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CN104508122A - 用于处理细胞群体的材料和方法 - Google Patents

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CN104508122A
CN104508122A CN201380038127.6A CN201380038127A CN104508122A CN 104508122 A CN104508122 A CN 104508122A CN 201380038127 A CN201380038127 A CN 201380038127A CN 104508122 A CN104508122 A CN 104508122A
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CN
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cell
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cytocompatibility
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cells
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Application number
CN201380038127.6A
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安德鲁·E·森耶伊
张海川
凯瑞·B·冈宁
张意
凯西·沃尔什
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Sere Na (china) Medical Technology Co Ltd
Original Assignee
Celula Inc
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Abstract

本发明公开了用于处理细胞群体(例如从细胞群体富集目的细胞)的材料和方法。所述方法可包括：获得分散于细胞相容基质中的细胞群体；向所述细胞群体施加一种或多种标记物以将目的细胞与所述细胞群体的一种或多种细胞区分开来；鉴定包含所述目的细胞的细胞相容基质部分；以及任选地分离包含所述目的细胞的细胞相容基质部分。相对于其他方法，所述方法可例如有利地提供降低的细胞损伤或损失。本发明还公开了可用于实施所述方法的装置和组合物。

Description

用于处理细胞群体的材料和方法
相关申请
本申请要求于2013年6月20日提交的题为“用于处理细胞群体的材料和方法(MATERIALS AND METHODS FOR PROCESSING CELLPOPULATIONS)”的美国临时专利申请61/662,246的优先权，在允许的情况下通过引用将其整体并入本文。
发明背景
存在许多用于从异质细胞群体富集目的细胞的材料和方法。例如，荧光活化的细胞分选(FACS)是专门类型的流式细胞术，其中可基于光散射或荧光性质分选窄的个体细胞流。再例如，已经使用了微流装置来富集细胞。由于例如在处理期间细胞粘附至表面，这些现有技术可能表现出显著的细胞损伤或损失。在从异质细胞群体中富集稀有细胞时，可能特别不期望该细胞损失。因此，存在改进用于从异质细胞混合物富集目的细胞的材料和方法的需求。
发明概述
本文公开的一些实施方案包括方法。所述方法可包括：获得分散于细胞相容基质中的细胞群体；向所述细胞群体施加标记物以将目的细胞与细胞群体的一种或多种细胞区分开来；以及鉴定包含所述目的细胞的细胞相容基质部分。
在一些实施方案中，所述方法还包括分离包含所述目的细胞的细胞相容基质部分。
在一些实施方案中，所述细胞相容基质包含聚合物。在一些实施方案中，所述细胞相容基质包含水凝胶。
在一些实施方案中，所述细胞群体是异质的。在一些实施方案中，所述细胞群体得自血液样品，在一些实施方案中，所述血液样品来自孕妇。在一些实施方案中，所述细胞群体包含母体细胞和胎儿细胞。在一些实施方案中，所述目的细胞是胎儿细胞。在一些实施方案中，所述目的细胞是癌细胞。在一些实施方案中，所述目的细胞是干细胞。
在一些实施方案中，获得分散于细胞相容基质中的细胞群体包括将所述细胞群体与包含聚合物的组合物合并，并交联所述聚合物以形成所述细胞相容基质。在一些实施方案中，交联所述聚合物以形成所述细胞相容基质包括向所述聚合物施加辐射、加热所述聚合物、调节所述组合物的pH，或将交联剂与所述组合物合并。
在一些实施方案中，将所述标记物施加至所述细胞群体包括在将所述细胞群体分散于所述细胞相容基质中之前将所述标记物与所述细胞群体合并。在一些实施方案中，将所述标记物施加至所述细胞群体包括在交联所述聚合物后将所述标记物与所述细胞群体合并。
在一些实施方案中，获得分散于所述细胞相容基质中的细胞群体包括将所述细胞群体与包含单体的组合物合并，并聚合所述单体以形成所述细胞相容基质。
在一些实施方案中，所述细胞相容基质包含选自以下的聚合物：聚(环氧烷烃)、淀粉、纤维素、多糖、聚氨酯、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚丙烯酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚酯、聚丙烯酰胺、聚乙醇酸、聚乳酸、蛋白质、以上物质的共聚物及以上物质的衍生物。
