CN104560856B - 一种好氧合成维生素b12的大肠杆菌及其构建与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种好氧合成维生素B₁₂的大肠杆菌及其构建与应用，属于代谢工程和微生物发酵领域。本发明大肠杆菌为宿主细胞，使用兼容的表达载体，将来源于类球红细菌和恶臭假单胞菌维生素B₁₂合成途径中大肠杆菌基因组缺失的基因进行模块化组装并表达，构建重组大肠杆菌工程菌株，通过发酵验证，实现了大肠杆菌合成维生素B₁₂。

Description

一种好氧合成维生素B12的大肠杆菌及其构建与应用

技术领域

本发明涉及一种好氧合成维生素B₁₂的大肠杆菌及其构建与应用，属于代谢工程和微生物发酵领域。

背景技术

维生素B₁₂(Vitamin B₁₂,VB₁₂)，又称为钴胺素，分子式为C₆₃H₈₈CoN₁₄O₁₄P，分子量是1355.38。它是一类含有钴的咕啉类化合物的总称，是目前已发现的最大、最复杂的维生素分子，也是唯一含有金属离子的维生素；其结晶为红色，故又称红色维生素。

1956年，Hodgkin等通过X-射线法证明了其晶体结构，即中心咕啉环、中心环轴向Coβ配基部分及1个含有核苷酸环的Coα配基，结构十分复杂。维生素B₁₂作为一种重要的维生素，其主要生理功能是参与制造骨髓红细胞，防止恶性贫血；防止大脑神经受到破坏。目前，已广泛应用于饲料、食品、医药卫生和化妆品等领域。

1972年，美国科学家Woodward,R.B.领导100多位合作者历时11年，共同完成了维生素B₁₂的全化学合成。但由于其化学合成步骤多，收率极低，因此化学合成十分昂贵。早期，人们从动物肝脏、肾脏等组织提取维生素B₁₂，但收率和效益也十分低下。后来，从链霉素发酵废液中提取，收率仍然很低。目前，工业生产中维生素B₁₂的生产主要采用微生物发酵法。

自然界中，维生素B₁₂从头合成途径分为两条途径，一条是厌氧合成途径，存在于费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenreichi)、谢氏丙酸杆菌(Propionibacteriumshermanii)、沙门氏菌属(Salmonella sp.)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)等细菌中；另一条是好氧合成途径，主要存在于脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)(好氧菌株)和类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)(兼性好氧菌株)中。目前，用于工业维生素B₁₂发酵的菌株主要是P.shermanii和P.denitrificans。培养基以葡萄糖为主要碳源，玉米浆为主要氮源，补加钴离子及前体5,6-二甲基苯丙咪唑(DMBI)。近年来，由于好氧发酵菌株具有诸多优点，如生长快、培养条件较为简单以及发酵易控制等。好氧发酵工艺是目前工业化生产维生素B12的主要工艺，全球80％以上的产量来自该工艺，以P.denitrificans为生产菌株，培养基采用甜菜糖蜜或麦芽糖为主要碳源，玉米浆或酵母膏为氮源，补加无机盐、钴离子以及DMBI。目前，国内外相关学者将注意力放在通过优化P.denitrificans的发酵工艺，以期提高维生素B₁₂的产量。

本发明在大肠杆菌中表达来源于类球红细菌和恶臭假单胞菌维生素B₁₂合成途径的基因， 采用不同拷贝数的表达载体对基因进行模块化组装，构建维生素B₁₂的从头好氧合成途径大肠杆菌工程菌株。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种好氧合成维生素B₁₂的大肠杆菌工程菌株，是在大肠杆菌中采用不同拷贝数的载体模块化组装表达来源于类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)和恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)的维生素B₁₂合成途径的基因，构建以葡萄糖为底物从头好氧合成维生素B₁₂的途径。

所述维生素B₁₂合成途径的基因包括cobA，cobI，cobG，cobJ，cobM，cobF，cobK，cobL，cobH，cobB，cobN，cobS，cobT，cobR，cobO，cobQ，cobC及cobD。

在本发明的一种实施方式中，所述维生素B₁₂合成途径的基因cobA，cobI，cobJ，cobM，cobF，cobK，cobL，cobH，cobB，cobN，cobS，cobT，cobO，cobQ，cobC和cobD来源于类球红细菌，cobG和cobR来源于恶臭假单胞菌。

