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CN104619826A - 微孔板 - Google Patents

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CN104619826A
CN104619826A CN201380047519.9A CN201380047519A CN104619826A CN 104619826 A CN104619826 A CN 104619826A CN 201380047519 A CN201380047519 A CN 201380047519A CN 104619826 A CN104619826 A CN 104619826A
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CN201380047519.9A
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塚田亮平
大久保春男
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Sumitomo Bakelite Co Ltd
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Sumitomo Bakelite Co Ltd
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Abstract

本发明的目的在于提供一种能够良好地形成细胞凝集块、并且确保充分的孔容量的微孔板，该微孔板具备具有在一个面开放的开口的孔，上述孔划定从上述开口向上述微孔板的内部形成的空间，上述空间具有开口侧部分、从上述开口侧部分向上述微孔板的内部形成的底部侧部分、和将开口侧部分(41)与底部侧部分(42)平滑地连接的过渡部分(43)，上述开口侧部分的横截面呈多边形，上述底部侧部分以朝向内部横截面积逐渐减少的方式形成。

Description

微孔板
技术领域
本发明涉及一种微孔板。
背景技术
近年来，药效评价的筛选和分化诱导因子的研究正在活跃地开展着。在这种研究中，使用各种细胞凝集块进行评价。因此，需求有效地形成细胞凝集块的培养方法。
另外，在筛选等的评价中，需要一次性且迅速地对多样本进行处理。因此，需求能够进行大量的细胞凝集块的形成以及评价的培养容器。
以这样的目的可以使用设置有许多孔的微孔板。在微孔板中，市面上销售有96孔或384孔、1536孔的微孔板，可以对大量的样本进行处理。
但是，设置有许多孔的微孔板存在如下的问题。由于微孔板的形状、大小是规格化(ANSI/SBS-12004、ANSI/SBS-22004、ANSI/SBS-32004、ANSI/SBS-42004)的，因此，如果孔的数量增加，就不得不减少孔的容量。因此，例如专利文献1中公开的具有超过1000个孔的微孔板中，每1个孔的容量为数μL左右。在这种低容量的孔中进行培养时，由于营养因子的量的确保和培养基的蒸发的影响，因此培养变得非常困难。另外，在药效评价时，在孔中加入培养液的一半至等量的试剂，但在低容量的孔中没有这样的余量空间。
为了避免这样的问题，增加孔的容量，考虑将孔的纵截面形状制成四边形。但是，这样的孔的形状中，由于孔的底面为平面，因此难以形成均匀的细胞凝集块。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2001-509272号公报
发明内容
发明所要解决的课题
本发明是鉴于上述课题而完成的，其目的在于提供一种能够良好地形成细胞凝集块、并且确保充分的孔容量的微孔板。
用于解决课题的技术方案
这样的目的通过下述(1)～(5)所述的本发明来实现。
(1)一种微孔板，其具备具有在一个面开放的开口的孔，上述微孔板的特征在于：
上述孔划定从上述开口向上述微孔板的内部形成的空间，上述空间具有开口侧部分、从上述开口侧部分向上述微孔板的内部形成的底部侧部分、和将开口侧部分41与底部侧部分42平滑地连接的过渡部分43，
