CN104774826A - 一种组蛋白脱乙酰化酶及其编码基因和应用 - Google Patents
一种组蛋白脱乙酰化酶及其编码基因和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104774826A CN104774826A CN201510124763.1A CN201510124763A CN104774826A CN 104774826 A CN104774826 A CN 104774826A CN 201510124763 A CN201510124763 A CN 201510124763A CN 104774826 A CN104774826 A CN 104774826A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- oshda704
- histone deacetylase
- rice
- gene
- plants
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000353 Histone deacetylase Proteins 0.000 title claims abstract description 42
- 102000003964 Histone deacetylase Human genes 0.000 title claims abstract description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title abstract description 21
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 61
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims abstract description 41
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims abstract description 39
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 26
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims abstract description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 21
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 12
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims description 11
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 7
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 4
- 230000015784 hyperosmotic salinity response Effects 0.000 claims description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 2
- 241000209094 Oryza Species 0.000 abstract description 38
- 230000035882 stress Effects 0.000 abstract description 19
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 abstract description 13
- 230000008641 drought stress Effects 0.000 abstract description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 8
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 7
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 7
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 4
- 101100123574 Arabidopsis thaliana HDA19 gene Proteins 0.000 abstract description 3
- 101150083200 HDA1 gene Proteins 0.000 abstract description 3
- 101001035011 Homo sapiens Histone deacetylase 2 Proteins 0.000 abstract description 3
- 101000899282 Homo sapiens Histone deacetylase 3 Proteins 0.000 abstract description 3
- 101001032118 Homo sapiens Histone deacetylase 8 Proteins 0.000 abstract description 3
- 101100297422 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) phd1 gene Proteins 0.000 abstract description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 abstract description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 abstract description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 abstract description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract 1