在一些实施方案中，所述细胞相容基质是透光的。在一些实施方案中，所述细胞相容基质对可见光具有至少约50％的透光率。在一些实施方案中，所述细胞相容基质具有至少约50cP的粘度。在一些实施方案中，所述细胞相容基质是多孔的。在一些实施方案中，所述细胞相容基质是光可降解的或可酶促降解的。在一些实施方案中，所述细胞相容基质在近平衡条件下具有小于约500的质量溶胀比(mass swelling ratio)。
在一些实施方案中，将一种或多种标记物施加至所述细胞群体包括将所述标记物施加至包含所述细胞群体的所述细胞相容基质的表面。在一些实施方案中，所述标记物中的至少一种鉴定细胞表面标志物或者细胞内标志物或结构。在一些实施方案中，所述细胞内标志物是核酸标志物或蛋白质标志物。在一些实施方案中，所述标记物中的至少一种是抗体。在一些实施方案中，所述标记物是染色剂，优选鉴定细胞结构的染色剂。在一些实施方案中，所述染色剂是核染色剂，例如苏木精、中性红/二苯乙烯红或尼罗蓝。
在一些实施方案中，所述方法包括将至少两种标记物施加至所述细胞群体。在一些实施方案中，将第一标记物和第二标记物施加至所述细胞群体，所述第一标记物被配置用于鉴定细胞表面标志物，并且所述第二标记物被配置用于鉴定细胞内标志物或结构。
在一些实施方案中，所述标记物中的至少一种是荧光标记的或放射性标记的。在一些实施方案中，所述标记物中的至少一种包含磁性颗粒或顺磁颗粒。
在一些实施方案中，所述标记物中的至少一种鉴定胎儿细胞的标志物。在一些实施方案中，所述胎儿细胞的标志物选自CD71、CD34、CD45和CD235a。
在一些实施方案中，所述标记物中的至少一种鉴定母体细胞的标志物。在一些实施方案中，所述母体细胞的标志物选自CD2、CD3、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD56、CD123和CD61。
在一些实施方案中，所述标记物中的至少一种鉴定癌细胞的标志物。
在一些实施方案中，从所述细胞群体鉴定包含目的细胞的细胞相容基质部分包括检测对应于所述标记物中的至少一种的辐射。
在一些实施方案中，从所述细胞群体鉴定包含目的细胞的细胞相容基质部分包括检测对应于所述标记物中的至少一种的磁场或磁力。
在一些实施方案中，分离包含所述目的细胞的细胞相容基质部分包括从所述细胞相容基质机械分离包含所述目的细胞的细胞相容基质部分。
在一些实施方案中，分离包含所述目的细胞的细胞相容基质部分包括选择性降解包含所述目的细胞的细胞相容基质部分中的细胞相容基质，并从所述细胞相容基质移除所降解的部分。
在一些实施方案中，分离包含所述目的细胞的细胞相容基质部分包括选择性降解与包含所述目的细胞的部分相邻的细胞相容基质，并将所降解的部分与包含所述目的细胞的部分分开。
本文公开的一些实施方案包括装置，其具有：基底；位于所述基底上的层，其中所述层包含细胞相容基质，并且所述层具有约2mm或更小的厚度；以及分散于所述层中的细胞群体。
本文公开的一些实施方案包括这样的组合物，其包含细胞相容基质以及能将目的细胞与所述细胞群体的一种或多种细胞区分开来的一种或多种标记物。
本文公开的一些实施方案包括这样的组合物，其包含细胞相容基质、细胞群体以及能将目的细胞与所述细胞群体的一种或多种细胞区分开来的一种或多种标记物。在一些实施方案中，所述细胞群体包含母体细胞和胎儿细胞。
附图说明
图1是描述使用细胞相容基质处理细胞群体的方法的一些实施方案的流程图。
图2是分散于细胞相容基质中的细胞群体的一个实例的透视图。
图3示出了使用亮视野显微镜拍摄的根据实施例1中的方法得到的分散于细胞相容基质中的细胞群体。
图4示出了使用荧光显微镜拍摄的根据实施例1中的方法得到的分散于细胞相容基质中的经染色的细胞群体。
图5示出了根据实施例1中的方法使用ε和γ血红蛋白抗体鉴定的靶细胞的对比度增强的图像。
发明详述
本文公开了使用细胞相容基质处理细胞群体的材料和方法。在一些实施方案中，所述方法可用于从异质细胞群体中富集目的细胞。所述方法可包括：获得分散于细胞相容基质中的细胞群体；向所述细胞群体施加一种或多种标记物以将目的细胞与细胞群体的一种或多种细胞区分开来；以及鉴定包含所述目的细胞的细胞相容基质部分。在一些实施方案中，所述方法还可包括分离包含所述目的细胞的细胞相容基质部分。相对于其他方法(例如，其他细胞富集方法)，所述方法可例如有利地提供减少的损伤或损失。本文还公开了用于实施本申请所公开方法的装置和组合物。
图1是描绘使用细胞相容基质处理细胞群体的方法的一些实施方案的流程图。在一些实施方案中，所述方法可从细胞群体进行目的细胞富集。所述方法可包括：方块100中所示的操作“获得分散于细胞相容基质中的细胞群体”；方块110中所示的操作“将一种或多种标记物施用至所述细胞群，以将目的细胞与所述细胞群体的一种或多种细胞区分开来”；方块120中所示的操作“鉴定包含所述目的细胞的细胞相容基质部分”；以及方块130中所示的任选操作“分离包含所述目的细胞的细胞相容基质部分”。虽然可依次进行操作100、110、120和130，但是应理解，可几乎同时进行这些操作中的一项或多项。还可以和图1中描述的顺序不同的顺序进行这些操作。
在操作100“获得分散于细胞相容基质中的细胞群体”中，获得用于处理的细胞群体。在一些实施方案中，可由第三方提供分散于细胞相容基质中的细胞群体。例如，医生可从患者获得样品，将细胞分散于细胞相容基质中，然后将所述样品送至诊断检测机构进行进一步处理。