在本发明的一种实施方式中，所述cobA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，cobI的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，cobG的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，cobJ的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，cobM的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，cobF的核苷酸序列如SEQID NO.6所示，cobK的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，cobL的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，cobH的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，cobB的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，cobN的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，cobS的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，cobT的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，cobR的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，cobO的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，cobQ的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，cobC的核苷酸序列如SEQID NO.17所示，cobD的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌宿主包括DH5α、JM109、W3110、BL21(DE3)、MG1655。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌为BL21(DE3)。

所述不同拷贝数表达载体分别为pACYCDuet-1、pCDFDuet-1、pETDuet-1和pRSFDuet-1。

在本发明的一种实施方式中，以pACYCDuet-1表达cobA、cobI、cobG、cobJ和cobM，pCDFDuet-1表达cobF、cobK、cobL、cobH和cobB，pETDuet-1表达cobN、cobS和cobT，pRSFDuet-1表达cobR、cobO、cobQ、cobC和cobD。

在本发明的一种实施方式中，在每个单独组装的基因模块前面，添加PgapA启动子和核糖体结合位点。

在本发明的一种实施方式中，使用pMD19为载体、同尾酶对基因进行组装。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌工程菌株的构建方法主要包括以下步骤：

(1)分别将PgapA和cobM，cobJ和cobG，cobI和cobA通过融合PCR方法连接，组装为PgapA-cobM，cobJG，cobIA。然后以pMD19为载体，利用同尾酶SpeI和XbaI以及BamHI和BglII将3个片段连接，构建质粒pMD19-PgapA-cobMJGIA。最后利用酶切位点AvrII和KpnI与经相同酶切的质粒pACYCDuet-1连接，构建质粒pACYCDuet-1-PgapA-cobMJGIA。

(2)分别将PgapA和cobB，cobH和cobL，cobK和cobF通过融合PCR方法连接，组装为PgapA-cobB，cobHL，cobKF。然后以pMD19为载体，利用同尾酶NsiI和PstI以及SpeI和XbaI将3个片段连接，构建质粒pMD19-PgapA-cobBHLKF。最后利用酶切位点AvrII和KpnI与经相同酶切的质粒pCDFDuet-1连接，构建质粒pCDFDuet-1-PgapA-cobBHLKF。

(3)分别将PgapA和cobN，cobS和cobT通过融合PCR方法连接，组装为PgapA-cobN，cobST。然后以pMD19为载体，利用同尾酶SpeI和XbaI将2个片段连接，构建质粒pMD19-PgapA-cobNST。最后利用酶切位点AvrII和KpnI与经相同酶切的质粒pETDuet-1连接，构建质粒pETDuet-1-PgapA-cobNST。

(4)分别将PgapA和cobD，cobC和cobQ，cobO和cobR通过融合PCR方法连接，组装为PgapA-cobD，cobCQ，cobOR。然后以pMD19为载体，利用同尾酶SpeI和XbaI及BamHI和BglII将3个片段连接，构建质粒pMD19-PgapA-cobDCQOR。最后利用酶切位点AvrII和KpnI与经相同酶切的质粒pRSFDuet-1连接，构建质粒pRSFDuet-1-PgapA-cobDCQOR。

(5)将构建的重组质粒pACYCDuet-1-PgapA-cobMJGIA、pCDFDuet-1-PgapA-cobBHLKF、pETDuet-1-PgapA-cobNST和pRSFDuet-1-PgapA-cobDCQOR共转化E.coli BL21(DE3)，获得重组菌株VB12-MBND(E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-cobMJGIA pCDFDuet-1-cobBHLKF pETDuet-1-cobNST pRSFDuet-1-cobDCQOR)。

本发明还提供一种应用所述大肠杆菌工程菌发酵生产维生素B₁₂的方法，是将重组菌活化后以2-5％的接种量转接到发酵培养基中，0h时添加0.1-0.5mM IPTG诱导基因表达，根据需要添加氯霉素、链霉素、氨苄青霉素、卡那霉素，30-37℃，200r/min培养，周期60-72h。发酵培养基(g/L)：葡萄糖60-80，酵母膏25-30，(NH₄)₂HPO₄2.5-3.0，MgSO₄·7H₂O 1.5-2.0，CoCl·6H₂O 0.05-0.1，5,6-二甲基苯并咪唑(DMBI)0.01-0.05，5-氨基乙酰丙酸0.05-0.1，ZnSO₄·7H₂O 0.05-0.1，pH 7.0～7.2。

