CN104622817A

CN104622817A - 一种蛋白-聚合物复合纳米载体及其制备方法

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Publication number: CN104622817A
Application number: CN201510038139.XA
Authority: CN
Inventors: 许颖; 金雪锋; 陈美�; 钱晨
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2015-01-27
Filing date: 2015-01-27
Publication date: 2015-05-20
Anticipated expiration: 2035-01-27
Also published as: CN104622817B

Abstract

本发明是一种蛋白-聚合物复合纳米载体及其制备方法，涉及抗肿瘤药物的纳米制剂领域，是基于人体天然的脂蛋白结构特点设计开发的，具有聚合物内核，亲水蛋白质外壳，并可根据治疗需要灵活修饰靶向配基，构建出具有主动靶向性的蛋白-聚合物复合纳米载体，提高药物体内稳定性，增加肿瘤靶向性；为了提高蛋白质在聚合物内核上的负载率，通过在处方中加入阳离子添加物制备了阳离子聚合物纳米粒；该纳米混悬液为乳白色液体，经透射电镜扫描可见粒子分布较为均匀，呈圆球形；为了使其更加容易保存，提高稳定性，加入冻干保护剂进行冷冻干燥形成粉状；本发明制备的蛋白-聚合物复合纳米载体粒径均匀，稳定性好，能有效的包封脂溶性抗肿瘤药物。

Description

一种蛋白-聚合物复合纳米载体及其制备方法

技术领域

本发明涉及抗肿瘤药物的纳米制剂领域，具体是一种能包载脂溶性抗肿瘤药物的蛋白-聚合物复合纳米载体及其制备方法。

背景技术

恶性肿瘤是仅次于心脏病，威胁全球人类健康和生命的第二大杀手。目前，化学药物治疗与手术治疗、放射治疗共同构成了肿瘤治疗的三大手段。

化学治疗是以化学药物杀灭肿瘤细胞的治疗方法。但由于大部分化疗药物属于脂溶性药物，水溶性差，很大程度上影响了药物的疗效。此外，由于化学药物具有较强的细胞毒作用，又缺少靶向特性，会引起较大的毒副作用，给患者带来痛苦，有时甚至会造成治疗中断。

目前上市的脂溶性化疗药物，大多采用有机溶剂及表面活性剂作为增溶手段，不仅靶向性差，而且所使用的表面活性剂成分亦会带来刺激性或过敏性，增加病人的痛苦。如紫杉醇和多栖紫杉醇注射液，为了达到溶解药物的目的，分别需要使用表面活性剂聚氧乙烯蓖麻油和吐温-80（聚山梨酯80）以及助溶剂乙醇；再如依托泊苷注射液，需加入吐温-80、聚乙二醇、乙醇等达到增溶药物的目的。这些表面活性剂等增溶成分的使用有可能引起一系列的不良反应，如过敏反应、神经毒性、骨髓抑制、液体潴留等。还有一些抗癌药物，在细胞实验中显示出卓越的抗癌活性，但由于溶解性及刺激性的问题尚未有制剂应用于临床。如蟾毒灵，是中药蟾酥的一种药理成分，是蟾酥中抗肿瘤作用最强的蟾酥二烯酸内酯之一。文献报道蟾毒灵在极低浓度下即可抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞分化、诱导凋亡，抑制肿瘤血管生成，并可恢复肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，抑制肿瘤血管生成等。蟾毒灵对多种实体瘤具有抑制作用，对肝癌细胞的抑制效果尤其显著，在细胞实验中，蟾毒灵显示出比多激酶靶向抑制剂索拉菲尼更强的肝肿瘤细胞抑制效果（Cao Y, Li HX, Xu LT, et al. Bufalin enhances the anti-proliferative effect of sorafenib on hμman hepatocellular carcinoma cells through downregulation of ERK [J]. Mol Biol Rep, 2012, 39(2):1683）。但是，蟾毒灵的水溶性差，半衰期短，对人体产生刺激性以及心脏毒性（Ying Li , Hang Zhao, Lin-Rui Duan,et al. Preparation, characterization and evaluation of bufalin liposomes coated with citrus pectin [J]. Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects, 2014,444:54–62），种种不良因素限制了蟾毒灵的应用，尚未有其单体制剂应用于临床。从用药的有效性及安全性方面考虑，开发这类药物的肿瘤靶向纳米制剂是最有可能解决其溶解性及刺激性问题的手段，降低药物的毒副作用，增加用药安全性，发挥其抗肿瘤效果。

聚α‐氰基丙烯酸酯类材料具有良好的生物相容性，无毒等特点，是可生物降解的高分子聚合物，现已广泛应用于纳米粒载体的制备。以聚α‐氰基丙烯酸酯类材料制备得到的纳米粒可提高制剂的稳定性，增加药物的溶解度，目前广泛应用于化合物及中药单体以及蛋白质与多肽递送系统的研究。但单独采用氰基丙烯酸酯作为载体，存在和大多数聚合物类载体相似的问题，聚合物纳米载体进入血液循环后，容易与免疫球蛋白G （immunoglobulin G），补体蛋白C₃(complement C₃)以及纤连蛋白（fibronectin）等血浆中的调理素结合，而被单核巨噬细胞系统摄取，体内稳定性不佳；不具备肿瘤靶向性。

白蛋白是天然的亲水性蛋白质，具有安全无毒、无免疫原性，可生物降解、生物相容性好，价廉易得等优点，而且性质相当稳定，可在pH4-9的范围内保持稳定。采用白蛋白作为载体外壳，能够增加载体的亲水性，提高载体在血液中的稳定性，并使载体具有一定的肿瘤趋向性，白蛋白还含有许多表面活性基团可供修饰，可在蛋白上修饰靶向配基，如胆酸，熊去氧胆酸，甘草次酸，抗体等，已有大量文献表明，肿瘤细胞表面具有相应的受体，可通过这些配体的介导增强肿瘤细胞对载体的摄取，使载体具有主动靶向性。

本专利采用亲水蛋白作为外壳，以聚合物载体作为内核，设计了一种新型的靶向蛋白-聚合物纳米载体，用以包载抗肿瘤药物。这种载体是基于人体天然的脂蛋白结构特点设计开发的，脂蛋白是人体天然存在的脂质运送载体，具有亲脂内核和亲水蛋白外壳结构。根据文献报道，脂蛋白能够有效的转运脂溶性抗癌药物，并且具有肿瘤靶向性（可靶向至过度表达低密度脂蛋白受体的肿瘤细胞）。但脂蛋白需要从新鲜血浆中提取，提取工艺非常复杂，而且载脂蛋白不稳定，易聚集，不易商品化；此外脂蛋白仅能靶向至低密度脂蛋白受体过度表达的肿瘤，其应用受到限制。本专利设计构建的蛋白-聚合物载体，具有亲水蛋白外壳及可容纳脂溶性药物的聚合物载体核心，并可根据需要修饰不同的靶向配基，具有优良的载药性能，卓越的体内相容性及稳定性，以及灵活的靶向性，是极具功能化的靶向载体。

以亲水性材料聚乙二醇作为载体表面的修饰外壳，是常用的增加聚合物或脂质体等纳米载体体内稳定性的方法，而以白蛋白作为载体的外壳结构，与聚乙二醇相比，具有特别的优势，（1）易于进行表面修饰，每个白蛋白分子有多个羧基和氨基，可以根据需要修饰功能基团；（2）更好的生物相容性和去调理作用，白蛋白是人体内存在的天然的亲水蛋白，无免疫原性，白蛋白能有效降低血浆中蛋白在载体上的吸附，延长载体在血液中的循环时间。（3）自身具有一定的肿瘤趋向性，肿瘤和炎症组织的血管通透性增加，白蛋白可以通过肿瘤血管内皮的gP60(60-kDa glycoprotein)受体，或者通过与肿瘤组织中富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（secreted protein acid and rich in cysteine，SPARC) 促进载体在肿瘤组织中的摄取。

目前也有不少单独使用白蛋白作为载体的研究及专利，但单独使用白蛋白作为载体可能存在以下问题。（1）一般需通过加热或化学交联剂固化。可能会影响药物的稳定性或蛋白的亲水性；（2）以白蛋白为材料制备的纳米粒或微球粒径较大，一般在500μm以上。美国生物科学公司开发了Nab技术制备药物白蛋白纳米粒，该技术采用高压乳匀技术对含药有机相及含蛋白水相的混合体系进行高压匀化，制备纳米粒，该技术对药物的理化性质选择性较强，药物需与白蛋白有较强的亲和性。除此之外，根据《药剂学》（崔福德主编，《药剂学》第二版，2011:536.）的分类，这些载体都属于被动靶向制剂，被动靶向制剂仅能利用机体内不同器官、组织或网状内皮系统对不同大小的微粒的截留或吞噬作用，将药物输送到靶部位，靶向效果欠佳。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种蛋白-聚合物复合纳米载体，以包载脂溶性抗肿瘤药物的聚合物作为内核，采用具有靶向作用的白蛋白作为亲水外壳；本发明还提供了以上蛋白-聚合物复合纳米载体的制备方法，根据治疗需要，可预先在白蛋白上修饰靶向基团，构建出具有主动靶向性的蛋白-聚合物复合纳米载体。

本发明通过以下技术方案实现：一种蛋白-聚合物复合纳米载体，包括聚合物内核和靶向蛋白质外壳；所述聚合物内核为氰基丙烯酸烷酯内核，所述氰基丙烯酸烷酯内核包载着脂溶性抗肿瘤药物；所述靶向蛋白质外壳包裹在所述氰基丙烯酸烷酯内核的表面；所述靶向蛋白质外壳为亲水蛋白质外壳。

所述蛋白-聚合物复合纳米载体按质量百分数计算包括以下组分：1~10%的抗肿瘤药物、10~60%的氰基丙烯酸烷酯、0.5~10%的阳离子添加物、1~10%的蛋白类物质、20~60%的稳定剂和5~30%的冻干保护剂。

所述抗肿瘤药物为蟾毒灵、依托泊苷、紫杉醇、多栖紫杉醇、吉非替尼、羟基喜树碱和阿霉素、姜黄素、氟尿嘧啶、环磷酰胺、伊立替康、米托蒽醌、顺铂中的一种。

所述氰基丙烯酸烷酯为氰基丙烯酸甲酯MCA、氰基丙烯酸乙酯ECA、氰基丙烯酸正丁酯BCA、氰基丙烯酸异丁酯IBCA、氰基丙烯酸己酯HCA和氰基丙烯酸异己酯IHCA中的一种。

所述阳离子添加物为十八胺、聚乙醇胺、L-赖氨酸和精氨酸中的一种或其组合物。

所述蛋白类物质为天然蛋白质或合成蛋白质或类蛋白及其衍生物或经修饰物修饰的蛋白质中的一种或其混合物。

所述稳定剂为普朗尼克F68、普朗尼克F123、普朗尼克F127、右旋糖酐70、右旋糖酐40、右旋糖酐20、聚乙烯醇、吐温-80和司盘-80中的一种或其混合物。

所述冻干保护剂为以下中的一种：（1）糖类/多元醇：蔗糖、海藻糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、麦芽糖；（2）聚合物：HES、PVP、PEG、葡聚糖、白蛋白；（3）氨基酸：L-丝氨酸、谷氨酸钠、丙氨酸、甘氨酸、肌氨酸；（4）盐和胺：磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐中的一种或其混合物。

所述蛋白类物质为白蛋白。

所述修饰物为胆酸、熊去氧胆酸、甘草次酸、透明质酸、半乳糖、叶酸和脂蛋白受体识别重组多肽中的一种或几种；所述修饰物可与所述蛋白类物质的氨基、羧基或巯基通过共价键连接。

所述蛋白-聚合物复合纳米载体的制备方法，包括以下步骤：

1）制备包载所述抗肿瘤药物的氰基丙烯酸烷酯内核；

按质量百分数计算，称取1~10%抗肿瘤药物、0.5~8%阳离子添加物与5~40%稳定剂用油相溶解，油相混合溶液，控制转速为100~1000rpm，缓慢将10~60%氰基丙烯酸烷酯单体逐滴加入含有5~40%稳定剂浓度为0~10M的稀盐酸中形成水相体系；

或称取1~10%抗肿瘤药物与5~40%稳定剂用油相溶解，油相混合溶液，控制转速为100~1000rpm，缓慢将10~60%氰基丙烯酸烷酯单体逐滴加入含有5~40%稳定剂与0.5~5%阳离子添加物浓度为0~10M的稀盐酸中形成水相体系；

或称取1~10%抗肿瘤药物、0.5~8%阳离子添加物用油相溶解，油相混合溶液，控制转速为100~1000rpm，缓慢将10~60%氰基丙烯酸烷酯单体逐滴加入含有5-50%稳定剂浓度为0~10M的稀盐酸中形成水相体系；

或称取1~10%抗肿瘤药物用油相溶解，油相混合溶液，控制转速为100~1000rpm，缓慢将10~60%氰基丙烯酸烷酯单体逐滴加入含有5-50%稳定剂与0.5~5%阳离子添加物浓度为0~10M的稀盐酸中形成水相体系；

或称取1~10%抗肿瘤药物、0.5~8%阳离子添加物与5~40%稳定剂用油相溶解，油相混合溶液，控制转速为100~1000rpm，缓慢将10~60%氰基丙烯酸烷酯单体逐滴加入含有5~40%稳定剂与0.5~5%阳离子添加物浓度为0~10M的稀盐酸中形成水相体系；

或称取1~10%抗肿瘤药物与0.5~8%阳离子添加物用油相溶解，油相混合溶液，控制转速为100~1000rpm，缓慢将10~60%氰基丙烯酸烷酯单体逐滴加入含有5~50%稳定剂与0.5~5%阳离子添加物浓度为0~10M的稀盐酸中形成水相体系；

将油相混合溶液缓慢滴加入水相体系中，搅拌2~8h后，形成含有所述氰基丙烯酸烷酯内核的混合液；

质量百分数计算，所述油相和所述水相中阳离子添加物总量为0.5~10%；油相及水相中稳定剂总量为20~60%。

所述油相为乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、乙醚中的一种或其混合物。

2）所述天然蛋白质提取纯化或在蛋白质上修饰，得到靶向蛋白质外壳；

其中蛋白质的修饰方法具体步骤为：将修饰物加入四氢呋喃或二甲基甲酰胺DMF溶解，再分别加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺；0℃搅拌2~6 h, 继续室温搅拌过夜，重结晶，得到修饰物的活性酯，溶于二甲基甲酰胺DMF 中，逐滴加入到溶有白蛋白的溶液中，边加边搅拌，室温继续搅拌2~6 h；反应液透析48 h后，12000 rpm 离心10min，除去未反应的修饰物活性酯及其水解产物，冻干得到白色的产物，即为修饰的白蛋白，白蛋白与修饰物的摩尔比为1:5~1:60。

3）在所述氰基丙烯酸烷酯内核外包覆所述靶向蛋白质外壳，形成含有蛋白-聚合物复合纳米载体的混悬液；

具体步骤为：将含有氰基丙烯酸烷酯内核的混合液用氢氧化钠调节pH至中性，加入按质量百分比算1~10%蛋白类物质，继续搅拌0.5~6 h，旋转蒸发30~120min，除去残余的有机溶剂，3000~10000 rpm离心2~15 min，过0.2~0.8 μm微孔滤膜进行无菌滤过，即得蛋白-聚合物复合纳米载体混悬液。

蛋白类物质通过电荷作用、疏水力、范德华力等分子间作用力，以非共价键结合在氰基丙烯酸烷酯内核的表面。

4）在混悬液中加入所述冻干保护剂进行冷冻干燥，形成粉状。

具体步骤为：在所述蛋白-聚合物复合纳米载体混悬液中加入5~30%的冻干保护剂，冻干24小时，形成粉状。

所述旋转蒸发的温度为0~60℃，优选的是20~30℃。

所述蛋白-聚合物复合纳米载体的平均粒径为20~1000nm，优选的是80~200nm。

所述蛋白-聚合物复合纳米载体用于制备抗肿瘤药物。

有益效果：本发明与现有技术相比，是基于人体天然的脂蛋白结构特点设计开发的，具有聚合物内核，亲水蛋白质外壳，并可灵活修饰靶向配基，能有效地包载脂溶性药物，提高药物体内稳定性，增加肿瘤靶向性；为了提高蛋白质在聚合物内核上的负载率，通过在处方中加入阳离子添加物制备了阳离子聚合物纳米粒，白蛋白等电点为4.5左右，在中性介质中带负电，能通过电荷作用、疏水力、范德华力等分子间作用力结合在聚合物纳米粒表面；可根据治疗需要，预先在蛋白上修饰靶向基团，由此构建出具有主动靶向性的蛋白-聚合物复合纳米载体；该纳米混悬液为乳白色液体，经透射电镜扫描可见粒子分布较为均匀，呈圆球形；为了使其更加容易保存，提高稳定性，加入冻干保护剂进行冷冻干燥形成粉状。

附图说明

图1为根据实例1制备的载蟾毒灵-熊去氧胆酸修饰白蛋白-聚合物复合纳米粒的粒径分布图。

图2为根据实例1制备的载蟾毒灵-熊去氧胆酸修饰白蛋白-聚合物复合纳米粒的透射电镜图。

图3为蟾毒灵原料药及根据实例1制备的载蟾毒灵-熊去氧胆酸修饰白蛋白-聚合物复合纳米粒中药物的体外释放曲线。

具体实施方式

下面通过实施例结合附图对本发明做进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。

实施例1：载蟾毒灵-熊去氧胆酸修饰蛋白-聚合物复合纳米粒的制备。

分别称取3.5 mg蟾毒灵、5 mg十八胺与30mg 普朗尼克F127用二氯甲烷溶解。缓慢将60 mg氰基丙烯酸正丁酯（BCA）逐滴加入5 mL含有右旋糖酐70与普朗尼克F68各25 mg的稀盐酸（0.1 M）中，将二氯甲烷混合溶液缓慢滴加入体系中，滴加边搅拌。搅拌4 h后，用氢氧化钠调节pH至中性，加入5 mg熊去氧胆酸修饰的牛血清白蛋白，继续搅拌1 h。旋转蒸发除去残余的二氯甲烷，5000 rpm离心3 min，过微孔滤膜，即得载蟾毒灵-熊去氧胆酸修饰蛋白-聚合物复合纳米载体混悬液。

在载蟾毒灵-熊去氧胆酸修饰蛋白-聚合物复合纳米载体混悬液中加入30mg 甘露醇，30mg 海藻糖冻干24小时，得到粉状物，可通过添加无菌水或生理盐水重新分散形成蛋白-聚合物复合纳米载体混悬液，粒径大小几乎与冻干前无变化。

实施例2：载蟾毒灵-透明质酸修饰蛋白-聚合物复合纳米粒的制备。

分别称取10 mg蟾毒灵、10 mg十八胺用二氯甲烷溶解。缓慢将 100 mg氰基丙烯酸乙酯（ECA）逐滴加入10 ml含有右旋糖酐70与普朗尼克F68各50 mg的的稀盐酸（0.1M）中，将二氯甲烷混合溶液缓慢滴加入体系中，滴加边搅拌。搅拌4 h后，用氢氧化钠调节pH至中性，加入20 mg透明质酸修饰的牛血清白蛋白，继续搅拌1 h。旋转蒸发除去残余的二氯甲烷，5000 rpm离心3 min，过微孔滤膜，即得载蟾毒灵-透明质酸修饰蛋白-聚合物复合纳米载体混悬液。

在载蟾毒灵-透明质酸修饰蛋白-聚合物复合纳米载体混悬液中加入50 mg 蔗糖冻干24小时，得到粉状物，可通过添加无菌水或生理盐水重新分散形成蛋白-聚合物复合纳米载体混悬液，粒径大小几乎与冻干前无变化。

实施例3：载依托泊苷-甘草次酸修饰蛋白-聚合物复合纳米粒的制备。

分别称取30 mg依托泊苷、3 mg十八胺与50 mg 普朗尼克F127用二氯甲烷溶解。缓慢将210 mg 氰基丙烯酸甲酯（MCA）逐滴加入5 mL含有右旋糖酐70与普朗尼克F68各10 mg的稀盐酸（0.1 M）中，将二氯甲烷混合溶液缓慢滴加入体系中，滴加边搅拌。搅拌4 h后，用氢氧化钠调节pH至中性，加入5 mg甘草次酸修饰的牛血清白蛋白，继续搅拌1 h。旋转蒸发除去残余的二氯甲烷，5000 rpm离心3 min，过微孔滤膜，即得载依托泊苷-甘草次酸修饰蛋白-聚合物复合纳米载体混悬液。

在载依托泊苷-甘草次酸修饰蛋白-聚合物复合纳米载体混悬液中加入20 mg PEG 400, 10 mg甘氨酸冻干24小时，得到粉状物，可通过添加无菌水或生理盐水重新分散形成蛋白-聚合物复合纳米载体混悬液，粒径大小几乎与冻干前无变化。

实施例4：载紫杉醇-叶酸修饰蛋白-聚合物复合纳米粒的制备。

分别称取5 mg紫杉醇、12mg十八胺与60 mg 普朗尼克F127用二氯甲烷溶解。缓慢将40 mg氰基丙烯酸异丁酯（IBCA）逐滴加入10 ml含有10 mg聚乙烯醇PVA 1788及1.5 mg 精氨酸的稀盐酸（0.1M）中，将二氯甲烷混合溶液缓慢滴加入体系中，滴加边搅拌。搅拌4 h后，用氢氧化钠调节pH至中性，加入15 mg叶酸修饰的牛血清白蛋白，继续搅拌1 h。旋转蒸发除去残余的二氯甲烷，5000 rpm离心3 min，过微孔滤膜，即得载紫杉醇-叶酸修饰蛋白-聚合物复合纳米载体混悬液。

在载紫杉醇-叶酸修饰蛋白-聚合物复合纳米载体混悬液中加入10 mg 甘露醇，10 mg 柠檬酸三钠冻干24小时，得到粉状物，可通过添加无菌水或生理盐水重新分散形成蛋白-聚合物复合纳米载体混悬液，粒径大小几乎与冻干前无变化。

实施例5：载多栖紫杉醇-熊去氧胆酸修饰蛋白-聚合物复合纳米粒的制备。

称取10 mg多栖紫杉醇用二氯甲烷溶解。缓慢将60 mg氰基丙烯酸正丁酯（BCA）逐滴加入10 ml含有25 mg 聚乙烯醇PVA 1788，15 mg 普朗尼克F127，右旋糖酐70与普朗尼克F68各20 mg及10 mg聚乙醇胺1200的稀盐酸（0.1 M）中，将二氯甲烷混合溶液缓慢滴加入体系中，滴加边搅拌。搅拌4 h后，用氢氧化钠调节pH至中性，加入10 mg熊去氧胆酸修饰的牛血清白蛋白，继续搅拌1 h。旋转蒸发除去残余的二氯甲烷，5000 rpm离心3 min，过微孔滤膜，即得载多栖紫杉醇-熊去氧胆酸修饰蛋白-聚合物复合纳米载体混悬液。

在载多栖紫杉醇-熊去氧胆酸修饰蛋白-聚合物复合纳米载体混悬液中加入25 mg 甘露醇，20 mg PVP K30，30mg谷氨酸钠冻干24小时，得到粉状物，可通过添加无菌水或生理盐水重新分散形成蛋白-聚合物复合纳米载体混悬液，粒径大小几乎与冻干前无变化。

实施例6：载吉非替尼-熊去氧胆酸修饰蛋白-聚合物复合纳米粒的制备。

分别称取3 mg吉非替尼与90 mg普朗尼克F127用三氯甲烷溶解。缓慢将25 mg 氰基丙烯酸己酯（HCA）逐滴加入10 ml含有右旋糖酐70与普朗尼克F68各25 mg，10 mg精氨酸的稀盐酸（0.1 M）中，将三氯甲烷混合溶液缓慢滴加入体系中，滴加边搅拌。搅拌4 h后，用氢氧化钠调节pH至中性，加入10 mg熊去氧胆酸修饰的牛血清白蛋白，继续搅拌1 h。旋转蒸发除去残余的三氯甲烷，5000 rpm离心3 min，过微孔滤膜，即得载吉非替尼-熊去氧胆酸修饰蛋白-聚合物复合纳米载体混悬液。

在载吉非替尼-熊去氧胆酸修饰蛋白-聚合物复合纳米载体混悬液中加入25 mg 乳糖，20 mg 甘氨酸三钠冻干24小时，得到粉状物，可通过添加无菌水或生理盐水重新分散形成蛋白-聚合物复合纳米载体混悬液，粒径大小几乎与冻干前无变化。

实施例7：载羟基载喜树碱-透明质酸修饰蛋白-聚合物复合纳米粒的制备。

分别称取5 mg羟基喜树碱、5 mg十八胺用二氯甲烷溶解。缓慢将50 mg氰基丙烯酸异己酯（IHCA）逐滴加入5 ml含有75 mg 聚乙烯醇PVA 1788与20 mg 普朗尼克F127，及5mg 赖氨酸的稀盐酸（0.1M）中，将二氯甲烷混合溶液缓慢滴加入体系中，滴加边搅拌。搅拌4 h后，用氢氧化钠调节pH至中性，加入5 mg透明质酸修饰的牛血清白蛋白，继续搅拌1 h。旋转蒸发除去残余的二氯甲烷，5000 rpm离心3 min，过微孔滤膜，即得载羟基载喜树碱-透明质酸修饰蛋白-聚合物复合纳米载体混悬液。

在载羟基载喜树碱-透明质酸修饰蛋白-聚合物复合纳米载体混悬液中加入20 mg 葡聚糖70，30 mg海藻糖冻干24小时，得到粉状物，可通过添加无菌水或生理盐水重新分散形成蛋白-聚合物复合纳米载体混悬液，粒径大小几乎与冻干前无变化。

实施例8：载阿霉素-甘草次酸修饰蛋白-聚合物复合纳米粒的制备。

分别称取7.5 mg阿霉素、10 mg十八胺与20 mg 普朗尼克F127用二氯甲烷溶解。缓慢将75 mg氰基丙烯酸异丁酯（IBCA）逐滴加入10 ml含有50 mg 聚乙烯醇PVA 1788的稀盐酸（0.1M）中，将二氯甲烷混合溶液缓慢滴加入体系中，滴加边搅拌。搅拌4 h后，用氢氧化钠调节pH至中性，加入10 mg甘草次酸修饰的牛血清白蛋白，继续搅拌1 h。旋转蒸发除去残余的二氯甲烷，5000 rpm离心3 min，过微孔滤膜，即得载阿霉素-甘草次酸修饰蛋白-聚合物复合纳米载体混悬液。

在载阿霉素-甘草次酸修饰蛋白-聚合物复合纳米载体混悬液中加入20 mg甘氨酸，20mg PEG400，10 mg 柠檬酸三钠冻干24小时，得到粉状物，可通过添加无菌水或生理盐水重新分散形成蛋白-聚合物复合纳米载体混悬液，粒径大小几乎与冻干前无变化。

实施例9：载紫杉醇-甘草次酸修饰蛋白-聚合物复合纳米粒的制备。

分别称取20 mg紫杉醇、15 mg十八胺与10 mg 普朗尼克F68用二氯甲烷溶解。缓慢将70 mg氰基丙烯酸正丁酯（BCA）逐滴加入10 ml含有20 mg 聚乙烯醇PVA 1788，20mg右旋糖酐70及4mg精氨酸的稀盐酸（0.1M）中，将二氯甲烷混合溶液缓慢滴加入体系中，滴加边搅拌。搅拌4 h后，用氢氧化钠调节pH至中性，加入20 mg甘草次酸修饰的牛血清白蛋白，继续搅拌1 h。旋转蒸发除去残余的二氯甲烷，5000 rpm离心3 min，过微孔滤膜，即得载紫杉醇-甘草次酸修饰蛋白-聚合物复合纳米载体混悬液。

在载紫杉醇-甘草次酸修饰蛋白-聚合物复合纳米载体混悬液中加入10 mg海藻糖冻干24小时，得到粉状物，可通过添加无菌水或生理盐水重新分散形成蛋白-聚合物复合纳米载体混悬液，粒径大小几乎与冻干前无变化。

实验例1：粒径及分布。

采用马尔文激光粒度测定仪（Zetasizer Nano ZS90型激光粒度仪，英国马尔文公司）测定粒径，实施例1测定结果见图2所示。测定结果表明，本发明所制备的蟾毒灵纳米制剂的平均粒径为149.3 nm，多分散系数为0.073。

实验例2：形态学分布。

取制剂适量，用蒸馏水稀释后，取一滴滴在覆有碳支持膜的铜网上，放置片刻后，滴加2%磷钨酸进行负染，用透射电子显微镜（Tecnai 12，Philips company，Holland）观察粒子形态，实施例1的观测结果见图2。由图2可见，粒子分布较为均匀，呈圆球形。

实验例3：蛋白负载率。

蛋白载负率：蛋白载负率（%）=（1-M_游离/M_投）*100

式中，M_游离指游离BSA（modified）的量（μg），M_投指投入的BSA（modified）的量（μg）。实施例1中熊去氧胆酸修饰白蛋白在载体表面的负载率为94.33%；实施例2中透明质酸修饰的白蛋白在载体表面负载率为89.72%；实施例3中甘草次酸修饰的白蛋白在载体表面的负载率为91.19%；实施例4中叶酸修饰的白蛋白在载体表面的负载率为85.42%；实施例5中熊去氧胆酸修饰的白蛋白在载体表面负载率为92.25%；实施例6中熊去氧胆酸修饰的白蛋白在载体表面负载率为95.18%；实施例7中透明质酸修饰的白蛋白在载体表面负载率为87.49%；实施例8中甘草次酸修饰的白蛋白在载体表面的负载率为92.31%；实验例9中甘草次酸修饰的白蛋白在载体表面的负载率为90.76%。

实验例4：体外释放。

以pH7.4的磷酸盐缓冲液为释放介质，考察制剂的体外释放行为。蟾毒灵饱和溶液中药物及实施例1制备的制剂中药物（蟾毒灵）的释放曲线如图3所示。由图3可看出，制剂中药物的释放与饱和溶液相比，有一定的缓释效果，但在24h基本可达到完全释放。

实验例5：细胞抑制率及靶向性评价。

考察实施例1制备的载蟾毒灵-熊去氧胆酸修饰蛋白-聚合物复合纳米粒及未包覆修饰蛋白的普通蟾毒灵-聚合物颗粒对肝肿瘤细胞 HepG2 的IC₅₀分别为32.7nM和98.6nM，可看出载蟾毒灵-熊去氧胆酸修饰蛋白-聚合物复合纳米粒对肝肿瘤细胞 HepG2的抑制效果显著高于未包覆修饰蛋白的普通蟾毒灵-聚合物颗粒。表明包覆熊去氧胆酸修饰的蛋白后，能增加肿瘤细胞对载体的摄取，具有肿瘤细胞靶向性。考察实施例3制备的载依托泊苷-甘草次酸修饰蛋白-聚合物复合纳米粒及未包覆修饰蛋白的普通依托泊苷-聚合物颗粒对肝肿瘤细胞 HepG2的IC₅₀分别为97.3μM和148.8μM，可看出载依托泊苷-甘草次酸修饰蛋白-聚合物复合纳米粒对肝肿瘤细胞 HepG2的抑制效果显著高于未包覆修饰蛋白的普通依托泊苷-聚合物颗粒。表明包覆修饰蛋白后，能增加肿瘤细胞对载体的摄取，具有肿瘤细胞靶向性。考察实施例5制备的载多栖紫杉醇-熊去氧胆酸修饰蛋白-聚合物复合纳米粒及未包覆修饰蛋白的普通多栖紫杉醇-聚合物颗粒对肝肿瘤细胞 HepG2 的的IC₅₀分别为62.7nM和128.9nM，可看出载多栖紫杉醇-熊去氧胆酸修饰蛋白-聚合物复合纳米粒对肝肿瘤细胞 HepG2的抑制效果显著高于未包覆修饰蛋白的普通多栖紫杉醇-聚合物颗粒。表明包覆修饰蛋白后，能增加肿瘤细胞对载体的摄取，具有肿瘤细胞靶向性。

所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，但应该承认，本领域技术人员可能对本发明做出各种修饰和转变，而这些修饰和转变同样属于所附权利要求书所定义的本发明的范围内。

Claims

1.一种蛋白-聚合物复合纳米载体，其特征在于，包括聚合物内核和靶向蛋白质外壳；

所述聚合物内核为氰基丙烯酸烷酯内核，所述氰基丙烯酸烷酯内核包载着脂溶性抗肿瘤药物；

所述靶向蛋白质外壳包裹在所述氰基丙烯酸烷酯内核的表面；

所述靶向蛋白质外壳为亲水蛋白质外壳。

2.根据权利要求1所述一种蛋白-聚合物复合纳米载体，其特征在于，按质量百分数计算包括以下组分：1~10%的抗肿瘤药物、10~60%的氰基丙烯酸烷酯、0.5~10%的阳离子添加物、1~10%的蛋白类物质、20~60%的稳定剂和5~30%的冻干保护剂。

3.根据权利要求2所述一种蛋白-聚合物复合纳米载体，其特征在于，

所述抗肿瘤药物为蟾毒灵、依托泊苷、紫杉醇、多栖紫杉醇、吉非替尼、羟基喜树碱和阿霉素、姜黄素、氟尿嘧啶、环磷酰胺、伊立替康、米托蒽醌、顺铂中的一种；

所述氰基丙烯酸烷酯为氰基丙烯酸甲酯MCA、氰基丙烯酸乙酯ECA、氰基丙烯酸正丁酯BCA、氰基丙烯酸异丁酯IBCA、氰基丙烯酸己酯HCA和氰基丙烯酸异己酯IHCA中的一种；

所述阳离子添加物为十八胺、聚乙醇胺、L-赖氨酸和精氨酸中的一种或其组合物；

所述蛋白类物质为天然蛋白质、合成蛋白质、类蛋白及其衍生物或经修饰物修饰的蛋白质中的一种或其混合物；

所述稳定剂为普朗尼克F68、普朗尼克F123、普朗尼克F127、右旋糖酐70、右旋糖酐40、右旋糖酐20、聚乙烯醇、吐温-80和司盘-80中的一种或其混合物；

所述冻干保护剂为以下所述的一种：

（1）糖类/多元醇：蔗糖、海藻糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、麦芽糖；

（2）聚合物：HES、PVP、PEG、葡聚糖、白蛋白；

（3）氨基酸：L-丝氨酸、谷氨酸钠、丙氨酸、甘氨酸、肌氨酸；

（4）盐和胺：磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐中的一种或其混合物。

4.根据权利要求3所述一种蛋白-聚合物复合纳米载体，其特征在于，所述蛋白类物质为白蛋白；所述修饰物为胆酸、熊去氧胆酸、甘草次酸、透明质酸、半乳糖、叶酸和脂蛋白受体识别重组多肽中的一种或几种。

5.根据权利要求1所述的一种蛋白-聚合物复合纳米载体的制备方法，包括以下步骤：

1）制备包载所述抗肿瘤药物的氰基丙烯酸烷酯内核；

6.根据权利要求5所述一种蛋白-聚合物复合纳米载体的制备方法，其特征在于，所述步骤1）具体为：

按质量百分数计算，称取1~10%抗肿瘤药物、0~8%阳离子添加物和0~40%稳定剂用油相溶解，油相混合溶液，控制转速为100~1000rpm，缓慢将10~60%氰基丙烯酸烷酯单体逐滴加入含有0~5%阳离子添加物和5~50%稳定剂浓度为0~10M的稀盐酸中形成水相体系；

所述步骤3）具体为：将含有氰基丙烯酸烷酯内核的混合液用氢氧化钠调节pH至中性，加入按质量百分比算1~10%蛋白类物质，继续搅拌0.5~6 h，旋转蒸发30~120min，除去残余的有机溶剂，3000~10000 rpm离心2~15 min，过0.2~0.8 μm微孔滤膜进行无菌滤过，即得蛋白-聚合物复合纳米载体混悬液;

所述步骤4）具体为：在所述蛋白-聚合物复合纳米载体混悬液中加入5~30%的冻干保护剂，冻干24小时，形成粉状。

7. 根据权利要求6所述一种蛋白-聚合物复合纳米载体的制备方法，其特征在于，所述油相为乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、乙醚中的一种或其混合物。

8.根据权利要求6所述一种蛋白-聚合物复合纳米载体的制备方法，其特征在于，所述蛋白-聚合物复合纳米载体的平均粒径为20~1000nm。

9.根据权利要求8所述一种蛋白-聚合物复合纳米载体的制备方法，其特征在于，所述蛋白-聚合物复合纳米载体的平均粒径为80~200nm。

10.根据权利要求1所述的一种蛋白-聚合物复合纳米载体，其特征在于，所述蛋白-聚合物复合纳米载体用于制备抗肿瘤药物。