所述细胞群体没有特别限制，并且可为例如需要富集的细胞群体。所述细胞群体可包含原核细胞、真核细胞或这些细胞的组合。在一些实施方案中，所述细胞群体可为哺乳动物细胞(例如，来自人的细胞)。在一些实施方案中，所述细胞群体得自哺乳动物的体液，如血液、羊水等。所述细胞群体可在分散于所述细胞相容基质中之前任选进行富集或预处理。例如，可在分散于细胞相容基质前，采用在密度梯度介质(如PERCOLL(Sigma-Aldrich,St.Louis,Mo.))中进行的密度梯度离心来减小细胞体积。所述细胞群体可为异质的或同质的。即，所述细胞群体可包含两种或更多种不同的细胞类型(例如，两种、三种、四种或更多种不同的细胞类型)，或者所述细胞群体可含有仅单一的细胞类型。
在一些实施方案中，所述细胞群体包含母体细胞和胎儿细胞。例如，所述细胞群体可得自孕妇的包含母体细胞和胎儿细胞的血液样品。在一些实施方案中，所述细胞群体包含癌细胞。例如，所述细胞群体可得自对象的癌组织样品。
可将所述细胞群体分散于多种类型的细胞相容基质中。所述细胞相容基质一般可为细胞相容的任何惰性材料。因此，所述细胞相容基质与组织学中通常用于保存生物组织的固定剂不同。许多细胞相容基质是本领域已知的，并且通常用于多种组织工程和药物递送应用中。在一些实施方案中，可配置所述细胞相容基质以使所述细胞群体的细胞中的基因组保持完整。在一些实施方案中，所述细胞相容基质包含聚合物。在一些实施方案中，所述细胞相容基质是水凝胶。
用于形成通常可为无毒和/或惰性的细胞相容基质的许多聚合物是本领域已知的。合适聚合物的非限制性实例包括聚(环氧烷烃)、淀粉、纤维素、多糖、聚氨酯、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙醇酸、聚乳酸和蛋白质。聚合物的一些具体实例包括聚乙二醇、聚丙二醇、羧甲基淀粉、透明质酸、壳聚糖、海藻酸、聚丙烯酸、明胶、骨胶原和纤维蛋白。可单独使用或组合使用这些聚合物来形成所述细胞相容基质。还可使用这些聚合物的多种共聚物，包括接枝共聚物。例如，可使用聚乙二醇和聚丙烯酸酯的共聚物，如聚乙二醇二丙烯酸酯。
所述细胞相容基质可为透光的，以允许观察所述细胞群体和/或标记物(例如，在下文进一步论述的操作110中施加至所述细胞群体的标记物)。在一些实施方案中，所述细胞相容基质被配置为透光的，从而可观察所述细胞群体(例如使用标准显微镜)。在一些实施方案中，所述细胞相容基质被配置为透光的，从而可检测从一种或多种标记物发射的光。例如，所述细胞相容基质可为透光的，从而可检测从荧光示踪抗体发射的荧光。所述细胞相容基质可例如对可见光具有以下透光率，其为，或至少为，或为至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或100％，或者由前述值中的任意两个限定的范围。在一些实施方案中，对可见光的透光率为50％至100％，或75％至95％。在一些实施方案中，所述细胞相容基质一般是透明的。通过本申请教导的引导，本领域技术人员将理解，可通过调节例如聚合物类型、聚合物浓度、交联度、分子量以及细胞相容基质的其他特征来容易地改变所述细胞相容基质的透光性。
所述细胞相容基质的粘度可例如具有以下粘度，其为，或至少为，或为至少约1cP、20cP、50cP、100cP、500cP、1,000cP、2,000cP、5,000cP或10,000cP。所述细胞相容基质可例如具有以下粘度，其为，或不大于，或不大于约100,000cP、50,000cP、20,000cP；或10,000cP。在一些实施方案中，所述细胞相容基质具有1cP至100,000cP，或20cP至20,000cP，或1,000cP至10,000cP的粘度。
所述细胞相容基质的溶胀性可具有以下质量溶胀比(在近平衡条件下所述细胞相容基质中的固体与水的重量比)，例如，其为，或不大于，或不大于约500、250、100、50、25或10。所述细胞相容基质可具有以下质量溶胀比，例如，其为，或至少为，或为至少约1、5、10、20或50。在一些实施方案中，所述细胞相容基质具有约1至约500的质量溶胀比。
可改变所述细胞相容基质中的任意化合物的重均分子量(交联前)，以调节所述细胞相容基质的多种性质(例如，粘度)。所述聚合物的重均分子量，例如，为，或至少为，或为至少约500Da、1,000Da、5,000Da、10,000Da、50,000Da；或100,000Da。所述聚合物的重均分子量，例如，为，不大于，或不大于约1百万Da、500,000Da、250,000Da、100,000Da、50,000Da或10,000Da。在一些实施方案中，所述聚合物的重均分子量可为500Da至1百万Da，或1,000Da至500,000Da，或5,000Da至250,000Da。
可改变任选聚合物的量以调节所述细胞相容基质的多种性质(例如，溶胀)。所述细胞相容基质中聚合物的量，例如，为，或至少为，或为至少约按重量计0.1％、按重量计0.5％、按重量计1％、按重量计2％；或按重量计5％。所述细胞相容基质中聚合物的量，例如，为，或不大于，或不大于约按重量计20％、按重量计15％、按重量计10％；或按重量计5％。在一些实施方案中，所述细胞相容基质中聚合物的量可为按重量计0.1％至20％，或按重量计0.5％至15％，或按重量计1％至10％。
所述细胞相容基质可包含水作为主要组分。所述细胞相容基质中水的量，例如，为，或至少为，或为至少约按重量计50％、按重量计70％、按重量计90％或按重量计95％。所述细胞相容基质中水的量，例如，为，或不大于，或不大于约按重量计99.9％、99％；或95％。在一些实施方案中，所述细胞相容基质中水的量可为按重量计50％至99.9％，或按重量计70％至99％。
所述细胞相容基质还可被配置为可透过一种或多种标记物。如将在下文中进一步论述的，可将一种或多种标记物施加至所述细胞群体。如果将所述标记物施加至所述细胞群体，同时使其分散于所述细胞相容基质中，则所述细胞相容基质可具有足以使所述标记物转运(例如，扩散)通过所述细胞相容基质到达靶标细胞标记物的渗透率。例如，所述细胞相容基质可具有足以使抗体转运至所述细胞相容基质中而结合细胞表面标志物的渗透率。在一些实施方案中，所述细胞相容基质可为多孔的，以增加渗透率。通过本申请教导的引导，本领域技术人员应理解，可通过改变例如聚合物浓度、分子量、交联度以及其他因素来获得足够的渗透率，从而容易地调节所述渗透率。
在一些实施方案中，所述细胞相容基质可为可降解的。如将在下文中论述的，可降解所述细胞相容基质以分离一部分的所述细胞相容基质(例如，在图1中描述的操作130期间)。所述细胞相容基质可任选为光可降解的。例如，可将光可降解的交联剂与聚合物组合以形成光可降解的水凝胶。Kloxin,A.等，Nature Protocols,Vol.5(12)，第1867-87页(2010)描述了使用基于邻硝基苄基醚的交联剂和聚乙二醇的光可降解聚合物的一个实例，其通过引用整体并入本文。所述细胞相容基质可任选地为可酶促降解的。例如，这可通过使用具有已知的降解这些聚合物的酶的多种多糖和蛋白质来实现。作为非限制性实例，透明质酸可被玻璃酸酶酶促降解，而骨胶原可被胶原酶酶促降解。
在一些实施方案中，获得分散于细胞相容基质中的细胞群体包括将所述细胞群体与包含聚合物的组合物合并(例如，混合)，并交联所述聚合物，以形成所述细胞相容基质。作为一个例子，可将体液(例如，血液)或组织(例如，活检组织)与聚合物混合物，然后交联所述聚合物以形成具有分散于水凝胶中的细胞群体的细胞相容基质。如上文所述，可在与所述聚合物合并以及交联之前预处理所述细胞群体(例如，减小体积、组织解离)。在一些实施方案中，还可将无菌流体、等渗流体(例如，盐水)与所述聚合物和所述细胞群体合并。在一些实施方案中，在与细胞相容基质合并之前用溶液或缓冲剂(例如，盐水或PBS)稀释所述细胞群体。
用于交联的方法可例如根据所使用的聚合物而变化。可使用任何已知的交联所述聚合物的方法，只要所述交联具有与所述细胞群体的低反应性即可。换言之，所述交联反应不显著损伤所述细胞群体(例如，所述反应是细胞相容的)。在一些实施方案中，交联所述聚合物包括向所述聚合物施加辐射、加热所述聚合物、调节包含所述聚合物的组合物的pH，或将交联剂与包含所述聚合物的组合物合并。例如，可将巯基修饰的透明质酸与包含乙烯基的交联剂合并，以形成所述细胞相容基质。Horkay,F.等，Polymer,第51卷，(2010),第4424-4430页描述了巯基修饰的透明质酸与聚乙二醇二丙烯酸酯的交联的一个实例，其通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，获得分散于细胞相容基质的细胞群体包括将所述细胞群体与包含单体的组合物合并(例如，混合)，并聚合所述单体以形成所述细胞相容基质。可使用任何已知的聚合所述单体的方法，只要所述方法具有与所述细胞群体的低反应性即可。在一些实施方案中，所述聚合可包括自由基聚合。例如，所述单体可为包含乙烯基的单体，如聚乙二醇二丙烯酸酯，并且可施加辐射以聚合所述包含乙烯基的单体单元。还可将诸如光引发剂IRGACURE 2959的聚合引发剂与所述单体合并，以起始聚合。
所述细胞群体中的细胞数可显著不等。所述细胞群体可包含例如至少约10个细胞；至少约100个细胞；至少约1,000个细胞；至少约10,000个细胞；至少约100,000个细胞；至少约1,000,000个细胞；至少约5,000,000个细胞；至少约10,000,000个细胞；或至少约100,000,000个细胞。
可例如通过改变与所述细胞群体合并的水凝胶(或水凝胶前体，如上文描述的聚合物或单体组合物)的量来改变所述水凝胶中的细胞密度。所述水凝胶中的细胞密度，例如，为，或至少为，或为至少约1千、1万、10万、1百万、1千万、2千万、5千万、1亿、10亿、100亿或1000亿个细胞每mL。所述水凝胶中的细胞密度，例如，不大于，或不大于约1000亿、100亿、10亿、1亿、5千万、2千万、1千万、1百万、10万或1万个细胞每mL。在一些实施方案中，所述水凝胶中的细胞密度为1千至1000亿个细胞每mL，或1百万至1亿个细胞每mL，或1千万至5千万个细胞每mL。
在一些实施方案中，可将包含细胞的溶液(例如，盐水)与所述水凝胶(或水凝胶前体，如上文描述的聚合物或单体组合物)合并。所述包含细胞的溶液的体积相对于所述水凝胶的体积可为1:100至约100:1，或1:10至1:1。
包含所述细胞群体的细胞相容基质的尺寸可不等。在一些实施方案中，所述细胞相容基质可为膜。所述膜可具有例如以下厚度：小于约2mm；小于约1mm；小于约500μm；小于约250μm；小于约100μm；小于约75μm；或小于约50μm。所述膜可具有大的表面积，以助于观察所述细胞相容基质中的细胞。所述膜的一面可具有如下的表面积：至少约1cm2；至少约5cm2；至少约10cm2；至少约50cm2；至少约500cm2；或至少约1m2。
图2是分散于细胞相容基质中的细胞群体的一个实例的透视图。膜200包含分散于细胞相容基质内的细胞群体210。膜200可包含本申请中公开的任何细胞相容基质和细胞群体。膜200还可被配置为使得细胞群体210可见(例如，使用标准显微镜)。膜200位于基底220上。在一些实施方案中，所述基底是透明的，或者具有如上文针对所述基质描述的对可见光为透光的。可将所述细胞相容基质位于例如玻片、聚合物层或水凝胶膜(例如，图2中描述的基底220可为玻片、聚合物层或水凝胶膜)上。在一些实施方案中，可将所述细胞相容基质位于两个基底之间。例如，可将所述细胞相容基质夹在两张玻片或两张水凝胶膜之间，所述水凝胶膜可为不含细胞的水凝胶膜。在一些实施方案中，可将所述细胞相容基质位于含有常规图案(例如网格)的基底上，以助于定位所述基质中的目的细胞。作为一个例子，基底230可为具有网格标记的玻片。当鉴定目的细胞时，可基于所述网格标记记录细胞位置，并在分离所述细胞相容基质部分时使用所记录的细胞位置。
参照图1，在操作110“将一种或多种标记物施加至所述细胞群体以将目的细胞与所述细胞群体的一种或多种细胞区分开来”中，可施加标记物来区分目的细胞。所施加的标记物可根据所述目的细胞而不同。一般而言，可将流式细胞技术中使用的任何标记物施加至所述细胞群体。所述标记物可为例如荧光示踪单克隆抗体、放射性标记的单克隆抗体或细胞染色剂或染料。在一些实施方案中，所述标记物中的至少一种包含可使用磁场检测的磁性颗粒或顺磁性颗粒。在一些实施方案中，所述标记物中的至少一种包含可使用荧光检测的纳米颗粒，如量子点。但是，本申请不限于流式细胞术中使用的标记物。
在一些实施方案中，将所述标记物中的至少一种被配置用于鉴定细胞表面标记物(例如，抗原)。例如，所述标记物可包括被配置用于结合诸如CD71的细胞表面标志物的具有荧光标签的抗体。在一些实施方案中，所述标记物中的至少一种被配置用于鉴定细胞内标志物(例如，细胞结构、蛋白标志物或核酸标志物)。作为一个例子，所述标记物中的至少一种可包括被配置用于结合胎儿细胞内的胎儿血红蛋白的抗胎儿血红蛋白抗体。作为另一个实例，可将双苯甲酰亚胺施加至所述细胞群体，以鉴定含有DNA的细胞。
可使用多种方法将一种或多种标记物施加至所述细胞群体。在一些实施方案中，可将所述标记物施加至包含所述细胞群体的所述细胞相容基质表面。然后所述标记物可转运(例如，扩散、电泳、光泳(optophoresis)、离心、磁场或电场)通过所述细胞相容基质到达所述细胞群体。在一些实施方案中，可在将所述细胞群体分散至所述细胞相容基质中之前将所述标记物施加至所述细胞群体。例如，可在交联之前将所述标记物与所述细胞群体和聚合物合并，或可在聚合之前将所述标记物与所述细胞群体和单体合并。
在一些实施方案中，仅将一种标记物施加至细胞群体。例如，仅将抗胎儿血红蛋白抗体施加至所述细胞群体以鉴定胎儿细胞。在一些实施方案中，将多种标记物(例如，两种、三种、四种或更多种标记物)施加至所述细胞群体。在一些实施方案中，将经配置用于鉴定细胞表面标志物的至少一种标记物施加至所述细胞群体，并且施加至少一种经配置用于鉴定细胞内标志物的标记物。例如，将CD71的放射性标记的抗体和双苯甲酰亚胺施加至所述细胞群体。在一些实施方案中，将经配置用于鉴定不同细胞表面标志物的至少两种标记物施加至所述细胞群体。作为一个例子，将经配置用于结合CD71的抗体和经配置用于结合CD123的抗体都施加至细胞群体。
在一些实施方案中，可选择所述标记物用于从包含母体细胞和胎儿细胞的细胞群体鉴定胎儿细胞。例如，鉴定得自母体血液样品的细胞群体中的胎儿细胞。所述标记物可例如被配置为用于鉴定胎儿细胞的至少一种标志物。胎儿细胞的标志物的非限制性实例包括CD71、CD34、CD235a、CK19、人白细胞抗原(HLA)标志物和胎儿血红蛋白。所述标记物可例如被配置为用于鉴定非胎儿细胞(例如，母体细胞)的至少一种标志物。非胎儿细胞的标志物的非限制性实例包括CD2、CD3、CD11、CD14、CD15、CD16、CD19、CD45、CD56、CD66、CD123和CD61。在一些实施方案中，将用于鉴定胎儿细胞标志物的至少一种标记物施加至所述细胞群体，并且将用于鉴定母体细胞标志物的至少一种标记物施加至所述细胞群体。
在一些实施方案中，可选择所述标记物用于鉴定癌细胞。例如，从得自对象的组织样品、细针吸样品或血液样品鉴定癌细胞。作为具体的实例，可将抗EGFR抗体施加至细胞以鉴定某些癌细胞(例如，乳腺癌)。
可使用本文公开的方法鉴定多种其他的细胞特征。所述标记物可被配置为用于鉴定对外部刺激表现出特定响应的细胞。因此，在一些实施方案中，所述方法可任选包括向所述细胞群体施加刺激，然后(或几乎同时)将一种或多种标记物施加至所述细胞群体。所述刺激可为将一种或多种分子施加至所述细胞群体，例如药物(例如，抗癌药物)、激素、蛋白质等。例如，可将抗癌药物施加至细胞群体，然后可将经配置用于鉴定细胞表面标志物的标记物施加至所述细胞群体。可使用所述标记物鉴定通过调节细胞表面标志物表达来响应所述抗癌药物的细胞。在一些实施方案中，将抗癌药物施加至所述细胞相容基质中的癌细胞群体，以鉴定对所述抗癌药物敏感或抗所述抗癌药物的癌细胞。
在操作120“鉴定包含所述目的细胞的细胞相容基质部分”中，可使用施加至所述细胞群体的一种或多种标记物来鉴定目的细胞。所述用于定位目的细胞的方法可根据例如目的细胞的类型以及施加至所述细胞群体的标记物而不同。
在一些实施方案中，将至少一种荧光示踪标记物(例如，染料或抗体)施加至所述细胞群体，并且可向所述基质施加有效使所述标记物发荧光的辐射。如果所述标记物被配置为用于鉴定所述目的细胞的标志物，则可将表现出对应于所述标记物的荧光的基质部分鉴定为包含所述目的细胞。可选地，如果所述标记物被被配置为用于鉴定除所述目的细胞之外的细胞标志物，则不表现出对应于所述标记物的荧光的部分可鉴定为包含所述目的细胞。可例如使用荧光显微镜或用于观察荧光的合适摄像头来鉴定所述基质部分。在一些实施方案中，所述标记物可具有能够通过人眼检测的颜色。因此，可在不施加产生荧光的辐射的情况下通过在显微镜下观察所述基质来鉴定所述基质部分。
在一些实施方案中，至少一种标记物可为放射性标记的，并且可测量对应于所述标记物的辐射，并将其与包含所述目的细胞的基质部分关联起来。在一些实施方案中，至少一种标记物可包含磁颗粒或顺磁颗粒，并且可测量对应于所述标记物的磁场或磁力，并将其与包含所述目的细胞的基质部分关联起来。
通过本申请教导的引导，本领域技术人员将理解，可组合使用多种标记物以鉴定具有较大概率包含所述目的细胞的基质部分。还可任选使用合适的电子装置(如带有图像处理软件的数字摄像头)自动进行所述基质部分的鉴定。
本申请的方法可用于鉴定多种目的细胞。在一些实施方案中，在所述细胞群体中富含所述目的细胞。目的细胞数目相对于所述细胞群体中的总细胞数，例如，为，至少为，或为至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或99％，或者由前述值中的任意两个限定的范围。在其他实施方案中，所述目的细胞在所述细胞群体中可为稀有的。目的细胞数相对于所述细胞群体中的总细胞数，例如为，或不大于，或不大于约1％、0.1％、0.01％、0.001％或0.0005％。例如，所述目的细胞可为得自母体血液样品的胎儿细胞。胎儿细胞的估计比例为约1,000,000个细胞中1至10个。
在操作130“分离包含所述目的细胞的细胞相容基质部分”中，可任选分离鉴定为包含所述目的细胞的基质部分。在一些实施方案中，分离所述细胞相容基质部分可包括从所述细胞相容基质机械分离包含所述目的细胞的细胞相容基质部分。例如，可使用手术刀、切割模或类似工具将所述细胞相容基质切成两个或更多个部分，并且可使用标准技术(例如通过用移液器抽吸或使用镊子)移除包含所述目的细胞的细胞相容基质部分。
在一些实施方案中，可通过选择性地降解包含所述目的细胞的部分中的细胞相容基质来分离包含所述目的细胞的细胞相容基质部分。然后可使用标准技术(例如通过洗涤、抽吸或毛细管作用)从所述细胞相容基质中分离所降解的部分。如上所述，所述基质可例如由光可降解材料或可酶促降解的材料组成。因此，在一些实施方案中，可选择性地将有效降解所述细胞相容基质的辐射施加至鉴定为含有目的细胞的基质部分。然后可移除被光降解的部分。在一些实施方案中，可选择性地将合适的酶施加(例如，使用微量移液器)至鉴定为含有目的细胞的基质部分。然后可移除被酶促降解的部分。
在一些实施方案中，可通过选择性地降解与包含所述目的细胞的部分相邻的至少一些基质区域，来分离包含所述目的细胞的细胞相容基质部分。例如，可将有效降解所述基质的辐射施加至包含所述目的细胞的部分周围的周边区域。然后可使用标准技术(例如通过抽吸、洗涤等)分离包含所述目的细胞的未降解部分。类似地，可使用酶促降解来选择性降解包含所述目的细胞的部分附近的至少一些基质区域。
所分离的基质部分可为所述基质的单一连续区域，或两个或更多个不同的包含所述目的细胞的基质区域(例如，两个、三个或更多个部分)。因此，可重复一次或多次例如切割和移除区域(或者降解和移除区域)的操作。如果分离两个或更多个不同的区域，则可将它们都放置在单个的容器或分离的容器中，用于进一步处理。
从所述基质移除的每个区域的尺寸可能相对较小。从所述基质移除的每个区域的体积可为例如小于约10mm3；小于约5mm3；小于约1mm3；小于约0.5mm3；小于约0.1mm3；小于约0.05mm3；或小于约0.01mm3。所分离的所述基质部分的总尺寸也可相对较小。所分离的所述基质的部分的总体积可为例如小于约100mm3；小于约10mm3；小于约5mm3；小于约1mm3；小于约0.5mm3；小于约0.1mm3；小于约0.05mm3；或小于约0.01mm3。
在分离包含所述目的细胞的基质部分后，可随后降解所述基质以提供与所述细胞的接近用于进一步处理。例如，可对包含所述目的细胞的部分进行酶促降解或光降解。然后可将所述目的细胞例如进行培养以增加细胞数。因此，在一些实施方案中，可完成本申请中公开的方法以使得所述目的细胞可为活的。所述活细胞可提供适于扩增的完整基因组。因此，本申请公开的方法可以不包括通常在组织学中使用的固定细胞(例如，不包括用醛或醇固定以保存死细胞)。
本申请中公开的方法可相比现有方法(例如细胞富集法)具有一些优势。在一些实施方案中，所述方法可具有施加至所述细胞群体的有限的离心步骤数(如果有的话)。所述方法可包括离心所述细胞群体，例如不多于两次；不多于一次；或零次。通过减少或去除离心步骤，这可减少细胞损伤或损失。在一些实施方案中，所述方法可快速完成。例如，所述方法可花少于2天；少于36小时、少于1天、少于18小时、少于12小时、少于6小时、少于1小时或少于5分钟。
本申请的方法可得到富集了所述目的细胞的细胞群体。目的细胞数相对于所述富集的细胞群体中的总细胞数，例如，为，或至少为，或为至少约0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％，或5％、20％，或50％，或者由前述值中的任意两个限定的范围。
本文公开的方法可包括多项任选的处理后操作。在一些实施方案中，可对所分离的基质部分中的目的细胞进行筛选或基因分型。在一些实施方案中，可扩增所分离的基质部分中的所述细胞。扩增方法的非限制性实例包括全基因组扩增、全转录组扩增、靶标核酸扩增、生成核酸序列的替代物或细胞分裂。在一些实施方案中，可使用聚合酶链式反应(PCR)来扩增来自所分离的基质部分中的所述细胞的DNA。
可在不从所述细胞相容基质(或所述细胞相容基质的降解形式)分离所述细胞的情况下对所分离的基质部分进行任选的扩增操作。作为一个例子，可降解所分离的基质部分(例如，得自图2中描绘的操作130的所分离的基质部分)，并可将包含所述细胞的所降解的基质直接用于扩增，从而不从所降解的基质分离所述细胞(例如，不使用离心以从所降解的基质分离细胞)。因此，在一些实施方案中，所述细胞相容基质可与扩增技术(如PCR)相兼容。
本文公开的方法可用于富集胎儿细胞以对所富集的细胞群体的胎儿鉴定物进行筛选和基因分型。共同转让的美国出版物第2011/0086769号公开了用于检测来自不同个体的两种细胞类型(例如，胎儿和母体细胞)的混合物中的等位基因、基因组和转录组的多种技术，并且通过引用将其整体并入本文。
本文公开的一些实施方案包括装置。例如，可使用所述装置来实施本申请公开的方法。在一些实施方案中，所述装置可用于从细胞群体富集目的细胞。所述装置可包括基底、位于所述基底上的层以及分散于所述层中的细胞群体。所述层(例如，图2中描述的膜200)可包含细胞相容基质，并且所述层可具有约2mm或更小的厚度。所述细胞相容基质可具有本申请中关于所述方法描述的任何性质。例如，所述细胞相容基质可包含聚合物，或可包含水凝胶。所述细胞群体(例如，图2中描述的细胞群体210)可具有本申请中关于所述方法描述的任何性质。所述基底(例如，图2中描述的基底220)可具有本申请中关于所述方法描述的任何性质。
本文公开的一些实施方案包括组合物。例如，可使用所述组合物来实施本申请中公开的方法。在一些实施方案中，所述组合物可用于从细胞群体富集目的细胞。所述组合物可包含细胞相容基质和一种或多种标记物。所述组合物可包含细胞相容基质、一种或多种标记物以及细胞群体。所述细胞相容基质、所述一种或多种标记物以及所述细胞群体可各自具有本申请中关于所述方法描述的任何性质。
实施例
在以下实施例中进一步详细公开了其他的实施方案，其不旨在以任何方式限制权利要求的范围。
实施例1
从怀孕对象获得10mL全血样品，并使用PERCOLL作为密度梯度介质进行密度离心来去除无核细胞。离心后，血液样品为约0.15mL，并且每μL包含约16万个细胞。
然后将约0.15mL该血液样品与约274mg聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEGDA；6K Da)、约6.03mL 1X PBS以及约15mg光引发剂IRGACURE2959混合。将该混合物施加至玻片上，以形成具有约40μm厚度的膜。向该膜施加UV辐射，以形成水凝胶。图3示出了使用亮视野显微镜拍摄的光聚合后的分散于水凝胶中的细胞群体。
将包含约0.02mg荧光示踪的ε-血红蛋白单克隆抗体、约0.05mg荧光示踪的γ-血红蛋白单克隆抗体以及约1mg皂苷的约5mL溶液施加至该膜的表面。如图4所示，使用荧光显微镜观察所得的膜。图5示出了使用ε-血红蛋白抗体和γ-血红蛋白抗体得到的在膜的部分中鉴定的靶细胞的对比度增强的图像。手动切割所鉴定的部分，并将其与膜分离。
实施例2
按实施例1中所述获得血液样品并离心。然后一般根据Kloxin,A.等，Nature Protocols,第5(12)卷，第1867-87页(2010)中公开的用于形成水凝胶并封装细胞的方法，将该血液样品悬浮于光可降解的水凝胶中，文献通过引用整体并入本文。所得的膜可具有约40μm的厚度。
按与实施例1中所述相同的方式向该膜施加荧光示踪的单克隆抗体。使用荧光显微镜观察所得的膜，并将膜的显示荧光的部分鉴定为包含胎儿细胞。在膜上放置遮蔽物，所述遮蔽物在所鉴定部分对应的位置处有开口。向该膜施加降解所鉴定的膜部分的365-nm光源。通过抽吸或毛细管作用移除所降解的部分以及这些部分中的细胞。

Claims (41)

1.从异质细胞群体富集目的细胞的方法，所述方法包括：
获得分散于细胞相容基质中的细胞群体；
将标记物施加至所述细胞群体，以将目的细胞与所述细胞群体的一种或多种细胞区分开来；以及
鉴定包含所述目的细胞的细胞相容基质部分。
2.如权利要求1所述的方法，其中获得分散于所述细胞相容基质中的细胞群体包括将所述细胞群体与包含单体的组合物合并，以及聚合所述单体以形成所述细胞相容基质。
3.如权利要求1至2中任一项所述的方法，其中获得分散于细胞相容基质中的细胞群体包括：
将所述细胞群体与包含聚合物的组合物合并；以及
交联所述聚合物以形成所述细胞相容基质。
4.如权利要求3所述的方法，其中交联所述聚合物以形成所述细胞相容基质包括向所述聚合物施加辐射、加热所述聚合物、调节所述组合物的pH，或将交联剂与所述组合物合并。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中将所述标记物施加至所述细胞群体包括在将所述细胞群体分散于所述细胞相容基质中之前将所述标记物与所述细胞群体合并。
6.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中将所述标记物施加至所述细胞群体包括在交联所述聚合物之后将所述标记物与所述细胞群体合并。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中将所述标记物施加至所述细胞群体包括将所述标记物施加至包含所述细胞群体的所述细胞相容基质的表面。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述方法包括将至少两种标记物施加至所述细胞群体。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中将第一标记物和第二标记物施加至所述细胞群体，所述第一标记物被配置用于鉴定细胞表面标志物，并且所述第二标记物被配置用于鉴定细胞内标志物或结构。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中鉴定包含目的细胞的细胞相容基质部分包括检测对应于所述标记物中的至少一种的辐射，或者检测对应于所述标记物中的至少一种的磁场或磁力。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其还包括分离包含所述目的细胞的细胞相容基质部分。
12.如权利要求11所述的方法，其中分离包含所述目的细胞的细胞相容基质部分包括从所述细胞相容基质机械分离包含所述目的细胞的细胞相容基质部分。
13.如权利要求11至12中任一项所述的方法，其中分离包含所述目的细胞的细胞相容基质部分包括选择性降解包含所述目的细胞的细胞相容基质部分中的细胞相容基质，以及从所述细胞相容基质去除所降解的部分。
14.如权利要求11至12中任一项所述的方法，其中分离包含所述目的细胞的细胞相容基质部分包括选择性降解与包含所述目的细胞的部分相邻的细胞相容基质，以及将所降解的部分与包含所述目的细胞的部分分开。
15.用于从异质细胞群体富集目的细胞的装置，所述装置包括：
基底；
位于所述基底上的包含细胞相容基质的层，其中所述层具有约2mm或更小的厚度；以及
分散于所述细胞相容基质中的细胞群体。
16.用于从异质细胞群体富集目的细胞的组合物，所述组合物包含：
分散于细胞相容基质中的细胞群体，以及能将目的细胞与所述细胞群体的一种或多种细胞区分开来的一种或多种标记物。
17.如权利要求1或16中任一项所述的方法、装置或组合物，其中所述细胞相容基质包含聚合物。
18.如权利要求1至17中任一项所述的方法、装置或组合物，其中所述细胞相容基质包含水凝胶。
19.如权利要求1至18中任一项所述的方法、装置或组合物，其中所述细胞群体获自血液样品。
20.如权利要求19所述的方法、装置或组合物，其中所述血液样品来自孕妇。
21.如权利要求1至20中任一项所述的方法、装置或组合物，其中所述细胞群体包含母体细胞和胎儿细胞。
22.如权利要求1至21中任一项所述的方法、装置或组合物，其中所述目的细胞是胎儿细胞、癌细胞或干细胞。
23.如权利要求1至22中任一项所述的方法、装置或组合物，其中所述细胞相容基质包含选自以下的聚合物：聚(环氧烷烃)、淀粉、纤维素、多糖、聚氨酯、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚丙烯酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚酯、聚丙烯酰胺、聚乙醇酸、聚乳酸、蛋白质、以上物质的共聚物及以上物质的衍生物。
24.如权利要求1至23中任一项所述的方法、装置或组合物，其中所述细胞相容基质是透光的。
25.如权利要求1至24中任一项所述的方法、装置或组合物，其中所述细胞相容基质对可见光具有至少约50％的透光率。
26.如权利要求1至25中任一项所述的方法、装置或组合物，其中所述细胞相容基质具有至少约50cP的粘度。
27.如权利要求1至26中任一项所述的方法、装置或组合物，其中所述细胞相容基质是多孔的。
28.如权利要求1至27中任一项所述的方法、装置或组合物，其中所述细胞相容基质是光可降解的或可酶促降解的。
29.如权利要求1至28中任一项所述的方法、装置或组合物，其中所述细胞相容基质在近平衡条件下具有小于约500的质量溶胀率。
30.如权利要求1至29中任一项所述的方法、装置或组合物，其中所述标记物能鉴定细胞表面标志物或者细胞内标志物或结构。
31.如权利要求30所述的方法、装置或组合物，其中所述细胞内标志物是核酸标志物或蛋白标志物。
32.如权利要求1至31中任一项所述的方法、装置或组合物，其中所述标记物是抗体。
33.如权利要求1至32中任一项所述的方法、装置或组合物，其中所述标记物是染色剂，优选是能鉴定细胞结构的染色剂。
34.如权利要求1至33中任一项所述的方法、装置或组合物，其中所述染色剂是核染色剂。
35.如权利要求34所述的方法、装置或组合物，其中所述染色剂是苏木精、中性红/二苯乙烯红或尼罗蓝。
36.如权利要求1至35中任一项所述的方法、装置或组合物，其中至少一种标记物包含荧光标记、放射性标记、磁颗粒或顺磁颗粒。
37.如权利要求1至36中任一项所述的方法、装置或组合物，其中至少一种标记物能鉴定胎儿细胞的标志物。
38.如权利要求37所述的方法、装置或组合物，其中所述胎儿细胞的标志物选自CD71、CD34、CD45和CD235a。
39.如权利要求1至38中任一项所述的方法、装置或组合物，其中至少一种标记物能鉴定母体细胞的标志物。
40.如权利要求39所述的方法、装置或组合物，其中所述母体细胞的标志物选自CD2、CD3、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD56、CD123和CD61。
41.如权利要求1至36中任一项所述的方法、装置或组合物，其中至少一种标记物能鉴定癌细胞的标志物。
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