CN104730164A - 一种美洲大蠊抗肿瘤活性提取物cⅱ-3的分子量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了美洲大蠊抗肿瘤活性提取物CⅡ-3的分子量检测方法。采用高效空间排阻色谱法(HPSEC)对样品的分子量及其分布进行测定，以Superdex Peptide 10/300GL或TSK G2000PWXL为色谱柱；以水(含0.1%TFA)-乙腈(0-50:100-50V/V)、磷酸盐缓冲液(pH=5~8)、Tris-HCl缓冲液(pH=7~9)中的一种为流动相，流速0.5~0.7ml/min；检测波长为200nm~400nm；进样量为5-50μl；柱温为20℃~30℃。根据标准物质的线性回归方程可计算样品的分子量。本发明为研发以美洲大蠊为原料药材的新型抗肿瘤药物的安全性提供参考。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗肿瘤有效成分的分子量检测方法，特别涉及一种具有抗肿瘤作用的美洲大蠊活性部位提取物的质量控制方法。
背景技术
美洲大蠊(Periplaneta americana )属昆虫纲，蜚蠊目，蜚蠊科，大蠊属，俗称蟑螂。其入药史记载早见于《神农本草经》，其谓“味咸寒，治血痰症坚，寒热，破积聚，喉咽痹，内寒无子”。《本草纲目》中亦有记载，蜚蠊又名茶婆虫、香娘子，为本经中品，其主治“瘀血，症坚，寒热，下气，利血脉”，常用于治疗小儿疳积、疔疮、喉蛾，无名肿毒、膨胀、梅毒以及毒蛇、蜈蚣咬伤等疾病。
长期的科研探索发现，美洲大蠊具有广泛的药用价值和开发前景。大量研究证实了美洲大蠊具有抗肿瘤、抗病毒、促进组织修复、保肝、抗炎、镇痛等作用。目前，以美洲大蠊为原料药材开发研制的药物有“康复新液”、“心脉隆注射液”、“肝龙胶囊”等，因其疗效显著、副作用小等优点而广泛应用于临床。研究发现，“康复新液”不仅对体表创伤的修复作用显著，还可以治疗口腔溃疡、胃及十二指肠溃疡、溃疡性结肠炎等疾病。“心脉隆注射液”可改善微循环、兴奋呼吸、利尿、增强心肌收缩力、增大体内脏器血液循环。“肝龙胶囊”为昆虫类抗乙肝病毒(HBV)的国家二类中药新药。该药具有疏肝理脾、活血解毒的作用，在慢性乙型肝炎的治疗方面效果显著，具有安全、有效、副作用小、给药方便等特点。
本发明研究的具有抗肿瘤活性的美洲大蠊提取物CⅡ-3由大理学院科研团队经长期不懈的努力精心研制而成，其制备方法为：将新鲜或干燥的美洲大蠊虫体经醇水提取、大孔吸附树脂柱层析、醇溶剂洗脱等工艺制得 (中国专利：CN200810059054)。
大量文献报道了美洲大蠊提取物对肿瘤生长有显著的抑制作用。通过对美洲大蠊提取物CⅡ-3进行体外筛选，证明了该提取物对3株人肺癌细胞的生长均有一定的抑制作用[胡艳芬，吕小满，刘光明，美洲大蠊提取物对3株人肺癌细胞的体外抑制作用，大理学院学报，2009，8(12)：1]。何正春等人将美洲大蠊醇提物通过聚酰胺柱层析分离得到不同部位后，采用MTT法对所得部位进行肿瘤细胞毒性测试，发现高活性部位的IC50值接近阳性药的三分之一，证明美洲大蠊醇提物中存在抑制肿瘤细胞生长的物质[何正春，王晓雨，杨雷香，美洲大蠊提取物对3株人体生殖系统肿瘤细胞的细胞毒性研究，西北药学杂志，2009，24(4)：271]。文献报道美洲大蠊提取物高剂量CⅡ-3可抑制H22荷瘤小鼠肿瘤的生长，且能降低小鼠血清中血管生长因子(VEGF)的含量，机制可能为减少VEGF的表达，进而发挥抑制肿瘤生长的作用[陈俊雅，耿玲，张旭强，美洲大蠊提取物CⅡ-3对H22肝癌小鼠血管生成作用的研究，肿瘤学杂志，2012，8(4)：274]。
在中药现代化发展迅猛的时代，药物的质量问题应倍受重视。关于美洲大蠊药材、提取物及其药物制剂的质量控制方法已有许多文献报道。本发明建立了美洲大蠊抗肿瘤活性提取物CⅡ-3的分子量检测方法，为开发研制以美洲大蠊为原料药材的新型抗肿瘤药物的质量控制提供参考。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于研究美洲大蠊抗肿瘤活性提取物CⅡ-3的分子量及其分布，设计该活性提取物的质量控制方法。
有关美洲大蠊抗肿瘤活性提取物CⅡ-3的分子量检测方法尚未见文献报道，本发明通过研究，选用不同的分离柱进行分析，尝试了多种洗脱体系与色谱条件，最终建立了美洲大蠊抗肿瘤活性提取物CⅡ-3的分子量检测方法。
本发明采用HPSEC法，该方法包括以下步骤：
(1)色谱条件与系统：以Superdex Peptide 10/300GL或TSK G2000PWXL为色谱柱；以水(含0.1%TFA) -乙腈(0-50:100-50V/V)、磷酸盐缓冲液(pH=5~8)、Tris-HCl缓冲液(pH=7~9)中的一种为流动相，流速0.5~0.7ml/min；检测波长为200nm~400nm；进样量为5-50μl；柱温为20℃~30℃。
(2)标准物质溶液的配制：称取细胞色素C、VB12、氧化型谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽、肌苷及酪氨酸适量，加水制成每1ml中各含0.1mg~2mg的溶液，分别过0.22μm滤膜，作为标准物质溶液。
(3)标准曲线的绘制：分别吸取上述标准物质溶液进行色谱分析，以标准物质出峰的保留时间Rt (min)为横坐标，其分子量的对数Log（Mr）为纵坐标，绘制标准曲线方程。
(4)供试品溶液的制备：称取美洲大蠊抗肿瘤活性提取物CⅡ-3干粉20mg于10ml量瓶中，加水，摇匀，定容至刻度。用0.22μm滤膜过滤，即得。
(5)测定方法：吸取上述供试品溶液进行色谱分析，将样品出峰的保留时间代入标准曲线方程，可求得各峰的相对分子质量，通过面积归一化法可计算出不同分子量范围的相对百分比。
本发明所述的活性提取物CⅡ-3的分子量检测方法，优选如下检测方法：
(1)色谱条件与系统：以Superdex Peptide 10/300GL为色谱柱；以乙腈: 水(含0.1%TFA)=25:75为流动相，流速0.5ml/min；检测波长为214nm；进样量为20μL；柱温为25℃。
(2)标准物质溶液的配制：称取细胞色素C、氧化型谷胱甘肽、肌苷及酪氨酸适量，加水制成每1ml中各含1mg、2mg、1mg、0.5mg的单标溶液，吸取上述溶液各300μL，混匀，过0.22μm滤膜，作为混合标准物质溶液。
(3)标准曲线的绘制：吸取上述混合标准物质溶液20μL进行色谱分析，以标准物质出峰的保留时间Rt (min)为横坐标，其分子量的对数Log（Mr）为纵坐标，绘制曲线方程。
(4)供试品溶液的制备：称取美洲大蠊抗肿瘤活性提取物CⅡ-3干粉20mg于10ml量瓶中，加水，摇匀，定容至刻度。用0.22μm滤膜过滤，即得。
(5)测定方法：吸取上述供试品溶液20μL进行色谱分析，将样品出峰的保留时间代入标准曲线方程，可求得各峰的相对分子质量，通过面积归一化法可计算出不同分子量范围的相对百分比。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明。
美洲大蠊抗肿瘤活性提取物CⅡ-3批号：20140608、20140828、20140829、20140830、20140905、20140906、20140907、20141008、20141009、20141010。
以上提取物均为实验室自制，供下列实施例使用。
（1）检测波长的选择
本实验在214nm、254nm、265nm、280nm波长处观察样品出峰情况，结果显示，仅有214nm处色谱图图形丰富，紫外吸收值明显。且肽键在214nm处有特征吸收峰，故选择214nm为检测波长。
（2）流动相的选择
方法一、磷酸缓冲盐体系
体系a：0.05mol·L-1的磷酸盐缓冲液（含有0.1mol·L-1NaCl ，pH=5.8）
体系b：0.05mol·L-1的磷酸盐缓冲液（含有0.1mol·L-1NaCl ，pH=7.0）
体系c：0.05mol·L-1的磷酸盐缓冲液（含有0.1mol·L-1NaCl ，pH=7.8）
方法二、Tris-HCl缓冲盐体系
体系a：0.05mol·L-1Tris-HCl(含有0.3 mol·L-1NaCl，pH=7.5)
体系b：0.05mol·L-1Tris-HCl(含有0.3 mol·L-1NaCl，pH=8.6)
方法三、有机相体系，采用等度洗脱方式
流动相为乙腈:水(含0.1%TFA)=25:75,流速为0.5ml/min
三种洗脱方法中，磷酸盐缓冲体系与Tris-HCl缓冲盐体系洗脱样品时，样品出峰峰形杂乱，且分离度差，而选择有机相体系进行等度洗脱时，样品分离较好，峰形清晰。因此选用方法三作为色谱条件。
（3）线性与范围
a)标准物质溶液的配制：称取细胞色素C、VB12、氧化型谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽、肌苷及酪氨酸适量，加水制成每1ml中各含1mg、0.1mg、2mg、2mg、1mg、0.5mg的单标溶液，分别过0.22μm滤膜，作为标准物质溶液。
b)标准曲线的绘制：分别吸取上述标准物质溶液，按已知条件进样，进样量10μL，记录色谱图。结果见下表。
表1 标准物质检测结果
由表可知，VB12、还原型谷胱甘肽的保留时间影响线性关系，因此选用细胞色素C、氧化型谷胱甘肽、肌苷及酪氨酸作为标准物质。
吸取上述已确定的4种标准物质溶液各300μL，混匀，过0.22μm滤膜，作为混合标准物质溶液。将该混标液按已知条件进样，进样量20μL，记录色谱图。以标准物质出峰的保留时间Rt (min)为横坐标，其分子量的对数Log（Mr）为纵坐标绘制标准曲线。求得线性回归方程为y=-0.0755x+5.3429，r=0.9997。结果表明，在16.476min~40.512 min范围内，Rt(min)与logMr线性关系良好。
（4）样品分子量测定及分布
a)供试品溶液的制备：称取美洲大蠊抗肿瘤活性提取物CⅡ-3干粉20mg于10ml量瓶中，加水，摇匀，定容至刻度。用0.22μm滤膜过滤，即得。
b)测定方法：吸取上述供试品溶液20μL进行分析，记录色谱图。将保留时间代入标准曲线方程，可求得各峰的相对分子质量，通过面积归一化法可计算出不同分子量范围的相对百分比。
结果表明，样品主要组分的保留时间位于16~50min之间，样品出峰的起始位置有小部分区域分子量接近细胞色素C的分子量（Mr=12355）。
分子量处于612.6Da~12355Da范围（保留时间位于16.476min~34.178min）的组分，通过面积归一化法计算可知，其峰面积的百分比为62.17%。分子量处于268Da~612.6Da范围（保留时间位于34.178~38.723min）的组分，峰面积占22.24%。分子量处于181Da~268Da范围（保留时间位于38.723~40.512min）的组分，峰面积占12.02%。迟于40.512min出峰的组分，其峰面积百分比为3.58%。
对于214nm波长处，吸收最高的峰尖位置所对应的分子量分别为1162Da、519 Da、254 Da、53Da（保留时间分别为30.167min、34.803 min、38.912 min、47.856 min）。
（5）仪器精密度
吸取浓度为1mg/ml的细胞色素C标准液，连续进样6次，进样量10μL，记录6次出峰的保留时间，并计算其RSD%。结果表明，仪器精密度良好，结果见表2。
表2 仪器精密度结果
| 序号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD(%) |
| 保留时间(min) | 16.454 | 16.483 | 16.470 | 16.677 | 16.468 | 16.473 | 0.52 |
（6）重复性试验考察
取20140828批次美洲大蠊抗肿瘤活性提取物CⅡ-3，按已知方法和色谱条件连续测定6次。记录色谱图。以峰1的Rt (min)考察该方法重复性。结果表明，重复性良好，见表3。
表3重复性试验结果
| 序号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD(%) |
| 保留时间(min) | 30.167 | 30.455 | 30.696 | 30.124 | 30.155 | 30.242 | 0.74 |
（7）稳定性试验考察
取20140828批次供试品溶液，在0、3、6、12、24、36h进样，记录色谱图。以峰1的Rt (min)考察该方法稳定性。结果表明，供试液在36h内稳定，见表4。
表4 稳定性试验结果
| 时间(h) | 0 | 3 | 6 | 12 | 24 | 36 | RSD(%) |
| 保留时间(min) | 30.244 | 30.363 | 30.283 | 31.014 | 30.476 | 31.213 | 1.3 |
（8）方法的耐用性
a)流速的影响：改变流速为0.6ml/min或0.7ml/min，其余条件不变，按已知方法对样品进行检测，以峰1的Rt (min)考察流速的影响，重复测定3次。见表5。
表5 流速对保留时间的影响
| 峰1(n=3) | 0.5ml/min | 0.6ml/min | 0.7ml/min |
| 1 | 30.167 | 28.242 | 26.355 |
| 2 | 30.455 | 28.621 | 26.784 |
| 3 | 30.696 | 28.377 | 26.201 |
| 平均值 | 30.439 | 28.413 | 26.447 |
| RSD(%) | 0.87 | 0.68 | 1.1 |
结果表明，流速对样品保留时间影响较大，由于本实验使用的凝胶色谱柱对压力有严格的限定，因此选用流速0.5ml/min作为色谱条件。
b)柱温的影响：改变柱温为20℃或30℃，其余条件不变，按已知方法对样品进行检测，以峰1的Rt (min)考察柱温的影响，重复测定3次。结果见表6。
表6 柱温对保留时间的影响
| 峰1(n=3) | 20℃ | 25℃ | 30℃ |
| 1 | 30.242 | 30.167 | 31.121 |
| 2 | 30.879 | 30.455 | 30.764 |
| 3 | 30.646 | 30.696 | 30.989 |
| 平均值 | 30.589 | 30.439 | 30.958 |
| RSD(%) | 1.1 | 0.87 | 0.58 |
结果表明，柱温对样品保留时间几乎无影响。
c)流动相比例调整：改变流动相比例为乙腈:水(含0.1%TFA)=23:77或21:79，其余条件不变，按已知方法对样品进行检测，以峰1的Rt (min)考察流动相比例的调整对样品的影响，重复测定3次。结果见表7。
表7 流动相比例调整对样品的影响
| 峰1(n=3) | 21:79 | 23:77 | 25:75 |
| 1 | 30.643 | 30.447 | 30.167 |
| 2 | 30.971 | 30.685 | 30.455 |
| 3 | 30.467 | 31.242 | 30.696 |
| 平均值 | 30.694 | 30.791 | 30.439 |
| RSD(%) | 0.83 | 1.3 | 0.87 |
结果表明，样品对该流动相体系的耐用性良好。
Claims (2)
1.一种美洲大蠊抗肿瘤活性提取物CⅡ-3的分子量检测方法，其特征在于该方法包括下列步骤：
(1)色谱条件与系统：以Superdex Peptide 10/300GL或TSK G2000PWXL为色谱柱，以水(含0.1%TFA)-乙腈(0-50:100-50V/V)、磷酸盐缓冲液(pH=5~8)、Tris-HCl缓冲液(pH=7~9)中的一种为流动相，流速0.5~0.7ml/min，检测波长为200nm~400nm，进样量为5-50μl，柱温为20℃~30℃；
(2)标准物质溶液的配制：称取细胞色素C、VB12、氧化型谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽、肌苷及酪氨酸适量，加水制成每1ml中各含0.1mg~2mg的溶液，分别过0.22μm滤膜，作为对照品溶液；
(3)标准曲线的绘制：分别吸取上述标准物质溶液进行色谱分析，以标准物质出峰的保留时间Rt(min)为横坐标，其分子量的对数Log（Mr）为纵坐标，绘制标准曲线方程；
(4)供试品溶液的制备：称取美洲大蠊抗肿瘤活性提取物CⅡ-3干粉20mg于10ml量瓶中，加水，摇匀，定容至刻度，用0.22μm滤膜过滤，即得；
(5)测定方法：吸取上述供试品溶液进行色谱分析，将样品出峰的保留时间代入标准曲线方程，可求得各峰的相对分子质量，通过面积归一化法可计算出不同分子量范围的相对百分比。
2.根据权利要求1所述的活性提取物CⅡ-3的分子量检测方法，其特征在于色谱条件与系统以Superdex Peptide 10/300GL为色谱柱，以乙腈:水(含0.1%TFA)=25:75为流动相，流速0.5ml/min，检测波长为214nm，进样量为20μL，柱温为25℃。
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- 2015-03-20 CN CN201510123412.9A patent/CN104730164A/zh active Pending
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