CN1046658A - 使用合成品9-β-L(+)腺苷刺激生长的方法 - Google Patents
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Abstract
叙述了一种通过使用合成的9-β-L(+)腺苷来刺激植物生长的方法。此方法用合成的化合物代替天然物，因为天然物的量极小，并且分离很困难。
Description
本发明涉及用化学方法制成（合成）的9-β-L（+）腺苷来刺激植物生长。本发明具体地涉及使用很少量的化学制成的9-β-L（+）腺苷来达到上述目的。
植物蜡中的一种天然成分蜂花醇（TRIA）是一个C30的伯醇，如Ries等人的美国专利4，150，970号;S.K.Ries的Critical Reviews in Plant Sciences 2∶239-285（1985）;以及S.K.Ries，V.F.Wert，C.C.Sweely和R.H.leavitt的Science 195∶1339-1341（1977）等文章所述，它能增进多种农作物生长，而且有时能提高产量。而且如中国科学院上海植物生理研究所在于1987年11月25-28日在中国镇江举行的关于蜂花醇的国际专题讨论会上发表的论文摘要;Lim，ung-Kyu在Korean J.Ecol.4∶1（1982）的文章和C.Devakumav，S.Baskaran和S.K.Mukerjee在Indian J.Agr.Sci.56∶744-747（1986）的文章所述，它每年在亚洲施用于几百万亩的茶林、蔬菜和农作物来提高产量。
按上面提到的S.K.Ries在Critical Reviews in Plant Sciences（1985）和S.K.Ries和V.F.Wert在J.Plant Growth Regulation 1∶117-127（1982）中所述，在用TRIA作用于玉米和稻子实生苗四十分钟时，可以测量到叶表面积、干重、凯氏法测得的总含氮量、水溶性蛋白质、还原糖和游离氨基酸都有所增加。如A.P.Lesniak和S.K.Ries在Physiol.Plant.68∶20-26（1986）所述，在大麦（Hordeum Vulgare）根的无细胞抽提液中加入2.3nm的TRIA，30分钟内依赖于Ca++和Mg++的腺苷三磷酸酶活性增加40-60%。按J.Jones，V.F.Wert和S.K.Ries在Planta 144∶277-292（1979）中所述，等摩尔浓度的二十八碳醇（OCTA，C28伯醇）和其他长链醇都能抑制TRIA的活性，而且如上面提到的S.K.Ries在Critical Reviews in Plant Sciences（1985）和J.Jones，V.F.Wert和S.K.Ries在Planta（1979）中所述，只要这些长链醇先于TRIA施用，即使这些醇和TRIA分别施于梢部和根部，也有抑制作用。
还有，如Ries等人的美国专利4150970号所述，施加1.0μg/L的蜂花醇（TRIA），在10分钟时增加了干重并改变了稻子（Oryza sativa L.）和玉米（Zea mays L.）实生苗的新陈代谢（也可参见上述的S.K.Ries的Critical Reviewsin plant Sciences（1985））。如前面提到的S.K.Ries的Critical Reviews in Plant Sciences（1985）以及J.Jones，V.F.Wert和S.K.Ries的Planta（1979）等文章所讨论的，在TRIA加入到实生苗某一部位前一分钟在相反的根部或梢部施用OCTA可以抑制稻实生苗的上述响应。
