CN104807875A - 混合物中生物聚合物碎片离子质谱采集 - Google Patents

Abstract

本发明涉及在电离产生不同电荷状态的生物聚合物时，选择最适合的离子种类来采集碎片离子质谱。本发明提出一种极快方法从不同生物聚合物中选择最适合的母离子，以对使用电喷雾电离(ESI)或产生多种多样电荷状态的类似电离方法、各种生物聚合物包含多种离子信号模式(电荷状态与同位素成分均不相同)的质谱破碎分片。选择方法为，在单一生物聚合物中最多测量一个离子种类。此外，各种情况下均可规定对分离破碎分片离子种类最适合的过滤器通带宽度。

Description

混合物中生物聚合物碎片离子质谱采集

技术领域

本发明涉及在电离产生不同电荷状态的生物聚合物时，选择最适合的离子种类来采集碎片离子质谱。

本发明提出一种极快方法从不同生物聚合物中选择最适合的离子种类，以对使用电喷雾电离(ESI)或类似电离方法、各种生物聚合物包含多种离子信号模式(电荷状态与同位素成分均不相同)的质谱破碎分片。选择方法为，在单一生物聚合物中最多测量一个离子种类。此外，各种情况下均可规定对分离所选破碎分片离子种类最适合的过滤器通带宽度。

背景技术

本文使用“道尔顿”(Da)单位，而非法定的“统一的原子质量单位”(u)，Da单位在国际计量局上一版(第八版，2006年)“国际单位制(SI)”文件中添加，与统一的原子质量单位处于同等地位。如文件所述，这样做主要是为了允许使用千道尔顿和毫道尔顿等类似单位。

本文所用术语“离子种类”表示物质S的电荷状态为z的离子，即S^z+。各种情况下都包括同位素成分不同的所有离子，因为物质包含所有同位素成分。离子种类可按M/z值区分，而与质谱中的惯例不同，其中M并非单同位素质量(通常指定为m)，而是各同位素成分平均分子质量M(原为分子重量)。

药理学、生物学和医学界对于鉴定体液中分子质量M在5至100千道尔顿之间的生物聚合物(尤其是蛋白质)十分关注。以下讨论主要涉及蛋白质。例如，抗体就是很受关注的蛋白质，通常酶解成三部分分子，质量分别约为50、50和25千道尔顿。虽然通常无法采用色谱法彻底分离多种蛋白质，但通过在液相色谱分离后对碎片离子谱进行质谱分析，鉴定效果更佳。通常使用电喷雾法(ESI)完成电离。对于每种蛋白质，质谱包含强度分布范围广泛、通常相对平滑的高价离子(电荷数z不同)正常模式，强度最大的离子种类质荷比M/z通常介于600至1200道尔顿。按质荷比M/z划分的各离子种类展示出同位素成分不同的离子窄分布。存在大量不同物质时，同位素分布出现众多重叠。

如果对蛋白质进行电喷雾电离，则电荷状态z不同的离子种类数取决于蛋白质的质量M；高质量与低质量相比，不同电荷状态数通常更大。在电喷雾方法中，当喷洒典型的乙腈和甲酸水溶液时，小蛋白质(如平均分子量M＝8564.76Da的泛素)通常产生八种不同电荷状态，电荷数z＝7、8、9...14(图1)。在有32种不同电荷状态z的质谱中存在平均质量M＝66.4kDa的牛血清蛋白(图2)。蛋白质的结构、变性溶剂的使用以及蛋白质内二硫键的存在均可影响电荷分布；牛血清蛋白内的紧密联系意味着，电离期间很少有质子可被吸收成为电荷载体，这就表示强度最大的离子种类相对较重，M/z约等于1200Da。

如图3所示，对于混合物的ESI质谱，尽管混合物只含四种蛋白质，仍然无法在视觉上辨别何种离子信号属于何种蛋白质。不过，可以采用电荷去卷积法，例如著名的程序MaxEnt(最大熵去卷积)，使用熵定义来为测得质谱计算出可能性最大的去卷积质谱。图3质谱的去卷积结果如图4所示；混合物的四种蛋白质可以清晰辨别。遗憾的是，MaxEnt程序去卷积即使在快速计算机上也需要一两分钟，因而无法用于快速搜寻合适的破碎候选对象，特别是在混合物滞留时间相近的情况下，此时一并从色谱洗脱，无法分辨。

