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CN104800858B - Hsp90抑制肽偶联物及其在肿瘤治疗中的应用 - Google Patents

Hsp90抑制肽偶联物及其在肿瘤治疗中的应用 Download PDF

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CN104800858B CN201510203194.XA CN201510203194A CN104800858B CN 104800858 B CN104800858 B CN 104800858B CN 201510203194 A CN201510203194 A CN 201510203194A CN 104800858 B CN104800858 B CN 104800858B
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Abstract

本发明公开了一种HSP90抑制肽偶联物及其在肿瘤治疗中的用途。具体地，本发明公开了一种由HSP90抑制肽与细胞毒性剂通过接头偶联形成的偶联物以及其在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物中的用途。所述偶联物具有靶向递送、化学治疗与促凋亡的三重抗肿瘤功效，不但增强药物对肿瘤的杀伤能力，还可以相应地减少用药量，可以明显减轻因化疗药物蓄积所引起的各种毒副作用。

Description

HSP90抑制肽偶联物及其在肿瘤治疗中的应用
技术领域
本发明涉及肿瘤靶向治疗剂，具体涉及一种热休克蛋白90抑制肽偶联物在制备治疗肿瘤的靶向治疗偶联物中的应用。
背景技术
恶性肿瘤严重威胁人类的生命健康，改善当前肿瘤的治疗效果是医药工作者的一项重要使命。临床使用的大部分化疗药物对肿瘤的靶向性较差，用药后并不是优先在肿瘤病灶富集，肿瘤药物总量通常只占总给药剂量的5-10％。同时化疗药物的毒副作用常常限制了化疗药物的最佳使用量，最终导致化疗不完全、早期复发和化疗耐药。
目前针对肿瘤细胞特有的突变信号通路的酪氨酸激酶抑制剂类在临床使用中获得了巨大成功。对于突变型病人而言，这类药物不仅疗效好，而且毒副作用很小。然而这些新型药物存在抑瘤谱窄、使用10-12月后出现耐药等不足。原癌信号通路之间存在多重平行关系，很多情况下可以互相补偿、代替，因而简单阻断一条通路往往不足以危及癌细胞的生存。为了弥补这种不足，人们开始着眼于这些通路的交汇点，希望以一种药物同时阻断多条通路，提高药物的作用效果，改善药物的抑瘤谱和病人个体普适性，HSP90就是其中一种。
HSP90是广泛存在于真核细胞的一种分子伴侣，正常条件下主要协助细胞内新合成的客户蛋白肽链(Nascent peptide of Client protein)以正确折叠成具有各种生化功能的酶、受体或信号因子等。在化疗药物作用下，肿瘤细胞启动保护性机制，其中包括快速上调HSP90的表达。这种保护机制是构成肿瘤化疗逃逸及耐药的重要基础。肿瘤细胞的HSP90表达水平普遍较正常细胞高2-10倍[1]，此外细胞膜上也有高丰度HSP90表达[2]。现已知有数十种原癌信号蛋白属于HSP90的客户蛋白[3]，从而使HSP90成为一个重要的原癌信号网络交汇点，对肿瘤细胞的HSP90分子伴侣功能进行抑制，就有可能同时促进多种原癌蛋白质的降解。同样HSP90通过调控细胞自噬过程参与细胞对药物的应答，因而抑制HSP90有望显著改善肿瘤治疗效果。
如发明人在其发明专利(专利号：ZL201310258476.0；发明名称：一种肿瘤特异性靶向肽及其应用)所述，利用噬菌体展示技术，筛选到与肺癌具有特异性结合的靶向肽(其氨基酸序列为LPLTPLP，下文简称为P7)，并将该肿瘤特异性靶向肽与包载多西紫杉醇的生物高分子材料聚乳酸连接，在制备肿瘤早期诊断和治疗试剂中的用途。在下文中，所述靶向肽与包载多西紫杉醇的聚乳酸形成的偶联物又称为靶向肽的纳米制剂(TN-DTX)。
发明内容
申请人提取了肿瘤细胞膜表面蛋白，经过聚丙烯酰胺凝胶电泳回收蛋白并进行质谱鉴定，经过质谱鉴定明确氨基酸序列为LPLTPLP的靶向肽(下文简称为靶向肽)的结合位点蛋白为HSP90。通过蛋白印迹实验研究了所述靶向肽对HSP90的表达影响。结果显示，靶向肽作用于肿瘤细胞后，可以直接降低HSP90的表达。因此该靶向肽是一种HSP90的抑制肽。
如背景技术部分所述，HSP90在多种肿瘤细胞中高表达，有利于细胞对抗外界的温度、药物及放射线刺激，在肿瘤复发和耐药过程中发挥重要作用。申请人对靶向肽联合多西紫杉醇的作用进行了探讨。
多西紫杉醇及靶向肽处理后，肿瘤细胞内自噬相关蛋白Beclin 1及LC3的蛋白表达水平发生变化。单独给予靶向肽不影响肿瘤细胞内自噬相关蛋白Beclin 1及LC3的蛋白表达。单独使用多西紫杉醇时，细胞内Beclin 1表达水平明显升高，同时LC3-I型向LC3-II型发生转变，表明细胞内自噬水平升高。当同时加入多西紫杉醇及靶向肽后，与单纯使用多西紫杉醇相比较，自噬相关蛋白Beclin 1表达水平明显下降，LC3-I型向LC3-II型的转变也有所逆转，结果表明靶向肽能够显著抑制多西紫杉醇引起的肿瘤细胞自噬。
由此可以看出，所述靶向肽不仅具有靶向作用，与多西紫杉醇联合使用时能够促进肿瘤细胞由自噬向凋亡转变，从而提高对肿瘤细胞的杀伤作用。基于此，申请人将所述靶向肽与多西紫杉醇偶联制备一种集成靶向递送、自噬抑制和肿瘤杀伤功能于一体的偶联物，下文以DTX-P7表示。
本发明通过在体实验显示，与常规制剂和基于该靶向肽制备的纳米制剂相比，所述偶联物能够显著缩小肿瘤体积，对肺腺癌、乳腺癌、黑素瘤等细胞也有明显的杀伤作用。
本发明提供了基于该HSP90抑制肽在制备细胞毒性剂偶联物方面的用途。本发明所述的HSP90抑制肽能够特异性结合肿瘤细胞并抑制细胞内HSP90的表达。
本发明还提供一种由HSP90抑制肽与细胞毒性剂通过接头连接形成的偶联物。优选地，所述HSP90抑制肽的氨基酸序列为LPLTPLP，优选地所述HSP90抑制肽的氨基端连接1-3个G，羧基端连接S、SH或SHS。优选地，所述细胞毒性剂选自多西紫杉醇、紫杉醇和阿霉素。优选地，所述的接头具有如下所示的通式：-CO-(CH2CH2)n-CO-，其中n选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，所述接头最优选为-CO-CH2CH2-CO-。
本发明提供所述的HSP90抑制肽由接头通过酯化或酰胺化反应与细胞毒性剂如多西紫杉醇，紫杉醇和阿霉素等制备偶联物，优选靶向肽的氨基端通过接头与多西紫杉醇和紫杉醇的2-OH相连接，制备偶联物。
在另一方面，本发明还提供所述的HSP90抑制肽氨基端通过接头与阿霉素的10-来苏己吡喃基上的-3-NH2相连接所制备的偶联物。
在另一方面，本发明还提供所述HSP90抑制肽氨基端通过接头与阿霉素的8-羟乙酰基相连接，制备偶联物。
本发明涉及以上述本发明偶联物作为活性成份的药物。通过将本发明偶联物与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。本发明还涉及所述偶联物在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物中的用途。所述肿瘤是HSP90高表达肿瘤，优选自肺癌、肺腺癌、黑色素瘤、胃癌、乳腺癌、肾癌、肝癌、口腔表皮癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、结肠癌和神经肿瘤，更优选为肺腺癌、乳腺癌和黑色素瘤，进一步优选为肺腺癌。
本发明偶联物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。
给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。
本发明偶联物可以制成普通制剂、也制成是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。
为了将本发明偶联物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。
还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。
为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明偶联物与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明化合物片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明化合物的胶囊剂。
为将本发明偶联物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。
此外，如需要也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。
为达到用药目的，本发明的药物可用任何公知的给药方法给药。
本发明的偶联物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。
本发明的偶联物的抗肿瘤效应已得到证实，可用于恶性肿瘤的治疗。
本发明公开了HSP90抑制肽通过连接细胞毒性剂如多西紫杉醇，紫杉醇和阿霉素等制备偶联物，不但增强药物对肿瘤的杀伤能力，还可以相应地减少用药量，可以明显减轻因化疗药物蓄积所引起的各种毒副作用，具有十分重要的应用价值。偶联药物具有靶向递送、化学治疗与促凋亡的三重抗肿瘤功效，将在肿瘤改善肿瘤治疗效果包括逆转肿瘤耐药方面有广阔的应用。
附图说明
图1表示靶向肽的结合位点为HSP90。
图2A至图2F表示的是靶向肽对HSP90表达、细胞自噬及凋亡的影响。图2A是蛋白印迹实验，表明靶向肽能够有效的降低热休克蛋白90的表达，且呈一定的浓度依赖关系。图2B至图2D表明靶向肽显著抑制多西紫杉醇引起的肿瘤细胞自噬。图2E是Annexin V法检测凋亡，表明靶向肽能够促进细胞发生凋亡，并且促进多西紫杉醇诱导的细胞凋亡。图2F是细胞电镜成像，表明靶向肽能够促进西紫杉醇诱导的细胞凋亡。
图3表示的是偶联物DTX-P7的质谱分析图谱。
图4表示的是各组的裸鼠体重变化。
图5表示的是DTX、DTX-P7、TN-DTX治疗组裸鼠肿瘤解剖图。
图6表示的是DTX、DTX-P7、TN-DTX对肿瘤相对体积的影响。在以上各图汇总，*表示与模型组相比；#表示与DTX和TN-DTX相比。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1、靶向肽结合位点及对HSP90表达的影响
使用膜蛋白提取试剂盒进行蛋白提取，经过SDS-Page电泳，切胶回收目的蛋白，酶切进行质谱分析，如图1所示，其中条带A分子量为53Kd，是热休克蛋白90kDα，条带B是热休克蛋白90kDβ,分子量为48Kd。经鉴定该结合靶点为HSP90(图1)。
实施例2、靶向肽对HSP90表达的影响
(1)取人肺腺癌A549细胞，胰酶消化处理，800×g离心5min，PBS重悬，细胞计数，调整密度为1×106/ml；
(2)6孔板接种1ml/孔，再加入2ml培养基，37℃，5％CO2培养过夜；
(3)用培养基稀释靶向肽，每孔加人300μl，使终浓度分别10-4M，阴性对照加入等体积的培养基，37℃，5％CO2作用48h，各组平行三孔，独立实验重复三次。提取蛋白进行蛋白印迹分析。
结果显示，靶向肽能够有效的降低热休克蛋白90的表达，且呈一定的浓度依赖关系(图2A)。因而该靶向肽为HSP90抑制肽。
实施例3、靶向肽对细胞凋亡的影响
培养接种细胞，用培养基稀释靶向肽，并配置相应浓度的多西紫杉醇溶液。阴性对照加入相当量的培养基，靶向肽组加入10-4M的靶向肽，多西紫杉醇组中加入10-9M，多西紫杉醇与靶向肽联合用药组中分别加入10-4M的靶向肽及10-9M的多西紫杉醇。37℃，5％CO2作用6h。Annexin V法检测凋亡，提取蛋白进行凋亡蛋白检测。
Annexin V法检测凋亡显示，加入靶向肽后，可诱导细胞凋亡产生；与多西紫杉醇联用后，可进一步诱导细胞凋亡。
蛋白印迹结果显示，加入靶向肽后，半胱天冬酶-3(Caspase-3)发生一定的裂分，并且和多西紫杉醇联用后，与单用多西紫杉醇相比较，Caspase-3裂分带更加明显。图2E和图2F表明靶向肽能够促进细胞发生凋亡，并且促进多西紫杉醇诱导的细胞凋亡。
实施例4、靶向肽对细胞自噬的影响
培养接种细胞，用培养基稀释靶向肽，并配置相应浓度的多西紫杉醇溶液。阴性对照加入相当量的培养基，靶向肽组加入10-4M的靶向肽，多西紫杉醇组中加入10-9M，多西紫杉醇与靶向肽联合用药组中分别加入10-4M的靶向肽及10-9M的多西紫杉醇。37℃，5％CO2作用6h。进行自噬小体的检测，提取蛋白进行自噬蛋白检测。
图2B至图2D结果表明，在多西紫杉醇及靶向肽处理后，细胞内自噬相关蛋白Beclin 1及LC3的蛋白表达水平发生变化；单独给予靶向肽时，未见细胞内这些蛋白表达水平明显变化，当经过多西紫杉醇诱导后，细胞内Beclin 1表达水平明显升高，同时LC3-I型向LC3-II型发生转变，提示自噬水平的升高。当同时加入多西紫杉醇及靶向肽后，与单纯使用多西紫杉醇相比较，自噬相关蛋白Beclin 1表达水平明显下降，LC3-I型向LC3-II型的转变也有所逆转，提示靶向肽能够很好地抑制多西紫杉醇引起的肿瘤细胞自噬。
实施例5、制备多西紫杉醇-HSP90抑制肽P7偶联物(DTX-P7)
DTX-Suc的合成
1.5gDTX和0.5g丁二酸酐(Succinic anhydride，简写为Suc)溶于20ml二氯甲烷中，加入0.5ml吡啶，常温搅拌一周，反应基本完成。减压除去二氯甲烷，残余物中加入50ml5％柠檬酸水溶液，用50ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，干燥后减压除去乙酸乙酯，得到DTX-Suc粗品，将粗品过制备型C18柱后进行纯化，冻干，得到DTX-Suc，做HPLC分析。色谱制备方法：流动相：40-70％乙腈(60-30％水)/0-30min，流速20ml/min。色谱分析方法：流动相：0-50％乙腈(100-50％水)/0-50min，流速1ml/min。
DTX-P7的合成
使用固相肽合成法制备P7。在0.83g Fmoc-Pro-Trt树脂(0.5mmol，树脂取代度0.6mmol/g)上依照序列连接氨基酸，肽链构建完成后将DTX-Suc连接在肽链的N-端。从树脂上裂解下来的偶联物粗品过制备型C18柱进行纯化，收集目标馏分，冻干，得到DTX-P7，做HPLC分析与质谱分析。色谱制备方法：流动相：40-70％乙腈(60-30％水)/0-30min，流速20ml/min。色谱分析方法：流动相：0-50％乙腈(100-50％水)/0-50min，流速1ml/min。DTX-P7质谱分析图见图3。
结构式1
用同样的方法制备紫杉醇七肽偶联物PTX-P7(结构式2)，阿霉素NH2七肽偶联物(DOX-P7)(结构式3)和阿霉素OH位七肽偶联物(DOX-OH-P7)(结构式4)。
结构式2
结构式3
结构式4
实施例6、制备人非小细胞肺癌裸鼠皮下移植模型
收集对数生长期的人非小细胞肺癌A549细胞，加入1ml含10％FBS的F-12K培养基，轻轻吹打混匀至单细胞悬液，适当稀释，进行细胞计数。Matrigel基质胶置于冰浴中冻融，用预冷的枪头将细胞悬液与Matrigel基质胶(1：3)按比例混合，调整细胞浓度为8×106/ml，冰浴保存待用。
取SPF级BALB/c nu/nu雌性3-4周龄裸鼠30只，约16g，实验前先适应环境1周。造模时，先用碘伏对裸鼠右前肢腋窝处的皮肤进行消毒处理，用1ml无菌BD注射器吸取适量A549细胞悬液，将注射器针头与皮肤平行进针，缓缓将100μl细胞悬液接种于裸鼠的右前肢腋窝皮下(接种浓度为8×105/100μl)。接种完细胞后，观察裸鼠状态，放回笼中继续饲养。
实施例7、荷瘤裸鼠分组给药
实时观察裸鼠的出瘤情况，出瘤后用游标卡尺测量、记录肿瘤大小，待肿瘤形成且体积达到100mm3时(肿瘤体积＝长径×短径2/2)，随机分成4组：生理盐水组(对照)，多西紫杉醇组(DTX)，多西紫杉醇靶向纳米药物组(TN-DTX)和多西紫杉醇-肽P7偶合物组(DTX-P7)。
动物分组第二天后给药，给药方式为腹腔注射，每周给药1次，共给药4周。设第一次给药时，记为第0天，则给药日期分别为第0、7、14、21天。给药剂量按DTX浓度计算为10mg/kg。
每周2次观察裸鼠的情况，并记录体重，用游标卡尺测量肿瘤的长径与短径，按公式计算出肿瘤体积(Tumor volume，V)和相对肿瘤体积(Relative tumor volume，RTV)。
V＝1/2×a×b2(设长径为a，短径为b)
RTV＝Vt/V0(设第一次给药时的肿瘤体积为V0，给药后第t天的肿瘤体积为Vt)
在第一次给药后第5周(即第28天)，裸鼠腹腔注射0.5％戊巴比妥钠溶液进行麻醉(剂量为50mg/kg)，采用脱颈方法处死动物，分离裸鼠右前肢腋窝皮下的肿瘤组织，称量肿瘤的质量并记录。将肿瘤组织切开，一部分浸泡于4％多聚甲醛溶液后置于4℃保存，剩余部分以液氮猝冷后置于-80℃冷冻保存。
体重监测结果显示，各组动物体重无明显差异，表明各种DTX制剂均具有良好的安全性(图4)。图5表明各组动物的肿瘤生长情况，图6以曲线图表示各组动物的肿瘤生长情况。其共同表明DTX、DTX-P7、TN-DTX均对肿瘤有不同程度的抑制作用。其中，DTX-P7的抗肿瘤作用尤其明显，与对照组相比，在第4天时相对肿瘤体积就开始明显减小(p<0.05)。DTX-P7的效果优于DTX，同时也明显优于申请人前期专利公布的纳米靶向药物TN-DTX(p<0.01)。以上结果表明DTX-P7对肿瘤的抑制效果不是多西紫杉醇与靶向肽抑制效果的简单叠加，还具有意想不到的抑制效果。即使DTX-P7与本申请人所公开的TN-DTX相比，其抑制效果差异也极其显著。这表明将细胞毒性剂与所述HSP90抑制肽通过接头连接形成的偶联物比所公开的纳米靶向药物TN-DTX相比，具有极为显著的抑制肿瘤生长的效果。
实施例8、四种偶联物对多种肿瘤细胞毒性实验
将肺腺癌A549、乳腺癌MCF-7S和黑色素瘤细胞A375稀释成3×104/ml的单细胞悬液，每孔100μl接种于96孔板，培养24h后分别加入5、20、80、320nM的DTX-P7，紫杉醇七肽偶联物(PTX-P7)，阿霉素NH2七肽偶联物(DOX-P7)和阿霉素OH位七肽偶联物(DOX-OH-P7)孵育48h，每孔加10μl CCK-8溶液，温育1.5h后在450nm波长测吸光度值，统计细胞存活率，计算三种偶联物的半数抑制浓度IC50。由表1可以可能看出四种偶联物对多种肿瘤细胞均有较好的杀伤作用，有望用于多种肿瘤的治疗。
表1.四种偶联物对不同肿瘤细胞的杀伤作用(IC50，nM)
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Claims (7)

1.偶联物在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物中的用途，其中：
所述的偶联物由氨基酸序列LPLTPLP所示的HSP90抑制肽与细胞毒性剂通过接头连接形成，
所述细胞毒性剂选自：多西紫杉醇、紫杉醇和阿霉素；
所述的肿瘤是选自以下的HSP90高表达的肿瘤：黑色素瘤、胃癌、乳腺癌、肾癌、肝癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、结肠癌。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述的肿瘤为乳腺癌或黑色素瘤。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述HSP90抑制肽的氨基端连接1至3个G，羧基端连接S、SH或SHS。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述的接头具有如下所示的通式：
-CO-(CH2CH2)n-CO-，
其中n选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述接头为-CO-CH2CH2-CO-。
6.根据权利要求1所述的用途，其中：
所述HSP90抑制肽的氨基端通过接头与多西紫杉醇或紫杉醇的2-OH相连接，或者
所述HSP90抑制肽的氨基端通过接头与阿霉素的10-来苏己吡喃基上的-3-NH2相连接，或者
所述HSP90抑制肽的氨基端通过接头与阿霉素的8-羟乙酰基相连接。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述的偶联物是下式所示的偶联物：
或
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