CN104630136A - 一种制备诱导多能性干细胞的方法以及该方法中所使用的组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种制备诱导多能性干细胞的方法以及在该方法中使用的组合物，所述方法包括将促进诱导多能性干细胞形成的组合物引入体细胞，所述组合物包含：（i）c-Jun拮抗剂，和选自下列七组因子中的一组因子：（1）Sox2、Klf4和c-Myc，（2）Klf4和c-Myc，（3）Oct3/4、Klf4和c-Myc，（4）Sox2、Nanog和Lin28，（5）Oct3/4、Nanog和Lin28，（6）Oct3/4、Klf和Sox2和（7）Klf4和Sox2；或（ii）c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1；和Glis1、Sall4或Lrh1中的至少一个；或（iii）c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1；和Oct4、Klf4、Sox2、Lin28、Esrrb、Lef1、Utf1或miRNA C中的至少一个。通过本发明的方法能够成功地制备得到诱导多能性干细胞，并且所得到的诱导多能性干细胞质量良好，没有产生异常染色体。

Description

一种制备诱导多能性干细胞的方法以及该方法中所使用的组合物及其应用

技术领域

本发明涉及一种制备诱导多能性干细胞的方法、促进诱导多能性干细胞（iPSC）形成的组合物及其用途。

背景技术

干细胞是一类能够通过细胞有丝分裂进行自我更新的细胞，并且能够在特定条件下分化为各种特化细胞。干细胞的这种自我更新能力被用作器官和组织发育所需的细胞分化和特化的基础。最近的证据显示干细胞可用于组织重建并且使生理功能和组织功能恢复。因此，干细胞具有用于治疗多种疾病和损伤（包括神经系统创伤，恶性肿瘤，遗传性疾病，血红蛋白病和免疫缺陷）的潜力。干细胞的细胞移植治疗是再生医学研究的一个重要方向，干细胞移植可被用来治疗心脏损伤，神经系统退行性疾病，脊髓损伤，肾衰竭、血液系统疾病等等。然而，细胞移植治疗面临着异体排斥、细胞来源有限等很多难以解决的问题。

诱导多能性干细胞（iPSC，induced pluripotent stem cell）是一种类似于胚胎干细胞、具有发育全能性的细胞，通过导入特定的基因诱导体细胞，使其获得干细胞特性。

2006年，日本京都大学教授山中伸弥实验室首次宣布在小鼠的成纤维细胞中导入4个基因（Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4）成功地将小鼠的成纤维细胞诱导重编程为全能性干细胞，得到的干细胞的性质和胚胎干细胞类似。在该实验中，Yamanaka等人首先选取了和小鼠胚胎干细胞自我更新及维持多能性相关的24个基因，分别将它们克隆到逆转录病毒载体，对胚胎成纤维细胞进行共转染，在进行基于Fbx15报告体系的筛选之后，他们发现了类胚胎干细胞的细胞集落的形成。经过对这24个基因的进一步分析，他们发现仅转导Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4就可以使胚胎成纤维细胞完全转变为诱导多能性干细胞（iPSC）。该iPSC具有正常核型，表达类似胚胎干细胞的分子标志，可以在体外被诱导分化为内、中、外三个胚层的分化细胞。然而，该实验中得到的iPSC在基因表达以及甲基化模式方面却与胚胎干细胞不同，也不能够得到活体的嵌合体小鼠。

2007年Yamanaka和俞君英两个研究小组分别成功地将人的体细胞重编程为iPS细胞，前者应用逆转录病毒将Oct3/4,Sox2,c-Myc,Klf4转导入人的表皮成纤维细胞，后者则是应用慢病毒将Oct3/4,Sox2,Nanog,Lin28导入包皮细胞。基因表达谱分析，Oct3/4，Nanog基因启动子区域甲基化分析都表明人的iPS细胞系与相应的胚胎干细胞系非常相似，将这些细胞注射到裸鼠体内，都能够发育成3个胚层组织。此外，不仅能够诱导小鼠体细胞和人体细胞进行重编程，还能够诱导大鼠体细胞、猪体细胞和猴体细胞进行重编程，形成诱导多能性干细胞。

迄今为止，众多研究机构在各种不同类型的细胞上尝试了重编程技术，并取得了成功。能够成功重编程的细胞不限于成纤维细胞，还包括肝细胞、胃细胞、造血细胞、脑膜细胞、外周血CD34阳性细胞、角质细胞，等等。诱导重新编程的方法除了通常使用的借助逆转录病毒、慢病毒将外源基因导入细胞这种方法之外，还可以采用其他不同的载体诱导重编程，例如，采用不整合基因组的腺病毒载体、转座子，等等。

综上所述，诱导多能性干细胞的形成对于再生医学和生命科学研究有着重要意义。诱导多能性干细胞可有助于哺乳动物发育机制的研究；通过体外分化提供各种类型的人体细胞进行药物研究（尤其是化疗药物的筛选方面的研究）；诱导多能性干细胞还有望用于临床移植，干细胞疗法，等等。正是由于诱导多能性干细胞的这些应用前景，目前需要寻找替代常用转录因子组合的其他组合因子，提高重编程的效率并减少重编程过程中细胞的突变。

发明内容

一方面，本发明提供一种制备诱导多能性干细胞的方法，所述方法包括将促进诱导多能性干细胞形成的组合物引入体细胞，所述组合物包含：（i）c-Jun拮抗剂，和选自下列七组因子中的一组因子：（1）Sox2、Klf4和c-Myc，（2）Klf4和c-Myc，（3）Oct3/4、Klf4和c-Myc，（4）Sox2、Nanog和Lin28，（5）Oct3/4、Nanog和Lin28，（6）Oct3/4、Klf和Sox2以及（7）Klf4和Sox2；或者，所述组合物包含：（ii）c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1；以及Glis1、Sall4或Lrh1中的至少一个；或者，所述组合物包含：（ii）c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1；以及Oct4、Klf4、Sox2、Lin28、Esrrb、Lef1、Utf1或miRNA C中的至少一个，并且，其中，当c-Jun拮抗剂是c-JunDN时，所述组合物不包含下列四组因子：（1）Sox2、Klf4和c-Myc，（2）Oct3/4、Klf4和c-Myc，（3）Oct3/4、Klf和Sox2以及（4）Klf4和Sox2。

再一方面，本发明提供一种促进诱导多能性干细胞形成的组合物，所述组合物包含：（i）c-Jun拮抗剂，和选自下列七组因子中的一组因子：（1）Sox2、Klf4和c-Myc，（2）Klf4和c-Myc，（3）Oct3/4、Klf4和c-Myc，（4）Sox2、Nanog和Lin28，（5）Oct3/4、Nanog和Lin28，（6）Oct3/4、Klf和Sox2以及（7）Klf4和Sox2；或者，所述组合物包含：（ii）c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1；以及Glis1、Sall4或Lrh1中的至少一个；或者，所述组合物包含：（iii）c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1；以及Oct4、Klf4、Sox2、Lin28、Esrrb、Lef1、Utf1或miRNA C中的至少一个，并且，其中，当c-Jun拮抗剂是c-JunDN时，所述组合物不包含下列四组因子：（1）Sox2、Klf4和c-Myc，（2）Oct3/4、Klf4和c-Myc，（3）Oct3/4、Klf和Sox2以及（4）Klf4和Sox2。

在本发明的一些实施方式中，本发明的促进诱导多能性干细胞形成的组合物包含：（a）c-Jun拮抗剂，和（b）Sox2、Klf4和c-Myc；或者，所述组合物包含：（a）c-Jun拮抗剂，和（b）Oct3/4、Klf4和c-Myc；或者，所述组合物包含：（a）c-Jun拮抗剂，和（b）Sox2和Klf4；或者，所述组合物包含：（a）c-Jun拮抗剂，和（b）Oct3/4、Klf和Sox2；或者，所述组合物包含：（a）c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1；以及（b）Glis1、Sall4和Lrh1；或者，所述组合物包含：（a）c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1，和（b）Oct4；或者，所述的组合物包含：（a）c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1；和（b）Klf4；或者，所述组合物包含：（a）c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1；和（b）Sox2；或者，所述组合物包含：（a）c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1；和（b）Lin28；或者，所述组合物包含：（a）c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1；和（b）Esrrb；或者，所述组合物包含：（a）c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1；和（b）Lef1；或者，所述组合物包含：（a）c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1；和（b）Utf1；或者，所述组合物包含：（a）c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1；和（b）miRNA C。

在本发明的一些实施方式中，所述c-Jun拮抗剂包括具有bZIP结构域但缺乏反式激活结构域的c-Jun拮抗因子和拮抗c-Jun活性的化合物、核酸、蛋白质、RNA。在本发明的优选实施方式中，所述c-Jun拮抗剂包括c-Jun基因的截短型c-JunDN或Jdp2或其功能性变体。所述功能性变体包括：c-JunDN的氨基酸中的1至100个氨基酸的取代、插入和/或缺失，但仍具有bZIP结构域、缺乏反式激活结构域的功能性变体，其中，所述c-JunDN的氨基酸序列为SEQ ID NO.2；所述Jdp2的氨基酸序列为SEQ ID NO.3；所述c-JunDN的功能性变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.2具有至少70%的同源性；所述Jdp2的功能性变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.3具有至少70%的同源性。

在本发明的一些方法实施方式中，所述体细胞选自小鼠体细胞和人体细胞，优选地，所述小鼠体细胞和所述人体细胞选自：成纤维细胞、骨髓衍生的单核细胞、骨骼肌细胞、脂肪细胞、外周血单核细胞、巨噬细胞、神经干细胞、肝细胞、角质细胞、口腔角质细胞、头发毛囊真皮细胞、胃上皮细胞、肺上皮细胞、滑膜细胞、肾细胞、皮肤上皮细胞或成骨细胞。

又一方面，本发明提供一种根据本发明的上述制备诱导多能性干细胞的方法获得的诱导多能性干细胞。

又一方面，本发明还提供本发明的促进诱导多能性干细胞形成的组合物在制备诱导多能性干细胞中的应用。

附图说明

图1A为与Oct4和Nanong相比，c-Jun在小鼠胚胎干细胞、诱导多能性干细胞和小鼠胚胎成纤维细胞中的表达水平。

图1B显示了与Oct4相比，c-Jun在小鼠胚胎干细胞、诱导多能性干细胞和小鼠胚胎成纤维细胞中的表达水平。

图1C表示c-Jun在c-Jun+/+、c-Jun-/-和c-Jun+/-小鼠胚胎干细胞中的蛋白质表达水平。

图1D和图1E分别表示随着细胞培养天数的增加c-Jun+/+、c-Jun-/-和c-Jun+/-小鼠胚胎干细胞和小鼠胚胎成纤维细胞的细胞数量变化。

图1F表示c-Jun纯合敲除的小鼠胚胎干细胞中多能性基因的表达水平。

图1G表示EB球实验中c-Jun-/-小鼠胚胎干细胞能够分化为三个胚层的细胞。

图1H是建立DOX诱导性表达c-Jun的胚胎干细胞的过程的示意图。

图2A显示了在c-Jun+OKS体系和c-Jun+OKSM体系中，在含血清培养基和无血清培养基中生长的干细胞的克隆数。

图2B显示了在c-Jun+OKS体系、对照+OKS体系、和c-Jun+OKSM体系、OKSM+对照体系中得到的诱导多能性干细胞的显微照片，其中对照为未加入c-Jun的OKS或OKSM体系，标尺为250μm。

图2C显示了不同DOX浓度条件下，c-Jun的表达水平和GFP+iPS克隆数。

图2D显示了c-Jun的表达水平和GFP+iPS克隆数随DOX的使用天数的变化。

图3A显示了野生型c-Jun（c-JunWT）、Ser63位点磷酸化的突变体（c-JunS63A）、Ser73位点磷酸化的突变体（c-Jun S73A）、Ser63和Ser73位点磷酸化的突变体（c-Jun S63A/S73A）以及具有bZIP结构域但缺乏反式激活结构域的位于170位氨基酸至334位氨基酸的截短型c-Jun（c-JunDN）的结构示意图。

图3B显示了OKS和OKSM体系中分别加入c-JunWT、c-Jun S63A、c-JunS73A、c-Jun S63A/S73A以及c-JunDN后GFP+iPS克隆数的变化，其中对照为OKS和OKSM体系本身。

图3C显示所得到的诱导多能性干细胞的显微照片，其中，对照为未加入任何其他因子的OKS和OKSM体系本身，标尺为250μm。

图4A显示了c-JunWT、c-Jun-bZIP、a.a75-334、c-JunDN、a.a254-334、a.a274-334、a.a170-282的蛋白序列示意图。

图4B显示了OKS体系中加入上述这些c-Jun因子突变体之后的采用流式细胞仪分析得到的绿色荧光细胞的比例。

图4C显示了分别加入了c-JunDN和c-Jun-bZIP的OKS体系中，在iSF1培养基或补充有维生素C的mES培养基中，得到的GFP+iPS克隆数，其中，对照为OKS体系本身，载体为pMXs逆转录病毒载体。

图5A显示了野生型c-Jun（c-JunWT）、c-JunDN和Jdp2的蛋白序列示意图。

图5B显示了OKS体系中加入c-JunWT、c-JunDN和Jdp2后所得到的GFP+iPS克隆数，对照为OKS体系本身。

图5C显示了Jdp2的各种不同的突变体的蛋白序列示意图。

图5D显示了OKS体系中加入上述这些Jdp2的突变体之后的采用流式细胞仪分析得到的绿色荧光细胞的比例。

图6A显示在c-JunDN/Jdp2+KSM体系和c-JunDN/Jdp2+KS体系中，通过PCR分析小鼠胚胎成纤维细胞得到的诱导多能性干细胞（iPSC）的外源基因整合图。

图6B显示了c-JunDN/Jdp2+KSM体系和c-JunDN/Jdp2+KS体系培养的诱导多能性干细胞的免疫荧光图像。

图6C显示Oct4和Nanog启动子区域的CpG岛甲基化状态分析结果。

图6D显示了c-JunDN/Jdp2+KSM体系和c-JunDN/Jdp2+KS体系中培养的诱导多能性干细胞的核型实验结果。

图6E显示了通过注入本发明的c-JunDN/Jdp2+KSM体系和c-JunDN/Jdp2+KS体系培养的诱导多能性干细胞形成的嵌合体小鼠。

图7A显示了被对照、c-JunFL、c-JunDN和Jdp2感染的小鼠胚胎成纤维细胞中的RNA-seq数据分析。

图7B显示了在小鼠胚胎成纤维细胞中被c-Jun上调和下调的基因。c-Jun激活细胞增殖相关基因，并下调细胞粘附基因。

图7C显示了随着培养天数的增加c-Jun、Oct4、c-JunDN和Jdp2对小鼠胚胎成纤维细胞数量的影响，其中，对照为没有加入c-Jun、Oct4、c-JunDN和Jdp2的小鼠胚胎成纤维细胞的生长。

图8A显示在KSM、KSM+Oct4、KSM+c-JunDN和KSM+Jdp2体系中进行重编程的小鼠胚胎成纤维细胞的RNA-seq数据分析。

图8B显示c-JunDN、Jdp2和Oct4所调控的基因数，其中，它们共同调控1100个基因。

图8C显示被c-JunDN/Oct4共同上调和下调的基因。c-JunDN/Oct4共同激活干细胞维持相关基因，下调细胞分化相关基因。

图8D表示通过qRT-qPCR方法证实小鼠胚胎成纤维细胞在重编程过程中的代表性基因Tdh、Nodal、Lefhy2、Pax1、Sqrd1、Stx11受c-JunDN、Jdp2和Oct4共同调控。

图9A显示了KSM+c-JunDN和OKM+c-JunDN体系所获得的GFP+iPS克隆数，其中，“-”表示没有添加c-JunDN，“+”表示加入了c-JunDN。

图9B显示了KSM+c-JunDN体系中培养得到的诱导多能性干细胞的荧光显微照片，其中，标尺为250μm。

图10A显示了KSM+Jdp2和KS+Jdp2体系所获得的GFP+iPS克隆数，其中，对照为没有加入Jdp2的KSM或KS体系。

图10B显示了KSM+Jdp2和KS+Jdp2体系培养得到的诱导多能性干细胞的荧光显微照片，其中，标尺为250μm。

图11显示在c-JunDN/Jdp2和Jhdm1b、Id1/3、Glis1、Sall4、Lrh1组合成的六因子（6F）体系中培养的小鼠胚胎成纤维细胞的GFP+iPS克隆数以及在减少6F中的任何一个因子后形成的五因子体系中培养的小鼠胚胎成纤维细胞的GFP+iPS克隆数。

图12显示6F体系下培养得到的诱导多能性干细胞的荧光显微照片，其中，标尺为250μm。

图13A是6F体系下培养的多能性干细胞的PCR分析结果。

图13B是6F体系下培养的多能性干细胞的核型实验的结果。

图13C是6F体系下培养得到的iPSC注射到供体小鼠的囊胚腔中，再将注射后的囊胚移植到假孕雌鼠的子宫中得到的嵌合体小鼠的照片。

具体实施方式

除非另有定义，本文所使用的科技术语的含义与本领域普通技术人员所理解的含义相同。

I.iPSC的制备方法

概述

总体而言，本发明提供一种使用含有c-Jun拮抗剂的组合物制备iPSC的方法以及该方法所用的促进诱导多能性干细胞（iPSC）形成的含有c-Jun拮抗剂的组合物，所述组合物含有c-Jun拮抗剂以及本文所述的一种或一种以上其他因子，所述c-Jun拮抗剂例如具有bZIP结构域但缺乏反式激活结构域的c-Jun拮抗因子，拮抗c-Jun活性的化合物、抗体或抗体片段。

一方面，本发明提供一种制备诱导多能性干细胞（iPSC）的方法，所述方法包括将促进诱导多能性干细胞（iPSC）形成的组合物引入体细胞，其中，所述组合物包含：

（i）c-Jun拮抗剂，和选自下列七组因子中的一组因子：（1）Sox2、Klf4和c-Myc，（2）Klf4和c-Myc，（3）Oct3/4、Klf4和c-Myc，（4）Sox2、Nanog和Lin28，（5）Oct3/4、Nanog和Lin28，（6）Oct3/4、Klf和Sox2以及（7）Klf4和Sox2；或者。

所述组合物包含：

（ii）c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1；以及Glis1、Sall4或Lrh1中的至少一个；或者，

所述组合物包含：

（iii）c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1；以及Oct4、Klf4、Sox2、Lin28、Esrrb、Lef1、Utf1或miRNA C中的至少一个。

c-Jun拮抗剂

c-Jun是一个原癌基因，在细胞增殖、存活、转化方面都有重要作用，也是第一个被发现的具有DNA序列特异性结合能力的致癌因子，其可通过结合启动子或增强子区域保守序列TGA(C/G)TCA来调控多种基因的表达。c-Jun结合到染色体上之后，与通用转录因子复合物相互作用，通过N端的反式激活结构域激活靶基因的表达。c-Jun还可以通过其亮氨酸拉链结构域与其他AP-1家族因子形成二聚体，从而产生更多类型的转录调节复合物，因此，c-Jun广泛参与调节肿瘤形成、细胞增殖、细胞凋亡等过程的下游靶标。

本文所述的“c-Jun拮抗剂”是指能够阻断或降低c-Jun活性的分子，例如能够与c-Jun的天然结合伙伴（例如AP-1）结合但不激活c-Jun的下游基因并且能够进入细胞内部的小分子化合物、核酸类物质，等等。在一些实施方式中，c-Jun拮抗剂包含能够与c-Jun或AP-1结合的小分子化合物，例如，可以降低c-Jun的表达的mRNA药物：FSK（Forskolin，毛喉素，一种常用的腺苷酸环化酶激活剂）、HDAC（组蛋白脱乙酰酶）抑制剂，等等。在一些实施方式中，c-Jun拮抗剂包含能够与c-Jun或AP-1结合的核酸，例如，适体。在一些实施方式中，c-Jun拮抗剂包含能够抑制c-Jun表达的蛋白质，例如，反义核酸（例如，DNA或RNA或其杂合体）。

在一些实施方式中，c-Jun拮抗剂包括c-Jun的变体，例如，c-Jun的功能性变体或者c-Jun的片段。本文所使用的术语“功能性变体”表示含有例如仅仅保守性改变或非关键残基或非关键区域的改变，并且保留原始多肽的功能。功能性变体还可包含相似氨基酸的替换，其导致功能未改变或不显著的改变。所述氨基酸的替换包括通过一个或多个氨基酸（例如，1至100个氨基酸，例如，1至90个氨基酸，例如，1至80个氨基酸，例如，1至70个氨基酸，例如，1至60个氨基酸，例如，1至50个氨基酸，例如，1至40个氨基酸，例如，1至30个氨基酸）的取代、缺失、插入、融合、截短或其任意组合在氨基酸序列上进行替换。在一些实施方式中，向截短后的氨基酸中插入多个氨基酸（例如，50个氨基酸，例如，40个氨基酸）以增强c-Jun拮抗剂的功能性变体的稳定性并提高其表达效率。

在本发明中，可将多种不同的分子用作c-Jun的拮抗剂。在一些实施方式中，可使用如下所述的步骤筛选新的c-Jun拮抗剂（T.S.Huang,et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88,5292,1991,B.L.Bennett et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,98,13681,2001）

（1）检测报告基因：采用AP-1报告基因荧光素酶质粒，将候选拮抗剂和报告基因质粒共同转入细胞中，36小时后用荧光照度计检测荧光强度；

（2）EMSA（凝胶迁移实验）：在用候选拮抗剂处理细胞后，裂解细胞，随后与含有AP-1结合位点的探针一同孵育，然后采用4%的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，随后将该聚丙烯酰胺凝胶烘干和显影。检测拮抗剂是否影响c-Jun与含有AP-1结合位点的探针的结合；

（3）蛋白免疫印迹检测：采用候选拮抗剂处理细胞，将细胞裂解后，采用磷酸化的c-Jun抗体检测细胞中c-Jun的磷酸化水平；

（4）RT-PCR检测：采用候选拮抗剂处理细胞，提取细胞mRNA，将提取的mRNA进行反转录，得到cDNA，随后用特异性c-Jun引物进行荧光定量PCR分析，检测样品中c-Jun的mRNA的表达水平。

iPSC的制备

一方面，本发明提供一种使用c-Jun拮抗剂和选自下列七组因子中的一组因子制备iPSC的方法：

（1）Sox2、Klf4和c-Myc，

（2）Klf4和c-Myc，

（3）Oct3/4、Klf4和c-Myc，

（4）Sox2、Nanog和Lin28，

（5）Oct3/4、Nanog和Lin28，

（6）Oct3/4、Klf和Sox2，以及

（7）Klf4和Sox2。

在本发明的一些实施方式中，本发明使用包含c-Jun拮抗剂，和Sox2、Klf4以及c-Myc的组合物制备iPSC，或者，使用包含c-Jun拮抗剂，和Oct3/4、Klf4以及c-Myc的组合物制备iPSC，或者，使用包含c-Jun拮抗剂，和Oct3/4、Klf4以及c-Myc的组合物制备iPSC，或者，使用包含c-Jun拮抗剂，和Sox2以及Klf4的组合物制备iPSC。

另一方面，本发明提供一种使用非Yamanaka因子，即使用c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1；以及Glis1、Sall4或Lrh1中的至少一个制备iPSC的方法。

在本发明的优选实施方式中，本发明使用c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1；以及Glis1、Sall4或Lrh1制备iPSC。

又一方面，本发明提供一种使用c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1以及选自Oct4、Klf4、Sox2、Lin28、Esrrb、Lef1、Utf1和miRNA C中的至少一个因子制备iPSC的方法。

在本发明的一些实施方式中，本发明使用c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1以及Oct4制备iPSC；或者使用c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1以及Klf4制备iPSC；或者使用c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1以及Sox2制备iPSC；或者使用c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1以及Lin28制备iPSC；或者使用c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1以及Esrrb制备iPSC；或者使用c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1以及Lef1制备iPSC；或者使用c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1以及Utf1制备iPSC；或者使用c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1以及miRNA C制备iPSC。

一般而言，制备iPSC的方法包括将哺乳动物体细胞诱导为多能干细胞的过程，该制备iPSC的方法通过使外源性或内源性多肽（尤其是在维持或调节胚胎干细胞的自我更新和/或多能性方面发挥重要作用的蛋白质）进行表达来完成。所述在维持或调节胚胎干细胞的自我更新和/或多能性方面发挥重要作用的蛋白质例如在胚胎干细胞中高表达的Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc转录因子。使这些转录因子表达可包括将编码目标多肽的表达载体导入细胞、用重组病毒转导细胞、将外源性的纯化的目标多肽导入细胞、使细胞与非天然生成的诱导编码目标多肽的内源性基因（例如，Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc）表达的诱导试剂接触，使细胞与一种或一种以上诱导试剂、诱导因子接触或使细胞与其他诱导编码目标多肽的基因（例如，内源性基因Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc）表达的生物试剂、化学试剂或物理试剂接触。例如，在一些情况下（取决于待诱导的细胞类型），一种或一种以上外源性诱导因子可与化学诱导试剂联合使用，所述化学诱导试剂例如，组蛋白去乙酰化酶（例如，丙戊酸），组蛋白甲基转移酶抑制剂（例如，BIX01294），DNA去甲基化试剂（例如，5-胞苷），L型钙离子通道激动剂（例如，BayK8644）或者TFG-β受体抑制剂。诱导细胞重编程的基本步骤包括：（1）收集来自供体的细胞，（2）通过例如使诸如Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc之类的多肽表达对细胞进行诱导，（3）选择多能性干细胞，（4）分离克隆，以及（5）任选地，存储细胞。在上述诱导细胞重编程的每个步骤中均包括细胞的培养和扩增。最后得到的诱导多能性干细胞可用于各种应用领域，例如细胞移植治疗，等等。

在本发明的诱导细胞重编程的方法中使用的来自供体的细胞可为多种哺乳动物的细胞。合适的哺乳动物细胞群的实例包括但不限于：成纤维细胞、骨髓衍生的单核细胞、骨骼肌细胞、脂肪细胞、外周血单核细胞、巨噬细胞、神经干细胞、肝细胞、角质细胞、口腔角质细胞、头发毛囊真皮细胞、胃上皮细胞、肺上皮细胞、滑膜细胞、肾细胞、皮肤上皮细胞或成骨细胞。

来自供体的细胞还可为来源于不同类型的组织的细胞，所述组织例如，骨髓、皮肤（例如，真皮、上皮）、头皮组织、肌肉、脂肪组织、外周血、骨骼肌或平滑肌。细胞还可衍生自新生儿组织，包括但不限于：脐带组织（例如，脐带、脐带血、脐带血容器）、羊膜、胎盘或者其他不同的新生儿组织（例如，骨髓液、肌肉、脂肪组织、外周血、皮肤、骨骼肌，等等）。

来自供体的细胞优选地为人细胞，但是也可来自于非人类的哺乳动物的细胞。非人类的哺乳动物包括但不限于：非人类的灵长类动物（例如，猿、猴子、猩猩）、啮齿类动物（例如，小鼠、大鼠）、牛、猪、绵羊、马、狗、猫或兔子。

在本发明的一些实施方式中，可从患有各种不同的疾病的患者中收集细胞，或者，可从未患病的人体中收集细胞。在一些情况下，从患有如下疾病或处于患上如下疾病的风险中的人体中收集细胞，所述疾病例如，慢性病（例如，心血管疾病）、眼部疾病（例如，黄斑变性）、听力疾病（例如，失聪）、糖尿病、认知功能障碍、精神分裂症、抑郁症、躁郁症、痴呆、神经退行性疾病、阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化、骨质疏松症、肝病、肾病、自体免疫性疾病、哮喘或增殖失调疾病（例如，癌症）。在一些情况下，可从患有如下疾病或处于患上如下疾病的风险中的人体中收集细胞，所述疾病例如，急性发生的疾病，例如，中风、脊髓损伤、烧伤、创伤，等等。

在一些实施方式中，本发明的制备iPSC的方法中使用的诸如Oct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc、Nanog和Lin28之类的其他诱导因子（IF）的氨基酸序列可为这些因子的天然生成的氨基酸序列，例如人或小鼠Oct3/4、人或小鼠Klf4、人或小鼠Sox2、人或小鼠c-Myc、人或小鼠Nanog以及人或小鼠Sox2，或者可为IF的天然生成的氨基酸序列的变体（即，非天然生成的氨基酸序列），但该变体在功能和结构上与天然生成的氨基酸序列具有同源性。

评价两个或多个氨基酸序列的功能或结构同源性的方法通常包括确定氨基酸序列之间的百分比一致性。百分比一致性指所比较的序列共有位置相同残基（即氨基酸或核苷酸）的数量。可使用本领域的标准算法（例如Smith和Waterman,1981,Adv.Appl.Math.2:482;Needleman和Wunsch,1970,J.MoI.Biol.48:443;Pearson和Lipman,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,85:2444）或者通过这些算法的计算机化版本（Wisconsin Genetics Software Package Release7.0,Genetics Computer Group,575Science Drive,Madison,WI）进行序列比对和比较，所述计算机化版本公开可用为BLAST和FASTA。另外，通过美国国家卫生研究院（Bethesda MD）可用的ENTREZ可用于序列比较。当使用BLAST和缺口BLAST程序时，可使用各个程序（例如BLASTN，在美国国家生物技术信息中心的因特网站点上可用）的缺省参数。在一个实施方案中，可使用缺口权重为1的GCG来确定两个序列的百分比同一性，使得每个氨基酸缺口给予权重如同它是两个序列间的单氨基酸不匹配。或者，可使用ALIGN程序（2.0版），其是GCG（Accelrys，San Diego，CA）序列比对软件包的一部分。

本发明中的“Oct3/4”是八聚合体（Octamer，Oct）家族转录因子之一，在维持多能性方面具有关键作用。Oct3/4+细胞（例如卵裂球和胚胎干细胞）中Oct3/4的缺失会导致自发的滋养层分化，因此Oct3/4的存在产生胚胎干细胞的多能性和分化潜力。Oct家族中的多个其他基因，包括Oct3/4的近亲Oct1和Oct6，不能诱导多能性，因此证明了Oct3/4在诱导多能性过程中的专有性。

与Oct3/4类似，Sox基因家族与维持多能性相关，虽然其与多能干细胞和单能干细胞相关，但其与Oct3/4专有性地在多能干细胞中表达不同。虽然Sox是Yamanaka等人最初使用的用于诱导多能性干细胞产生的基因，但是发现Sox家族中的其他基因也在诱导过程中起作用。Sox1以类似于Sox2的效率产生iPSC，Sox3、Sox15和Sox18也产生iPSC，虽然效率较低。

在制备诱导多能性干细胞中，至少一个Oct成员（例如Oct3/4）和至少一个Sox成员（例如Sox2）是促进多能性产生所需的。Yamanaka等人（KazutoshiTakahashi,et al.,Cell,131:1-12,2007）报道了Nanog对于诱导多能性产生不是必需的，但是俞君英等人（Junying Yu,et al.Science,318:1917-1920,2007）报道了可以使用Nanog作为因子之一来促进iPSC形成并且Nanog确实以剂量依赖的方式提高重编程效率。

Lin28是一种mRNA结合蛋白，其在胚胎干细胞和胚胎癌细胞中表达，与分化和增殖相关。俞君英等人（Junying Yu,et al.Science,318:1917-1920,2007）证明Lin28是产生iPSC的一个因子，虽然其不是必需的。

Klf基因家族的Klf4最初由Yamanaka等人鉴定，并由Jaenisch等人（Jaenisch,Science,240:1468-1474,1998）确认为用于产生小鼠iPSC的因子，并由Yamanaka等人（Kazutoshi Takahashi,et al.,Cell,131:1-12,2007）证明是用于产生人类iPSC的因子。Klf2和Klf4是能够产生iPSC的因子，相关的基因Klf1和Klf5同样也能够产生iPSC，只是效率较低。

Myc基因家族是参与癌症的原癌基因。Yamanaka等人和Jaenisch等人（Jaenisch,Science,240:1468-1474,1998）证明c-Myc是参与产生小鼠iPSC的因子。Yamanaka等人证明c-Myc是参与产生人iPSC的因子。但是，c-Myc不是产生人类iPSC所必需的。n-Myc和L-Myc已被鉴定为以与c-Myc类似的效率诱导iPSC产生。

Jhdm1b是含JmjC结构域的组蛋白去甲基化酶（JmjC-domain-containinghistone demethylase，JHDM）家族中一个进化上保守且普遍表达的成员，其也被称为Fbxl10。

Glis1是Gli样转录因子1（Glis family zinc finger1），Glis1富集于未受精卵母细胞和胚胎的单细胞阶段，能促进多个重新编程早期步骤，能够替代c-Myc促进诱导多能性干细胞的形成。

Sall4是婆罗双树样基因4（sal-like4，SALL4）位于染色体20q13.13-13.2，编码蛋白是1个含有8个锌指基序的转录因子。Sall4基因在胚胎早期发育、器官形成以及胚胎干细胞增殖和多能性维持方面发挥着重要作用。

Lrh1是核受体FTZ-F1亚家族成员，其能够替代Oct4

Id1是骨形态发生蛋白（BMP）的下游因子，其能够促进Oct4和Sox2两因子体系中的体细胞的重编程。

Esrrb是孤雌受体家族蛋白，其在胚胎干细胞中发挥着重要作用，具体而言，沉默Esrrb，会导致胚胎干细胞在LIF（白细胞抑制因子）存在的情况下分化；另外，蛋白组学研究发现，Esrrb可以与Nanog发生蛋白-蛋白相互作用。

Lef1是淋巴增强结合因子1，其是在前体B细胞和T细胞中表达的分子量为48kD的核内蛋白。Lef1与T细胞受体α（TCRA）增强子中的功能性重要位点结合并且赋予最大增强子活性。Lef1属于与高迁移率族蛋白-1（HMG1）具有同源性的调节蛋白家族。

Utf1是未分化的胚胎细胞转录因子1（Undifferentiated embryonic celltranscription factor1），其在干细胞中高表达，定位在细胞核内，可以调节干细胞的染色质状态，抑制干细胞分化。

miRNA C代表miRNA基因簇302-367，该miRNA基因簇通过加速间充质细胞至上皮细胞的转化来提高体细胞重编程的效率（B.Liao et al.,J Biol Chem,286(19):17359–17364,2011）。

本领域技术人员已知多种多能性因子。优选地，所述多能性因子包括Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4、Esrrb、Nanog以及Lin28。上述多能性因子可以根据所要导入的细胞而由任何来源衍生得到。优选的多能性因子为小鼠多能性因子及其变体，例如，Sox2，NCBI登录号为NM_011443.3；Oct4，NCBI登录号为NM_013633.2；Klf4，NCBI登录号为NM_010637.2；c-Myc，NCBI登录号为NM_010849.4；Nanog，NCBI登录号为NM_028016；Lin28，NCBI登录号为NM_145833。c-Myc还可由其突变体L-myc替代（NCBI登录号为NM_008506.2），或者由其突变体N-Myc（NCBI登录号为NM_008709.3）替代。

将促进体细胞重编程的因子或组合物导入细胞的方法

通常通过将某些干细胞相关的基因转染进入非多能性细胞（例如，成纤维细胞）来制备iPSC。在目前的实践中，通常通过整合病毒载体（例如逆转录病毒）来实现转染。转染的基因包括转录调节因子（例如Oct3/4和Sox）。在转染关键时期之后，少数的转染细胞开始变成在形态上和生物化学上与多能干细胞类似的细胞，通常通过形态学选择加倍时间或者通过报告基因和抗生素感染来进行分离。

2007年Yamanaka的研究组和俞君英的研究组分别从成年人细胞中诱导产生了iPSC。Yamanaka的研究组使用四个关键基因Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc通过逆转录病毒系统成功地将人成纤维细胞转化为诱导多能性干细胞。俞君英的研究组使用Oct4、Sox2、Nanog和Lin28通过慢病毒系统成功地将人成纤维细胞转化为诱导多能性干细胞。

在一些实施方式中，重编程载体可以是病毒载体，例如逆转录病毒载体，以在细胞中表达这些重编程因子。

载体

本领域技术人员熟知通过标准重组技术构建载体的方法（例如，Sambrookand Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual3rd Ed.,Cold SpringHarbor Laboratory Press,2001；和Ausubel et al.,Current Protocols in MolecularBiology,GreenePubl.Assoc.Inc.&John Wiley&Sons,Inc.,MA,1994）。载体包括但不限于：质粒、粘粒、病毒（噬菌体、动物病毒和植物病毒）以及人工染色体（例如YAC），其中，病毒载体包括逆转录病毒载体（例如源自莫罗尼氏鼠白血病病毒（MoMLV）、MSCV、SFFV、MPSV、SNV等的载体）、慢病毒载体（例如，源自HIV-1、HIV-2、SIV、BIV、FIV等的载体）、腺病毒（Ad）载体（包括它的有复制能力、无复制能力和裸腺病毒形式）、腺相关病毒（AAV）载体、猿猴病毒40（SV40）载体、牛乳头瘤病毒载体、Epstein-Barr病毒载体、疱疹病毒载体、痘病毒载体、哈维鼠肉瘤病毒载体、鼠乳腺肿瘤病毒载体、劳斯肉瘤病毒载体。

在一些实施方式中，载体是病毒载体。逆转录病毒和慢病毒载体已被成功用于体细胞的重编程。病毒载体可以有效地将细胞导入宿主细胞并将其自身DNA导入宿主细胞。病毒载体是一类表达构建体，其利用病毒序列以将核酸导入细胞。某些病毒通过受体介导的细胞内吞作用感染细胞或进入细胞并整合进入宿主细胞基因组并稳定且有效表达病毒基因的能力使其成为将外源核酸转移进入细胞（例如哺乳动物细胞）的优良候选者。下面描述可用于递送本发明的用于制备iPSC的组合物或因子组合的载体的非限定性实例。

a.逆转录病毒载体

逆转录病毒具有作为基因递送载体的潜力是由于它们具有以下能力：将其基因整合进入宿主基因组，转移大量的外源遗传物质，感染多种物种和细胞类型，并在特殊的细胞系内装配。

为了构建逆转录病毒载体，将核酸插入病毒基因组中以替换某些病毒序列，从而产生复制缺陷型病毒。为了产生病毒粒子，构建装配细胞系，其包含gag、pol和env基因，但不含LTR和装配组分。当包含cDNA以及逆转录病毒LTR和装配序列的重组质粒被导入特殊细胞系时（例如通过磷酸钙沉淀法），装配序列允许重组质粒的RNA转录本被装配进入病毒颗粒，然后其被分泌到培养基中。然后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选地进行浓缩并用于基因转移。逆转录病毒能够感染多种类型的细胞。

b.慢病毒载体

慢病毒是复合的逆转录病毒，除了普通的逆转录病毒基因gag、pol和env之外，还包含具有调节或结构功能的其他基因。慢病毒载体是本领域熟知的，参见，例如美国专利第6,013,516号和第5,994,136号。

重组慢病毒载体能够感染非分裂中的细胞并且可用于体内和离体基因转移以及核酸序列表达。例如美国专利5,994,136中描述了能够感染非分裂中的细胞的重组慢病毒，其中以携带装配功能基因（即gag、pol和env）以及rev和tat的两个或两个以上载体转染合适的宿主细胞。

c.RNA病毒载体

本发明中的病毒载体还可以由RNA病毒构建，所述RNA病毒包括单链RNA（ssRNA）病毒、双链RNA（dsRNA）病毒。在一些实施方式中，病毒是dsRNA病毒，包括但不限于：传染性胰腺坏死病毒、传染性腔上囊病病毒、维多利蠕孢菌病毒、囊状病毒、减毒病毒属、分病毒、α潜隐病毒属、β潜隐病毒属、轮状病毒属等。在一些实施方式中，病毒是ssRNA病毒，包括但不限于：冠状病毒属、SARS、头甲病毒、虱P病毒、Plautia stali肠病毒、蚜虫病毒、琉璃叶蝉病毒1（HoCV-1）、家蟋病毒、海洋RNA病毒属、肠道病毒属、鼻病毒、脊髓灰质炎病毒、感冒病毒、甲型肝炎病毒、脑心肌炎病毒、副肠孤病毒、马乙型鼻病毒、塞内卡谷病毒、脊髓灰质炎病毒、樱桃锉叶病毒、温州蜜柑矮缩病毒、Sequi病毒属、托拉多病毒、矮化病毒属、线虫传多面体病毒、黑悬钩子坏死病毒、诺瓦克病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、丙型肝炎病毒、登革热病毒、β四病毒属、ω四病毒属、风疹病毒、罗斯河病毒、辛德毕斯（Sindbis）病毒、切昆贡亚病毒、戊型肝炎病毒、疱疹病毒、埃波拉病毒、马尔堡病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、尼帕（Nipah）病毒、Hendra病毒、狂犬病病毒、伊派病毒、拉沙病毒、Lujo病毒、淋巴球性脉络丛脑膜炎病毒、Mobala病毒、Mopeia病毒、Amapari病毒、查帕雷病毒、Flexal病毒、Guanarito病毒、胡宁病毒、拉丁美洲病毒、Machjupo病毒、花漾病毒、Paraná病毒、伯钦特病毒、Pirital病毒、Sabiá病毒、塔卡里伯病毒、它米阿米病毒、白水阿罗约病毒、汉坦病毒、Dugbe病毒、布尼奥罗病毒、立夫特山谷热病毒、流感病毒、鲑传贫病毒、索戈托病毒属、丁型肝炎病毒、乙型肝炎病毒等。

调节元件

载体还可含有其他成分或功能性，它们进一步调节基因传递和/或基因表达，或者为靶向的细胞提供有益特征，例如，影响与细胞的结合或影响靶向细胞的成分（包括调节细胞类型或组织特异性结合的成分）；影响细胞对载体核酸的摄取的成分；影响摄取之后多核苷酸在细胞内的定位的成分（例如调节细胞定位的试剂）；以及影响多核苷酸表达的成分。

载体中包括的真核细胞表达盒优选地包含（以5’至3’的方向）：与蛋白编码序列可操作地连接的真核细胞转录启动子、剪接信号（包括插入序列）以及转录终止/多腺苷化序列。

启动子/增强子

“启动子”是控制序列，其为核酸序列的区域，在该区域控制转录的启动和速率。启动子可以包含可被调节性蛋白和分子（例如RNA聚合酶）和其它转录因子结合的遗传元件，以启动核酸序列的特定转录。词语“可操作地定位”、“可操作地连接”、“在......控制下”和“在......转录控制下”的意思是启动子相对于核酸序列而言处于正确的功能位置和/或方向，以控制该序列的转录启动和/或表达。

启动子一般包含这样的序列：其作用是定位RNA合成的起始位点。这样的序列的最有名的实例是TATA盒，但是一些启动子缺少TATA盒，例如哺乳动物末端脱氧核苷酸基转移酶基因的启动子，以及SV40晚期基因的启动子，起始位点本身之上的离散元件辅助固定起始位置。另外的启动子元件调节转录启动的频率。通常而言，这些元件位于起始位点上游30-110bp的区域，虽然已经表明很多启动子也包含位于起始位点下游的功能元件。为了使编码序列在启动子的控制之下，人们将转录阅读框的转录起始位点的5’端置于所选的启动子的下游（即置于其3’端）。处于上游的“启动子”刺激DNA的转录并促进所编码的RNA的表达。

启动子元件之间的间隔通常是灵活可变的，所以，当元件被倒置或彼此相对发生移动时，能够保持启动子的功能。在tk启动子中，启动子元件之间的间隔可以增至相隔50bp，此后发生活性的下降。取决于启动子，似乎单个元件可以协调发挥作用或独立地激活转录。启动子可以与增强子联用或者不与之联用，增强子是指参与核酸序列的转录激活的顺式调节序列。

启动子可以是与核酸序列天然结合的启动子，其可以通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5’非编码序列来获得。此类启动子可以被称作“内源性的”。类似地，增强子可以是与核酸序列天然结合的增强子，位于该序列的下游或上游。可选地，通过将编码核酸区段置于重组或异源启动子（即在其天然环境中通常不与核酸序列结合的启动子）控制下将会产生某些益处。重组或异源增强子是指在其天然环境中通常不与核酸序列结合的增强子。此类启动子或增强子可以包括其它基因的启动子或增强子，以及分离自任意其它病毒或原核或真核细胞的启动子或增强子，以及“天然不存在”的启动子或增强子，即含有不同转录调节区的不同元件，和/或改变表达的突变。例如，在构建重组DNA时最常使用的启动子包括β-内酰胺酶（青霉素酶）、乳糖和色氨酸（trp）启动子系统。除了通过合成方式产生启动子和增强子的核酸序列之外，还可以使用重组克隆和/或核酸扩增技术来产生序列，例如PCR方法。也可以使用非细胞核细胞器（例如线粒体、叶绿体等）内的指导序列转录和/或表达的控制序列。

通常而言，使用有效指导DNA区段在所选的用于表达的细胞器、细胞类型、组织、器官或生物中的表达的启动子和/或增强子具有重要意义。分子生物学领域技术人员一般知晓用于蛋白表达的启动子、增强子和细胞类型。所使用的启动子可以是组成型的、组织特异性的、可诱导的和/或可用于在合适条件下指导所导入的DNA区段的高水平表达的启动子，这在大规模生产重组蛋白和/或肽中具有优势。启动子可以是异源的或内源的。

另外，任何启动子/增强子组合（按照例如真核细胞启动子数据库EPDB，http://www.epd.isb-sib.Ch/）也可用于驱动表达。使用T3、T7或SP6细胞质表达系统是另一种可行的实施方式。如果提供合适的细菌聚合酶（作为递送复合物的一部分或作为另外的遗传表达构建体），真核细胞可以支持从某些细菌启动子进行细胞质转录。

启动子的非限制性实例包括早期或晚期病毒启动子，例如SV40早期或晚期启动子，细胞巨化病毒（CMV）立即早期启动子，劳斯肉瘤病毒（RSV）早期启动子；真核细胞启动子，例如β肌动蛋白启动子（Ng,Nuc.Acid Res.,17:601-615,1989,Quitsche等人，1989）、GADPH启动子（Alexander et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85:5092-5096,1998;Ercolani et al.,J.Biol.Chem.,263:15335-15341,1988）、金属硫蛋白启动子（Karin et al.,Cell,36:371-379,1989；Richards et al.,Cell,37:263-272,1984）；以及级联应答元件启动子，例如环式AMP应答元件启动子（ere）、血清应答元件启动子（sre）、佛波酯启动子（TPA）和最简TATA盒附近的应答元件启动子（tre）。还可以使用人类生长激素启动子序列（例如，描述于Genbank的人类生长激素最简启动子，登记号X05244的核苷酸283-341）或小鼠乳腺肿瘤启动子（可以从ATCC，Cat.No.ATCC45007获得）。具体实例可以是磷酸甘油酸激酶（PGK）启动子。

启动信号

编码序列的有效翻译还可能需要特定的启动信号。这些信号包括ATG起始密码子或邻近的序列。可能需要提供外源的翻译控制信号，包括ATG起始密码子。本领域普通技术人员将能够容易地确定这一点并提供必要的信号。熟知的是起始密码子必须与想要的编码序列的阅读框处于框架内，以确保整个插入子的翻译。外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或合成的。可以通过加入合适的转录增强子元件来增强表达效率。

多克隆位点

载体可以包括多克隆位点（MCS），其是包含多个限制性酶位点的核酸区域，所述酶中的任一种可用于根据标准重组技术来消化该载体（参见，例如Carbonelli et al.,FEMS Microbiol.Lett.,177(1):75-82,1999;Levenson et al.,Hum.Gene Ther.,9(8):1233-1236,1998;Cocea,Biotechniques,23(5):814-816,1997，通过引用并入本文）。“限制性酶消化”是指以仅在核酸分子的特定位置发挥作用的酶催化性切割核酸分子。很多这样的限制性酶是商业上可以获得的。本领域技术人员普遍理解此类酶的使用。通常，使用在MCS内切割的限制性酶将载体线性化或片段化，以使外源序列连接进入载体。“连接”是指在两个核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程，所述两个核酸片段可以是彼此连续的或不连续的。涉及限制性酶和连接反应的技术是重组技术领域技术人员熟知的。

剪接位点

多数经转录的真核RNA分子将经历RNA剪接以从初级转录本中除掉内含子。含有基因组真核序列的载体可能需要供体和/或受体剪接位点以确保转录本的正确加工以表达蛋白（参见，例如Chandler et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94(8):3596-601,1997，通过引用并入本文）。

终止信号

本发明的载体或构建体可能需要至少一个终止信号。“终止信号”或“终止子”包含参与通过RNA聚合酶特异性终止RNA转录本的DNA序列。因此，在一些实施方式中涉及结束RNA转录本产生的终止信号。终止子可能是体内所必需的以实现想要的信使水平。

在真核系统中，终止子区域还可以包含特定的DNA序列，其允许新转录本的位点特异性切割，从而暴露多腺苷化位点。这会向专职的内源聚合酶发出信号，使其将一串大约200个残基A（多聚A）添加到转录本的3’末端。经此多聚A尾巴修饰的RNA分子表现得更加稳定并且更有效地被翻译。因此，在其它涉及真核细胞的实施方式中，优选地，终止子包含用于RNA切割信号，更优选地，终止子信号促进信使的多聚腺苷化。终止子和/或多聚腺苷化位点元件可用于增强信使水平，并使从盒读入其它序列的读取最小化。

考虑到用于本发明的终止子包括如本文描述的或本领域普通技术人员已知的任意已知的转录终止子，包括但不限于，例如，基因的终止序列，例如牛生长激素终止子或病毒终止序列，例如SV40终止子。在一些实施方式中，终止信号可以是可转录或可翻译序列的缺失，例如由于序列截短所造成的。

多腺苷化信号

在表达时，尤其是真核表达时，通常会包括多腺苷化信号以进行转录本的正确的多腺苷化。优选的多腺苷化信号包括SV40多腺苷化信号或牛生长激素多腺苷化信号。多腺苷化可以增强转录本的稳定性或者可以促进细胞质转运。

载体递送

在本发明中，将重编程载体导入体细胞中可以使用任何合适的用于核酸递送以转化细胞的方法，如本文所描述或如本领域普通技术人员已知的。此类方法包括但不限于，DNA的直接递送，例如通过离体转染（Wilson et al.,Science,244:1344-1346,1989;Nabel等人，1989），通过注射（美国专利第5,994,624号,第5,981,274号,第5,945,100号,第5,780,448号,第5,736,524号,第5,702,932号,第5,656,610号,第5.589,466号和第5,580,859号，每篇通过引用并入本文），包括微注射（Harland and Weintraub,J.Cell Biol.,101(3):1094-1099,1985；美国专利第5,789,215号，通过引用并入本文）；通过电穿孔（美国专利第5,384,253号，通过引用并入本文；Tur-Kaspa et al.,Mol.Cell Biol.,6:716-718,1986；Potter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:7161-7165,1984）；通过磷酸钙沉淀（Graham and Van Der Eb,Virilogy,52:456-467,1973.；Chenand Okayama,Mol.Cell Biol.,7(8):2745-2752,1987；Rippe et al.,Mol.Cell Biol.,10:689-695,1990）；通过使用DEAE-葡聚糖，然后通过聚乙二醇（Gopal,Mol.Cell Biol.,5:1188-1190,1985）递送；通过直接的声波载入（Fechheimer et al.,Proc Natl.Acad.Sci.USA,84:8463-8467,1987）；通过脂质体介导的转染（Nicolau and Sene,Biochim.Biophys.Acta,721:185-190,1982；Fraley et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76:3348-3352,1979；Nicolau et al.,Methods Enzymol.,149:157-176,1987；Wong et al.,Gene,10:87-94,1980；Kaneda et al.,Science,243:375-378,1989；Kato et al.,J.Biol.Chem.,266:3361-3364,1991）和受体介导的转染（Wu and Wu,Biochemistry,27:887-892,1988;Wu and Wu,J.Biol.Chem.,262:4429-4432,1987）；通过微弹轰击（WO94/09699和WO95/06128；美国专利第5,610,042号；第5,322,783号；第5,563,055号；第5,550,318号；第5,538,877号和第5,538,880号，每篇通过引用并入本文）；通过以碳化硅纤维搅拌（Kaeppier et al.,Plant Cell Reports,9:415-418,1990；美国专利第5,302,523号和第5,464,765号，每篇通过引用并入本文）；通过农杆菌介导的转化（美国专利第5,591,616号和第5,563,055号,每篇通过引用并入本文）；通过PEG介导的原生质体转化（Omirulleh et al.,Plant Mol.Biol.,21(3):415-428,1993；美国专利第4,684,611号和第4,952,500号，每篇通过引用并入本文）；通过干燥/抑制介导的DNA摄取（Potrykus et al.,Mol.Gen.Genet.,199(2):169-177,1985），以及任意此类方法的组合。通过应用诸如此类的技术，可以稳定地或瞬间地转化细胞器、细胞、组织或生物体。

脂质体介导的转染

在本发明的一些实施方式中，核酸可以包载在脂复合物例如脂质体中。脂质体是囊泡结构，其特征在于磷脂双层膜和内部水性介质。多层脂质体具有被水性介质分开的多个脂层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，它们会自发形成。在形成封闭结构并将水和溶解的溶质包载在脂双层之间以前，脂成分会经历自我重排（Ghosh and Bachhawat,Gopal,1985）。还考虑到核酸与Lipofectamine（Gibco BRL）或Superfect（Qiagen）的复合。所使用的脂质体的量可以根据脂质体的性质以及所使用的细胞而变化，例如，考虑到大约5μg至大约20μg载体DNA/1-10×10⁶个细胞。

在体外进行脂质体介导的核酸递送和外源DNA的表达已经是非常成功的（Nicolau和Sene,1982；Fraley等人，1979；Nicolau等人，1987）。也已经证明了脂质体介导的外源DNA递送和在培养的鸡胚胎、HeLa和肝细胞瘤细胞中表达的可行性（Wong et al.,Gene,10:87-94,1980）。

在本发明的一些实施方式中，脂质体可以与血凝病毒（HVJ）复合。已表明这会促进与细胞膜的融合并促进脂质体包载的DNA进入细胞（Kaneda等人，1989）。在其它实施方式中，脂质体可以与细胞核非组蛋白染色体蛋白（HMG-I）复合或与之结合使用（Kato et al.,J.Biol.Chem.,266:3361-3364,1991）。在其它实施方式中，脂质体可以与HVJ和HMG-I二者复合或与之结合使用。在其它实施方式中，递送介质可以包含配体和脂质体。

电穿孔

在本发明的一些实施方式中，通过电穿孔法将核酸导入细胞。电穿孔包括将细胞悬浮液和DNA暴露于高压放电。可以通过机械击伤使受体细胞变得更加易于转化。同样，所使用的载体数量可以根据所使用的细胞的性质而变化，例如，大约5μg至大约20μg载体DNA/1-10×10⁶个细胞。

通过电穿孔法转染真核细胞已经是相当成功的做法。已经以人类κ_免疫球蛋白基因转染了小鼠pre-Β淋巴细胞（Potter等人，1984），也已经按照这种方式以氯霉素乙酰转移酶基因转染了大鼠肝细胞（TurKaspa等人，1986）。

磷酸钙

在本发明的其它实施方式中，使用磷酸钙沉淀法将核酸导入细胞中。已经使用该技术以腺病毒5DNA转染了人类KB细胞（Grahamand Van Der Eb，1973）。同样，按照这种方式，已经以新霉素标志物基因转染了小鼠L(A9)、小鼠C127、CH0、CV-1、BHK、NIH3T3和HeLa细胞（Chen和Okayama，1987），并且以多种标志物基因转染了大鼠肝细胞（Rippe等人，1990）。

DEAE-葡聚糖

在其它实施方式中，使用DEAE-葡聚糖、然后以聚乙二醇将核酸递送进入细胞中。按照这种方式，将报告分子质粒导入了小鼠骨髓瘤和红白血病细胞（Gopal，1985）。

声波载入

本发明的其他实施方式包括通过直接声波载入法来导入核酸。已经通过声波载入法以胸苷激酶基因转染了LTK-成纤维细胞（Fechheimer等人，1987）。

受体介导的转染

另外，可以通过受体介导的递送介质将核酸递送进入靶细胞。这利用了靶细胞内发生的受体介导的细胞内吞作用选择性摄取大分子这一优势。鉴于多种受体的细胞类型特异性分布，该递送方法增加了本发明的另外的特异性程度。

一些受体介导的基因靶向囊泡包括细胞受体特异性的配体和核酸结合试剂。其它的包括细胞受体特异性配体，待递送的核酸与之可操作地连接。有数种配体已被用于受体介导的基因转移（Wagner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87(9):3410-3414,1990；Perales et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:4086-4090,1994；Myers,EPO0273085），其建立起了该技术的可行性。已经描述了另一种哺乳动物细胞类型情况下的特异性递送（Wu and Wu,Adv.DrugDelivery Rev.,12:159-167,1993；通过引用并入本文）。在本发明的一些方面，将配体选择为对应于在靶细胞群体上特异性表达的受体。

在其它实施方式中，细胞特异性核酸靶向囊泡的核酸递送介质成分可以包括与脂质体联合的特异性结合配体。待递送的核酸装在所述脂质体内，并且所述特异性结合配体功能性地掺入所述脂质体的膜中。因此脂质体特异性与靶细胞的受体结合并将内容物递送进入细胞。已经表明此类系统是功能性的，使用了这样的系统：例如，其中表皮生长因子（EGF）用于通过受体介导的核酸递送，递送进入显示出EGF受体上调的细胞中。

在其它实施方式中，靶向递送介质的核酸递送介质成分可以是脂质体本身，其优选包含一种或多种指导细胞特异性结合的脂或糖蛋白。例如，已经将乳糖酰基神经酰胺，半乳糖末端神经节苷脂，掺入脂质体，并且观察到肝细胞对胰岛素基因摄取的增加（Nicolau等人，1987）。考虑到可以按照类似方式将本发明的组织特异性转化构建体特异性递送进入靶细胞中。

微弹轰击

微弹轰击技术可用于将核酸导入至少一个细胞器、细胞、组织或生物体（美国专利号第5,550,318号；美国专利第5,538,880号；美国专利第5,610,042号和WO94/09699；每篇通过引用并入本文）。该方法依赖于将DNA包被的微弹加速至高速的能力，以允许它们穿过细胞膜并进入细胞而不杀死细胞（Kleinet al.,Nature,327:70-73,1987）。本领域已知有多种微弹轰击技术，其中很多可用于本发明。

在这种微弹轰击方法中，可以使用至少一个核酸包被一个或多个颗粒并通过推进力将其递送进入细胞。已经开发了数种用于加速小颗粒的装置。一种此类装置利用高压放电以产生电流，继而提供驱动力（Yang等人，1990）。所使用的微弹由生物惰性物质组成，例如钨或金颗粒或珠子。示例性的颗粒包括那些包含钨、钼和优选金的颗粒。在一些情况下，DNA沉淀到金属颗粒上对于通过微弹轰击将DNA递送进入受体细胞而言不是必需的。另一方面，颗粒也可以包含DNA而不是被DNA包被。DNA包被的颗粒可以增强通过颗粒轰击递送的DNA的水平，但是就其本身而言不是必需的。

为了进行轰击，将悬浮液中的细胞浓缩于纤维或固体培养基上。可替代地，可以将未成熟的胚胎或其它靶细胞排列于固体培养基上。将待轰击的细胞置于微弹阻停板下合适的距离。

此外，在本发明的方法中，也可通过使用非病毒载体将某些干细胞相关的基因转染进入非多能性细胞（例如，成纤维细胞）来制备iPSC。所述非病毒载体的实例包括单独的寡核苷酸或与合适的蛋白质、多糖或脂质制剂结合的寡核苷酸。

术语“寡核苷酸”是指核糖核酸（RNA）或脱氧核糖核酸（DNA）的寡聚体或多聚体，或模拟物。“寡核苷酸”包括天然的和/或修饰的单体或键合的线性或环状寡聚体，包括脱氧核糖核苷类、核糖核苷类、其取代形式和α-异头物形式、肽核酸（PNA）、锁核酸（LNA）、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯，及其它类似物。寡核苷酸能够通过单体-单体相互作用（例如，Watson-Crick型碱基配对，或反式型碱基配对，等等）的常规模式特异性地结合靶多核苷酸。寡核苷酸可以是“嵌合的”，即由不同的区域组成。在本发明中，“嵌合的寡核苷酸”或“嵌合体（chimeras）”是含有两个或两个以上化学上不同的区域的寡核苷酸，其中，每个区域由至少一个核苷酸构成。这些寡核苷酸通常包括至少一个修饰的核苷酸区域和作为能够切割RNA:DNA或RNA:RNA杂交体的酶的底物的区域，其中，所述至少一个修饰的核苷酸区域赋予一种或一种以上有益性能（如，提高对核酶的耐受性、提高细胞的摄取、提高RNA靶的结合亲和力）。

非病毒载体主要包括改性的天然高分子和合成高分子两大类。改性的天然高分子主要是脂质类（如固醇类）、多糖类（如壳多糖、右旋糖苷和藻酸等）、蛋白质类（如胶原蛋白、鱼精蛋白等）以及多肽类的物质。合成高分子则主要是一些可以生物降解的（如聚赖氨酸、聚乳酸、聚乙烯醇及其嵌段或接枝共聚物等）、聚阳离子性的高分子（聚乙烯亚胺、聚酰胺树枝状高分子等）。这些改性的天然高分子和合成高分子充当运送载体，分别以微球、囊泡或胶束等形式包覆DNA，运送到达病理部位后进行释放。

iPSC的选择

在本发明的一些方面，在将重编程载体导入体细胞之后，培养这些细胞以进行扩展。可以根据载体元件（例如报告分子或选择标志物）的存在来选择细胞，以浓缩经转染的细胞。重编程载体在这些细胞中表达重编程因子，并随着细胞分裂而复制和分割。这些被表达的重编程因子会诱导体细胞基因组进行重编程，以建立自我持续的多能性状态，同时或在除掉存在的载体的阳性选择之后，外源遗传元件将逐渐丧失。转基因表达的沉默允许根据报告基因表达的关闭来选择诱导的多能性干细胞，或联合其它胚胎干细胞的特征来选择诱导的多能性干细胞，因为本领域已知胚胎干细胞与多能性干细胞的特征基本相同。

本文使用的术语“干细胞”是指能够自我复制和具有多能性的细胞。通常而言，干细胞可以使受损的组织再生。本文的干细胞可以是但不限于：胚胎干细胞或组织干细胞（也称作组织特异性干细胞，或成体干细胞）。胚胎干细胞（ESC）是源自早期胚胎的多能性干细胞。胚胎干细胞首先于1981年建立，从1989年开始，其也被用于产生敲除小鼠。在1998年建立了人胚胎干细胞，目前胚胎干细胞开始应用于再生医学。与胚胎干细胞不同，组织干细胞具有有限的分化潜力。组织干细胞存在于组织中的特定位置，并且具有未分化的细胞内结构。因此，组织干细胞的多能性通常较低。组织干细胞具有较高的核质比并且具有极少的细胞内细胞器。多数组织干细胞具有低的多潜能性、长的细胞周期和超出个体生命的增殖能力。基于细胞所来源的位点（例如皮系统、消化系统、骨髓系统、神经系统等），组织干细胞被分成多个类别。皮系统中的组织干细胞包括表皮干细胞、毛囊干细胞等。消化系统中的组织干细胞包括胰腺（普通）干细胞、肝脏干细胞等。骨髓系统中的组织干细胞包括造血干细胞、间质干细胞等。神经系统中的组织干细胞包括神经干细胞、视网膜干细胞等。

本文使用的“诱导多能性干细胞”通常简写为iPSC，是指通过插入被称作重编程因子的基因以人工方式从非多能性细胞（例如体细胞）制备的一类多能性干细胞，所述非多能性细胞通常是成年体细胞或末端分化的细胞，例如成纤维细胞、造血细胞、肌细胞、神经元、表皮细胞等。本文使用的“多能性”是指干细胞具有分化成构成一种或多种组织或器官或优选三个胚层中的任何一个胚层的所有细胞的潜力：内胚层（胃内层、胃肠道、肺）、中胚层（肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖器）或外胚层（表皮组织和神经系统）。本文使用的“多能性干细胞”是指能够分化成源自三个胚层中的任一层细胞的细胞，例如，全能细胞或诱导的多能性细胞的后代。

报告基因

本发明的一些实施方式使用报告基因以指示成功的转化。例如，报告基因可以位于表达盒内并且在通常与编码重编程基因的编码区结合的调节元件的控制之下，以同时表达。报告分子允许包含重编程载体的细胞被分离而无需将它们置于药物或其它选择性压力下或使细胞具有存活性的风险。另外的好处是以沉默的报告分子表达来富集诱导的多潜能干细胞。

此类报告基因的实例包括编码细胞表面蛋白（例如CD4、HA表位）、荧光蛋白、抗原决定簇和酶（例如半乳糖苷酶）的基因。包含载体的细胞可以被分离，例如使用针对细胞表面蛋白的荧光标记的抗体通过FACS分离或通过可以被载体编码的酶转化为荧光产物的底物来分离。

在具体的实施方式中，报告基因是荧光蛋白。已经开发了众多荧光蛋白遗传变体，其特征荧光发射光谱几乎跨越整个可见光谱。在最初的维多利亚水母绿色荧光蛋白中进行的诱变已经产生了新的荧光探针，其颜色范围从蓝色到黄色，它们是生物研究中最常在体内使用的一些报告分子。已经从海洋中的海葵和珊瑚（属于珊瑚纲）中开发了在橙色和红色光谱区发射的较长波长的荧光蛋白。还开发了其它种类以产生类似的具有青色、绿色、黄色、橙色和深红色荧光发射的蛋白。正在进行开拓性研究努力以改善荧光蛋白的亮度和稳定性，从而改善它们的总体效用。

根据报告基因的表达选择iPSC

导入了本发明的重编程因子的组合的细胞可以同时表达报告分子和重编程因子，并且可以在不同的时间点根据报告基因表达的存在或不存在来进行选择。例如，可以各根据报告基因的存在来选择细胞，并且可以通过使用报告基因优化转染。可以根据报告基因的丧失来筛选诱导的多能性干细胞，因为在重编程过程中转基因会被沉默。这种选择或筛选是基于由报告基因的表达产生的可检测信号，其作为转基因表达的指示。

可以通过多种方式中的任一种来产生可检测信号，这取决于本发明的方法中所使用的报告基因的性质。例如，可检测信号可以是发光，例如荧光信号，例如GFP。GFP是一种荧光多肽，其产生荧光信号而无需底物或辅因子。GFP的表达和检测技术是本领域熟知的，可以从商业上获得试剂盒，例如从Clontech获得。可以在完整细胞中测定GFP的表达，无需将其裂解或添加另外的试剂。或者，所述可检测信号可以是由酶活性或细胞表面标志物例如LNGFR的识别而产生的信号。

流式细胞术，例如，荧光激活的细胞分选（FACS）被普遍用于基于报告基因的表达来选择可检测信号。FACS提供了将细胞的异质混合物分选进入两个或更多个容器的方法，每次分选一个细胞，其基于每个细胞的特定光散射和荧光特征。这提供了从单个细胞中发出的荧光信号的快速的、客观的和定量的记录，并提供了诱导的多能性细胞的物理分离。

萤光素酶也可用作测定的基础。萤光素酶的表达是本领域已知的，萤光素酶的表达和检测试剂盒可以从Clontech（Palo Alto,Calif.）通过商业渠道获得。有利地，在通过闪烁计数器监视发光信号之前，将细胞裂解并向细胞中加入萤光素底物，以测定萤光素酶的存在。

基于酶的测定法的实施方式与基于萤光素酶的测定法类似，不同之处在于检测不一定是通过发光进行。检测技术将取决于酶，因此可以是目测（例如在半乳糖苷酶的情况下）。

物理和生物化学方法也可用于鉴定或定量本发明的报告基因的表达。这些方法包括但不限于：（1）Southern分析或PCR扩增，以检测并确定重组DNA插入子的结构；（2）Northern印迹、S-IRNase保护、引物延伸或逆转录酶-PCR扩增，以检测并检查基因构建体的RNA转录本；（3）酶测定法，以检测酶活性（当此类基因产物由基因构建体编码时）；（4）蛋白凝胶电泳、Western印迹技术、免疫沉淀或酶联免疫测定（当基因构建体产物是蛋白时）；以及（5）由于所导入的基因构建体的表达而产生的化合物的生物化学测定。另外的技术，例如原位杂交、酶染色和免疫染色也可用于检测特定细胞中报告基因的存在或表达。

根据胚胎干细胞特征进行选择

先前的研究中成功产生的iPSC在以下方面与天然分离的多能性干细胞（例如，小鼠胚胎干细胞（mESC）和人胚胎干细胞（hESC）是显著相似的，由此确认了iPSC相对于天然分离的多能性细胞的性质、真实性和多能性。因此，除了报告基因表达的存在或不存在以外，可以基于下列一个或多个胚胎干细胞特征来选择根据本发明公开的方法制备的诱导多能性细胞。

a.细胞生物学特征

形态学：iPSC在形态上类似于ESC。每个细胞可以具有圆形、大的核仁并缺乏细胞质。iPSC的群落也可以与ESC类似。人类iPSC形成具有明显边界的、平坦的、紧密聚集的群落，这与hESC类似；小鼠iPSC形成与mESC类似的群落，不如hESC的群落平坦，比hESC的群落聚集度更高。

生长特征：加倍时间和有丝分裂活性是ESC的要素，因为干细胞必须自我更新。iPSC在有丝分裂活性、自我更新活性、增殖和分裂速率方面可以与ESC相同。

干细胞标志物：iPSC可以表达在ESC上表达的细胞表面抗原性标志物。人类iPSC表达hESC特异性的标志物，包括但不限于SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E和Nanog。小鼠iPSC表达SSEA-1但不表达SSEA-3也不表达SSEA-4，这与mESCs是类似的。

干细胞基因：iPSC可以表达在未分化的ESC中表达的基因，包括Oct-3/4、Sox2、Nanog、GDF3、REX1、FGF4、ESG1、DPPA2、DPPA4和hTERT。

端粒酶活性：端粒酶是维持细胞分裂不受Hayflick极限（～50次细胞分裂）限制所必需的。ESC表达高端粒酶活性，以维持自我更新和增殖，iPSC也显示出高端粒酶活性并表达TERT（人端粒酶逆转录酶），其为端粒酶蛋白复合物中的必要成分。

多能性：iPSC将能够以类似于ESC的方式分化为完全分化的组织。

神经的分化：iPSC可以分化成神经元，表达βIII-微管蛋白、酪氨酸羟化酶、AADC、DAT、ChAT、LMXlB和MAP2。儿茶酚胺相关的酶的存在可以指示iPSC（类似于hESC）可以分化成为多巴胺能神经元。在分化之后，干细胞相关的基因将会被下调。

心脏的分化：iPSC可以分化为心肌细胞，其自发开始跳动。心肌细胞表达TnTc、MEF2C、MYL2A、MYHC0和NKX2.5。在分化之后，干细胞相关的基因将会被下调。

畸胎瘤形成：注射进入免疫缺陷型小鼠的iPSC可能在一定时间之后（例如9周）自发形成畸胎瘤。畸胎瘤是含有源自三个胚层即内胚层、中胚层和外胚层的组织的多谱系肿瘤；这与其它肿瘤不同，其它肿瘤通常仅是一种细胞类型。畸胎瘤的形成是多能性的标志测定。

胚状体：培养中的ESC自发形成球状胚胎样结构，其被称作“胚状体”，其由具有有丝分裂活性的和分化中的ESC的核心和来自所有三个胚层的完全分化的细胞的外围组成。iPSC也可能形成胚状体并具有外周分化的细胞。

胚泡注射：ESC天然地驻留于胚泡的内细胞群（成胚区）内，在成胚区中分化为胚胎；而胚泡的壳（滋养层）分化为胚胎外的组织。中空的滋养层不能形成活的胚胎，因此，成胚区中的胚胎干细胞必须分化并形成胚胎。通过微量吸液将iPSC注射进入滋养层以产生被转移进入雌性受体的胚泡，这可能导致产生嵌合的活的小鼠幼崽：具有10%-90%的嵌合性，遍布其身体掺入了iPSC衍生物的小鼠。

b.表观遗传学的重编程

启动子去甲基化：甲基化是甲基被转移至DNA碱基，通常是甲基被转移至CpG位点（邻近的胞嘧啶/鸟嘌呤序列）中的胞嘧啶分子。基因的广泛甲基化会通过抑制表达蛋白的活性或募集干扰表达的酶而对表达产生干扰。因此，基因的甲基化会通过阻止转录而有效地使其沉默。内源的多能性相关的基因（包括Oct3/4、Rexl和Nanog）的启动子可能在iPSC中被去甲基化，显示出其启动子活性以及多能性相关的基因在iPSC中的活性启动和表达。

组蛋白去甲基化：组蛋白是在结构上定位于DNA序列的紧凑的蛋白，其可以通过多种染色质相关的修饰发挥其活性。与Oct3/4、Sox2和Nanog相关的H3组蛋白可以被去甲基化以激活Oct3/4、Sox2和Nanog的表达。

培养iPSC

在根据本发明的方法制备诱导多能性干细胞的过程中，在培养细胞的过程中使诱导重编程因子和选择标志物进行表达，随后根据上述细胞生物学特征和表观遗传性特征对所得到的细胞进行筛选。在一些实施方式中，在进行诱导之前对细胞进行一段时间的培养，或者，无需前期培养直接对细胞进行诱导和选择。在一些实施方式中，在不同的时间段使用不同的细胞培养基。例如，在诱导之前使用一种类型的培养基，而在诱导过程中使用另一类型的培养基。有时在选择细胞的过程中使用第三种类型的培养基。

在从供体样本（例如，组织样本或细胞样本）中收集细胞之后，根据不同的细胞类型或组织类型使用合适的培养基。一些代表性的培养基包括但不限于：多能性成体祖细胞（MAPC）培养基，FBM（由Lonza生产），胚胎干细胞（ESC）培养基，间充质干细胞生长培养基（MSCGM）（由Lonza生产），MCDB202改良的培养基，内皮细胞培养基kit-2（EBM2）（由Lonza生产），IMDM，DMEM，MEF调节的ES和mTeSR^TM。

本文中主要使用诱导iPS的培养基主要有如下几种：

mES培养基：DMEM（High Glucose,Gibco）+15%FBS（Gibco）+1×非必需氨基酸+1×谷氨酰胺GlutaMAX（1×,Gibco）＋丙酮酸钠（1×，Gibco）＋青霉素/链霉素（50untis/ml P，50mg/ml S，Hyclone）+0.1mMβ-巯基乙醇+1000u白细胞抑制因子LIF（millipore）；

无血清培养基iSF1：该培养基所包含的组分及其含量在中国专利申请CN200910038883.4，PCT/CN2009/074358中公开，该专利申请通过引用并入本文。

化学成分确定的无血清培养基iCD1：该培养基所包含的组分及其含量在中国专利申请201010167062.3，以及Rational optimization of reprogrammingculture conditions for the generation of induced pluripotent stem cells withultra-high efficiency and fast kinetics.Cell Res21,884-894中公开。

MEF培养基：包含高糖DMEM，2mM L-谷氨酰胺，1×非必需氨基酸。

ES培养基：其包括以下几种：

（1）mES培养基：DMEM（High Glucose,Gibco）+15%FBS（Gibco）+1×非必需氨基酸+2mM谷氨酰胺GlutaMAX（1×,Gibco）＋丙酮酸钠（1×，Gibco）＋青霉素/链霉素（50untis/ml P，50mg/ml S，Hyclone）+0.1mMβ-巯基乙醇+1000u白细胞抑制因子LIF（millipore）；

（2）mKSR培养基：knock-out DMEM（Gibco）+15%KSR+1×非必需氨基酸+2mM谷氨酰胺GlutaMAX（1×,Gibco）＋青霉素/链霉素（50untis/mlP，50mg/ml S，Hyclone）+0.1mMβ-巯基乙醇+1000u白细胞抑制因子LIF（millipore）；

（3）N2B27+2i培养基：knock-out DMEM（Gibco）/DMEM（High Glucose,Gibco）(1/1)+N2无血清添加剂(Gibco,0.5X)+B27无血清添加剂（Gibco,0.5X)+1×非必需氨基酸+2mM谷氨酰胺GlutaMAX（1×,Gibco）＋青霉素/链霉素（50untis/ml P，50mg/ml S，Hyclone）+0.1mMβ-巯基乙醇+1000u白细胞抑制因子LIF（millipore）+3mM CHIR99021+1μM PD0325901。

在从供体（例如，人或者小鼠）中分离细胞之后立即对细胞进行初期培养。可在初期培养之后，对细胞进行二次培养。二次培养是指对初期培养后的细胞进行再培养一次。在一些情况下，对初期培养的细胞进行一次再培养（即，二次培养），或者进行两次再培养（即，三次培养）。培养细胞的技术是本领域所熟知的。在本发明优选的实施方式中，对细胞进行初期培养和二次培养。在一些情况下，在进行诱导之前，细胞可被培养1天至12天，例如，细胞可被培养2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天，等等。在其他情况下，细胞可被培养超过12天，例如，细胞可被培养12天至20天、12天至30天或者12天至40天。在一些实施方式中，在对细胞进行诱导之前，对待诱导的细胞进行传代，例如，传代1次、传代2次或者传代3次。

在一些情况下，以低密度培养细胞，例如，细胞密度为1×10³个细胞/cm²、1×10⁴个细胞/cm²。在一些实施方式中，以1×10³个细胞/cm²至3×10⁴个细胞/cm²的密度培养细胞。

通常在向细胞中导入诱导重编程的因子之前，先在第一培养基中培养细胞和/组织，随后在向细胞中导入诱导重编程的因子的过程中和/或之后，在第二或第三培养基中培养细胞。

在本发明的一些实施方式中，在逆转录病毒开始进行转染时，立即将细胞在MEF培养基中培养，随后，在诱导重编程的因子开始表达时，在mES，mES+Vc，iSF1，iCD1及其他ES细胞培养基中培养细胞。

当使用低血清浓度培养基或高血清浓度培养基培养细胞时，可在培养基中加入一种或一种以上生长因子，例如，成纤维细胞生长因子（碱性FGF），血小板衍生的生长因子（PDGF），上皮细胞生长因子（EGF），胰岛素样生长因子（IGF），IGF II，或者，培养基可包含胰岛素。可用于补充细胞培养基的其他生长因子包括但不限于：转化生长因子β-1（TGFβ-1），激活素A，脑源性神经营养因子（BDNF），神经生长因子（NGF），神经营养因子（NT）-1，NT-2或者NT-3。在一些实施方式中，上述这些生长因子中的一个或一个以上可用于替代MC-ES培养基或其他细胞培养基中的bFGF或FGF-2。

本文所述的培养基（例如，mES，iSF1，iCD1，N2B27+2i，mTeSR1^TM）中的生长因子（例如，bFGF，EGF，IGF，胰岛素，TGFβ-1，激活素A）的浓度可为4ng/ml至50ng/ml,例如，2ng/ml,3ng/ml,4ng/m,5ng/ml,6ng/ml,7ng/ml,8ng/ml,10ng/ml,12ng/ml,14ng/ml,15ng/ml,17ng/ml,20ng/ml,25ng/ml,30ng/ml,35ng/ml,40ng/ml,45ng/ml,或50ng/ml。

在本发明的具体实施方式中，与小鼠胚胎干细胞（mESC）一样，可以将iPSC维持在以下培养基中：

（1）DMEM（High Glucose,Gibco）+15%FBS（Gibco）+1×非必需氨基酸+2mM谷氨酰胺GlutaMAX（1×,Gibco）＋丙酮酸钠（1×，Gibco）＋青霉素/链霉素（50untis/ml P，50mg/ml S，Hyclone）+0.1mMβ-巯基乙醇+1000u白细胞抑制因子LIF（millipore）；

（2）N2B27+2i培养基：knock-out DMEM（Gibco）/DMEM（High Glucose,Gibco）(1/1)+N2无血清添加剂(Gibco,0.5X)+B27无血清添加剂（Gibco,0.5X)+1×非必需氨基酸+2mM谷氨酰胺GlutaMAX（1×,Gibco）＋青霉素/链霉素（50untis/ml P，50mg/ml S，Hyclone）+0.1mMβ-巯基乙醇+1000u白细胞抑制因子LIF（millipore）+3mM CHIR99021+1μM PD0325901。

在本发明的制备iPSC的方法中，待诱导的细胞可在37℃，5%CO2孵育器中培养，优选地，在培养细胞的过程中每天更换培养基，培养8天至15天之后，根据本文所述的细胞生物学特征和表观遗传学特征鉴定并选择诱导多能性干细胞集落。

本发明制备的iPSC的用途

iPSC具有很多用途。它们可进一步分化产生不同类型的细胞，例如，神经细胞、肝细胞或心肌细胞。它们还可产生其他类型的干细胞，例如，神经干细胞，肝干细胞或心脏干细胞。它们能够分化为特定细胞系中的细胞。被诱导的细胞以及从其中分化得到的细胞可用于细胞移植疗法。因为被诱导的细胞可从非胚胎细胞诱导产生，所以细胞移植疗法包括向受治者提供从他或她自身组织衍生得到的细胞，从而降低可能的排异反应。

iPSC还可用于化疗药物的筛选，将通过本发明的方法制备得到的iPSC进一步分化为特定的细胞系的细胞，例如神经细胞、肝细胞、心肌细胞、上皮细胞，等等，然后将待筛选的药物作用于各种类型的细胞上，测定待筛选的药物的细胞毒性和有效性，等等，从而筛选出具有最低的细胞毒性和最高的疗效的药物。

iPSC分化

iPSC细胞可分化为各种不同类型的细胞系。分化的细胞的实例包括从外胚层中分化的细胞（例如，神经细胞和成纤维细胞）系，从中胚层中分化的细胞（例如，心肌细胞）系或者从内胚层中分化的细胞（例如，乙酰细胞）系。分化的细胞可为一种或一种以上如下细胞：胰岛β细胞、神经干细胞、神经元（例如，多巴胺能神经元）、少突胶质细胞、少突胶质细胞的祖细胞，肝细胞、肝干细胞、星形细胞、心肌细胞、造血干细胞或心脏细胞。

从根据本发明的方法制备得到的诱导多能性干细胞中衍生得到的分化细胞可为最终分化的细胞，或者可生成特定细胞系的细胞。例如，iPSC可分化为多种专能性细胞，例如，神经干细胞、心脏干细胞或肝干细胞。干细胞可进一步分化为新的细胞类型，例如，神经干细胞可进一步分化为神经元，心脏干细胞可进一步分化为心肌细胞，肝干细胞可进一步分化为肝细胞。

本领域已熟知多种将iPSC分化为特定细胞类型的方法。分化iPSC的方法与分化干细胞（例如，胚胎干细胞，造血干细胞，等等）的方法类似。在一些情况下，分化在体外进行，而在一些情况下，分化在体内进行。

本领域技术人员已熟知从胚胎干细胞中分化产生神经干细胞的方法可用于从iPSC中分化产生神经干细胞，参见例如，Reubinoff et al.,Nat,Biotechnol.,19(12):1134-40,2001,Nat,Biotechnol.,19(12):1134-40。例如，神经干细胞可通过在悬浮液中培养iPSC，在存在生长因子（例如，FGF-2）的条件下产生，参见，Zhang et al.,Nat.Biotech.,(19):1129-1133,2001。在一些情况下，可在含有FGF-2的无血清培养基中培养iPSC的聚集体。在其他实施方式中，iPSC可与小鼠基质细胞系在存在含有FGF-2的无血清培养基的条件下共培养。在其他实施方式中，iPSC可直接转移至含有FGF-2的无血清培养基中，从而直接诱导iPSC分化。

从iPSC中衍生得到的神经干细胞可进一步分化为神经元，少突胶质细胞或星形细胞。通常用于产生神经干细胞的条件也可用于产生神经元、少突胶质细胞或星形细胞。

iPSC可通过本领域已知的方法（例如，参见，Lumelsky et al.,Science,292:1389-1394,2001;Assady et al.,Diabetes,50:1691-1697,2001;D'Amour et al.,Nat.Biotechnol.,24:1392-1401,2006;D'Amour et al.,Nat.Biotechnol.23:1534-1541,2005）进一步分化为胰岛β细胞。所述方法包括在补充由激活素A的无血清培养基中培养iPSC，随后在补充有全反式维甲酸的无血清培养基中培养iPSC，随后在补充有bFGF和烟酰胺的无血清培养基中培养iPSC。

还可从iPSC中分化得到肝细胞或肝干细胞。例如，在存在丁酸钠的条件下培养iPSC可得到肝细胞，参见例如，Rambhatla et al.,Cell Transplant,12:1-11,2003。在一些实施方式中，iPSC可通过在存在激活素A的条件下培养2天至6天（例如，2天、3天、4天、5天或6天），随后在存在肝细胞生长因子的条件下培养5天至10天（例如，5天、6天、7天、8天、9天或10天）被分化为肝细胞或肝干细胞。

组合物

本发明还提供一种促进诱导多能性干细胞形成的组合物，所述组合物包含：

（i）c-Jun拮抗剂，和选自下列七组因子中的一组因子：（1）Sox2、Klf4和c-Myc，（2）Klf4和c-Myc，（3）Oct3/4、Klf4和c-Myc，（4）Sox2、Nanog和Lin28，（5）Oct3/4、Nanog和Lin28，（6）Oct3/4、Klf和Sox2以及（7）Klf4和Sox2；或者

所述组合物包含：

（ii）c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1；以及Glis1、Sall4或Lrh1中的至少一个；或者

所述组合物包含：

（iii）c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1；以及Oct4、Klf4、Sox2、Lin28、Esrrb、Lef1、Utf1或miRNA C中的至少一个。

在本发明的一些实施方式中，本发明的促进诱导多能性干细胞形成的组合物包含：c-Jun拮抗剂和Sox2、Klf4以及c-Myc，或者所述组合物包含c-Jun拮抗剂和Oct3/4、Klf4以及c-Myc，或者，所述组合物包含c-Jun拮抗剂和Oct3/4、Klf4以及c-Myc，或者，所述组合物包含c-Jun拮抗剂和Oct3/4、Klf以及Sox2，或者所述组合物包含c-Jun拮抗剂和Sox2以及Klf4。

在本发明的一实施方式中，本发明的促进诱导多能性干细胞形成的组合物包含：c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1；以及Glis1、Sall4或Lrh1中的至少一个。在优选的实施方式中，所述组合物包含c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1；以及Glis1、Sall4或Lrh1。

在本发明的一些实施方式中，本发明的促进诱导多能性干细胞形成的组合物包含c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1以及Oct4；或者所述组合物包含c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1以及Klf4；或者所述组合物包含c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1以及Sox2；或者所述组合物包含c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1以及Lin28；或者所述组合物包含c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1以及Esrrb；或者所述组合物包含c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1以及Lef1；或者所述组合物包含c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1以及Utf1；或者所述组合物包含c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1以及miRNA C制备iPSC。

在一些实施方式中，本发明的组合物可通过例如逆转录病毒载体或慢病毒载体被导入从供体（例如小鼠或人）中获得的细胞（例如，小鼠胚胎成纤维细胞），随后将细胞在本文所述的培养诱导多能性细胞的条件下进行培养，从而在体外对体细胞进行重编程，制备诱导多能性干细胞。

在一些实施方式中，本发明的组合物可包含其中分别转染了本发明的促进重编程的因子中的一种或一种以上的病毒和转染了c-Jun拮抗剂的病毒，所述病毒例如，逆转录病毒、慢病毒、痘病毒、腺病毒，等等。在一些实施方式中，本发明的组合物可包含编码本发明的促进重编程的因子中的一种或一种以上的核酸和c-Jun拮抗剂的核酸。在本发明的一些实施方式中，本发明的组合物可包含包裹有一种或一种以上病毒载体的脂质体，所述病毒载体中分别转染了本发明的促进重编程的因子和c-Jun拮抗剂。

试剂盒

本发明还提供一种包含促进诱导多能性干细胞形成的组合物的试剂盒，该试剂盒还包括包装和/或本发明的组合物的使用说明。该试剂盒中还包括使用本发明的组合物培养诱导多能性干细胞所需的培养平板、培养基（例如，ES培养基、MC-ES培养基）以及补充物（例如，成纤维细胞生长因子（FGF）-2，碱性FGF，血小板衍生的生长因子（PDGF），上皮细胞生长因子（EGF）和胰岛素）以及可以指示iPSC形成的绿色荧光蛋白（GFP）。该试剂盒还可包括从供体收集细胞样本或组织样本的工具、保存所述细胞样本或组织样本的培养瓶等。所述试剂盒中的说明书可向使用者提供关于组合物的使用及其相关信息。该说明书可为任何合适的形式，包括，但不限于，印刷物、录像带、电脑可读盘或光盘。

实施例

实施例1.c-Jun对体细胞重编程的抑制作用

（1）c-Jun在体细胞和干细胞中发挥不同作用

为了研究c-Jun在体细胞和干细胞中所发挥的作用，选取小鼠胚胎干细胞和小鼠胚胎成纤维细胞作为模型，使用TRIzol提取小鼠胚胎干细胞和小鼠胚胎成纤维细胞中的总mRNA，随后，通过如下所述的步骤进行qPCR：用ReverTraAce（Toyobo）和oligo-dT制备cDNA，随后用Premix Ex Taq进行qPCR（Takara）分析。

图1A为与Oct4和Nanong相比，c-Jun在小鼠胚胎干细胞、诱导多能性干细胞和小鼠胚胎成纤维细胞中的表达水平。如图1A所示，c-Jun在小鼠胚胎干细胞和诱导多能性干细胞中表达较低，而在小鼠胚胎成纤维细胞中表达较高。

为了进一步验证qPCR测试得到的结果，进行蛋白免疫印迹（Western-Blot）分析（以GAPDH作为对照）：将细胞培养物用蛋白裂解液裂解，通过SDS-PAGE凝胶电泳分离之后，转膜封闭，用与蛋白对应的一抗进行孵育，进而用相应的二抗孵育，最后用显色液显色，X-光片显影定影，通过特异条带大小观察蛋白表达量。图1B显示了与Oct4相比，c-Jun在小鼠胚胎干细胞、诱导多能性干细胞和小鼠胚胎成纤维细胞中的表达水平。如图1B所示，与上述qPCR测试得到的结果一致，c-Jun在小鼠胚胎干细胞和诱导多能性干细胞中表达较低，而在小鼠胚胎成纤维细胞中表达较高。

接下来，通过如下步骤对c-Jun进行基因敲除：采用TALEN基因编辑技术，首先设计针对Jun基因特异位点的TALEN载体，同时构建含嘌呤霉素抗性的Jun缺失质粒对基因组上的c-Jun进行取代，通过抗性筛选和基因鉴定最终得到纯合敲除的c-Jun（c-Jun-/-）和杂合敲除的c-Jun（c-Jun+/-）并在蛋白质水平对纯合敲除的c-Jun（c-Jun-/-）和杂合敲除的c-Jun（c-Jun+/-）进行了验证（如图1C所示）。比较野生型c-Jun（c-Jun+/+）、c-Jun-/-以及c-Jun+/-小鼠胚胎干细胞中的c-Jun表达水平以及上述基因敲除对小鼠胚胎干细胞和小鼠成纤维细胞的增殖的影响。图1D和图1E表示随着细胞培养天数的增加c-Jun+/+c-Jun-/-和c-Jun+/-细胞数量的变化。如图1D所示，c-Jun+/+、c-Jun-/-和c-Jun+/-小鼠胚胎干细胞的数量显著增加，而c-Jun-/-小鼠胚胎成纤维细胞的数量并未增加，只有c-Jun+/+小鼠胚胎成纤维细胞的数量增加（如图1E所示）。并且如图1F和图1G所示，c-Jun-/-小鼠胚胎干细胞中多能性基因的表达水平类似并且在EB球实验中c-Jun-/-小鼠胚胎干细胞能够分化为三个胚层的细胞。这些结果说明，c-Jun纯合敲除后的c-Jun-/-小鼠胚胎干细胞正常增殖，而c-Jun-/-小鼠成纤维细胞无法正常增殖。由此说明，c-Jun在体细胞和干细胞中的表达和所发挥的作用完全不同。

本发明中PCR分析所使用的引物（5’-3’）如下：

mFos-q-F      GGGAACGGAATAAGATGGCT(SEQ ID NO.4)

mFos-q-R      TGGGCTGCCAAAATAAACTC(SEQ ID NO.5)

mFosB-q-F     TGTCTTCGGTGGACTCCTTC(SEQ ID NO.6)

mFosB-q-R     GATCCTGGCTGGTTGTGATT(SEQ ID NO.7)

mFra1-q-F     GAGACCGACAAATTGGAGGA(SEQ ID NO.8)

mFra1-q-R     CTCCTTCTGGGATTTTGCAG(SEQ ID NO.9)

mFra2-q-F     CCTTGTCTTCACCTACCCCA(SEQ ID NO.10)

mFra2-q-R     TCCCCACTGCTACTGCTTCT(SEQ ID NO.11)

mATF2-q-F     CAAGAAGGCTTCCGAAGATG(SEQ ID NO.12)

mATF2-q-R     AGGTAAAGGGCTGTCCTGGT(SEQ ID NO.13)

mATF3-q-F     ACAACAGACCCCTGGAGATG(SEQ ID NO.14)

mATF3-q-R     TCTTGTTTCGACACTTGGCA(SEQ ID NO.15)

mJun-q-F      TCCCCTATCGACATGGAGTC(SEQ ID NO.16)

mJun-q-R      GAGTTTTGCGCTTTCAAGGT(SEQ ID NO.17)

mJdp2-q-F     AGAAGAGCGAAGGAAAAGGC(SEQ ID NO.18)

mJdp2-q-R     CTCTGCAGAAACTCTGTGCG(SEQ ID NO.19)

GAPDH-q-f     AACTTTGGCATTGTGGAAGGGCTCA(SEQ ID NO.20)

GAPDH-q-r     TTGGCAGCACCAGTGGATGCAGGGA(SEQ ID NO.21)

Nanog-q-f     CTCAAGTCCTGAGGCTGACA(SEQ ID NO.22)

Nanog-q-r     TGAAACCTGTCCTTGAGTGC(SEQ ID NO.23)

Dppa5-q-f     CCGTGCGTGGTGGATAAG(SEQ ID NO.24)

Dppa5-q-r     GCGACTGGACCTGGAATAC(SEQ ID NO.25)

Rex1-q-f      CAGCCAGACCACCATCTGTC(SEQ ID NO.26)

Rex1-q-r      GTCTCCGATTTGCATATCTCCTG(SEQ ID NO.27)

mDnmt3l-q-f   CGGAGCATTGAAGACATC(SEQ ID NO.28)

mDnmt3l-q-r   CATCATCATACAGGAAGAGG(SEQ ID NO.29)

Sox2-q-f      AGGGCTGGGAGAAAGAAGAG(SEQ ID NO.30)

Sox2-q-r      CCGCGATTGTTGTGATTAGT(SEQ ID NO.31)

Errsb-q-f     TTTCTGGAACCCATGGAGAG(SEQ ID NO.32)

Errsb-q-r     AGCCAGCACCTCCTTCTACA(SEQ ID NO.33)

Sall4-q-f     CTAAGGAGGAAGAGGAGAG(SEQ ID NO.34)

Sall4-q-r     CAAGGCTATGGTCACAAG(SEQ ID NO.35)

Oct4-q-f      CATTGAGAACCGTGTGAG(SEQ ID NO.36)

Oct4-q-r      TGAGTGATCTGCTGTAGG(SEQ ID NO.37)

（2）c-Jun对体细胞重编程的抑制作用

如图1H所示，通过如下方法建立DOX诱导性表达c-Jun的小鼠胚胎干细胞（c-Jun^TetOn ESC）用于研究c-Jun对小鼠胚胎干细胞分化的影响：将c-Jun基因核苷酸序列克隆到pW-TRE可诱导慢病毒表达载体上，将包装的病毒感染胚胎干细胞，挑取不同的胚胎干细胞，传代后分别在不添加或添加有DOX的胚胎干细胞培养基中培养，收取RNA和蛋白样品，分别采用q-PCR和蛋白免疫印迹鉴定ES克隆是否转入可诱导的c-Jun。

小鼠体细胞重编程通过如下方式进行：

I.使用如下培养基培养细胞：

饲养层细胞、小鼠胚胎成纤维细胞和PlatE细胞的培养基组成为：高糖基础培养基DMEM，外加10%胎牛血清（FBS）。

小鼠胚胎干细胞培养基的组成成分包含：DMEM高糖培养基，15%FBS，1%NEAA（GIBCO），1mM L-谷氨酰胺，0.1mMβ巯基乙醇及白细胞抑制因子（LIF）。

iCD1培养基：该培养基所包含的组分及其含量在中国专利申请CN201010167062.3中公开，该专利申请通过引用并入本文。

KSR（Knockout Serum Replace）无血清培养基，其是一种商品化代血清干细胞培养添加剂，用于培养干细胞或iPSC的完全KSR无血清培养基，其组成成分为：Knockout-DMEM，15%kKSR，1%NEAA（GIBCO），1mM L-谷氨酰胺，0.1mMβ巯基乙醇及白细胞抑制因子（LIF）。

II.用于重编程的细胞

重编程采用的体细胞类型均为OG2小鼠胚胎成纤维细胞（由实验室自制），传代数不超过三代。OG2小鼠的一个特点是在干细胞特异表达基因Oct4基因的启动子后连有绿色荧光蛋白（GFP）。在重编程过程中，当OG2小鼠胚胎成纤维细胞内源Oct4被激活时，绿色荧光蛋白伴随表达，在荧光显微镜下，可见成功重编程的细胞或克隆细胞团块呈现绿色，通过直接统计重编程克隆即绿色荧光克隆数或采用流式细胞仪分析绿色荧光细胞的比例，可以容易地比较不同条件下的重编程效率。

III.诱导体细胞重编程的方法

如下所述准备重编程细胞。以2万个细胞/孔的密度种植细胞于12孔培养板，细胞种植8小时后，视其密度和状态用带有小鼠重编程因子的病毒进行感染。

i.病毒的制备

用于重编程的转录因子，例如小鼠Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc的cDNA的逆转录病毒载体pMXs；Oct4，NCBI登录号为NM_013633.2；Sox2，NCBI登录号为NM_011443.3；Klf4，NCBI登录号为NM_010637.2；c-Myc，NCBI登录号为NM_010849.4。应用本领域常用的转染试剂将pMX载体上的重编程因子质粒转染进病毒包装细胞（PlatE），转染48小时后用针筒收集病毒上清液，通过孔径为0.45μm的滤膜将该上清液过滤到合适的离心管中，将这样收集的病毒用作第一轮感染用病毒。向plat-E培养盘中再加入新鲜的10ml10%FBS培养基（100mm盘），置于5%CO₂，37℃培养箱中继续培养。24小时后，按同样的方法再次收集病毒用于第二轮感染。

ii.用病毒感染小鼠胚胎成纤维细胞

感染分两轮进行。将每次收集的病毒上清液与MEF细胞培养基以1:1的比例混合（如四因子感染，Oct4:Sox2:Klf4:c-Myc:底培养基为1:1:1:1:1,三因子感染则Oct4:Sox2:Klf4：底培养基为1：1：1：1，以此类推）并添加终浓度为8μg/ml的溴化己二甲铵（polybrene），混合均匀。随后对MEF细胞进行第一轮感染，24小时后用再次收集的病毒按同样方法进行第二轮感染。在感染后不同时间点，在荧光显微镜下观察带有GFP荧光的细胞。

iii.采用流式细胞仪分析GFP荧光细胞的比例或对感染后的细胞进行培养直到诱导多能性干细胞克隆形成，典型的iPS克隆具有与胚胎干细胞相似的形态，并带有绿色荧光（采用的是带有GFP的报告细胞）。统计带有GFP荧光的克隆数目，从而对重编程效率进行比较。

根据上文所述干细胞克隆形成的方法，可使用本发明范围内的各种不同的促进诱导多能性干细胞形成的因子组合进行实验。

本发明中示例性的促进诱导多能性干细胞形成的因子组合如下：

（1）Oct4、Klf4和Sox2，简称为OKS体系，

（2）Oct4、c-Myc、Klf4和Sox2，简称为OKSM体系，

（3）Klf4、Sox2和c-Myc，简称为KSM体系，

（4）Klf4和Sox2，简称为KS体系，

（5）c-JunDN/Jdp2和Jhdm1b、Id1/3、Glis1、Sall4、Lrh1，简称为6F体系。

通过上述方法，在OKS体系以及OKSM体系中测试c-Jun对体细胞的重编程效率的影响。图2A显示了在c-Jun+OKS体系和c-Jun+OKSM体系中，在含血清培养基和无血清培养基中生长的诱导多能性干细胞的克隆数，图2B显示了在c-Jun+OKS体系、对照+OKS体系、c-Jun+OKSM体系、OKSM+对照体系中所得到的诱导多能性干细胞的显微照片，其中对照为没有加入c-Jun的OKS体系和OKSM体系。如图2A和图2B所示，c-Jun强烈抑制体细胞的重编程，c-Jun对体系重编程的效率几乎为0，并且在显微镜视野中几乎看不到任何诱导多能性干细胞。随后，测试了在c-Jun^TetOn ESC+OKS体系中，c-Jun的表达和GFP+iPS克隆数随DOX浓度的变化。图2C显示了不同DOX浓度条件下，c-Jun的表达水平和GFP+iPS克隆数。从图中可以看出，未加入DOX的条件下，c-Jun的表达水平几乎为零而GFP+iPS克隆数最高，随着DOX的不断加入，诱导c-Jun表达水平提高，GFP+iPS克隆数逐渐降低。这表明c-Jun以剂量依赖的方式抑制重编程。同时，测试了在c-Jun^TetOn ESC+OKS体系中，c-Jun的表达和GFP+iPS克隆数随时间的变化。图2D显示了c-Jun的表达水平和GFP+iPS克隆数随DOX的使用天数的变化。从图中可以看出，在不使用DOX时，GFP+iPS克隆数最高，在随着DOX使用天数的增加，c-Jun的表达水平逐渐提高，GFP+iPS克隆数逐渐降低。这表明c-Jun对重编程的抑制作用贯穿整个重编程过程。

通过上面对c-Jun在体细胞和干细胞的不同作用和c-Jun对体细胞重编程的影响的研究，本发明的发明人发现，c-Jun能明显抑制多能性相关基因，从而抑制体细胞重编程而导致干细胞分化，因此，本发明的发明人预见到可以通过拮抗c-Jun的活性而消除c-Jun对体细胞重编程的抑制作用，从而使用c-Jun拮抗剂来促进诱导多能性干细胞的形成。

实施例2.c-Jun中bZIP结构域的作用

1.c-Jun各个结构域对体细胞重编程的影响

通过分子克隆方法构建了c-Jun的JNK-磷酸化位点（Ser63/Ser73）突变体和具有bZIP结构域但缺乏反式激活结构域的位于170位氨基酸至334位氨基酸的截短型c-Jun（c-JunDN）。野生型c-JunWT的氨基酸序列为如下SEQ ID NO.1；c-JunDN的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

野生型c-JunWT（即，全长c-Jun）的氨基酸序列（SEQ ID NO.1）：

mtakmettfy ddalnasflq sesgaygysn pkilkqsmtl nladpvgslk phlraknsdl    60

ltspdvgllk laspelerli iqssnghitt tptptqflcp knvtdeqegf aegfvralae    120

lhsqntlpsv tsaaqpvsga gmvapavasv agagggggys aslhseppvy anlsnfnpga    180

lssgggapsy gaaglafpsq pqqqqqppqp phhlpqqipv qhprlqalke epqtvpempg    240

etpplspidm esqerikaer krmrnriaas kcrkrkleri arleekvktl kaqnselast    300

anmlreqvaq lkqkvmnhvn sgcqlmltqq lqtf                                334

c-JunDN的氨基酸序列（SEQ ID NO.2）：

yanlsnfnpg alssgggaps ygaaglafps qpqqqqqppq pphhlpqqip vqhprlqalk    60

eepqtvpemp getpplspid mesqerikae rkrmrnriaa skcrkrkler iarleekvkt    120

lkaqnselas tanmlreqva qlkqkvmnhv nsgcqlmltq qlqtf                    165

图3A显示了野生型c-Jun（c-JunWT）、Ser63位点磷酸化的突变体（c-JunS63A）、Ser73位点磷酸化的突变体（c-Jun S73A）、Ser63和Ser73位点磷酸化的突变体（c-Jun S63A/S73A）以及具有bZIP结构域但缺乏反式激活结构域的位于170位氨基酸至334位氨基酸的截短型c-Jun（c-JunDN）的蛋白序列示意图。

随后根据实施例1所描述细胞培养方法和重编程效率的检测方法，测试了在OKS和OKSM体系中分别加入c-JunWT、c-Jun S63A、c-Jun S73A、c-JunS63A/S73A以及c-JunDN对重编程效率的影响。图3B显示了OKS和OKSM体系中分别加入c-JunWT、c-Jun S63A、c-Jun S73A、c-Jun S63A/S73A以及c-JunDN后GFP+iPS克隆数的变化，其中对照为未加入任何其他因子的OKS和OKSM体系本身。如图3B所示，在加入了JNK-磷酸化位点突变体（c-Jun S63A、c-JunS73A、c-Jun S63A/S73A）和c-JunWT的OKS和OKSM体系中，GFP+iPS克隆数几乎为零，而在加入了c-JunDN的OKS和OKSM体系中，GFP+iPS克隆数显著增加，这表明作用相同JNK-磷酸化位点突变体（c-Jun S63A、c-Jun S73A、c-Jun S63A/S73A）与c-JunWT作用相同，完全阻断了重编程，而c-JunDN能够显著促进OKS和OKSM体系中体细胞的重编程。图3C显示的干细胞荧光显微照片进一步证实了这个结果，如图3C所示，在加入了c-JunDN的OKS和OKSM体系中产生了较多的干细胞，而添加有野生型c-Jun（c-JunWT）的OKS和OKSM体系中几乎没有干细胞产生，这说明c-JunDN很大程度上促进了体细胞的重编程，从而促进诱导多能性干细胞的形成，而c-JunWT抑制体细胞的重编程。

为了进一步说明c-Jun各个结构域对体细胞重编程的作用，通过本实施例中的上述方法构建了除c-JunDN之外的c-Jun的其他截短型突变体：位于254位氨基酸至334位氨基酸的截短型c-Jun因子（c-Jun a.a254-334）、位于274位氨基酸至334位氨基酸的截短型c-Jun因子（c-Jun a.a274-334）、位于170位氨基酸至282位氨基酸的截短型c-Jun因子（c-Jun a.a170-282），缺乏bZIP结构域的c-Jun因子（c-Jun-bZIP，a.a1-256）以及包含反式激活结构域和bZIP结构域的c-Jun因子（c-Jun a.a75-334）。图4A显示了c-JunWT、c-Jun-bZIP、c-Jun a.a75-334、c-JunDN、c-Jun a.a254-334、c-Jun a.a274-334、c-Jun a.a170-282的蛋白序列示意图。

随后根据实施例1所描述细胞培养方法和重编程效率的检测方法，测试了OKS体系中加入c-JunWT、c-Jun-bZIP、c-Jun a.a75-334、c-JunDN、c-Jun a.a254-334、c-Jun a.a274-334、c-Jun a.a170-282对重编程效率的影响。图4B显示了OKS体系中加入上述这些c-Jun因子突变体之后的采用流式细胞仪分析得到的绿色荧光细胞的比例。从图中可看出，加入了c-JunDN的OKS体系中绿色荧光细胞的比例最大，高达3.5，其次是加入了c-Jun a.a254-334的OKS体系中的绿色荧光细胞的比例，而加入了c-JunWT的OKS体系中绿色荧光细胞的比例最低，几乎为零，加入了c-Jun-bZIP和c-Jun a.a75-334的OKS体系中绿色荧光细胞的比例小于1，加入了c-Jun a.a254-334、c-Jun a.a274-334、c-Jun a.a170-282的OKS体系中绿色荧光细胞的比例略大于1。这说明具有bZIP结构域但缺乏反式激活结构域的截短型c-Jun因子能够显著高效地促进重编程，进而促进诱导多能性干细胞的形成。而c-JunWT和缺乏bZIP结构域的c-Jun因子（c-Jun-bZIP）会抑制重编程，阻碍诱导多能性干细胞的形成。

为了进一步验证bZIP结构域对重编程的影响，比较了c-JunDN和c-Jun-bZIP对重编程效率的影响。图4C显示了分别加入了c-JunDN和c-Jun-bZIP的OKS体系中，在iSF1培养基（高葡萄糖培养基DMEM、10%KOSR、0.5%N2、1000U/mL LIF、5ng/ml bFGF、2mM L-谷氨酰胺、1/100NEAA MEM、0.1mM巯基乙醇、青霉素-链霉素，该培养基所包含的组分及其含量具体请参见中国专利申请CN200910038883.4，该专利申请的全部内容，通过引用并入本文）或补充有维生素C的mES培养基中，得到的GFP+iPS克隆数，其中，对照为未加入任何其他因子的OKS体系本身，载体为pMXs。从图中可以看出，在加入了c-JunDN的OKS体系中，iSF1培养基或补充有维生素C的mES培养基这两种培养基中的GFP+iPS克隆数均显著增加，而加入了c-Jun-bZIP的OKS体系中，上述这两种培养基中的GFP+iPS克隆数小于OKS体系本身所产生的GFP+iPS克隆数，这个结果说明，缺乏bZIP结构域的c-Jun-bZIP因子并不能促进重编程，bZIP结构域是重编程必需的。

同时，从AP-1家族蛋白中分离出了Jun二聚体蛋白2（Jdp2），其氨基酸序列如下：

Jdp2的氨基酸序列（SEQ ID NO.3）：

mmpgqipdps vtagslpglg pltglpssal tteelkyadi rnigamiapl hflevklgkr    60

pqpvkselde eeerrkrrre knkvaaarcr nkkkertefl qreserlelm naelktqiee    120

lklerqqlil mlnrhrptci vrtdsvrtpe segnplleql dkk                      163

通过序列分析发现，Jdp2与c-JunDN具有相同的序列结构。图5A显示了全长c-Jun（c-JunFL）、c-JunDN和Jdp2的序列结构示意图。从图中可看出，Jdp2与c-JunDN具有相同的序列结构特征，即具有bZIP结构域但缺乏反式激活结构域。随后测试了在OKS体系中加入c-JunFL、c-JunDN和Jdp2后的GFP+iPS克隆数。图5B显示了OKS体系中加入c-JunFL、c-JunDN和Jdp2后所得到的GFP+iPS克隆数，对照为OKS体系本身。如图5B所示，与c-JunFL+OKS体系相比，Jdp2与c-JunDN同样能够显著促进OKS体系中体细胞的重编程。

本发明还构建了Jdp2的各种不同的突变体，这些突变体的蛋白序列示意图如图5C所示，这些突变体包括不同长度的缺乏bZIP结构域的突变体（a.a.1-80和a.a.1-100）和包括bZIP结构域的突变体（a.a.1-140、a.a.25-163、a.a.50-163、a.a.77-140、a.a.77-163、a.a.94-163），随后在OKS体系中测试了加入这些Jdp2的突变体对重编程效率的影响。图5D显示了OKS体系中加入上述这些Jdp2的突变体之后的采用流式细胞仪分析得到的绿色荧光细胞的比例。从图中可看出，全长Jdp2具有最高绿色荧光细胞的比例，高于3.0，其次是具有bZIP结构域的Jdp2突变体a.a.25-163，而缺乏bZIP结构域的Jdp2突变体（a.a.1-80和a.a.1-100）的绿色荧光细胞的比例小于1.0，这就进一步说明bZIP结构域对于促进重编程而言是必需的。

实施例3.所得到的诱导多能性干细胞的鉴定

以c-JunDN/Jdp2+KSM（Klf4、Sox2和c-Myc）和c-JunDN/Jdp2+KS（Klf4和Sox2）体系为例，采用小鼠胚胎成纤维细胞，根据上述实施例1所述的方法和培养基，培养诱导多能性干细胞（iPSC）并对得到的诱导多能性干细胞进行如下分析鉴定。

i.PCR分析外源基因整合分析，如图6A所示，在细胞中检测到了外源因子，说明iPSC中有外源因子的整合。

ii.启动子区域甲基化状况分析

采用本领域公知的亚硫酸氢钠测序方法进行启动子区域甲基化状况分析。

图6B显示了c-JunDN/Jdp2+KSM体系和c-JunDN/Jdp2+KS体系培养的诱导多能性干细胞的免疫荧光图像，结果显示上述这两个体系得到的诱导多能性干细胞表面表达REX1，而且表达Nanog。图6C显示c-JunDN/Jdp2+KSM体系获得的诱导多能性干细胞的Oct4启动子区域和Nanog启动子区域的CpG岛甲基化状态分析，图中黑色部分为表示已甲基化，白色表示没有甲基化。从图6C中可以看出，c-JunDN/Jdp2+KSM体系获得的诱导多能性干细胞的Oct4启动子和Nanog启动子的CpG岛的去甲基化程度与小鼠胚胎干细胞的去甲基化程度类似。Nanog和Oct4是胚胎干细胞特异性表达的基因，表达状态与细胞的命运密切相关，这些结果说明，使用c-JunDN/Jdp2+KSM体系获得的细胞其命运发生了改变，也就是说被诱导成为了多能性干细胞。

iii.iPSC的核型鉴定

接下来，通过如下所述的方法对iPSC的核型进行鉴定。

iPSC的核型鉴定按照下述方法进行：

在无饲养条件下培养iPS克隆，当细胞生长至密度为80%-90%时，更换新鲜培养基，并加入终浓度为0.2μg/m的秋水仙素，在37℃培养箱中处理60分钟。吸去培养液，用PBS清洗后，用0.25%胰酶消化收集细胞，在250g条件下，离心处理5分钟，随后加入在37℃下预热的7ml0.075mol/L的氯化钾溶液，吹匀细胞，在37℃的水浴中处理20分钟。

用新配置的卡诺固定液预固定细胞3分钟。预固定结束后，在1200rpm/分钟的条件下离心处理5分钟，丢弃上清液，再加入约7ml新鲜的固定液，随后在37℃的水浴中固定40分钟。在1200rpm/分钟的条件下离心处理5分钟，丢弃大部分固定液，留下部分固定液用于重悬细胞。用冷冻的干净载玻片进行滴片处理，滴片后，马上将载玻片置于75℃的烘箱中烘干3小时。

将0.03g胰蛋白酶粉溶于55ml生理盐水中以制备胰蛋白酶消化液，用3%Tris调节胰蛋白酶消化液的pH值至7.2。随后，将制备好的载玻片放入胰蛋白酶消化液中处理8秒，随后迅速放入生理盐水中终止消化。将载玻片放入Giemsa染色液中进行染色5分钟至10分钟，然后，用镊子夹出载玻片，用自来水轻轻冲洗。室温干燥或电吹风吹干后，油镜下观察分裂相。

核型实验的结果如图6D所示，c-JunDN/Jdp2+KSM体系和c-JunDN/Jdp2+KS体系中培养的诱导多能性干细胞核型正常。这说明产生的诱导多能性干细胞质量良好，没有产生异常染色体。

iv.囊胚嵌合体分析

随后，将iPSC注射到供体小鼠的囊胚腔中，再将注射后的囊胚移植到假孕雌鼠的子宫中制作嵌合体小鼠，根据出生的小鼠的毛色来判定是否产生嵌合。图6E显示了通过本发明的c-JunDN/Jdp2+KSM体系和c-JunDN/Jdp2+KS体系培养的诱导多能性干细胞形成的嵌合体小鼠，产生的第一代小鼠毛色为杂色，下一代的小鼠毛色为纯色，说明产生了生殖系传递的嵌合小鼠。

实施例4.c-JunDN/Jdp2可替代Oct4促进体细胞重编程

i.c-JunDN和Jdp2与Oct4调控相同的基因群

使c-Jun、c-JunDN和Jdp2在小鼠胚胎成纤维细胞中过表达，通过如下所述的RNA-seq方法检测它们调控的基因群。

RNA-seq方法：首先，使用TRIzol制备总RNA，随后，将TruSeq RNA样品Prep试剂盒（RS-122-2001，Illumina）用于文库构建并且使用Miseq Reagent试剂盒V2（MS-102-2001）进行测序，用于RNA-seq。

如图7A和图7B所示，在c-Jun调控的1733基因中，主要富集在神经发育、细胞增殖分化、迁移凋亡和细胞连接方面。图7C显示了c-Jun、Oct4、c-JunDN和Jdp2随着培养天数的增加对小鼠胚胎成纤维细胞的细胞数量的影响，其中，对照为感染空载体的小鼠胚胎成纤维细胞的生长。从图中可看出，c-JunDN和Jdp2能够抑制小鼠胚胎成纤维细胞增殖，并且与Oct4作用方式相似，而c-Jun明显促进小鼠胚胎成纤维细胞增殖，这说明c-Jun与c-JunDN和Jdp2调控的不同的基因，而c-Jun与c-JunDN和Oct4调控基本相同的基因。

接下来，随后研究了c-JunDN、Jdp2、Oct4分别与KSM（Klf4、Sox2和c-Myc）共同诱导小鼠胚胎成纤维细胞重编程过程中调控基因的情况。根据实施例1所述的体细胞培养方法和培养条件，分别在c-JunDN+KSM、Jdp2+KSM、Oct4+KSM这三种体系中培养小鼠胚胎成纤维细胞，在小鼠胚胎成纤维细胞转变为诱导多能性细胞的过程中，通过上述RNA-seq方法检测c-JunDN、Jdp2、Oct4调控的基因群。结果如图8A至图8C所示，这三种因子调控的基因群有很大的相似性，共同调控了1100个基因，共同调控的基因包括在维持多能性、核小体装配、上皮细胞分化方面起重要作用的基因，例如，Tdh、Nodal、Lefhy2、Pax1、Sqrd1、Stx11，等等。以Tdh、Nodal、Lefhy2、Pax1、Sqrd1、Stx11这些基因为例，通过qRT-PCR分析，结果显示（如图8D所示），这些代表性的基因受c-JunDN、Jdp2和Oct4共同调控。由此说明c-JunDN或Jdp2可替代Oct4诱导体细胞重编程。

ii.c-JunDN或Jpd2可替代Oct4促进体细胞重编程

根据实施例1所述的培养方法和培养条件，在KSM+c-JunDN和OKM（Oct4、Klf4和c-Myc）+c-JunDN体系中培养细胞，并检测GFP+iPS克隆数，从而确定这两种体系对重编程效率的影响。图9A显示了KSM+c-JunDN和OKM+c-JunDN体系所获得的GFP+iPS克隆数，其中，“-”表示没有添加c-JunDN，“+”表示加入了c-JunDN。如图9A所示，加入了c-JunDN的OKM体系的GFP+iPS克隆数比未加入c-JunDN的体系显著增加，在没有Oct4的KSM体系中加入c-JunDN也使GFP+iPS克隆数比未加入c-JunDN的体系显著增加。这说明c-JunDN能替代Oct4提高KSM体系的重编程效率，从而促进iPSC产生，也能替代Sox2提高OKM体系的重编程效率，从而促进iPSC产生。

还通过荧光显微成像的方法，观察到了KSM+c-JunDN体系中GFP+iPS克隆，如图9B所示，加入了c-JunDN的KSM体系中iPSC的数目（passage2）较没有c-JunDN的KSM体系（passage0）明显增多。这说明c-JunDN能替代Oct4提高KSM体系的重编程效率，从而促进iPSC产生。

同样，根据实施例1所述的培养方法和培养条件，在KSM+Jdp2和KS+Jdp2中培养细胞，并检测GFP+iPS克隆数，从而确定这两种体系对重编程效率的影响。图10A显示了KSM+Jdp2和KS+Jdp2体系所获得的GFP+iPS克隆数，其中，对照为没有加入Jdp2的KSM或KS体系。如图10A所示，加入了Jdp2的KSM体系和加入了Jdp2的KS体系中GFP+iPS克隆数比未加入Jdp2的体系显著增加。这说明Jdp2能替代Oct4提高KSM体系和KS体系的重编程效率，从而促进iPSC产生。

同样，通过荧光显微成像的方法，观察到了KSM+Jdp2和KS+Jdp2体系中GFP+iPS克隆，如图10B所示，加入了Jdp2的KSM体系和KS体系（passage2）中iPSC的数目较没有Jdp2的KSM体系和KS体系（passage0）明显增多。这也说明Jdp2能替代Oct4提高KSM体系和KS体系的重编程效率，从而促进iPSC产生。

实施例5.能够促进体细胞重编程的六因子体系

先前的研究已发现了能够促进Oct4单因子重编程的因子Jhdm1b[Wang etal,2011]、BMP的下游因子Id1/3[Chen et al,2011b]以及能够促进重编程效率的三个因子Glis1、Sall4、Lrh1[Buganim et al,2012;Heng et al,2010;Maekawa et al,2011]。

本发明的发明人基于上述实验所得到的结果：c-JunDN/Jdp2可替代Oct4，在KSM或KS体系中促进体系重编程，从而促进诱导多能性干细胞的形成，将c-JunDN/Jdp2和Jhdm1b、Id1/3、Glis1、Sall4、Lrh1组合成六因子（6F）体系，根据实施例1所述的培养方法和培养条件，在该六因子条件下培养小鼠胚胎成纤维细胞，检测所得到的细胞的GFP+iPS克隆数。如图11所示，6F体系中培养得到的细胞的GFP+iPS克隆数高达约18，这说明小鼠胚胎成纤维细胞被成功地诱导为多能性干细胞。接着减少6F中的任何一个因子，形成下列五因子体系：

（1）c-JunDN/Jdp2+Jhdm1b+Id1/3+Glis1+Sall4，

（2）c-JunDN/Jdp2+Jhdm1b+Id1/3+Glis1+Lrh1，

（3）c-JunDN/Jdp2+Jhdm1b+Id1/3+Lrh1+Sall4，

（4）c-JunDN/Jdp2+Jhdm1b+Glis1+Sall4+Lrh1，

（5）Jhdm1b+Id1/3+Glis1+Sall4+Lrh1，

（6）c-JunDN/Jdp2+Id1/3+Glis1+Sall4+Lrh1。

同样，根据实施例1所述的培养方法和培养条件，在上述这些五因子条件下分别培养小鼠胚胎成纤维细胞，检测所得到的细胞的GFP+iPS克隆数。结果如图11所示，缺少Glis1、Sall4、Lrh1因子中的任一个的五因子体系，也具有较高的GFP+iPS克隆数，而缺少c-JunDN/Jdp2、Jhdm1b、Id1/3中的任一个的五因子体系的GFP+iPS克隆数几乎为零。这说明c-JunDN/Jdp2、Jhdm1b、Id1/3是体细胞重编程所必需的，缺少Glis1、Sall4和Lrh1中的任一个的五因子体系同样也能够促进体细胞重编程，从而促进诱导多能性干细胞的形成。

通过细胞荧光显微成像方法，观察到了6F体系对诱导多能性干细胞形成的影响，如图12所示的细胞荧光显微照片所示，在6F体系下多能性干细胞明显增多。

根据上述实施例3所述的PCR分析方法、核型鉴定方法和囊胚嵌合体分析方法对6F体系中得到的诱导多能性干细胞进行分析鉴定。结果如图13A至图13C所示。图13A是PCR分析结果，如图所示，得到的iPSC没有整合Ymanaka因子。图13B是核型实验的结果，6F体系中培养的诱导多能性干细胞核型正常。这说明产生的诱导多能性干细胞质量良好，没有产生异常染色体。图13C是iPSC注射到供体小鼠的囊胚腔中，再将注射后的囊胚移植到假孕雌鼠的子宫中得到的嵌合体小鼠的照片。从图中可以看出，小鼠毛色为杂色说明6F体系培养的诱导多能性干细胞能够形成嵌合体小鼠。

虽然本文描述并显示了本发明的优选的实施方式，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，这些实施方式仅仅是举例说明。本领域技术人员可对这些实施方式作出多种改变、修改和替换，而不背离本发明。通过所附的权利要求来限定本发明的范围，并且这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物也被所附的权利要求涵盖。

Claims (12)

1.一种制备诱导多能性干细胞的方法，所述方法包括将促进诱导多能性干细胞形成的组合物引入体细胞，所述组合物包含：

（i）c-Jun拮抗剂，和选自下列七组因子中的一组因子：（1）Sox2、Klf4和c-Myc，（2）Klf4和c-Myc，（3）Oct3/4、Klf4和c-Myc，（4）Sox2、Nanog和Lin28，（5）Oct3/4、Nanog和Lin28，（6）Oct3/4、Klf和Sox2以及（7）Klf4和Sox2；或者

（ii）c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1；以及Glis1、Sall4或Lrh1中的至少一个；或者

（iii）c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1；以及Oct4、Klf4、Sox2、Lin28、Esrrb、Lef1、Utf1或miRNA C中的至少一个；并且

其中，当c-Jun拮抗剂是c-JunDN时，所述组合物不包含下列四组因子：

（1）Sox2、Klf4和c-Myc，（2）Oct3/4、Klf4和c-Myc，（3）Oct3/4、Klf和Sox2以及（4）Klf4和Sox2。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述c-Jun拮抗剂包括具有bZIP结构域但缺乏反式激活结构域的c-Jun拮抗因子和拮抗c-Jun活性的化合物、核酸、蛋白质、RNA。

3.如权利要求2所述的方法，其中，所述c-Jun拮抗剂包括c-Jun基因的截短型c-JunDN或Jdp2或其功能性变体，其中，所述c-JunDN的氨基酸序列为SEQID NO.2，所述Jdp2的氨基酸序列为SEQ ID NO.3，所述c-JunDN的功能性变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.2具有至少70%的同源性，所述Jdp2的功能性变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.3具有至少70%的同源性。

4.如权利要求3所述的方法，其中，所述功能性变体包括：c-JunDN的氨基酸中的1至100个氨基酸的取代、插入和/或缺失，但仍具有bZIP结构域、缺乏反式激活结构域的功能性变体。

5.如权利要求1所述的方法，其中，所述体细胞选自小鼠体细胞和人体细胞。

6.如权利要求5所述的方法，其中，所述小鼠体细胞和所述人体细胞选自：成纤维细胞、骨髓衍生的单核细胞、骨骼肌细胞、脂肪细胞、外周血单核细胞、巨噬细胞、神经干细胞、肝细胞、角质细胞、口腔角质细胞、头发毛囊真皮细胞、胃上皮细胞、肺上皮细胞、滑膜细胞、肾细胞、皮肤上皮细胞或成骨细胞。

7.一种促进诱导多能性干细胞形成的组合物，所述组合物包含：

（i）c-Jun拮抗剂，和选自下列七组因子中的一组因子：（1）Sox2、Klf4和c-Myc，（2）Klf4和c-Myc，（3）Oct3/4、Klf4和c-Myc，（4）Sox2、Nanog和Lin28，（5）Oct3/4、Nanog和Lin28，（6）Oct3/4、Klf和Sox2以及（7）Klf4和Sox2；或者

（ii）c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1；以及Glis1、Sall4或Lrh1中的至少一个；或者

（iii）c-Jun拮抗剂、Jhdm1b和Id1；以及Oct4、Klf4、Sox2、Lin28、Esrrb、Lef1、Utf1或miRNA C中的至少一个；并且

其中，当c-Jun拮抗剂是c-JunDN时，所述组合物不包含下列四组因子：

（1）Sox2、Klf4和c-Myc，（2）Oct3/4、Klf4和c-Myc，（3）Oct3/4、Klf和Sox2以及（4）Klf4和Sox2。

8.如权利要求7所述的组合物，其中，所述c-Jun拮抗剂包括具有bZIP结构域但缺乏反式激活结构域的c-Jun拮抗因子和拮抗c-Jun活性的化合物、核酸、蛋白质、mRNA。

9.如权利要求8所述的组合物，其中，所述c-Jun拮抗剂包括c-Jun基因的截短型c-JunDN或Jdp2或其功能性变体，所述c-JunDN的氨基酸序列为SEQ IDNO.2，所述Jdp2的氨基酸序列为SEQ ID NO.3，所述c-JunDN的功能性变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.2具有至少70%的同源性，所述Jdp2的功能性变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.3具有至少70%的同源性。

10.如权利要求9所述的组合物，其中，所述功能性变体包括：c-JunDN的氨基酸中的1至100个氨基酸的取代、插入和/或缺失，但仍具有bZIP结构域、缺乏反式激活结构域的功能性变体。

11.一种由权利要求1至6中任一项所述的方法获得的诱导多能性干细胞。

12.权利要求7至10中任一项所述的组合物在制备诱导多能性干细胞中的应用。