在本发明的一种实施方式中，是将重组菌活化后以2％接种量转接，0h时添加0.1-0.5mM IPTG诱导基因表达，根据需要添加氯霉素(34μg/mL)、链霉素(100μg/mL)，氨苄青霉素(100μg/mL)，卡那霉素(50μg/mL)，30-37℃，200r/min培养，周期60-72h。发酵培养基(g/L)：葡萄糖80，酵母膏30，(NH₄)₂HPO₄3.0，MgSO₄·7H₂O 2.0，CoCl·6H₂O 0.1，5,6-二甲基苯并咪唑(DMBI)0.05，5-氨基乙酰丙酸0.1，ZnSO₄·7H₂O 0.1，pH 7.0～7.2。

本发明在大肠杆菌中采用不同拷贝数的载体模块化组装表达来源于类球红细菌和恶臭假单胞菌维生素B₁₂合成途径的基因cobA，cobI，cobG，cobJ，cobM，cobF，cobK，cobL，cobH，cobB，cobN，cobS，cobT，cobR，cobO，cobQ，cobC及cobD，构建维生素B₁₂的从头好氧合成途径，实现微生物发酵法直接好氧发酵葡萄糖合成维生素B₁₂。

附图说明

图1：基因组装及质粒构建图

图2：大肠杆菌工程菌株发酵产维生素B₁₂质谱鉴定

A：氰钴胺素标样(100mg/L)

B：对照菌株：E.coli BL21(DE3)

C：重组菌株：E.coli BL21(DE3)VB12-MBND

具体实施方式

维生素B₁₂分析方法(高效液相色谱法)：

样品制备：在备好的10mL发酵液中加入8％NaNO₃溶液和冰醋酸各2.5mL，摇匀，置95～100℃水浴中加热30min后取出，冷却至室温，50W白炽灯下光照30min后加去离子水定容至50mL，过滤，所得滤液用0.22μm微孔滤膜针头过滤器过滤1mL至样品瓶，用微量进样器吸取氰化钠溶液20μL放人样品瓶中，将样品瓶放人35～40℃水浴中反应1h，取出，在给定条件下进行液相色谱分析。

高效液相色谱条件：流动相：250mmol/L磷酸水溶液-乙腈(30：70，v/v)，色谱柱：BackmanC18柱(4.6mm×250mm，5μm)；检测波长：361nm；进样量：20μL；流速：1.0mL/min；柱温：25℃。

培养基：

斜面培养基(g/L)：蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉5.0，琼脂20，pH 7.0；

种子培养基(g/L)：葡萄糖40，酵母膏10，NH₄Cl 1.0，MgSO₄·7H₂O 0.5，ZnSO₄·7H₂O0.1，pH 7.2～7.4；

发酵培养基(g/L)：葡萄糖80，酵母膏30，(NH₄)₂HPO₄3.0，MgSO₄·7H₂O 2.0，CoCl·6H₂O0.1，5,6-二甲基苯并咪唑(DMBI)0.05，5-氨基乙酰丙酸0.1，ZnSO₄·7H₂O 0.1，pH 7.0～7.2。

培养条件：

菌种培养：甘油管划线，然后挑取单菌落划线平板37℃培养，作为种子来源；

种子培养：平板挑取菌体，37℃，200r/min，根据要求添加氯霉素34μg/mL，链霉素100μg/mL，氨苄青霉素100μg/mL，卡那霉素50μg/mL，培养约12h，转接发酵培养基；

发酵培养：以2％接种量转接，0h时添加0.1-0.5mM IPTG诱导基因表达，根据需要添加氯霉素(34μg/mL)、链霉素(100μg/mL)，氨苄青霉素(100μg/mL)，卡那霉素(50μg/mL)，30-37℃，200r/min培养，周期60-72h。

实施例1重组质粒及工程菌株的构建

(1)基因组装及质粒构建

将基因进行模块化组装，在每个单独组装的基因模块前面，添加PgapA启动子和核糖体结合位点。由于所组装的基因较多且片段较长，在连接过程中可用的酶切位点较少，本实施例使用pMD19为载体，借用同尾酶进行基因组装(图1)。构建重组质粒pACYCDuet-1-PgapA-cobMJGIA、pCDFDuet-1-PgapA-cobBHLKF、pETDuet-1-PgapA-cobNST和pRSFDuet-1-PgapA-cobDCQOR：

(1)分别将PgapA和cobM，cobJ和cobG，cobI和cobA通过融合PCR方法连接，组装为PgapA-cobM，cobJG，cobIA。然后以pMD19为载体，利用同尾酶SpeI和XbaI以及BamHI和BglII将3个片段连接，构建质粒pMD19-PgapA-cobMJGIA。最后利用酶切位点AvrII和KpnI与经相同酶切的质粒pACYCDuet-1连接，构建质粒pACYCDuet-1-PgapA-cobMJGIA。

(2)分别将PgapA和cobB，cobH和cobL，cobK和cobF通过融合PCR方法连接，组装为PgapA-cobB，cobHL，cobKF。然后以pMD19为载体，利用同尾酶NsiI和PstI以及SpeI和XbaI将3个片段连接，构建质粒pMD19-PgapA-cobBHLKF。最后利用酶切位点AvrII和KpnI与经相同酶切的质粒pCDFDuet-1连接，构建质粒pCDFDuet-1-PgapA-cobBHLKF。

(3)分别将PgapA和cobN，cobS和cobT通过融合PCR方法连接，组装为PgapA-cobN，cobST。然后以pMD19为载体，利用同尾酶SpeI和XbaI将2个片段连接，构建质粒pMD19-PgapA-cobNST。最后利用酶切位点AvrII和KpnI与经相同酶切的质粒pETDuet-1连接，构建质粒pETDuet-1-PgapA-cobNST。

(4)分别将PgapA和cobD，cobC和cobQ，cobO和cobR通过融合PCR方法连接，组装为PgapA-cobD，cobCQ，cobOR。然后以pMD19为载体，利用同尾酶SpeI和XbaI及BamHI和BglII将3个片段连接，构建质粒pMD19-PgapA-cobDCQOR。最后利用酶切位点AvrII和KpnI与经相同酶切的质粒pRSFDuet-1连接，构建质粒pRSFDuet-1-PgapA-cobDCQOR。

(2)维生素B₁₂重组大肠杆菌菌株的构建

将构建的重组质粒pACYCDuet-1-PgapA-cobMJGIA、pCDFDuet-1-PgapA-cobBHLKF、pETDuet-1-PgapA-cobNST和pRSFDuet-1-PgapA-cobDCQOR共转化E.coli BL21(DE3)，获得重组菌株VB₁₂-MBND。

实施例2重组大肠杆菌工程菌株摇瓶发酵验证

重组大肠杆菌VB₁₂-MBND在250mL三角瓶中发酵验证，接种量2％，初始葡萄糖浓度为80g/L，0h添加0.1-0.5mM IPTG诱导以及相应的抗生素，发酵结束后，对菌体细胞进行处理，分析维生素B₁₂的合成，经液相及质谱分析测定，维生素B₁₂的产量约为100μg/L(图2)。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (5)

1.一种好氧合成维生素B₁₂的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，是在大肠杆菌中采用不同拷贝数的载体模块化组装表达来源于类球红细菌和恶臭假单胞菌的维生素B₁₂合成途径的基因，构建以葡萄糖为底物好氧合成维生素B₁₂的途径；所述维生素B₁₂合成途径的基因包括cobA、cobI、cobG、cobJ、cobM、cobF、cobK、cobL、cobH、cobB、cobN、cobS、cobT、cobR、cobO、cobQ、cobC及cobD；所述cobA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，cobI的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，cobG的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，cobJ的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，cobM的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，cobF的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，cobK的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，cobL的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，cobH的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，cobB的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，cobN的核苷酸序列如SEQID NO.11所示，cobS的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，cobT的核苷酸序列如SEQ IDNO.13所示，cobR的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，cobO的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，cobQ的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，cobC的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，cobD的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；以pACYCDuet-1表达cobA、cobI、cobG、cobJ和cobM，pCDFDuet-1表达cobF、cobK、cobL、cobH和cobB，pETDuet-1表达cobN、cobS和cobT，pRSFDuet-1表达cobR、cobO、cobQ、cobC和cobD。

2.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，所述大肠杆菌包括DH5α、JM109、W3110、BL21(DE3)、MG1655。

3.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，将PgapA和cobM，cobJ和cobG，cobI和cobA通过融合PCR方法连接，组装为PgapA-cobM，cobJG，cobIA，连接后再与质粒pACYCDuet-1连接；将PgapA和cobB，cobH和cobL，cobK和cobF通过融合PCR方法连接，组装为PgapA-cobB，cobHL，cobKF，连接后再与pCDFDuet-1连接；将PgapA和cobN，cobS和cobT通过融合PCR方法连接，组装为PgapA-cobN，cobST，连接后再与pETDuet-1连接，构建质粒pETDuet-1-PgapA-cobNST；将PgapA和cobD，cobC和cobQ，cobO和cobR通过融合PCR方法连接，组装为PgapA-cobD，cobCQ，cobOR，连接再与pRSFDuet-1连接。

4.一种构建权利要求1所述大肠杆菌工程菌株的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：

(1)分别将PgapA和cobM，cobJ和cobG，cobI和cobA通过融合PCR方法连接，组装为PgapA-cobM，cobJG，cobIA；然后以pMD19为载体，利用同尾酶SpeI和XbaI以及BamHI和BglII将3个片段连接，构建质粒pMD19-PgapA-cobMJGIA；最后利用酶切位点AvrII和KpnI与经相同酶切的质粒pACYCDuet-1连接，构建质粒pACYCDuet-1-PgapA-cobMJGIA；

(2)分别将PgapA和cobB，cobH和cobL，cobK和cobF通过融合PCR方法连接，组装为PgapA-cobB，cobHL，cobKF；然后以pMD19为载体，利用同尾酶NsiI和PstI以及SpeI和XbaI将3个片段连接，构建质粒pMD19-PgapA-cobBHLKF；最后利用酶切位点AvrII和KpnI与经相同酶切的质粒pCDFDuet-1连接，构建质粒pCDFDuet-1-PgapA-cobBHLKF；

(3)分别将PgapA和cobN，cobS和cobT通过融合PCR方法连接，组装为PgapA-cobN，cobST；然后以pMD19为载体，利用同尾酶SpeI和XbaI将2个片段连接，构建质粒pMD19-PgapA-cobNST；最后利用酶切位点AvrII和KpnI与经相同酶切的质粒pETDuet-1连接，构建质粒pETDuet-1-PgapA-cobNST；

(4)分别将PgapA和cobD，cobC和cobQ，cobO和cobR通过融合PCR方法连接，组装为PgapA-cobD，cobCQ，cobOR；然后以pMD19为载体，利用同尾酶SpeI和XbaI及BamHI和BglII将3个片段连接，构建质粒pMD19-PgapA-cobDCQOR；最后利用酶切位点AvrII和KpnI与经相同酶切的质粒pRSFDuet-1连接，构建质粒pRSFDuet-1-PgapA-cobDCQOR；

(5)将构建的重组质粒pACYCDuet-1-PgapA-cobMJGIA、pCDFDuet-1-PgapA-cobBHLKF、pETDuet-1-PgapA-cobNST和pRSFDuet-1-PgapA-cobDCQOR共转化E.coli BL21(DE3)，获得重组菌株VB12-MBND(E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-cobMJGIA pCDFDuet-1-cobBHLKFpETDuet-1-cobNST pRSFDuet-1-cobDCQOR)。

5.一种应用权利要求1所述大肠杆菌工程菌株发酵生产维生素B₁₂的方法，其特征在于，是将重组菌活化后以2-5％的接种量转接到发酵培养基中，0h时添加0.1-0.5mM IPTG诱导基因表达，根据需要添加氯霉素、链霉素、氨苄青霉素、卡那霉素，30-37℃，200r/min培养，周期60-72h；发酵培养基(g/L)：葡萄糖60-80，酵母膏25-30，(NH₄)₂HPO₄ 2.5-3.0，MgSO₄·7H₂O 1.5-2.0，CoCl₂·6H₂O 0.05-0.1，5,6-二甲基苯并咪唑0.01-0.05，5-氨基乙酰丙酸0.05-0.1，ZnSO₄·7H₂O 0.05-0.1，pH 7.0～7.2。