在此处引为参考并构成本文的一部分的Ries申请的美国专利4，741，754叙述了TRIA可以迅速诱导出第二个信使，称作TRIM。TRIM在植株中迅速运动导致了刺激生长（干重增加）和水分吸收。OCTA也可诱导出第二个信使（OCTAM），它抑制TRIA的活性，但是不抑制TRIM的活性。从未用TRIA处理的对照植物中，用提取TRIM的相同方法可以得到一个化合物，它对植物生长没有作用。熔点、红外（IR）光谱，质谱（MS）和核磁共振谱（NMR）产生的结果是：TRIM和脂肪烷基硫酸酯（TAS）看起来是相同的。但是这两个化合物在生物活性方面显著不同。在一段时期，对TRIM给化学法鉴别和活性成分的合成未能成功。
如Ries的美国专利4，741，754所述，在TRIA作用于植物后，只能从植物中分离和提纯出微量的TRIM。从植物生长刺激素要达到商业水平的数量这一观点出发，需要合成法制备其纯物质。
因此，本发明的目的之一是提供一种用合成法制备的9-β-L（+）腺苷来刺激植物生长的方法，该物质的效力至少和天然诱导生成的TRIM一样，并且在某些场合明显地更加有效。本领域专业人员通过下面的说明和附图可以明确本发明的这些目的与其它一些目的。
图1和1A分别是天然得到的9-β-L（+）腺苷（TRIM）和9-β-D（-）腺苷（TAS）的1H核磁共振谱（300MHz，CD3OD）。从合成得到的9-β-L（+）腺苷和TRIM的谱图相似。
图2是天然得到的TRIM的化学离子化质谱图（MS）。天然得到的TAS，合成制备的9-β-D（-）腺苷和合成制备的9-β-L（+）腺苷的质谱图与TRIM的相似。
图3a到3g展示了天然得到的TAS，天然得到的TRIM以及经过和没有经过用腺苷脱氨酶去除9-β-D（-）腺苷而纯化的合成制备的9-β-L（+）腺苷的圆二色性（CD），其中的9-β-D（-）腺苷是有抑制作用的杂质。图3a和3b展示了纯化的9-β-L（+）腺苷谱图，图3C显示了用腺苷脱氨酶纯化后的TRIM的谱图。图3d显示的是用腺苷脱氨酶处理前的TRIM谱图。图3e展示的是用腺苷脱氨酶处理和再纯化后的不纯的9-β-D（-）腺苷的谱图。图3f展示处理和纯化前的结果。图3g显示用腺苷脱氨酶处理前的TAS谱图。
本发明涉及一种刺激植物生长的方法，它包含为了刺激植物生长而对植物施用有效量的合成法制备的9-β-L（+）腺苷。此腺苷可以基本上不含其它抑制植物生长刺激作用的物质，合适的量是每升水溶液中含0.01-100微克，为了可润湿植物表面所用的水溶液可施于植物的根、梢或叶部。
按照在此引为参考的和作为本文一部分的Ries的美国专利4，741，754，TRIM没用化学方法鉴定，并且提取的费用昂贵。本发明鉴定了该活性物质并且提供了其合成方法。如美国专利4，741，754所述，将从13-18天的在梢部用1.0微克/L的TRIA喷撒后的稻秧的根部提取到的微量的水溶性TRIM，施用到植株后24小时，与从未处理的植株得到的相似的提取物比较，稻秧生长增快约50%。OCTA和OCTAM二者都能抑制TRIA的活性，但是对TRIM不起抑制作用。在叶面施用TRIA 1分钟后，从稻根部分离出来TRIM，在用4mm水柱（乳胶管）与剪断的梢部相连的稻根中发现了TRIM。将从TRIA处理过的植株上切下的茎浸在水中，从该水中可以回收到微量的TRIM，但是将未处理过的或经表面活性剂处理过的切下的茎浸在水中，则从该水中找不到TRIM。
在本说明书中，TRIM和TAS指的是天然产物。合成产物照此鉴定。
合成的9-β-L（+）腺苷可以和各种适于农用的，无干扰作用的载体（特别是水、水和表面活性剂及其它有机物或上述的混合物）合并使用。这样的载体对专业人员来说很熟悉，含有例如象粉状粘土，硅酸盐，纤维素等物质。产品可以液体和粉末形式喷在植物上。也可考虑制成缓慢释放的颗粒，它能延长合成的9-β-L（+）腺苷的释放时间。美国专利№4，741，754叙述了各种制剂。