上述开口侧部分的横截面呈多边形，
上述底部侧部分以朝向内部横截面积逐渐减小的方式形成。
(2)根据上述(1)所述的微孔板，上述开口侧部分的深度与上述底部侧部分和过渡部分的合计深度的深度之比为3：1～4：1。
(3)根据上述(1)或(2)所述的微孔板，上述开口侧部分的与上述开口平行的截面为四边形、五边形或六边形的任一种。
(4)根据上述(1)～(3)中任一项所述的微孔板，上述底部侧部分的与上述开口平行的截面为圆形。
(5)根据上述(1)～(4)中任一项所述的微孔板，上述孔的数量为384个以上。
发明效果
根据本发明的微孔板，通过优化孔的形状，能够良好地进行细胞凝集块的形成，并且能够确保充分的孔容量。
附图说明
图1是本发明的实施方式的微孔板的俯视图。
图2是图1的II部分的放大图。
图3是本发明的实施方式的孔的纵截面图。
具体实施方式
下面，参照附图对本发明的微孔板的优选实施方式详细地进行说明。
图1是本发明的实施方式的微孔板1的俯视图。图2是图1的II部分的放大图。图3是本实施方式的孔2的纵截面图。其中，在以下的说明中，有时将图3中附图的上方称为上侧、将下方称为下侧。
首先，使用图1对本实施方式的微孔板1进行说明。微孔板1通常用于小规模的细胞培养或生物化学实验等。其中，本实施方式的微孔板1在具有孔2的深度以上的厚度的平板上形成有孔2，但本发明并不限定于此，也可以使具有低于孔2深度的厚度的平板的一部分凹陷而形成孔2。
如图1和3所示，微孔板1在树脂制的平板的一个面(上侧的面)上形成有开放的孔2。孔2一般配置成n行m列，其数量可以使用6、12、24、48、96、384、1536等。以下，以384孔(16行24列)的微孔板1为例进行说明。但是本实施方式的微孔板1并不限定于此，可以使用各种形状、尺寸、孔数的微孔板。
图1所示的本实施方式的微孔板1为纵向125mm左右、横向83mm左右、厚度14mm左右的平板状。
作为微孔板1的材料，可以列举例如聚丙烯树脂、聚乙烯树脂、乙烯-丙烯共聚物等聚烯烃系树脂或环状聚烯烃系树脂、聚苯乙烯、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯系树脂等聚苯乙烯系树脂、聚碳酸酯树脂、聚对苯二甲酸乙二醇酯树脂、聚甲基丙烯酸甲酯树脂等甲基丙烯酸系树脂、氯乙烯树脂、聚对苯二甲酸丁二醇酯树脂、聚芳酯树脂、聚砜树脂、聚醚砜树脂、聚醚醚酮树脂、聚醚酰亚胺树脂、聚四氟乙烯等氟系树脂、聚甲基戊烯树脂、聚丙烯腈等丙烯酸系树脂、丙酸酯树脂等纤维素系树脂等。
其中，在培养容器所要求的成形性、放射线杀菌耐性方面，优选聚苯乙烯树脂。
另外，在进行细胞凝集块的形状观察和吸光度测定的情况下，优选选择透明性的树脂；在进行每个孔的发光测定或荧光测定的情况下，优选选择遮光性的树脂。
孔2是划定用于形成细胞凝集块的空间4的部分。即，在微孔板1的上表面形成有划定凹部的孔2，该凹部成为空间4。在本实施方式中，如图3所示，由孔2划定的空间4具有：开口侧部分41、向微孔板1的内部形成的底部侧部分42、将开口侧部分41与底部侧部分42平滑地连接的过渡部分43。
进一步具体而言，开口侧部分41是以孔板1的上表面为其上端、以其多边形的横截面开始向圆形变形的部位为下端的部分。所谓的上述开始向圆形变形的部位，也就是多边形的内角中的任意一个的角度开始增大的部位。
底部侧部分42意味着从朝向内部横截面积开始逐渐减小的上端至作为孔的底部的下端。
此外，过渡部分是从开口部侧部分41的下端至底部侧部分42的上端的部分。
如图2所示，本实施方式的孔2的开口3基本形成为正方形。这样，通过使开口3为多边形而不为圆形，能够增大开口侧部分41的容积。只要开口3的形状为多边形就具有增大容积的效果，特别是在制成四边形、五边形或六边形的任一种形状时，与圆形的情况相比，容量增大，因此优选。特别是在孔2的数量为384以上的微孔板1中，将开口3制成多边形而带来的容量增加的效果好。
其中，在本实施方式中，也可以如图2所示，开口3的形状不为完全的多边形，而是各角形成为圆角。这样一来，能够良好地进行对孔2的表面处理等，因此优选。
空间4的开口侧部分41基本形成为多棱锥台形状。即，如图3所示，在开口侧部分41的纵截面，壁面向底部侧倾斜。优选倾斜角度尽可能小，例如为1～2°左右。这样，通过带有一些倾斜，在制造时容易将微孔板1从成形模具抽出。但是，也可以例如在脱模处理上下功夫等，只要脱模性良好，也可以不设置该倾斜。
空间4的底部侧部分42以朝向内部横截面积逐渐减小的方式形成。在本实施方式中，横截面形状为圆形。即，底部侧部分42形成为所谓的U底状形。这样的形状容易将细胞聚集在最深部，有利于细胞凝集块的形成。但是，底部侧部分42并不限定于U底、即使例如为V底，即底部侧部分42的纵截面形状并不限定于U字状、即使制成例如V字状，也能够进行细胞凝集块的形成。
过渡部分43位于开口侧部分41与底部侧部分42之间。过渡部分43以将具有多边形横截面的开口侧部分41与具有圆形横截面的底部侧部分42平滑地连接的方式形成。
在此，对孔2的代表的尺寸例进行说明。
开口3的一边为3.3mm左右的大小。另外，开口侧部分41的深度为8.8mm左右，底部侧部分42与过渡部分43合在一起的深度为3.2mm左右。因此，开口侧部分41、与底部侧部分42和过渡部分43的合计深度之比为3：1～4：1左右。在将开口侧部分41、与底部侧部分42和过渡部分43的合计深度之比设定在上述范围内时，能够具有可形成细胞凝集块的底部，并且能够充分地确保孔2的容量。
并且，在制成本实施方式的孔2形状时，孔2的容量为108.4μL。而在以对应的大小开口为圆形的情况下，孔的容量为87.16μL。在形成细胞凝集块时，每个孔的培养基量优选为50μL左右，如果制成本实施方式的孔形状，在以后的评价中能够添加与培养基等量的试剂。
下面，对本实施方式的微孔板1的使用方法进行说明。
作为一例，在本实施方式中，以50μL/孔进行培养。因此，对应于使用细胞凝集块的评价的目的，制备细胞悬浊液，以在50μL中确保所需要的细胞数。
将这样制备的细胞悬浊液接种于384孔的微孔板1上，以37℃、5％CO2浓度开始培养。接种的细胞以非粘接的状态增殖，在2天左右在孔2的最深部形成细胞凝集块。
接着，使用细胞凝集块，在微孔板1上进行药效评价的筛选。
作为一例，在本实施方式中，将与培养液同量的Cell Titer-Glo(TM)Luminescent Cell Viability Assay(Promega公司制)按照制品添加的说明添加于得到的细胞凝集块中，测定与每孔的细胞内ATP量成比例的发光量。将测定值作为细胞数的指标，能够算出每孔的细胞数的变化率，在每孔中加入不同的药剂时，能够评价药剂对细胞增殖的影响。
如上所述，根据本实施方式的微孔板1，从细胞凝集块的形成起、至药效评价的筛选止，能够不移动细胞凝集块地进行。因此，即使为使用大量样本的筛选，也能够迅速地进行评价。
实施例
下面，使用实施例对本发明进行说明。
(实施例1)
使用透明的聚苯乙烯树脂(PS Japan公司制、HF77)、和在透明的聚苯乙烯树脂中混合有15％白色色素钛白颜料(SUMIKA COLORCO.,LTD.制)的着色树脂，通过注射成形形成透明、白色2种384孔微孔板。
得到的微孔板的形状为横向127.7mm、纵向85.5mm、高度14.4mm。
另外，各孔的形状如图3所示，开口部为一边3.3mm的四边形，深度为12mm，底部的曲率半径为1.5mm，孔容量为108.4μL。
另外，开口侧部分41的深度为8.8mm，底部侧部分42和过渡部分43的合计深度为3.2mm，深度之比为15：4。
使用等离子体处理装置(BRANSON/IPC公司制SERIES7000)对得到的板进行等离子体处理(氧等离子体10分钟)，对板表面赋予润湿性。
接着，在用着色树脂进行了遮光的聚丙烯容器中，将水溶性树脂BIOSURFINE(R)-AWP(东洋合成工业株式会社制)溶解于25容量％乙醇水溶液中，制备0.3重量％的水溶性树脂溶液。利用自动分注机(Molecular Devices公司制、AquaMax 2000)，在上述的板上在每1孔中加入80μL上述的水溶性树脂溶液，浸渍3秒。
其后，用该自动分注机将溶液吸引除去，以25℃一次干燥17小时。
接着，用UV灯照射250nm的UV光1.0mW/cm2×30秒，使水溶性树脂固化。
其后，用超纯水反复清洗3次并干燥后，以吸收线量5.8kGy照射γ射线(RADIA INDUSTRY CO.,LTD.)，得到培养容器(板)。
(比较例1)
除了作为成形品使用市售的微孔板之外，按照与实施例1相同的工序得到培养容器(板)。作为市售的微孔板，使用Greiner公司制的781101。形状为横向127.7mm、纵向85.5mm、高度14.4mm，孔的开口部为一边3.7mm的四边形。孔的形状为仅由开口侧部分41构成的大致多棱锥台形状，深度为11.5mm，具有约1°的抽出梯度，底面为不具有过渡部分43和底部侧部分42的、一边3.3mm的四边形的平面。
对实施例1和比较例1中得到的培养容器，进行以下的评价。
(1)使用HepG2细胞(来自人肝癌的细胞)的细胞凝集块形成
根据细胞凝集块培养的培养期间的细胞的营养要求、以及由于培养中的培养基蒸发的影响，需要50μL/孔以上的培养液量，因此，在以下的评价中以培养液量50μL/孔进行。
将预先用90mmφ的培养盘进行培养并增殖的HepG2细胞以2×103cells/mL的浓度分散于培养液(杜尔贝科改性MEM+10％胎牛血清)中，制备细胞悬浊液。
将上述的细胞悬浊液以每50μL/孔分注于由透明树脂形成的板的全部孔中，在37℃、5％CO2氛围下培养3天。
3天后，通过显微镜观察评价各孔的细胞凝集块的状态。
结果，在实施例1中，在板的全部孔中观察到单一的细胞凝集块。而在比较例1中，在1个孔内观察到多个细胞凝集块。
对于得到了单一的细胞凝集块的由实施例1得到的培养容器，进行以下的评价。
(2)使用HepG2细胞的细胞凝集块的利用荧光素酶活性测定的细胞数计数
将HepG2细胞以2×103cells/mL的浓度分散于培养液(杜尔贝科改性MEM+10％胎牛血清)，制备细胞悬浊液。
以每50μL/孔分注于由上述的着色树脂形成的白色板上，在37℃、5％CO2氛围下培养3天。
3天后，按照制品添加的说明，添加与培养液等量的Promega公司的Cell Titer-Glo(TM)Luminescent Cell Viability Assay(Promega公司制)，测定与每孔的细胞内ATP量成比例的发光量。
另外，以n＝384进行评价，由预先测定的标准曲线求出细胞数。
在实施例1中，相对于初始细胞数1000个，细胞数平均值为4810个，CV值为9.5％，确认了均匀的细胞的增殖。
另外，在每孔中加入不同的药剂时，可以评价药剂对细胞增殖的影响，利用本实施方式的微孔板，能够从细胞凝集块的形成起、至药效评价的筛选止，不移动细胞凝集块地进行。因此，即使为使用大量样本的筛选，也能够迅速地进行评价。
产业上的可利用性
由于本发明的微孔板具备具有适宜形状的孔，因此，可以良好地进行细胞凝集块的形成，并且能够确保充分的孔容量。
符号说明
1  微孔板
2  孔
3  开口
4  空间
41 开口侧部分
42 底部侧部分
43 过渡部分

Claims (5)

1.一种微孔板，具备具有在一个面开放的开口的孔，所述微孔板的特征在于：
所述孔划定从所述开口向所述微孔板的内部形成的空间，所述空间具有开口侧部分、从所述开口侧部分向所述微孔板的内部形成的底部侧部分、和将开口侧部分(41)与底部侧部分(42)平滑地连接的过渡部分(43)，
所述开口侧部分的横截面呈多边形，
所述底部侧部分以朝向内部横截面积逐渐减小的方式形成。
2.如权利要求1所述的微孔板，其特征在于：
所述开口侧部分的深度与所述底部侧部分和过渡部分的合计深度之比为3：1～4：1。
3.如权利要求1或2所述的微孔板，其特征在于：
所述开口侧部分的与所述开口平行的截面为四边形、五边形或六边形的任一种。
4.如权利要求1～3中任一项所述的微孔板，其特征在于：
所述底部侧部分的与所述开口平行的截面为圆形。
5.如权利要求1～4中任一项所述的微孔板，其特征在于：
所述孔的数量为384个以上。
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