- 102100021455 Histone deacetylase 3 Human genes 0.000 abstract 1
- 230000006197 histone deacetylation Effects 0.000 abstract 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 14
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 13
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 4
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000007226 seed germination Effects 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 102100039999 Histone deacetylase 2 Human genes 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 239000007218 ym medium Substances 0.000 description 3
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 2
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 2
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 2
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 239000006661 aam medium Substances 0.000 description 2
- OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N acetosyringone Chemical compound COC1=CC(C(C)=O)=CC(OC)=C1O OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 2
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 2
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 108010023981 Histone Deacetylase 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 101000654471 Mus musculus NAD-dependent protein deacetylase sirtuin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 239000012881 co-culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 229960002064 kanamycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 239000012882 rooting medium Substances 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000012879 subculture medium Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
- C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
- C12Y203/01048—Histone acetyltransferase (2.3.1.48)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明公开了一种组蛋白脱乙酰化酶及其编码基因和应用，属于基因工程技术领域。本发明从水稻(Oryza Sativa L.)中克隆得到了组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA704，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示第93位到1964位碱基；编码组蛋白脱乙酰化酶OsHDA704，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该基因属于水稻组蛋白脱乙酰化酶家族RPD3/HDA1亚家族，其作为正调控因子参与了水稻对高盐和干旱胁迫的应答过程。通过转基因及功能鉴定证实超量表达OsHDA704能提高水稻对高盐和干旱的抗性，OsHDA704基因在培育抗逆植物尤其是水稻新品种方面具有非常重要的理论及应用价值。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种组蛋白脱乙酰化酶及其编码基因和应用。
背景技术
植物在生长发育过程中常常会受到干旱、高盐、极端温度等多种不利环境条件的影响，这些不利因素在很大程度上限制着农作物的产量和分布，成了许多地区农业发展的障碍。尽快培育出抗逆的作物品种并应用于生产已经成为农业科学技术研究攻关的重要方向。
基因工程技术通过改变一个或几个基因的活性来提高植物的抗逆性，它是在基因水平上进行的，具有精确性和稳定性，提高了育种的效率，极大地加快了育种进度。随着分子生物学与基因工程技术的日趋成熟和迅猛发展，通过基因工程手段改良作物的抗性已经受到越来越广泛的关注和重视。
水稻是我国的主要粮食作物之一，提高水稻的抗逆性对保障我国粮食产量稳定具有重要意义。干旱和高盐是水稻种植中最为常见的逆境，培育抗逆水稻一直是水稻品种改良的主要目标之一。利用基因工程这一分子育种技术，将抗逆基因转入当前广泛应用的优良水稻品种中，从而提高其抗逆性，是水稻抗逆育种的有效途径之一。
在真核生物细胞核中，基因组DNA由组蛋白以及其它一些蛋白共同组成了核蛋白复合物，也就是常说的染色质。染色质的结构是高度动态的，并且能够被与其相关的一些蛋白所调控。目前已知水稻中含有18个组蛋白脱乙酰化酶成员，可分为3大亚家族：RPD3/HDA1亚家族14个成员、SIR2亚家族2个成员和HD2亚家族2个成员(Fu,et al.2007)。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种可用于提高植物耐盐和抗旱的组蛋白脱乙酰化酶OsHDA704及其编码基因OsHDA704。
所述的组蛋白脱乙酰化酶OsHDA704，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述的编码上述组蛋白脱乙酰化酶OsHDA704的组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA704，其特征在于，其序列如SEQ ID NO.1的第93位到1964位碱基所示。
本发明的第二个目的是提供一种含有所述的组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA704的重组表达载体。
所述的表达载体为任意一种可用于农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹攻击的载体，如pCAMBIA系列载体、pBI系列载体、pBin系列载体或GatewayTM系列载体。
本发明的第三个目的是提供组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA704在增强植物耐盐和抗旱中的应用。
所述的应用优选为在培育耐盐和抗旱植物品种中的应用。
优选，所述的应用是将所述的组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA704导入植物细胞、组织或器官，再将被转化的植物细胞、组织或器官培育成植株，使所述的组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA704在植物中表达，得到耐盐和抗旱的转基因植物。进一步优选，所述组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA704是通过植物表达载体导入植物细胞、组织或器官的。
所述的植物为水稻。
本发明克隆得到的属于水稻组蛋白脱乙酰化酶家族RPD3/HDA1亚家族的OsHDA704基因，其作为正调控因子参与了水稻对高盐和干旱胁迫的应答过程，通过转基因及功能鉴定证实超量表达OsHDA704基因能提高水稻对高盐和干旱的抗性，OsHDA704基因在培育抗逆植物尤其是水稻新品种方面具有非常重要的理论及应用价值。
附图说明
图1是50μM ABA、300mM NaCl和20％PEG处理0h、1h、3h和6h后OsHDA704基因的表达模式。
图2是pCUbiO l301植物双元表达载体图。
图3是用OsHDA704的全长开放阅读框引物对OsHDA704超表达转基因植株基因组DNAPCR的电泳图。
图4是野生型植株WT和超表达转基因株系OX1、OX4、OX6、OX14和OX26中OsHDA704的表达水平检测，HDA704OX1、HDA704OX4、HDA704OX6、HDA704OX14和HDA704OX26分别代表超表达转基因株系OX1、OX4、OX6、OX14和OX26。
图5是野生型种子WT和OsHDA704超表达种子在MS培养基上(control)、添加有终浓度为5μM ABA、150mM NaCl和15％PEG的MS培养基上的种子萌发趋势。
图6是苗龄两周野生型植株WT和OsHDA704超表达OX14和OX26植株在标准营养液(control)、含150mM NaCl和20％PEG营养液处理下的表型。
图7是苗龄两周野生型植株WT和OsHDA704超表达OX14和OX26植株在含150mMNaCl和20％PEG营养液处理3天恢复7天的存活率统计，其中HDA704OX14和HDA704OX26分别代表超表达转基因株系OX14和OX26。
图8是苗龄两周野生型植株WT和OsHDA704超表达OX1和OX14植株，离体叶片的相对失水率测定，其中HDA704OX14和HDA704OX26分别代表超表达转基因株系OX14和OX26。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
下列实例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行。如J.萨姆布鲁克等《分子克隆实验指南》、F.奥斯伯等《精编分子生物学实验指南》中所述条件，或按照所用产品生产厂商的使用说明。
实施例中所用水稻中花11(Oryza Sativa L.)种子购于广东省农科院；TriZol Reagent购自Invitrogen公司，其货号为：15596026；逆转录酶M-MLV购自Promega公司，其货号为：M1701；pGEM T载体购自Promega公司，其货号为：A1360；标准营养液为国际水稻所标准营养液；LB、YM、AAM培养基为本领域常用培养基，其配方参考J.萨姆布鲁克等《分子克隆实验指南》。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。
实施例1：OsHDA704基因的克隆
取水稻中花11的幼苗叶片部位，用TriZol Reagent提取叶片总RNA，采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测总RNA的纯度及量，取1μg的总RNA做起始逆转录反应，所采用的逆转录酶为M-MLV，逆转录反应的步骤参考该逆转录酶的使用说明。以逆转录产物为模板，采用引物：F：GATCGCCCTCCAGATTGCGT，R：ACATCAGGATCATTCGACAG进行常规PCR扩增，PCR反应条件为：94℃ 4min；94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 90sec，30个循环；72℃10min。采用琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，连接于pGEM T载体上，连接反应：PCR产物7μl，pGEM T载体1μl，3U T4ligase 1μl，10×buffer 1μl，共10μl体积，16℃连接3h。取5μl连接产物，转到大肠杆菌DH5α中，加800ml LB，复苏1h，涂于含100mg/L氨苄抗生素(Amp)的LB平板上(已经涂布X-gal/IPTG)，37℃过夜。挑取白色克隆，在LB+Amp(100mg/L)液体培养基中扩增培养，送交测序。其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，开放阅读框从第93位到1964位碱基，长1872bp，将此开放阅读框命名为组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA704，其编码623个氨基酸，其序列如SEQ ID NO.2所示，将该蛋白命名为组蛋白脱乙酰化酶OsHDA704。
实施例2：组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA704在逆境胁迫下的表达模式分析
1.胁迫处理：将水稻中花11种子浸泡催芽后，在发芽盒内用标准营养液水培生长，在25℃，16h光照/8h黑暗光周期条件下的光照培养室中培养两周，光照强度为10000lux。进行如下的胁迫处理：外源ABA胁迫：50μM ABA处理0h，1h，3h和6h；高盐胁迫：300mM NaCl处理0h，1h，3h和6h；模拟干旱处理：20％PEG处理0h，1h，3h和6h。将处理的植株用液氮速冻后于-80℃低温保存。
2.RNA提取：用Trizol reagent进行试验材料的总RNA提取，整个操作过程严格按照Trizol reagent的RNA提取流程说明进行。
3.逆转录：采用M-MLV逆转录酶逆转录mRNA成cDNA第一链，方法按照试剂说明书进行。
4.实时定量RT-PCR：根据组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA704的核苷酸序列，设计以下引物对：qHDA704-F：TTGCTCCAGACATCACCATC；qHDA704-R：GACGCCATCCTAGAATATCCAG。将所得cDNA稀释5倍后作为模板，进行实时定量RT-PCR反应。反应体系及程序参照Premix Ex TaqTM II(TaKaRa)说明书，在ABI7500 Real-time PCR仪上进行反应。每个反应设置3个重复，所得数据使用ABI 7500 Real-time PCR system软件进行处理。
5.结果分析：水稻中花11植株中的组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA704的表达量，在50μM ABA处理后在1h先下降后逐渐上升；300mM NaCl处理后在1h有稍微的下降，3h和6h后明显的上升；20％PEG处理后成明显上升的趋势；结果如图1所示。结果表明水稻中组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA704受盐和干旱的诱导后表达量明显上升，参与水稻抗盐、抗旱胁迫应答调节过程。
实施例3：转组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA704水稻的获得和鉴定
1.目的基因组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA704的超表达载体的构建
根据组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA704全长设计引物，以水稻中花11的cDNA为模板，高保真扩增获得组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA704全长，同时在两条引物的5’端加上BamHI酶切位点，扩增引物为HDA704OX-F：CGGGATCCATGGCGTCTGATATGAGGTC(下划线部分为BamH I酶切位点)；HDA704OX-R：CGGGATCCTTAGGGCCCTGCTTCATCAT(下划线部分为BamH I酶切位点)。扩增产物经BamH I酶切纯化后，回收目的DNA片段(1888bp)；用BamH I酶切表达载体pCUbiO1301(含有Ubiquitinl启动子)，T4连接酶连接，得到目的质粒，然后鉴定插入正反向后，将正向插入的阳性克隆质粒进行PCR和测序验证。pCUbiO1301载体为图2所示，它是在pCAMBIA 1301载体的基础上接了一个玉米泛素启动子(组成型高表达启动子，Ubi promoter)，将组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA704(如SEQ IDNO.1的第93位到1964位碱基所示)接在此启动子后面，构建成组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA704超表达载体，将此重组载体命名为pCUbiOl301-OsHDA704。
2.重组质粒pCUbiO l301-OsHDA704转化到农杆菌EHA105
取1μl重组质粒表达载体pCUbiOl301-OsHDA704与农杆菌EHA105感受态细胞混匀，冰上放置30min。然后液氮速冻1min后，迅速转到37℃放置5min。加800μl无抗生素的YM培养基，在28℃中，100RPM转速中培养2-4h。将培养物涂到25mL YM平板,YM培养基中含卡那霉素和硫酸链霉素，浓度都为50mg/L。将平板倒置放在28℃的培养箱中培养，直至菌落长出(约2天)。挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，菌落鉴定的PCR引物为HDA704OX-F和HDA704OX-R。选取转入了超表达载体pCUbiO l301-OsHDA704的农杆菌EHA105克隆作为阳性克隆。
3.农杆菌介导的水稻遗传转化
(1)水稻成熟胚的诱导
水稻成熟种子去壳后，用70％乙醇浸泡1min，0.1％升汞浸泡15min，再用无菌水清洗4次，种子放在无菌滤纸上晾干后，接种在诱导培养基上，26℃暗培养。约10-15天后，切去胚根和胚乳，转接到继代培养基上，26℃暗培养。两周后继代培养一次，挑选适合大小、紧密和色泽淡黄的愈伤组织预培养3天。
(2)EHA105农杆菌的培养
将含有超表达载体pCUbiO l301-OsHDA704的农杆菌EHA105在含有50mg/L Kan和50mg/L Str的YM平板上划线，28℃黑暗培养3天，挑取单克隆于加有同样抗生素的5ml液体YM中培养12～24h，然后以1：30的比例于同样的液体YM(30ml)中进行扩大培养4～5h，5500rpm离心10min后收集菌液，用液体AAM培养基(内含乙酰丁香酮(As)，浓度为100微摩尔每升)重新悬浮(OD600约为0.5)，置于28℃摇床轻微振荡培养15-30min，该农杆菌悬浮液即可用于转化水稻愈伤。
(3)水稻愈伤组织与农杆菌的共培养
挑选状态较好(预培养3天、色泽淡黄)的颗粒状愈伤组织放入50ml无菌三角瓶中，加入准备好的农杆菌悬浮液，静置培养20min，每隔5min轻轻摇一下三角瓶。倒掉菌液，将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余菌液，随即转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上，22℃黑暗培养3天。
(4)抗性愈伤组织的筛选
将共培养3天后的愈伤组织放在含有500mg/L的头孢霉素(Cef)的灭菌水中清洗，每次4-5min，共4-5次。然后将愈伤组织置于灭菌过的滤纸上吸干水分。将干燥后的愈伤组织放在含有50mg/L潮霉素(Hyg)和500mg/L的头孢霉素(Cef)的筛选培养基上，26℃暗培养2周，转到新配制的筛选培养基上继续筛选2周(大部分愈伤组织在筛选后10天左右褐化，然后在褐化组织的边缘重新生长出乳白色的抗性愈伤组织)。
(5)抗性愈伤组织的分化
从经两轮筛选后长出的抗性愈伤组织中，挑选一定大小、乳黄色致密的抗性愈伤组织转至含有50mg/L Hyg和500mg/L Cef的预分化培养基上暗培养7天，然后转至分化培养基上在16h光/8h黑暗的光周期条件下培养，温度为26℃，光照强度为10000lux，一般经过6-10天就会有绿点出现，20-30天后进一步分化出小苗。
(6)生根、壮苗和移栽
当抗性愈伤组织分化的芽长至约8厘米左右时，将小苗移到生根培养基上，培养两周左右。选择高约10厘米、根系发达的小苗，洗去培养基，在温室内移栽入土。
(7)GUS染色检测转基因阳性植株
将转化得到的苗进行GUS染色。染色后为蓝色的为转基因阳性植株，反之为阴性植株。
4.转基因植株的分子鉴定
(1)转基因阳性植株的初步分子鉴定：DNA的提取采用CTAB的方法，以转基因植株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增引物为HDA704OX-F和HDA704OX-R，用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。如图3所示：其中M为Marker 2000；2和10为转基因阴性植株；1，3，4，5，6，7，8和9和为阳性植株。结果表明，pCUbiOl301-OsHDA704重组质粒已经插入到水稻基因组中，得到转组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA704水稻。
(2)超表达转基因植株目的基因OsHDA704的表达量鉴定：选取5个转基因阳性植株和野生型植株，取叶片为材料提取RNA，逆转录成cDNA后用引物qHDA704-F和qHDA704-R扩增OsHDA704。结果如图4所示，在转基因阳性植株中组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA704的表达水平都有不同程度的提高，表明组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA704超表达转基因体系成功，转化所得的OsHDA704转基因材料可用于后续的实验。
实施例4：转基因植株抗旱抗盐性鉴定
1.种子萌发期对盐胁迫和干旱胁迫的耐受性
每个处理选取30粒饱满的种子，3个生物学重复。将种子去壳后用75％乙醇浸泡1min后，用0.1％升汞浸泡15min(每5min振荡一次)，后用无菌水清洗3-4次，在无菌的滤纸上晾干后转接到含有相应胁迫处理的培养基上，在规定的时间点统计萌发率。如图5所示，在没有胁迫处理下转基因阳性植株的(组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA704超表达)种子在前60个小时萌发速率比野生型稍快，用5μM ABA、150mM NaCl和15％PEG处理后转基因阳性植株的(组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA704超表达)种子的萌发速率显著地高于野生型。表明，超表达组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA704后，在种子萌发期增强了对盐胁迫和干旱胁迫的耐受性。
2.幼苗对盐胁迫和干旱胁迫的耐受性
组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA704超表达转基因株系幼苗干旱胁迫生长实验结果表明：标准营养液中生长两周的幼苗在含15％PEG6000的营养液中模拟干旱处理3天后，移到水稻营养液中恢复培养7天，组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA704超表达转基因株系的存活率明显比野生型高，如图6所示。两周的幼苗在含150mM NaCl营养液中处理3天后，移到水稻营养液中恢复培养7天，组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA704超表达转基因株系的存活率明显也比野生型高，如图7所示。因此，与野生型植株相比，超表达组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA704基因后能够显著提高水稻抵御高盐和干旱胁迫的能力。
3.幼苗抗旱性测定
用标准营养液水培水稻至两周，取苗的地上部分，每个株系取30棵，设置3个生物学重复。将所取样品在培养室中自然放置，每隔30min称取一次重量，在210min内连续称量7次。拿第一次的重量减去相应时间点称取的重量为这个时间点的失水量。称量完后在105℃的烘箱里放置4h，称重，用失水前的重量减去干重即为植株的含水量。相对失水量为各时间点的失水量除以含水量的百分比。组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA704超表达转基因株系的失水速率明显低于野生型植株，如图8所示，说明转基因植株保水能力较好，抗旱能力比野生型强。
Claims (10)
1.一种组蛋白脱乙酰化酶OsHDA704，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种编码权利要求1所述的组蛋白脱乙酰化酶OsHDA704的组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA704，其特征在于，其序列如SEQ ID NO.1的第93位到1964位碱基所示。
3.一种重组表达载体，其特征在于，含有权利要求2所述的组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA704。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述的表达载体为任意一种可用于农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹攻击的载体。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述的表达载体为pCAMBIA系列载体、pBI系列载体、pBin系列载体或GatewayTM系列载体。
6.权利要求2所述的组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA704在增强植物耐盐和抗旱中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的应用为在培育耐盐和抗旱植物品种中的应用。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的应用是将所述的组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA704导入植物细胞、组织或器官，再将被转化的植物细胞、组织或器官培育成植株，使组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA704在植物中表达，得到耐盐和抗旱的转基因植物。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA704是通过植物表达载体导入植物细胞、组织或器官的。
10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的植物为水稻。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510124763.1A CN104774826B (zh) | 2015-03-20 | 2015-03-20 | 一种组蛋白脱乙酰化酶及其编码基因和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510124763.1A CN104774826B (zh) | 2015-03-20 | 2015-03-20 | 一种组蛋白脱乙酰化酶及其编码基因和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104774826A true CN104774826A (zh) | 2015-07-15 |
| CN104774826B CN104774826B (zh) | 2017-12-12 |
Family
ID=53616597
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510124763.1A Expired - Fee Related CN104774826B (zh) | 2015-03-20 | 2015-03-20 | 一种组蛋白脱乙酰化酶及其编码基因和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104774826B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105087615A (zh) * | 2015-09-28 | 2015-11-25 | 中国科学院华南植物园 | 拟南芥组蛋白脱乙酰化酶基因hda15在调控植物种子萌发中的应用 |
| CN113698282A (zh) * | 2021-09-22 | 2021-11-26 | 中国科学院华南植物园 | 一种提高甘草中查尔酮a含量的方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004022735A1 (en) * | 2002-09-05 | 2004-03-18 | Greengene Biotech Inc. | Method for producing a plant with a high-growth rate |
| CN102363782A (zh) * | 2011-10-25 | 2012-02-29 | 中国科学院华南植物园 | 一种水稻组蛋白脱乙酰化酶基因hdt701启动子及其应用 |
-
2015
- 2015-03-20 CN CN201510124763.1A patent/CN104774826B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004022735A1 (en) * | 2002-09-05 | 2004-03-18 | Greengene Biotech Inc. | Method for producing a plant with a high-growth rate |
| CN102363782A (zh) * | 2011-10-25 | 2012-02-29 | 中国科学院华南植物园 | 一种水稻组蛋白脱乙酰化酶基因hdt701启动子及其应用 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| J.H.ZHAO，ET AL.: "OsHDA704 regulates drought and salt tolerance in rice via stomatal aperture control", 《万方数据》 * |
| KIKUCHI,S.，ET AL.: "ACCESSION：AK111557，Oryza sativa Japonica Group cDNA clone:J013057F02, full insert sequence", 《GENBANK》 * |
| WENQUN FU,ET AL.: "Sequence and expression analysis of histone deacetylases in rice", 《BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS》 * |
| YONGFENG HUA，ET AL.: "Rice histone deacetylase genes display specific expression patterns and developmental functions", 《BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS》 * |
| 段俊 等: "水稻组蛋白脱乙酰化酶基因的功能初探", 《全国植物分子育种研讨会摘要集》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105087615A (zh) * | 2015-09-28 | 2015-11-25 | 中国科学院华南植物园 | 拟南芥组蛋白脱乙酰化酶基因hda15在调控植物种子萌发中的应用 |
| CN105087615B (zh) * | 2015-09-28 | 2018-09-28 | 中国科学院华南植物园 | 拟南芥组蛋白脱乙酰化酶基因hda15在调控植物种子萌发中的应用 |
| CN113698282A (zh) * | 2021-09-22 | 2021-11-26 | 中国科学院华南植物园 | 一种提高甘草中查尔酮a含量的方法 |
| CN113698282B (zh) * | 2021-09-22 | 2022-05-13 | 中国科学院华南植物园 | 一种提高甘草中查尔酮a含量的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104774826B (zh) | 2017-12-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107118264B (zh) | 一种水稻孕穗期耐冷性相关蛋白CTB4a及编码基因与应用 | |
| CN101736014A (zh) | 水稻生长素运输蛋白基因OsPIN2的基因工程应用 | |
| WO2020221029A1 (zh) | 玉米类受体激酶基因ZmRLK7及其应用 | |
| CN115724931A (zh) | 水稻基因OsBRR1在调控水稻株型及粒型中的应用 | |
| CN102676541B (zh) | 大豆圣豆9号NAC转录因子基因GmST2及其应用 | |
| CN106929498B (zh) | 组蛋白脱乙酰化酶OsHDT701或其编码基因在调控植物种子发育中的应用 | |
| Juan et al. | Agrobacterium-mediated transformation of tomato with the ICE1 transcription factor gene | |
| CN106397556B (zh) | 植物抗旱相关蛋白ZmNAC111及其编码基因与应用 | |
| CN110684088B (zh) | 蛋白ZmbZIPa3及其编码基因在调控植物生长发育与耐逆性中的应用 | |
| CN105524933A (zh) | OsJMJ714影响水稻籽粒大小以及盐胁迫耐性的功能及其应用 | |
| CN104774826B (zh) | 一种组蛋白脱乙酰化酶及其编码基因和应用 | |
| CN120310846A (zh) | OsRBP22基因在调控水稻耐盐性方面的应用 | |
| CN106749577B (zh) | 耐逆性相关转录因子蛋白nac及其应用 | |
| CN104628840B (zh) | 植物耐逆性相关蛋白VrDREB2A及其编码基因与应用 | |
| CN117844846A (zh) | OsGLD1基因或其编码蛋白质在调控水稻籽粒大小、休眠、分蘖及耐盐中的应用 | |
| CN104805065B (zh) | 一种水稻组蛋白脱乙酰化酶及其编码基因和应用 | |
| CN117143212A (zh) | 一种转录因子AmbHLH148及其在抗旱中的应用 | |
| CN104087600A (zh) | 小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因TaMsrA4.1及其应用 | |
| CN116535476A (zh) | 茎瘤芥BjuDA1R356K基因及其编码的蛋白与应用 | |
| CN110499326B (zh) | Rgga在调控作物农艺性状中的应用 | |
| Jin et al. | Ectopic expression of AtSOC1 gene driven by the inducible promoter rd29A, causes early flowering in Chrysanthemum | |
| CN112553224A (zh) | 组蛋白去乙酰化酶基因OsHDT701在延长植物种子寿命中的应用 | |
| CN120485266B (zh) | OsT5H基因在增强水稻苗期低温胁迫抗性中的应用 | |
| CN104878026B (zh) | Lrk2基因在提高水稻抵御干旱能力中的应用 | |
| CN116103311B (zh) | OsPIU1基因及其编码蛋白质在调控水稻籽粒大小、叶夹角和耐盐性中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20171212 Termination date: 20190320 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |