CN104628816A - 生物改性蓖麻蛋白质的制备方法及其在制备抗恶性胸膜间皮瘤药品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物改性蓖麻蛋白质的制备方法及其在制备抗恶性胸膜间皮瘤药品中的应用，所述生物改性蓖麻蛋白质的制备方法如下：将生物改性蓖麻虫体在常温膨化装置中膨化粉碎；然后加入到膨胀溶剂体系提取装置中提取出生物改性蓖麻蛋白质粗品；收集含有生物改性蓖麻蛋白质粗品的溶液并用微孔过滤器过滤去掉杂质；用超滤机超滤处理，收集生物改性蓖麻蛋白质超滤溶液；超滤液溶解在乙腈中用固相萃取柱分离，收集洗脱成分；将洗脱成分溶解在溶剂体系中，用超声驻波液相制备色谱分离纯化；用真空冷冻干燥机制备成冻干蛋白粉，可用于制备抗恶性胸膜间皮瘤药品。本发明制备的生物改性蓖麻蛋白质制剂质量稳定，结构清楚，药理明晰，疗效明显。

Description

生物改性蓖麻蛋白质的制备方法及其在制备抗恶性胸膜间皮瘤药品中的应用

技术领域

本发明涉及一种药物的制备方法及其新用途，尤其是生物改性蓖麻蛋白质的制备方法及其在制备抗恶性胸膜间皮瘤药品中的应用。

背景技术

恶性胸膜间皮瘤是原发于胸膜间皮组织的一种胸膜肿瘤。大约80%的恶性胸膜间皮瘤的患者与职业环境中接触各种石棉纤维有关，其它导致恶性胸膜间皮瘤的可能因素有结核性胸膜炎、病毒感染、放射线辐射、特殊工业化合物的接触史以及遗传因素等。

目前常用的治疗方法有手术治疗、放射治疗、化学治疗、免疫治疗及分子靶向治疗。

中医则对症状分别以行气活血、利水逐饮、益气补阴、清热化痰等方式治疗。

CN103842823A公开了用于胸膜间皮瘤患者的早起发现的分子标志物及其表达分析方法。该发明提供了间皮瘤的检测方法，包括受试者的血液和胸水中的至少任一种样品中的人骨膜蛋白蛋白质浓度的测定方法。

CN101868249A公开了治疗间皮瘤的药物的方法，该方法涉及使用至少一种减毒的麻疹病毒来制备旨在治疗个体的恶性间皮瘤的药物。

CN102159709A公开了用于恶性间皮瘤的新型治疗剂和免疫刺激剂，该发明提供了使用REIC/DKK-3来治疗恶性间皮瘤的方法和含有REIC/DKK-3的用于恶性间皮瘤的治疗剂。

CN103288968A公开了一种抗肿瘤靶向复合物及其制备方法和应用，该发明涉及一种抗肿瘤靶向复合物，该复合物是蝎氯毒素和蛙卵核糖核酸酶通过二硫键交联得到的化学交联复合物CTX-Onc。

蓖麻是大戟科蓖麻属植物，蓖麻种子含有蓖麻毒素、血细胞凝集素等成分，蓖麻毒素是一种蛋白质毒素，存在于蓖麻籽的蛋白质中。

蓖麻毒素是由两条多肽链组成，N-末端的氨基酸是异亮氨酸（Ile）和丙氨酸（Ala），根据末端氨基酸命名为Ile链（即A链）和Ala链（即B链），两链间由一个二硫键连接。

实验证明：以二硫键结合A链、B链的蓖麻毒素毒性很强，但是分离的A链、B链混合在一起却没有毒性，故毒素的两链以二硫键的结合对毒性是重要的，这是一个奇妙的现象。

201210316220.6公开了蓖麻蛋白的生物改性工艺，该发明生物改性过程首先诱导昆虫逐渐嗜硫到一定程度后加入到含蓖麻毒素的培养基中，可以对蓖麻毒素A链与B链间的双硫键快速进行切割，并与切割后的A链和B链分别产生抗性应答物，既消除蓖麻毒素的毒性，又充分利用A链与B链的生物活性制备出一种独特蛋白。

发明内容

本发明的目的是提供一种生物改性蓖麻蛋白质的制备方法及其在制备抗恶性胸膜间皮瘤药品中的应用，利用生物改性蓖麻虫体为原料，经过分离纯化蛋白质，再用此蛋白质制备各种剂型的药品，本过程工艺简要明了，药品成分明确，一致性好，疗效明显。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

（1）将1000g生物改性蓖麻虫体在常温膨化装置（200520108339.X）中常温条件下膨化粉碎。

本步骤中，所述膨化压力为0.1~5MPa，时间为10~60min。

（2）膨化粉碎后的物料加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076.6）中，加入膨胀溶剂并加压至2~10MPa，形成膨胀溶剂体系，提取出生物改性蓖麻蛋白质粗品。

本步骤中，所述膨胀溶剂由1~10Kg液态二氧化碳、100~500mL甲醇及100~300gNH₃·H₂O组成或由1~10Kg液态二氧化碳、100~500mL乙醇及100~300g氯化铵组成。

本步骤中，所述提取温度为10~20℃，时间为10~30min。

（3）收集含有生物改性蓖麻蛋白质粗品的溶液并且用微孔过滤器过滤去掉杂质。

本步骤中，所述微孔过滤器的孔径为0.5~50μm。

（4）用超滤机超滤处理，收集含有相应分子量的生物改性蓖麻蛋白质超滤溶液。

本步骤中，所述超滤机的孔径为50~100nm。

（5）超滤液溶解在适宜的溶剂中用固相萃取柱分离，收集洗脱成分。

本步骤中，所述溶剂为乙腈。

（6）将洗脱成分溶解在合适的溶剂体系中，用超声驻波液相制备色谱（200920274485.8）分离纯化。

本步骤中，所述溶剂体系由正丁醇-乙酸乙酯-水（体积比1.25:3.75:5）组成或4.5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500（重量比）组成。

（7）纯化后的生物改性蓖麻蛋白质用真空冷冻干燥机制备成冻干蛋白粉。

本步骤中，所述真空冷冻干燥温度为-30~50℃、时间为18~26h。

（8）赋予不同的药用辅助材料，分别制备成注射剂、口服剂、栓剂，可用于制备抗恶性胸膜间皮瘤药品。

本发明的优点和有益效果如下：通过本发明分离纯化的生物改性蓖麻蛋白质用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法及葡聚糖凝胶G-75凝胶过滤法测得相对分子量为11.8~12.6KPa；用等电聚焦发测定其等电点为pH8.2~9.3；常规化学法分析结果表明其不含糖类和磷酸基团；紫外分光光度法分析在260nm和280nm测定纯化的生物改性蓖麻蛋白质含量为98.2%；分子结构属非典型、非单一的昆虫蛋白质，链内与链间不含二硫键，其三级结构构象单元以无规卷曲为主，α螺旋与β折叠的含量比例基本相当。本发明制备的生物改性蓖麻蛋白质制剂质量稳定，结构清楚，药理明晰，疗效明显，含量可检可测，剂型多样，成本较低，适合工业化生产。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限如此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

实施例1：

（1）将1000g生物改性蓖麻虫体干燥品装入常温膨化装置（200520108339.X）中，对膨化装置内充入二氧化碳气体并加压至0.1~5MPa，时间10~60min，然后迅速释放压力至常压，生物改性蓖麻虫体被膨化成粉体；

（2）膨化粉碎后的生物改性蓖麻粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076.6）中，加入1~10Kg液态二氧化碳、100~500mL甲醇及100~300gNH₃·H₂O，加压至2~10MPa，形成膨胀溶剂体系，保持温度10~20℃，时间10~30min，生物改性蓖麻粉体中的蛋白质溶解，然后降压至常压，生成生物改性蓖麻蛋白粗品与甲醇-NH₃·H₂O的混合液；

（3）收集含有生物改性蓖麻蛋白粗品的溶液，用孔径0.5~50μm的微孔过滤器过滤去处固体杂质；

（4）溶液用孔径50~100nm的超滤机超滤处理，压力0.3~0.8MPa，温度为常温，收集含有相应分子量的生物改性蓖麻蛋白超滤溶液；

（5）超滤溶液用20%乙腈溶解，C₁₈固相萃取柱用50~100%乙腈活化预处理，加0.02~0.1%三氟乙酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超滤溶液上柱，常温下用10~80%的乙腈梯度脱洗，流速1~10mL/min，收集相关梯度的洗脱成分；

（6）将洗脱成分溶解在4.5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500（重量比）溶剂体系中，用超声驻波液相制备色谱（200920274485.8）分离纯化，超声波功率0.2~3.0KW，频率500~1000KHz，流速50~500mL/min，紫外检测器波长260~280nm；

（7）纯化后的生物改性蓖麻蛋白用真空冷冻干燥机在温度-30~50℃、时间18~26h干燥制备成冻干蛋白粉。

实施例2：

（1）将1000g生物改性蓖麻虫体干燥品装入常温膨化装置（200520108339.X）中，对膨化装置内充入二氧化碳气体并加压至0.1~5MPa，时间10~60min，然后迅速释放压力至常压，生物改性蓖麻虫体被膨化成粉体；

（2）膨化粉碎后的生物改性蓖麻粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076.6）中，加入5Kg液态二氧化碳、300mL甲醇及200gNH₃·H₂O，加压至5MPa，形成膨胀溶剂体系，保持温度15℃，时间20min，生物改性蓖麻粉体中的蛋白质溶解，然后降压至常压，生成生物改性蓖麻蛋白粗品与甲醇-NH₃·H₂O的混合液；

（3）收集含有生物改性蓖麻蛋白粗品的溶液，用孔径30μm的微孔过滤器过滤去处固体杂质；

（4）溶液用孔径100nm的超滤机超滤处理，压力0.5MPa，温度为常温，收集含有相应分子量的生物改性蓖麻蛋白超滤溶液；

（5）超滤溶液用20%乙腈溶解，C₁₈固相萃取柱用80%乙腈活化预处理，加0.05%三氟乙酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超滤溶液上柱，常温下用10~80%的乙腈梯度脱洗，流速5mL/min，收集相关梯度的洗脱成分；

（6）将洗脱成分溶解在4.5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500（重量比）溶剂体系中，用超声驻波液相制备色谱（200920274485.8）分离纯化，超声波功率1.0KW，频率500KHz，流速200mL/min，紫外检测器波长260nm；

（7）纯化后的生物改性蓖麻蛋白用真空冷冻干燥机在温度-30~40℃、时间20h干燥制备成冻干蛋白粉。

实施例3：

（1）将1000g生物改性蓖麻虫体干燥品装入常温膨化装置（200520108339.X）中，对膨化装置内充入二氧化碳气体并加压至0.1~5MPa，时间10~60min，然后迅速释放压力至常压，生物改性蓖麻虫体被膨化成粉体；

（2）膨化粉碎后的生物改性蓖麻粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076.6）中，加入1~10Kg液态二氧化碳、100~500mL乙醇及100~300g氯化铵，加压至2~10MPa，形成膨胀溶剂体系，保持温度10~20℃，时间10~30min，生物改性蓖麻粉体中的蛋白质溶解，然后降压至常压，生成生物改性蓖麻蛋白粗品与乙醇-氯化铵的混合液；

（3）收集含有生物改性蓖麻蛋白粗品的溶液，用孔径0.5~50μm的微孔过滤器过滤去处固体杂质；

（4）溶液用孔径50~100nm的超滤机超滤处理，压力0.3~0.8MPa，温度为常温，收集含有相应分子量的生物改性蓖麻蛋白超滤溶液；

（5）超滤溶液用20%乙腈溶解，C₁₈固相萃取柱用50~100%乙腈活化预处理，加0.02~0.1%三氟乙酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超滤溶液上柱，常温下用10~80%的乙腈梯度脱洗，流速1~10mL/min，收集相关梯度的洗脱成分；

（6）将洗脱成分溶解在正丁醇-乙酸乙酯-水（体积比1.25:3.75:5）溶剂体系中，用超声驻波液相制备色谱（200920274485.8）分离纯化，超声波功率0.2~3.0KW，频率500~1000KHz，流速50~500mL/min，紫外检测器波长260~280nm；

（7）纯化后的生物改性蓖麻蛋白用真空冷冻干燥机在温度-30~50℃、时间18~26h干燥制备成冻干蛋白粉。

实施例4：

（1）将1000g生物改性蓖麻虫体干燥品装入常温膨化装置（200520108339.X）中，对膨化装置内充入二氧化碳气体并加压至2MPa，时间40min，然后迅速释放压力至常压，生物改性蓖麻虫体被膨化成粉体；

（2）膨化粉碎后的生物改性蓖麻粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076.6）中，加入6Kg液态二氧化碳、200mL乙醇及150g氯化铵，加压至6MPa，形成膨胀溶剂体系，保持温度20℃，时间10min，生物改性蓖麻粉体中的蛋白质溶解，然后降压至常压，生成生物改性蓖麻蛋白粗品与乙醇-氯化铵的混合液；

（3）收集含有生物改性蓖麻蛋白粗品的溶液，用孔径50μm的微孔过滤器过滤去处固体杂质；

（4）溶液用孔径100nm的超滤机超滤处理，压力0.5MPa，温度为常温，收集含有相应分子量的生物改性蓖麻蛋白超滤溶液；

（5）超滤溶液用20%乙腈溶解，C₁₈固相萃取柱用60%乙腈活化预处理，加0.08%三氟乙酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超滤溶液上柱，常温下用10~80%的乙腈梯度脱洗，流速8mL/min，收集相关梯度的洗脱成分；

（6）将洗脱成分溶解在正丁醇-乙酸乙酯-水（体积比1.25:3.75:5）溶剂体系中，用超声驻波液相制备色谱（200920274485.8）分离纯化，超声波功率2.0KW，频率1000KHz，流速300mL/min，紫外检测器波长280nm；

（7）纯化后的生物改性蓖麻蛋白用真空冷冻干燥机在温度-30~50℃、时间18h干燥制备成冻干蛋白粉。

实施例5：

取生物改性蓖麻冻干蛋白粉100~150g、卵磷脂1~15g、液体石蜡200~350g，将三者搅拌均匀，用研磨机以30~60r/min研匀成糊状，另取乌桕脂100~200g在水浴上加热40~60℃熔化后，冷却至25~38℃，倒入研匀的生物改性蓖麻蛋白-卵磷脂-液体石蜡混合物中迅速搅拌均匀，趁热浇注于栓剂模具中，冷凝到10~20℃，从栓剂模具中取出即为成型的生物改性蓖麻蛋白栓剂，整理光滑后包装成品。

实施例6：

取生物改性蓖麻冻干蛋白粉120g、卵磷脂10g、液体石蜡250g，将三者搅拌均匀，用研磨机以60r/min研匀成糊状，另取乌桕脂150g在水浴上加热60℃熔化后，冷却至30℃，倒入研匀的生物改性蓖麻蛋白-卵磷脂-液体石蜡混合物中迅速搅拌均匀，趁热浇注于栓剂模具中，冷凝到15℃，从栓剂模具中取出即为成型的生物改性蓖麻蛋白栓剂，整理光滑后包装成品。

实施例7：

脂质体注射剂制备：

（1）1mol磷脂酰丝氨酸用玻璃平面成型法制成薄膜后，加入1000~3000L生理盐水水合处理，再用超声波在频率500~2000KHz、功率0.01~5KW处理1~5min。

（2）取上述溶液1~100mL加入到含量0.001~0.01mol/L的0.1~1000mLCaCl₂溶液中，在转速30~75r/min条件下搅拌10~30min，然后在25~50℃条件下静置30~120min。

（3）将生成物放置离心机中，在转速1500~3000r/min离心分离5~30min，将离心物从离心机中取出后加入2~50g生物改性蓖麻蛋白混合均匀，在10~25℃条件下静置10~120min。

（4）上述物体加入含有0.01~10mol/L的乙二胺四乙酸的生理盐水溶液0.1~10L中，混合均匀静置30~180min，得到单层脂质体。

（5）取1~10mg单层脂质体与10~200mL生理盐水溶液混合，制备成为注射剂。

实施例8：

脂质体注射剂制备：

（1）1mol磷脂酰丝氨酸用玻璃平面成型法制成薄膜后，加入2000L生理盐水水合处理，再用超声波在频率1000KHz、功率2KW处理5min。

（2）取上述溶液50mL加入到含量0.005mol/L的1000mLCaCl₂溶液中，在转速45r/min条件下搅拌30min，然后在30℃条件下静置60min。

（3）将生成物放置离心机中，在转速2000r/min离心分离20min，将离心物从离心机中取出后加入20g生物改性蓖麻蛋白混合均匀，在15℃条件下静置60min。

（4）上述物体加入含有1mol/L的乙二胺四乙酸的生理盐水溶液5L中，混合均匀静置80min，得到单层脂质体。

（5）取5mg单层脂质体与100mL生理盐水溶液混合，制备成为注射剂。

实施例9：

肠溶胶囊的制备：

取10~100g生物改性蓖麻蛋白、500~2000g预凝胶淀粉及5-50g乳糖充分混合，填充入羟丙基甲基纤维素肠溶胶囊中制备成为生物改性蓖麻蛋白肠溶胶囊。

实施例10：

肠溶胶囊的制备：

取50g生物改性蓖麻蛋白、1000g预凝胶淀粉及30g乳糖充分混合，填充入羟丙基甲基纤维素肠溶胶囊中制备成为生物改性蓖麻蛋白肠溶胶囊。

实施例11：

恶性胸膜间皮瘤疾病分期：

0期：癌灶局限于粘膜层，无淋巴结转移；

期：肿瘤局限于固有肌层以内，无淋巴结转移；

期：肿瘤浸润超过固有肌层，但无淋巴结转移；

期：淋巴结转移；

期：远处转移（脑、肝、肺等）或腹膜转移。

治疗方法：

患者需严格戒除烟、酒、茶，按体重70Kg计，每天注射脂质体药剂1次，每次300μg；或每天使用栓剂1次，肛门给药，每次1支；或口服肠溶胶囊2次，每次3粒。

治疗结果分级标准：

、近期疗效（40天末与治疗前比较）

（1）完全缓解：病灶完全消失，无新的病灶出现；

（2）部分缓解：病灶缩小到治疗前的50%或更小，无新的病灶出现，多灶性病变时没有一个病灶增大；

（3）稳定期：轻度缓解：病灶缩小面积30%或增大面积25%，自觉症状改善，体力基本状况上升；基本稳定：病灶缩小不到25%或增大面积不超过25%以上，自觉症状改善，体力基本状况上升。

（4）扩展：单个面积或多个病灶总面积比治疗前增大25%以上或出现新的病变，临床症状加重，体力基本状况下降。

、中期疗效（7周~1年）

（1）完全缓解：无瘤生存；

（2）部分缓解：癌体回变到治疗前的面积50%以上，或出现新的病灶；癌体无增大或缩小，病症改善或消失；体力基本状况上升。

（3）转移或扩展：病原灶扩大发展，出现新的转移灶，临床症状加重，体力状况下降。

、远期疗效（1~5年）

（1）无瘤生存；

（2）带瘤生存；

（3）死亡。

治疗结果：

Claims (10)

1.一种生物改性蓖麻蛋白质的制备方法，其特征在于所述制备方法步骤如下：

（1）将1000g生物改性蓖麻虫体在常温膨化装置中常温条件下膨化粉碎；

（2）膨化粉碎后的物料加入到膨胀溶剂体系提取装置中，加入由1~10Kg液态二氧化碳、100~500mL甲醇及100~300gNH₃·H₂O组成或由1~10Kg液态二氧化碳、100~500mL乙醇及100~300g氯化铵组成的膨胀溶剂并加压至2~10MPa，形成膨胀溶剂体系，提取出生物改性蓖麻蛋白质粗品；

（3）收集含有生物改性蓖麻蛋白质粗品的溶液并且用微孔过滤器过滤去掉杂质；

（4）用超滤机超滤处理，收集生物改性蓖麻蛋白质超滤溶液；

（5）超滤液溶解在乙腈中用固相萃取柱分离，收集洗脱成分；

（6）将洗脱成分溶解在由正丁醇-乙酸乙酯-水按体积比1.25:3.75:5组成或由聚乙二醇-葡聚糖T500按重量比4.5:7组成的溶剂体系中，用超声驻波液相制备色谱分离纯化；

（7）纯化后的生物改性蓖麻蛋白质用真空冷冻干燥机制备成冻干蛋白粉。

2.根据权利要求1所述的生物改性蓖麻蛋白质的制备方法，其特征在于所述膨化压力为0.1~5MPa，时间为10~60min。

3.根据权利要求1所述的生物改性蓖麻蛋白质的制备方法，其特征在于所述提取温度为10~20℃，时间为10~30min。

4.根据权利要求1所述的生物改性蓖麻蛋白质的制备方法，其特征在于所述微孔过滤器的孔径为0.5~50μm。

5.根据权利要求1所述的生物改性蓖麻蛋白质的制备方法，其特征在于所述超滤机的孔径为50~100nm。

6.根据权利要求1所述的生物改性蓖麻蛋白质的制备方法，其特征在于所述真空冷冻干燥温度为-30~50℃、时间为18~26h。

7.权利要求1-6任一所述方法制备的生物改性蓖麻蛋白质在制备抗恶性胸膜间皮瘤药品中的应用。

8.根据权利要求7所述的生物改性蓖麻蛋白质在制备抗恶性胸膜间皮瘤药品中的应用，其特征在于所述抗恶性胸膜间皮瘤药品的剂型为栓剂，制备方法如下：

取生物改性蓖麻蛋白质冻干蛋白粉100~150g、卵磷脂1~15g、液体石蜡200~350g，将三者搅拌均匀，用研磨机以30~60r/min研匀成糊状，另取乌桕脂100~200g在水浴上加热40~60℃熔化后，冷却至25~38℃，倒入研匀的生物改性蓖麻蛋白质-卵磷脂-液体石蜡混合物中迅速搅拌均匀，趁热浇注于栓剂模具中，冷凝到10~20℃，从栓剂模具中取出即为成型的生物改性蓖麻蛋白质栓剂。

9.根据权利要求7所述的生物改性蓖麻蛋白质在制备抗恶性胸膜间皮瘤药品中的应用，其特征在于所述抗恶性胸膜间皮瘤药品的剂型为脂质体注射剂，制备方法如下：

（1）1mol磷脂酰丝氨酸用玻璃平面成型法制成薄膜后，加入1000~3000L生理盐水水合处理，再用超声波在频率500~2000KHz、功率0.01~5KW处理1~5min；

（2）取上述溶液1~100mL加入到含量0.001~0.01mol/L的0.1~1000mLCaCl₂溶液中，在转速30~75r/min条件下搅拌10~30min，然后在25~50℃条件下静置30~120min；

（3）将生成物放置离心机中，在转速1500~3000r/min离心分离5~30min，将离心物从离心机中取出后加入2~50g生物改性蓖麻蛋白质混合均匀，在10~25℃条件下静置10~120min；

（4）上述物体加入含有0.01~10mol/L的乙二胺四乙酸的生理盐水溶液0.1~10L中，混合均匀静置30~180min，得到单层脂质体；

（5）取1~10mg单层脂质体与10~200mL生理盐水溶液混合，制备成为注射剂。

10.根据权利要求7所述的生物改性蓖麻蛋白质在制备抗恶性胸膜间皮瘤药品中的应用，其特征在于所述抗恶性胸膜间皮瘤药品的剂型为肠溶胶囊，制备方法如下：

取10~100g生物改性蓖麻蛋白质、500~2000g预凝胶淀粉及5-50g乳糖充分混合，填充入羟丙基甲基纤维素肠溶胶囊中，制备成为生物改性蓖麻蛋白质肠溶胶囊。