9-β-L（+）腺苷可以用记载在Nucleic Acid Chemis-try J.Wiley & Sons，New York，Article NO.92，Part 1∶527-532（1978）中的Antonin Holy的方法以纯品的形式大量合成。N.J.Cusack，M.E.Hickman和G.V.R.Born的文章Proc.R.Soc.London，Ser.B206（1163）139-144（1979）也叙述了制备这一化合物的方法。用腺苷脱氨酶可以去除9-β-D（-）腺苷，使之成为肌苷。
例1和例2给出了TRIM的分离和纯化方法，其纯化合物鉴定为9-β-L（+）腺苷。虽然9-β-L（+）腺苷一般需要去除杂质来纯化，它作为一个合成的化合物在商业上是可行的。试验表明合成的纯9-β-L（+）腺苷比TRIM更有效力。对照例3显示了合成的9-β-D（-）腺苷和其它的化学药品在稻株上对于TRIM或合成的9-β-L（+）腺苷的影响。例4提供了对玉米的处理情况。例5提供了对黄瓜的处理情况。
在下面的例1至例3中，稻子（CVM-101，u.of Calif）的种植情况如Ries的美国专利4，741，754所述。对于每一个活性实验，稻苗在含0.5浓度营养液（20ml）的试管（14.5cm×2.4cm）中生长24小时，白天温度在30℃，夜间温度在25℃，光照时间16小时，（PAR 300-350mol S-1m-2）。在试验设计中，按所观察的植株大小，将稻苗分划成很多区组。在喷药和把它们放回生长室前后的操作中，所有的处理按随机数字表随机处理各区组。所有的数据要经过方差分析，用F试验比较趋势作用，用最小显著差别法比较平均分离。
例1
为了得到用于化学鉴别的纯TRIM，将按R.G.Laughlin，R.L.Munyon，S.K.Ries和V.F.Wrt在Science 219∶1219-1221（1983）中所述配制的TRIA（1.0μg/L）胶体分散液喷在生长了21-24天的稻苗叶子上。对照苗用0.01μg/L的脂肪烷基硫酸酯（TAS）喷撒，这正是制剂中表面活性剂的浓度。在100分钟后取下根部，在提取前要称重和冷冻，在索氏提取器内用150ml甲醇提取冷冻过的根部（20μg）2小时，将提取物在真空中干燥。剩余物用水（20ml）再溶解，离心（7900rpm），所得上清液在减压下蒸发干燥。在闪式层析柱中（35cm×20mm，C18键合硅胶，40μm）将提取物初步纯化，用甲醇-水（30∶70V/V）淋洗，流速2ml/min，按每批5ml收集到二十个馏分。用稻株进行生物试验显示出仅第6-14个馏分有活性，将这些含活性物TRIM的馏分合并后蒸发至干。用相似的闪式层析柱纯化对照的（TAS）提取物，对馏分的稻秧生物试验表明无活性。
上述的含TRIM和TAS的馏分用C18CN-H2O（80∶20V/V，2ml/min）的流动相经制备柱在60℃用高压液相色谱法纯化。在22.1分钟流出的含有TRIM和TAS的馏分用相同溶剂进一步纯化。最终的高压液相色谱法纯化是在相同的柱中在25℃用CH3OH-H2O（30∶70V/V，4ml/min）的流动相进行的。在19.4分钟收集到的组分在真空下蒸发至干。所得化合物经鉴定认为，从试验物根部得到的是TRIM，从对照物根部得到的是无活性的TAS。
用甲醇重结晶纯化的TRIM和TAS生成无色结晶、熔点都是230-234℃（用Kofler热级装置测量，未校正）。两个化合物的1H-（图1）和13C-NMR谱相同。TRIM和TAS混合的1H-NMR谱是单个质子谱的迭加。对纯化后的TRIM和TAS，相同的CI和FAB MS（图2）谱图在m/Z 268处给出（M+H），与NMR数据符合。这些结果使鉴定TRIM发生困难。