按照“早先的技术”，最简单的破碎方法先破碎最高强度的离子种类，并采集其碎片离子质谱，然后对强度次之的离子进行相同操作，依此类推。但这意味着，属于同种蛋白质、但电荷数不同的离子会被反复测量，直到最终找到另一种不同的蛋白质为止。强度较低的蛋白质(如图3和4中的胰岛素离子)经常根本找不到。按照“早先的技术”，另一种方法也按强度次序选择离子种类，但分析同位素信号分离来确定这种离子种类的电荷z，然后结合已知的M/z确定蛋白质质量M。如果次高离子种类质量M相同，则不选择它进行破碎，而是继续检查下一级离子种类，依此类推。但此法只能用于各同位素信号互相明确分离的条件下，即在所用质量分析器的质量分辨率足够高时；如果质谱仪不具备极高的解析能力，则会失败。在质量大于30千道尔顿的情况下，几乎无法使用此法，因为解吸能力R需要高于60000，而通过飞行时间质谱仪来实现这一点十分困难。

因此，需要可以快速选择最合适离子种类的方法，以对混合多种蛋白质的复杂质谱进行破碎分片，如图3示例所示，各种相关生物聚合物面面俱到，至少也要尽可能多。并不需要彻底去卷积。最好还能确定同位素分布宽度Δ(M/z)，以对离子种类分离实现质量过滤器设置优化等目的。

发明内容

本发明提出了一种方法，极为快速地从相关各种生物聚合物中选择最适合的离子种类，以对所含离子信号模式多种多样、带电状态与同位素成分各不相同的生物聚合物质谱进行破碎分片，采用电喷雾电离等方法实现。具体选择时，并不毫无必要地反复测量相同生物聚合物中具有大量不同电荷状态的离子。此外，各种情况下均可规定对分离同位素信号模式(即分离所选离子种类)最适合的过滤器通带宽度。

此法先在测得质谱中设定起始范围(例如600＜M/z＜1200道尔顿)，然后对目标质谱设定目标范围(例如5000＜M＜60000道尔顿)。更可取的是，再将目标范围分为次级窄频道(“带隙”)，例如每个5道尔顿。此外，还可设置电荷数z的范围，例如5≤z≤60。在此，范围完全可以定义为上下限之间的每个整数。某些具体情况下，范围定义并不涵盖上下限之间所有整数，而是跳过一些，或取不连续的电荷数，也很有用。测得谱此时可采用快速算法进行平滑处理，以等比M/z值减少数据点数i(M/z)，即可从测量参数尺度(例如飞行时间)转换为质量尺度。在此，如果同位素信号之后不再单独出现，则很有益处，因为只使用包络。或者，最初借助峰值拾取算法从测得谱获得的线谱也可映射到具有等比M/z值的谱上。

在经过平滑缩减处理的谱中，所选范围内每个离子信号M/z值根据需要依次乘以电荷数z范围内的整数n，例如乘以n＝5、6、7...60，然后减去n个电荷载体的质量n×p进行修正。正离子的电荷载体是有正质量p的质子。在目标谱带间内对强度i(M/z)求和得到强度和∑i，具体结果为M_n＝(M/z)×n-n×p，只要计算出的质量M_n仍在目标范围内。计算出的质量M_n超出目标范围时，对此离子信号的乘法运算即告终止。对于每个带隙，信号质荷比M/z和强度i(M/z)均记录在附表中。也可以只记录主要被加数的强度i(M/z)和M/z。目标谱此时包含许多毫无意义的内容；但能够惊奇地发现，强度和∑i正好等于实际存在的生物聚合物质量M，因为这种生物聚合物中具有各种电荷状态z的信号和值为此。在这些显著信号中便可选择最适合破碎分片的离子种类，例如各种情况下按带隙总强度∑i降序，或各种情况下强度i(M/z)最大的离子种类M/z。

根据本发明中的定义，电荷载体也可以有负质量，例如在通过负电喷雾法对生物聚合物进行电离时，物质失去高价质子。这种情况下，电荷数的范围或总量将包含负项n。特别适合负极性电离的生物聚合物有脱氧核糖核酸(DNA)和糖胺聚糖。对于失去高价负质子的离子，电荷载体有(失去的)质子(具有负质量，可以表示为-p)。但计算规则在本质上与上述相同。

仍要检查所选离子种类是独立存在，还是与其他离子种类重叠，尤其是强度更大的种类。如果存在重叠，则从带隙为这种蛋白质选择强度次高的离子种类，然后检查是否重叠，直到找到没有任何重叠的离子种类为止。如果仅储存主要被加数，则借助经过缩减的M/z谱按上文所述检查重叠；如果与强信号严重重叠，则对于质量为M的蛋白质，检查与最初选择的离子种类临近的离子种类M/z强度i(M/z）是否合适以及是否重叠，直到找到合适的离子种类为止。

使用迭代法也很可取，在为第一种生物聚合物选择离子种类后，从经过平滑和缩减处理的谱中，删除所选生物聚合物的所有其他离子种类M/z，然后再次执行乘法运算和储存过程。使用迭代法能够发现集中程度很低的生物聚合物。

可通过假设生物聚合物成分平均包括氢(H)、碳(C)、氮(N)、氧(O)、硫(S)和磷(P)，与相关生物聚合物的统计平均相符，来计算所选离子种类的同位素分布宽度。研究发现，质荷比为M/z的不同离子种类的同位素分布越窄，生物聚合物的质量M越大。该宽度既可用于在迭代法中删除离子种类，也可为分离这种离子种类设置质量过滤器。

附图说明

图1显示泛素的ESI质谱(m＝8.564kDa)，具有七个离子种类M/z，电荷数范围从z＝14至z＝7。

图2显示牛血清蛋白的ESI质谱(m＝66.4kDa)，带有电荷状态不同的离子种类分布，由于内部联系紧密，其最大值略大于M/z＝1200Da。全谱显示32个离子种类。各离子信号通过多种加合物加宽。

图3显示胰岛素(～5.74kDa)、泛素(～8.564kDa)、细胞色素C(～12.38kDa)和肌红蛋白(～17.05kDa)混合物经过电喷雾电离后测得的质谱。这些蛋白质的高价离子仅有四种，但重叠严重，以至于无法通过肉眼区分。

图4显示通过著名的MaxEnt程序对图3质谱进行去卷积，其中四种主要成分十分清晰。但即便使用快速计算机，去卷积也需要数分钟。

图5显示目标谱，采用与发明原理相符的方法，可从图1质谱生成。

图6上图显示对图3质谱以高分辨率测量得出的一个只有12道尔顿的狭窄部分，其中泛素9+(左，M/z≈951.5Da)、细胞色素C13+(M/z≈952.5Da)和在图中心附近的胰岛素6+(M/z≈956.2Da)。下图是以质量过滤器单独滤除有六倍电荷的胰岛素离子后，获得的质谱。以此方式滤除的离子可用于破碎分片。

图7显示具有单电荷离子(质量m＝622、922、1222、1522、1822、2122Da)的校准液质谱(各自z均等于1)，其中泛素质谱含有高价离子种类。

图8以更高图形分辨率显示，图7质谱中质量m＝1222Da左右的值，同位素信号m＝1223Da，胰岛素的同位素分布为7+。

具体实施方式

如上所述，本发明提出一种非常快速的方法，在分析包含至少一种生物聚合物的离子(电荷状态与同位素成分各不相同)信号模式的生物聚合物混合物质谱时，选择最适合破碎分片的离子种类。电荷状态与同位素成分各不相同的这种离子信号模式可通过电喷雾电离等方法产生。因此，可通过电荷不同的离子种类防止多次测量同一种生物聚合物，以免耗费测量时间，却不提供与生物聚合物混合物成分有关的任何新信息。凭借强力质谱仪所使用的计算机，计算过程大约只需10至100毫秒；因此可在采集各碎片离子质谱三四次之后，借助测得质谱实时搜寻。此外，各种情况下均可规定对分离破碎分片离子种类最适合的质量过滤器通带宽度。图3显示一个有四种蛋白质50多个离子种类信号的混合物ESI质谱。

此法不仅适用于ESI质谱，而且适用于通过不同电离法得到的质谱(如果产生电荷状态不同的离子模式)。例如DESI(解吸电喷雾电离)，将电喷雾束射向固体样品。

对于计算，最好先在测得谱中设定质荷比起始范围(例如600＜M/z＜1200道尔顿)，然后在目标谱中设定目标范围(例如5000＜M_Target＜60000道尔顿)。更可取的是，再将目标范围分为次级窄频道(“带隙”)，例如11000个带隙，每个5道尔顿。此外，还可设定电荷数z的范围，它在一种示例情况下用作乘数n，例如5≤z≤60。测得谱此时可使用快速算法完成背景噪声削减和平滑处理。如果同位素信号之后不再单独出现，肯定很有益处，因为只使用包络。质谱之后可以等比M/z值减少数据点数i(M/z)，即可从测量参数尺度(例如飞行时间)等转换为质量尺度。在经过转换缩减且无背景噪声的质谱中，相关生物聚合物的电荷分布模式仍有重叠，根据色谱条件，还可能存在生物聚合物离子加合物，例如Na⁺、K⁺或其他离子。

在经过平滑缩减处理的谱中，升至零线以上的第一个离子信号的M/z值此时依次乘以电荷数z设定范围内所有整数n，例如乘以n＝5、6、7...60，然后减去电荷载体的质量(即正离子的质子质量p)进行修正。每个结果M_n＝(M/z)×n-n×p都输入目标谱的正确带隙M_Target。带隙内各项强度i(M/z)求和得出∑i(M_Target)。对于每个带隙，输入的所有信号质荷比M/z和强度i(M/z)都记录在附表中；也可采用一种更加快速(更重要的是，内存要求更低)的方法，只记录主要被加数的强i(M/z)和质荷比M/z。计算出的质量M_n＝(M/z)×n-n×p超出目标范围时，第一个离子信号所用方法即告终止。然后对平滑化质谱的第二个离子信号执行乘法和存储方法，即第二个M/z值，然后是第三、四、五个...M/z值，直到所有离子信号(即平滑缩减谱的所有M/z值)均经过乘法和存储方法处理为止。

这个带有源表的目标谱此时包含许多毫无意义的内容；但令人惊奇的是，强度和∑i(M_Target)正好等于实际存在的蛋白质质量M，因为质量M＝M_Target的蛋白质所有电荷状态z的信号和值为此。图5显示应用上述计算法则从图3测得谱获得的目标谱。

在第一种情况下，这些显著信号此时便可用于选择要破碎分片的蛋白质，例如按强度和∑i(M_Target)降序。对于每种蛋白质，从带隙内选择最合适的离子种类，以对附表中各项进行破碎分片，例如强度i(M/z)最高的离子种类M/z，或输入表中的主要离子种类。检查最初选择的每个离子种类M/z是独立存在，还是与其他离子种类重叠，进而存在干扰。如果存在重叠，则从带隙内选择这种蛋白质的强度次高离子种类，并检查是否重叠，直到找到不重叠的离子种类为止。

为避免在采集质谱选择离子种类与之后采集碎片离子质谱之间浪费过多时间，可在确定第一个离子种类之后立即开始采集碎片离子质谱，然后继续确定后续离子种类。在以较短时间采集的较低质量质谱上，也可至少选出第一个离子种类。

在第二种(理想)情况下，本文所述算法反复迭代执行。为此，最初仅为质量M＝M_Target的生物分子选择强度∑i(M_Target)最高的一个离子种类。如果其他信号不与所选离子种类M/z重叠，即可将其用于破碎分片，生物分子的所有离子种类均从平滑缩减谱中删除。删除时计算M/z所有相应值。可为同位素信号的分布宽度假设一个适当的平均值；但根据下述方法通过质量M来计算离子种类M/z的同位素信号分布宽度Δ_y(M/z)更佳。通过以此方法删除而修改的谱，按所述算法编制新的目标质谱。然后从新的目标谱中，选择目前最强生物分子的适当离子种类。此法反复迭代，直到找到预先确定的生物分子数，或处理所有可用离子信号为止。

可通过假设生物聚合物平均包括H、C、N、O、S和P等成分，与统计平均相符，来计算所选离子种类的同位素分布宽度Δ_i(M/z)。对于蛋白质，平均成分对应于分子式C_4.9384H_7.7583N_1.3577O_1.4773S_0.0417。以此方式可计算出各质量M的k_i(M，s)数，它表示质量为M的蛋白质有多少条同位素线高于百分比强度阈值s。强度阈值为最大强度的5％时，等式k_i(M，5％)＝√(a×M/m_u-b)适用，其中m_u＝1Da，作为同位素质量与常量a＝0.016955，b＝2.77之间的近似分隔。如专业人士所知，其他类型的生物聚合物常量a和b略有不同。离子种类M/z的宽度即为Δ_i(M/z)＝(k_i(M，s)-1)×m_u/z。

选择适当的离子种类后，测量碎片离子质谱。所选离子种类(不断从离子源流出)经过质谱仪的质量过滤器分离，并在适当单元内破碎分片，然后测量碎片离子的质谱。一般通过从带负电的适当施主分子离子转移电子(ETD＝电子转移解离)对高价蛋白质分子破碎分片。对于蛋白质鉴定，通过碎片离子质谱按此方法确定氨基酸部分序列(尽可能长)。对于改性蛋白质，通过碎片离子质谱确定与常态相比所发生的变化。本文不再进一步详细讨论各项具体任务。

同位素分布宽度Δ_i(M/z)的测定也可用于为分离所选离子种类优化设置质量过滤器。

此处应注意，并不一定总是多种重分子的混合物，才有各种离子种类重叠。在主要由几种单电荷离子组成的质谱只含一种重分子的高价离子种类分布时，此法也可使用，如图7所示。这是胰岛素质谱，高价离子包含在校准液质谱内，离子单一同位素质量m＝622、922、1222、1522、1822、2122Da(各自z均等于1)。图8放大显示质量m＝1222Da左右的值，同位素信号m＝1223Da，胰岛素的同位素分布为7+。

如上所述，由于色谱液中存在盐(特别是Na⁺和K⁺)，某些物质的离子种类还与碱离子形成加合物。通常只有少数物质分子形成这种加合物。加合物中质子由碱离子取代。一般来说，每个分子只加合一个碱离子，通常加合到具体物质的所有离子种类。因而，这些加合物在混合物中表现为新物质，比不存在加合物的原有物质重22或38道尔顿。按照所述方法，可通过与混合物中其他物质相同的方式来找到它们。

根据本发明，此法主要涉及分析混合物中分子质量M各不相同的各种生物聚合物。本方法使用电喷雾或其他电离方法，产生类似的大量电荷状态，形成单个蛋白质的多个离子种类，它们各自具有不同的电荷数z，然后借助一个离子种类的碎片离子质谱，通过从离子混合物中所选的质荷比M/z进行分析。此法主要包括借助计算出的目标谱(预选质量范围M_min＜M＜M_max)，来选择蛋白质离子种类M/z进行破碎分片。目标谱的构成方法是，在通过将测得质谱中存在的所有离子种类的质荷比M/z分别乘以各种情况下的所有整数n，然后减去电荷载体的质量n×p(只要所得质量M_n＝(M/z)×n-n×p处于目标谱预选质量范围以内)，而计算出的位置对所有强度i(M/z)求和。因此，相关离子种类的强度i(M/z)和值等于M_n。质量p是离子种类电荷载体的质量；对于正离子来说，p就是质子的质量。目标谱可以具体细分为带隙，其中强度i(M/z)和值等于各种情况下计算得出的质量M_n＝(M/z)×n-n×p。对于每个带隙，在目标谱附表中记录所有相关离子种类的质荷比m/z和强度i(M/z)很有益处。然而，只记录主要离子种类的强度i和质荷比M/z，可以节省内存和计算时间。

以此方法，不必总使用测得质谱的所有离子种类，而是可将离子种类M/z限定为一个质量范围(M/z)_min＜M/z＜(M/z)_max。只考虑预选范围z_min＜n＜z_max的整数n，甚至只是一列不连续整数，特别可取。

可使用目标谱强度总值∑i(M_Target)和单个离子种类M/z的强度值i(M/z)来选择要进行破碎分片的离子种类M/z，例如按强度∑i(M_Target)和i(M/z)的降序选择。

要生成整齐的碎片离子质谱，最好检查所选离子种类是否与其他强度更大的离子种类重叠，然后再将其用于破碎分片。如果存在重叠，则应选择不同的离子种类M/z。

可通过假设生物聚合物平均包括H、C、N、O、S和P等成分，与统计平均相符，来计算所选离子种类的同位素分布宽度Δ_i(M/z)。研究发现，质荷比为M/z的离子种类所在位置的同位素分布越窄，蛋白质的质量m越大。计算出的宽度Δ_i(M/z)可用于设置质量过滤器来分离所选离子种类，以及在迭代法中删除质量为m的生物聚合物的所有M/z组成部分。

Claims (10)

1.混合物中生物聚合物分析方法，混合物电离产生各生物聚合物的多个离子种类，质荷比M/z各不相同，借助离子混合物的所选离子种类M/z的碎片离子质谱，其中，只选择一个离子种类M/z进行破碎分片来鉴定生物聚合物，具体选择时借助通过预选质量范围M_min＜M＜M_max计算出的目标谱，目标谱的构成方法是，在通过将测得谱中存在的所有离子种类的质荷比M/z分别乘以预选范围内所有整数n，然后减去电荷载体的质量n×p(只要所得质M_n＝(M/z)×n-n×p处于目标谱预选质量范围内)，各种情况下在M_n位置对相关离子种类(M/z)的强度i(M/z)求和。

2.权利要求1对应方法，对测得谱进行背景噪音削减和平滑处理，并从测量参数尺度转换为质量尺度，然后再编制目标谱。

3.权利要求1或2对应方法，将目标谱细分为带隙，对带隙内强度i(M/z)求和得出质量M_n＝(M/z)×n-n×p。

4.权利要求3对应方法，对于每个带隙，在目标谱附表中记录所有相关离子种类的质荷比M/z和强度i(M/z)。

5.权利要求3对应方法，对于每个带隙，在目标谱附表中记录强度最高的离子种类的质荷比M/z和强度i(M/z)。

6.权利要求1至5对应方法，并不使用测得谱的所有离子种类，而只使用质量范围(M/z)_min＜M/z＜(M/z)_max的离子种类M/z。

7.权利要求1至6对应方法，按目标谱强度总值∑i(M_Target)和各离子种类M/z的强度值i(M/z)选择离子种类进行破碎分片。

8.权利要求1至7对应方法，检查所选离子种类是否与其他离子种类重叠，并且如果存在重叠，则选择不同的离子种类M/z进行破碎分片。

9.权利要求1至8对应方法，在选择生物聚合物的第一个离子种类M/z后，从测得谱中删除此生物聚合物的所有离子种类，再以缩减后的测得谱构成新的目标谱，来选择第二个离子种类，该过程以迭代方式反复进行，在迭代法的每一步都选择新的离子种类，直到找到预先确定的生物聚合物数目，或处理完测得谱所有离子信号为止。

10.权利要求9对应方法，使用同位素分布的宽度Δ₁(M/z)来删除离子种类，同位素分布的宽度通过所分析的生物聚合物的平均元素组成计算得出。