂溶性差、易被氧化和降解等缺点，这大大限制了其在医药和食品等行业的应用。如果将二氢杨梅素搭载安全高效的药物载体，携带二氢杨梅素进入目标细胞，则能有效的克服其性质上的缺陷。
目前，药物投递主要采用非病毒类载体，非病毒类载体具有良好的安全性和稳定性，且制备简单、成本较低。常用的非病毒类载体主要包括脂质体、纳米颗粒、高分子聚合物等。阳离子脂质体是运用最广泛的非病毒载体，具有较高的基因携载能力和细胞摄取率，但表面带有大量正电荷，血液循环中容易与体环境中的聚阴离子发生反应，从而引起较大的细胞毒性。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种载二氢杨梅素三元复合脂质体的制备方法，制备工艺具有操作简单、过程可控、易于保持药物生物活性等优点，为实现二氢杨梅素在临床上的运用奠定了基础。本发明采用层层自组装技术制备载二氢杨梅素三元复合脂质体，主要利用带相反电荷的物质在液固界面通过静电作用交替沉积而形成多层超薄膜，并提出“阴离子脂质--阳离子脂质--羧甲基壳聚糖”这一全新多层自组装体系。羧甲基壳聚糖是壳聚糖分子引入羧甲基后得到的水溶性衍生物,可生物降解，是一种pH敏感性材料。当pH>7.0时，由于羧基的离子化而带负电；当pH<7.0时,由于氨基的质子化而带正电。在血液循环pH7.4条件下，羧甲基壳聚糖带负电，紧密吸附于阳离子脂质的表面，可以保护载体免受血清中蛋白的相互作用，提高了载体在血液循环中的稳定性。当到达肿瘤组织后，由于肿瘤组织通常为酸性,羧甲基壳聚糖在这种酸性条件下带正电，与带正电的阳离子脂质发生排斥，便从载体表面脱离，暴露出带正电的阳离子脂质。
本发明的技术方案如下：一种载二氢杨梅素三元复合脂质体的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备阴离子脂质体：将二氢杨梅素、阴离子脂质与辅助脂质按摩尔比2-3:3-4:3-4的比例溶于氯仿，减压蒸发除去氯仿，得到干燥的脂质膜；加入HEPES缓冲液(pH7.4)，缓缓震摇使脂质膜悬浮于HEPES缓冲液，得到阴离子脂质体混悬液；将阴离子脂质体混悬液进行水浴超声，水合后，挤压过膜，即得阴离子脂质体；
(2)制备阴-阳离子二元复合脂质体混悬液：将阳离子脂质、辅助脂质按摩尔比的比例1-1.2：0.8-1溶于氯仿，减压蒸发除去氯仿，得到均匀的薄膜，加入一定体积的HEPES缓冲液(pH7.4)，缓缓震摇使脂质膜悬浮于HEPES缓冲液，得到阳离子脂质体混悬液；将阳离子脂质体混悬液与步骤(1)制备的阴离子脂质体，按阳离子脂质体：阴离子脂质体摩尔比2-2.5:1-1.5缓缓混合，水浴超声10min，得到阴-阳离子二元复合脂质体混悬液；
(3)制备载二氢杨梅素三元复合脂质体：随后向步骤(2)所得的阴-阳离子二元复合脂质体混悬液中加入0.5％-1％浓度的羧甲基壳聚糖水溶液，室温静置30min，即得载二氢杨梅素三元复合脂质体。
较佳地，步骤(1)中阴离子脂质为磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)中的一种或数种的混合物。
较佳地，步骤(1)、(2)中的辅助脂质为二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、磷脂酰胆碱(PC)、胆固醇(CHOL)中的一种或数种的混合物。
较佳地，步骤(3)中阳离子脂质为溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵(DOTAP),1，2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯(DOSC)，氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵(DOTMA)中的一种或数种的混合物。
本发明的有益效果为：用本发明所述的载二氢杨梅素三元复合脂质体的制备方法，制备的“阴离子脂质--阳离子脂质--羧甲基壳聚糖”这一全新的三元复合脂质体，既保留了阳离子脂质较高的药物携载能力和细胞摄取率等优点，同时由于阴离子脂质的加入，中和了部分阳离子表面的电荷，有效的降低了脂质体的毒性。而将具有长循环功能的羧甲基壳聚糖引入到载体的组装中，则巧妙的利用了羧甲基壳聚糖对pH值的敏感性，实现二氢杨梅素在不同介质中的选择性释放。与一般载体相比，使二氢杨梅素在到达靶向位置之前得到充分保护，免受血清中蛋白等的相互作用，而当载体到达指定位置后，又能及时从表面脱落，暴露出阳离子载体,从而提高转染的效率。采用层层自主装法制备的复合脂质体，具有操作简单，制备过程易控制等优点，同时减少了有机溶剂的使用，且静电力为弱的相互作用力，不影响物质结构，有利于保持二氢杨梅素的生物活性。
本发明采用基于静电吸引力的层层自组装技术，以二氢杨梅素为内核，然后依次组装阴离子脂质层、阳离子脂质层和羧甲基壳聚糖层，构建高效低毒的三元复合脂质体，为开发功能性二氢杨梅素类临床治疗药物奠定技术基础。组装完成的三元复合脂质体粒径为204.8±6.2nm，电位为-8.1±2.5mV，具有明显的层状结构，在血浆中具有良好的稳定性，细胞毒性小于阳离子脂质体，同时具有pH敏感性，可在不同介质中选择性释放二氢杨梅素。
附图说明
图1A为阴离子脂质体的透射电镜图。
图1B为阴-阳二元复合脂质体的透射电镜图。
图1C为阴-阳-羧甲基壳聚糖三元复合脂质体的透射电镜图。
图2为脂质体与血浆作用后吸光度的变化图。
图3为复合脂质体和阳离子脂质体在HepG2细胞中的存活率比较图。
图4为脂质体在不同磷酸盐缓冲液中二氢杨梅素的释放率比较图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明进一步说明，以帮助更好的理解本发明的内容，但这些具体实施方式不以任何方式限制本发明的保护范围。
实施例1：
一种载二氢杨梅素三元复合脂质体的制备方法，包括以下步骤：
(1)将二氢杨梅素、磷脂酰甘油(PG)与二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)按摩尔比2:3:3的比例溶于氯仿，减压蒸发除去氯仿，得到干燥的脂质膜，加入HEPES缓冲液(pH7.4)，缓缓震摇使脂质膜悬浮于HEPES缓冲液，得到阴离子脂质体混悬液，将阴离子脂质体混悬液置于超声清洗仪中进行水浴超声，充分水合后，挤压过膜，即得阴离子脂质体；
(2)将溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵(DOTAP)、磷脂酰胆碱(PC)按摩尔比1:1的比例溶于氯仿，减压蒸发除去氯仿，得到均匀的薄膜，加入HEPES缓冲液(pH7.4)，缓缓震摇使脂质膜悬浮于HEPES缓冲液，得到阳离子脂质体混悬液，将阳离子脂质体混悬液与步骤(1)制备的阴离子脂质体，按阳离子脂质体：阴离子脂质体摩尔比2:1缓缓混合，水浴超声10min，得到阴-阳离子二元复合脂质体混悬液；
(3)随后向步骤(2)所得的阴-阳离子二元复合脂质体混悬液中加入0.5％-1％浓度的羧甲基壳聚糖水溶液，室温静置30min，即得载二氢杨梅素三元复合脂质体。
实施例2：
一种载二氢杨梅素三元复合脂质体的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将二氢杨梅素、磷脂酰肌醇(PI)与胆固醇(CHOL)按摩尔比2.5:3.5:3.5的比例溶于氯仿，减压蒸发除去氯仿，得到干燥的脂质膜，加入HEPES缓冲液(pH7.4)，缓缓震摇使脂质膜悬浮于HEPES缓冲液，得到阴离子脂质体混悬液，将阴离子脂质体混悬液置于超声清洗仪中进行水浴超声，充分水合后，挤压过膜，即得阴离子脂质体；
(2)将1，2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯(DOSC)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)按摩尔比1:0.8的比例溶于氯仿，减压蒸发除去氯仿，得到均匀的薄膜,加入HEPES缓冲液(pH7.4)，缓缓震摇使脂质膜悬浮于HEPES缓冲液，得到阳离子脂质体混悬液，将阳离子脂质体混悬液与步骤(1)制备的阴离子脂质体，按阳离子脂质体：阴离子脂质体摩尔比2.5:1缓缓混合，水浴超声10min，得到阴-阳离子二元复合脂质体混悬液；
(3)随后向步骤(2)所得的阴-阳离子二元复合脂质体混悬液中加入0.5％-1％浓度的羧甲基壳聚糖水溶液，室温静置30min，即得载二氢杨梅素三元复合脂质体。
实施例3：
一种载二氢杨梅素三元复合脂质体的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将二氢杨梅素、磷脂酰丝氨酸(PS)与二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)按摩尔比2.8:4:3的比例溶于氯仿，减压蒸发除去氯仿，得到干燥的脂质膜，加入一定体积的HEPES缓冲液(pH7.4)，缓缓震摇使脂质膜悬浮于HEPES缓冲液，得到阴离子脂质体混悬液，将阴离子脂质体混悬液置于超声清洗仪中进行水浴超声，充分水合后，挤压过膜，即得阴离子脂质体；
(2)将氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵(DOTMA)、磷脂酰胆碱(PC)按摩尔比1.2:1的比例溶于氯仿，减压蒸发除去氯仿，得到均匀的薄膜，加入HEPES缓冲液(pH7.4)，缓缓震摇使脂质膜悬浮于HEPES缓冲液，得到阳离子脂质体混悬液；将阳离子脂质体混悬液与步骤(1)制备的阴离子脂质体，按阳离子脂质体：阴离子脂质体摩尔比2.5:1.5缓缓混合，水浴超声10min，得到阴-阳离子二元复合脂质体混悬液；
(3)随后向步骤(2)所得的阴-阳离子二元复合脂质体混悬液中加入0.5％-1％浓度的羧甲基壳聚糖水溶液，室温静置30min，即得载二氢杨梅素三元复合脂质体。
实施例4：
一种载二氢杨梅素三元复合脂质体的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将二氢杨梅素、磷脂酰甘油(PG)与磷脂酰胆碱(PC)按摩尔比3:4:4的比例溶于氯仿，减压蒸发除去氯仿，得到干燥的脂质膜，加入HEPES缓冲液(pH7.4)，缓缓震摇使脂质膜悬浮于HEPES缓冲液，得到阴离子脂质体混悬液，将阴离子脂质体混悬液置于超声清洗仪中进行水浴超声，充分水合后，挤压过膜，即得阴离子脂质体；
(2)将1，2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯(DOSC)、胆固醇(CHOL)按摩尔比1.1:0.9的比例溶于氯仿，减压蒸发除去氯仿，得到均匀的薄膜，加入一定体积的HEPES缓冲液(pH7.4)，缓缓震摇使脂质膜悬浮于HEPES缓冲液，得到阳离子脂质体混悬液；将阳离子脂质体混悬液与步骤(1)制备的阴离子脂质体，按阳离子脂质体：阴离子脂质体摩尔比2:1.3缓缓混合，水浴超声10min，得到阴-阳离子二元复合脂质体混悬液；
(3)随后向步骤(2)所得的阴-阳离子二元复合脂质体混悬液中加入0.5％-1％浓度的羧甲基壳聚糖水溶液，室温静置30min，即得载二氢杨梅素三元复合脂质体。
实施例5：
一种载二氢杨梅素三元复合脂质体的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将二氢杨梅素、磷脂酰肌醇(PI)与胆固醇(CHOL)按摩尔比2.5:3:3的比例溶于氯仿，减压蒸发除去氯仿，得到干燥的脂质膜，加入一定体积的HEPES缓冲液(pH7.4)，缓缓震摇使脂质膜悬浮于HEPES缓冲液，得到阴离子脂质体混悬液，将阴离子脂质体混悬液置于超声清洗仪中进行水浴超声，充分水合后，挤压过膜，即得阴离子脂质体；
(2)将氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵(DOTMA)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)按摩尔比1:1的比例溶于氯仿，减压蒸发除去氯仿，得到均匀的薄膜，加入HEPES缓冲液(pH7.4)，缓缓震摇使脂质膜悬浮于HEPES缓冲液，得到阳离子脂质体混悬液；将阳离子脂质体混悬液与步骤(1)制备的阴离子脂质体，按阳离子脂质体：阴离子脂质体摩尔比2.3:1.2缓缓混合，水浴超声10min，得到阴-阳离子二元复合脂质体混悬液；
(3)随后向步骤(2)所得的阴-阳离子二元复合脂质体混悬液中加入0.5％-1％浓度的羧甲基壳聚糖水溶液，室温静置30min，即得载二氢杨梅素三元复合脂质体。
实施例6：
一种载二氢杨梅素三元复合脂质体的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将二氢杨梅素、磷脂酰丝氨酸(PS)与磷脂酰胆碱(PC)按摩尔比2.5:3.5:3.5的比例溶于氯仿，减压蒸发除去氯仿，得到干燥的脂质膜，加入HEPES缓冲液(pH7.4)，缓缓震摇使脂质膜悬浮于HEPES缓冲液，得到阴离子脂质体混悬液，将阴离子脂质体混悬液置于超声清洗仪中进行水浴超声，充分水合后，挤压过膜，即得阴离子脂质体；
(2)将溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵(DOTAP)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)按摩尔比1.2:0.8的比例溶于氯仿，减压蒸发除去氯仿，得到均匀的薄膜,加入一定体积的HEPES缓冲液(pH7.4)，缓缓震摇使脂质膜悬浮于HEPES缓冲液，得到阳离子脂质体混悬液；将阳离子脂质体混悬液与步骤(1)制备的阴离子脂质体，按阳离子脂质体：阴离子脂质体摩尔比2:1.5缓缓混合，水浴超声10min，得到阴-阳离子二元复合脂质体混悬液；
(3)随后向步骤(2)所得的阴-阳离子二元复合脂质体混悬液中加入0.5％-1％浓度的羧甲基壳聚糖水溶液，室温静置30min，即得载二氢杨梅素三元复合脂质体。
实施例7本发明的测试实验和结果如下：
(1)脂质体的形态观察
分别取阴离子脂质体混悬液、阴-阳离子二元复合脂质体混悬液、载二氢杨梅素三元复合脂质体混悬液少许，滴至铺有碳膜的铜网上，静置1min，用滤纸吸干混悬液，再滴加2％磷钨酸染色，于透射电镜下观察脂质体的形态并拍照，结果见图1A，1B和1C。
由图1A，1B和1C可以看出，每个脂质体均呈类球形，且可以观察到明显的层状结构，说明了各层材料都组装成功。
(2)脂质体的粒径和电位
分别取一定量的阴离子脂质体混悬液、阴-阳离子二元复合脂质体混悬液、载二氢杨梅素三元复合脂质体混悬液，用磷酸盐缓冲液稀释，采用激光粒度分析仪测定脂质体的粒径和表面电位，结果见表1。
表1组装过程中脂质体的粒径和电位变化
由表1可以看出，随着不同材料的组装，脂质体的电位不断发生逆转，粒径也逐渐增大。
(3)脂质体在血浆中的稳定性
取一定浓度的三元复合脂质体和阳离子脂质体，加入10％的血浆，于室温下分别孵育0.5、1、2、4、6、8、10、12、16、18、24h，用紫外分光光度计测定在600nm波长处的吸光度(A)值，通过吸光度的变化考察其血浆稳定性。
利用所得数据作图如图2，由图2可以看出，阳离子脂质体与血浆作用后产生较大的团聚，导致吸光度急剧下降，而三元复合脂质体与血浆作用后吸光度基本不变，说明三元复合脂质体较阳离子脂质体具有更好的血浆稳定性。
(4)脂质体的细胞毒性
采用MTT法测定细胞活性。将HepG 2细胞接种于96孔培养板中，过夜培养至细胞完全贴壁，PBS洗涤后每孔加入100μL无血清培养基，并分别加入浓度为100ug/ml,200ug/ml,300ug/ml,400ug/ml,500ug/ml的三元复合脂质体和阳离子脂质体，空白对照组只加入100μL无血清培养基。轻轻摇匀后，培养6h移去培养液，换成含10％小牛血清完全培养基，继续培养24h，然后向每孔加入20μL MTT溶液，继续培养4h。吸弃孔内上层液体，向每孔中加入二甲基亚砜(DMSO)，室温下将平板置于恒温震荡器上振荡，待紫色结晶完全溶解。选择波长为570nm，用酶联免疫检测仪测定各孔OD值。细胞存活率＝OD570(样品)/OD570(对照)×100％。
用所得细胞存活率和对应的三元复合脂质体和阳离子脂质体浓度作图，结果见图3。由图3可以看出，在不同浓度下，三元复合脂质体的细胞存活率均高于阳离子脂质体，说明三元复合脂质体比阳离子脂质体的细胞毒性要低。
(5)复合脂质体在不同磷酸盐缓冲液中二氢杨梅素的释放
采用恒温振荡摇床法测定三元复合脂质体在不同pH值(5.5、6.0、6.5、7.0、7.4)磷酸盐缓冲液中二氢杨梅素的释放率，通过二氢杨梅素释放速度的快慢考察三元复合脂质体的pH敏感性。分别取13份复合脂质体的混悬液和不同pH值的磷酸盐缓冲液，在37℃恒温水浴振荡,每份样品对应一个时间点，在13个预设时间点(2、4、6、8、10、12、24、36、48、60、72、96、120h)取样，离心后取上清液测定释放率。
用所得释放率和对应的预设时间点作图，结果如图4，由图4可以看出，当释放时间超过12h以后，随着磷酸盐缓冲液pH值不断的增大，二氢杨梅素的释放率不断的降低，说明复合脂质体在酸性介质中二氢杨梅素的释放速度较快。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其架构形式能够灵活多变，可以派生系列产品。只是做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。
Claims (4)
1.一种载二氢杨梅素三元复合脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备阴离子脂质体：将二氢杨梅素、阴离子脂质与辅助脂质按摩尔比2-3:3-4:3-4的比例溶于氯仿，减压蒸发除去氯仿，得到干燥的脂质膜；加入HEPES缓冲液(pH7.4)，缓缓震摇使脂质膜悬浮于HEPES缓冲液，得到阴离子脂质体混悬液；将阴离子脂质体混悬液进行水浴超声，水合后，挤压过膜，即得阴离子脂质体；
(2)制备阴-阳离子二元复合脂质体混悬液：将阳离子脂质、辅助脂质按摩尔比的比例1-1.2：0.8-1溶于氯仿，减压蒸发除去氯仿，得到均匀的薄膜，加入一定体积的HEPES缓冲液(pH7.4)，缓缓震摇使脂质膜悬浮于HEPES缓冲液，得到阳离子脂质体混悬液；将阳离子脂质体混悬液与步骤(1)制备的阴离子脂质体，按阳离子脂质体：阴离子脂质体摩尔比2-2.5:1-1.5缓缓混合，水浴超声10min，得到阴-阳离子二元复合脂质体混悬液；
(3)制备载二氢杨梅素三元复合脂质体：随后向步骤(2)所得的阴-阳离子二元复合脂质体混悬液中加入0.5％-1％浓度的羧甲基壳聚糖水溶液，室温静置30min，即得载二氢杨梅素三元复合脂质体。
2.如权利要求1所述的载二氢杨梅素三元复合脂质体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中阴离子脂质为磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)中的一种或数种的混合物。
3.如权利要求1所述的载二氢杨梅素三元复合脂质体的制备方法，其特征在于，步骤(1)、(2)中的辅助脂质为二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、磷脂酰胆碱(PC)、胆固醇(CHOL)中的一种或数种的混合物。
4.如权利要求1所述的载二氢杨梅素三元复合脂质体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中阳离子脂质为溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵(DOTAP),1，2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯(DOSC)，氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵(DOTMA)中的一种或数种的混合物。
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