TRIM和TAS最终鉴定为都含有9-β-腺苷。TRIM和TAS分析的不同处仅在于使用JASCO Model J600光谱仪得到的圆二色性（CD）（图3a-3g）。购买到的9-β-D（-）腺苷与纯化的TAS和TRIM的光谱比较证实，纯的TAS和纯的TRIM结构分别为9-β-D（-）腺苷和9-β-L（+）腺苷。
按原先提到的N.J.Cusack，M.E.Hickman和G.V.R.Born在Proc.R.Soc.London（1979）中叙述的方法合成制备的并用腺苷脱氨酶处理过的9-β-L（+）腺苷与纯的TRIM比较，在各方面包括在稻苗上的生物活性都是一致的，如表1所示。
表1
生长17天的稻苗对TAS对照物;9-β-D（-）腺苷，纯化的TRIM（9-β-L（+）腺苷），合成制得的9-β-D（-）腺苷和合成的9-β-L（+）腺苷的响应。
24小时的增加量
化学药物（10.0μg/L） 干重 水分吸收
（mg/植株） （ml/植株）
对照（未处理） 7.00 4.48
TAS对照 7.24 4.77
纯 TRIM 13.44 5.18
发酵生成的9-β-D（-）腺苷 7.60 4.84
合成的9-β-L（+）腺苷（1）13.44 5.20
LSD 5% 1.91 0.28
LSD 1% 2.58 0.38
（1）Sigma化学试剂公司位于St.Louis，Missouri.
当用表1中的组合物在稻苗上进行生物试验、与叶面喷雾TRIM（100μg/L，为表1中数据的10倍）相比时，在20小时后，TRIM和9-β-L（+）腺苷明显地增加了干重和水分吸收。在植株起始时重量为38.70mg的情况下，空白对照，TAS和TRIM三者的净干重增值分别是8.45，6.98和13.04mg/全株。合成的9-β-L（+）腺苷产生与TRIM等价的结果。用来比较TRIM和另外两种处理的F值在1%水平上显著不同。
因不同的处理和对照植株按三种方案进行提取。从生长21-24天的稻苗根上获得纯TRIM的平均产量约为124μg/g干根重。从TAS（对照）植株获得的腺苷产量约为96μg/g干根重。因此，用提取法生产很少量的TRIM需要很大数量的植株。而合成法得到的物质可以大量制备。
例2
从各种来源得到的9-β-L（+）腺苷与腺苷脱氨酶反应以检测其纯度。腺苷脱氨酶选择性地与9-β-D（-）腺苷反应生成D-肌苷。9-β-L（+）腺苷不受此酶的影响。结果如表2a所示。
表2a
将不同来源的腺苷加入腺苷脱氨酶后，经HPLC（高压液相色谱）分析得出剩余的9-β-L（+）腺苷含量，腺苷脱氨酶只对9-β-D（-）腺苷作用。样品为100μg样品/含0.1单位酶的100μl水。
时间（小时）
9-β-L（+）腺苷的百分含量
腺苷来源 2 4 6 8
9-beta-D（-）（1）0.55 0.45 0.47 -
9-beta-L（+）（2）100.0 100，0 100.0 99.83
TAS对照 0.57 0.52 0.67 0.57
TRIM 6.02 5.73 5.85 5.63
（1）Sigma化学试剂公司，位于St.Louis，Missouri
（2）Cusack等人，前面提到过。
8小时后，测试这些物质的圆二色谱（CD）。图3a显示用Cusack等人的方法制成的已知的纯9-β-L（+）腺苷的谱图。图3b显示经腺苷脱氨酶处理后的TRIM的谱图。图3c显示了用腺苷脱氨酶处理前的TRIM谱图。图3d显示了经腺苷脱氨酶处理后的商业生产的9-β-D（-）腺苷的谱图。图3e显示了在用腺苷脱氨酶处理前的图3d所用的购得的腺苷的谱图。图3f显示了经腺苷脱氨酶处理后的TAS谱图。图3g显示了在用腺苷脱氨酶处理前的TAS谱图。
从表2a和图3a-3g可以看出，购得的9-β-D（-）腺苷含有一些9-β-L（+）腺苷，非常不纯。同样地，我们认为是纯的TRIM，实际上是非常不纯的。虽然试验了几种手性层析柱，若不经腺苷脱氨酶作用而后用HPLC进一步纯化，还是不能将TRIM进一步纯化。但是若不使用酶，TRIM仍不能用已知的HPLC技术进一步纯化。
已经发现纯的9-β-L（+）腺苷的效力相当于美国专利№ 4，741，754提供的高浓度的不纯TRIM的效力。
表2b显示了生长16天的稻苗接受用经腺苷脱氨酶处理一段时间后再用HPLC纯化的各种来源的腺苷处理后的响应。
表2b
24小时后增加的干重
腺苷来源
（1.0ugL） （mg/植株）（相当对照的%）
无 8.16
未处理的根 7.66 94
TAS 对照 8.78 108
TRIM 13.69 168
合成的L（+）腺苷 13.80 169
购得的D（-）腺苷＊11.60 142
（用腺苷脱氨酶处理一段时间）
LSD 5% 1.90
LSD 1% 2.55
＊这显示了商业产品含有显著量的L（+）腺苷。
对比实例3
腺苷半硫酸盐，腺嘌呤，9-β-D-arabinosutanoside，腺苷5′-二磷酸葡糖二钾，腺苷-5′-单磷酸，腺苷-3′-单磷酸-水合物，腺苷5-三磷酸和腺苷3′，5环单磷酸钠盐在浓度至少是100μg/L的情况下，在稻生物试验中没有活性。它们与纯的TRIM和TAS不共同用色谱法分析。
合成生产出的9-β-D（-）腺苷在几个稻生物试验中有活性（增加干重）。但是，在三种物质互相比较的同一试验中，它从未如 TRIM那么多地促进生长，也没达到TRIM（1.0μg/L）那么低的浓度。因为从TAS（对照植株）得到的9-β-D（-）腺苷没有显示出明显的活性，即使其浓度为表3中TRIM浓度的100倍也是如此，合成的9-β-D（-）腺苷从未达到TRIM那样大的活性，这些结果是可疑的。已经发现合成的9-β-D（-）腺苷含有一些9-β-L（+）腺苷对映体，这可以从例2看出。
表3
分别用纯TAS，9-β-D（-）腺苷和TRIM处理的生长了15天的稻苗的生长情况
19小时后的增加
（药物） （μg/L） （mg DW/植株）
O 0 3.87
TAS 10 3.79
TAS 1000 3.19
TRIM 10 8.44a
LSD 5% 3.51
aF值，按1%水平与其它处理比较显著性（F＝12.4）
在这个试验中，合成的9-β-L（+）腺苷与TRIM得到的结果相同。表4中显示出用腺苷脱氨酶处理过的与TRIM相比可以说很纯的9-β-L（+）腺苷作用于稻苗的结果。
表4
生长了17天的稻苗对于不同浓度的合成产生的9-β-L（+）腺苷和TRIM的响应比较。此试验的结果是两个试验的平均，每个试验重复5次。零时间时TRIM对应的植株的平均干重为33.55mg，合成的9-β-L（+）腺苷对应的为33.36mg。
浓度 TRIM 相对于对照物 合成 相对于对照物
（μg/L） DW 增加的% DW 增加的%
0 6.95 - 5.77
.001 7.83 13 7.46 29
.01 8.19 18 8.19 55
1.00 9.72 40 9.89 71
100.0 11.34 63 9.08 55
LSD 5% 1.87 1.95
LSD 1% 2.51 2.61
结果清楚地显示出在浓度为0.0001-1.0微克/升之间，合成的纯腺苷的效力比TRIM高许多。
例4
表5显示了“3780”地块的玉米苗在温室中种植后一周施用L（+）腺苷、并在处理后6天收获所得到的响应。
表5
L（+）腺苷 干重 相对于对照物
（μg/L） （mg/嫩苗） 增加%
对照 402
0.01 478a 19
1.00 438 9
100.00 438 9
10000.00 445 11
aF值，按5%水平显示与对照物差别的显著性。
此试验显出相对于对照物，使用9-β-L（+）腺苷后干重有明显的增加，特别是在很低的浓度情况下是如此。
例5
表6显示在温室中黄瓜在两个不同光照强度下生长时施用两次L（+）腺苷得到的响应。施用腺苷和对照物时与6摩尔尿素一起喷撒。腺苷溶在尿素中防止细菌破坏。在种植后的12天和17天施用，嫩苗在种植后22天收获。
表6
光强度（moles/m2/sec）
9+beta- 低b高b
L（+）腺苷 （120） （320） 平均a相对于对照物
（μg/L） 干重 增加%
mg/植株
0 490 717 604
0.01 483 800 742 5%
1.00 543 770 656 9%
100.00 480 823 652 8%
aF值，在5%水平显示对照物与处理物比较的显著性。
bF值，在5%水平显示低光强与高光强比较的立方趋势显著性。
此试验显示出使用9-β-L（+）腺苷相对于对照物有明确的增加，只要不对刺激生长产生干扰，各种已知的抗菌剂都可在制剂中使用。
同样的情况，大豆、麦子，高粱和大麦，以及其它谷物用浓度0.01-100μg/L的9-β-L（+）腺苷处理以增加干重。
已知TRIA是一个非常亲油的化合物，它能作用于细胞膜产生微量的TRIM，TRIM迅速遍及整个植株，引起一连串新陈代谢变化，结果能观察到可溶性蛋白质，还原糖和干重增加。因为9-β-L（+）腺苷尚未在对照物中发现，也未在文献中报道，可以相信在植物膜上存在的腺苷包含一个开链核糖部分。通过TRIA与膜结合酶的作用，它可以转变为9-β-L（+）腺苷，而在没有TRIA的情况下，可以转变为9-β-D（-）腺苷。按上面引用的S、K.Ries在Critical Reviews in Plant Sciences（1985）的文献所述，将其它长链醇施加到植物的相反部位也会诱发第二信使，此信使在1分钟内能停止9-β-L（+）腺苷的生成。因此通过TRIA诱导使9-β-腺苷对映体转化成9-β-L（+）腺苷和长链醇对这一活性的抑制表明在植物中存在着人们原先不知道的生长调节系统。
本发明提供了一个可以使作物每亩生长量大大提高的方法。如原先提到过的Cusack等人的论文和Jurovcik等人在Febs Letters 18∶274-276（1971）的论文可知，因为9-β-L（+）腺苷对哺乳动物和细菌无活性作用，它对植物的活性是意想不到的。
所有类型的植物都可用本发明的方法施用。处理的范围至少和TRIA和TRIM适用的范围一样广泛。
如本文已经用到过的，“合成”一词的含义对生产9-β-L（+）腺苷来说，是指经过体外方法，或是相对于植物体内方法而言的。合成法可以是整个过程都是化学合成，也可以是涉及到通过活细胞合成的方法，例如在某一特定步骤利用了微生物方法。
愿意指出，上面的叙述仅是说明本发明，本发明的范围仅只受在本文后面所提出的权利要求的限制。
Claims (7)
1、一种剌激植物生长的方法，包括：将有效量的合成法制备的9-β-L(+)腺苷施用于植物中，以剌激植物生长。
2、根据权利要求1的方法，其中的9-β-L（+）腺苷实际上是纯化合物。
3、根据权利要求1的方法，其中的植物是稻实生苗。
4、根据权利要求1的方法，其中9-β-L（+）腺苷以水溶液形式施用。
5、根据权利要求4的方法，其中每升水溶液含9-β-L（+）腺苷的量约为0.0001-100微克。
6、根据权利要求1的方法，其中9-β-L（+）腺苷和农业上适用的载体合并使用。
7、根据权利要求1的方法，其中一种抗菌剂与腺苷混合使用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |