CN104487576A

CN104487576A - 具有修饰的生物碱含量的大红罂粟

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Publication number: CN104487576A
Application number: CN201280073863.0A
Authority: CN
Inventors: 贾斯廷·泰勒·库姆斯; 贾罗德·戴维·里奇; 马克·阿尔弗雷德·特斯特; 达明·莱特富特; 迪帕·杰哈
Original assignee: TPI Enterprises Ltd
Current assignee: TPI Enterprises Ltd
Priority date: 2012-04-30
Filing date: 2012-04-30
Publication date: 2015-04-01
Also published as: CA2872079A1; WO2013163668A1

Abstract

本发明涉及遗传修饰的大红罂粟(Papaver bracteatum)物种植物，其中由所述植物产生一种或多种生物碱的类型或量已被改变。具体地，相对于野生型大红罂粟(P.bracteatum)，所述遗传修饰的植物具有蒂巴因6-O-脱甲基酶、可待因O-脱甲基酶和/或可待因酮还原酶中的一种或多种的增加的表达，从而使所述遗传修饰的罂粟植物相对于野生型大红罂粟产生增加量的选自可待因、东罂粟碱和/或吗啡的生物碱。还提供以上述遗传修饰的罂粟植物作为亲本的子代植物；上述植物的突变体或衍生植物；来源于上述植物的繁殖材料，由上述植物产生的秆，由上述植物产生的秆浓缩物，来源于上述植物的胶乳，或来源于上述植物的一种或多种分离的细胞。还提供由上述植物产生生物碱的方法以及6-O-脱甲基酶和可待因O-脱甲基酶基因的核酸和氨基酸序列变体。

Description

具有修饰的生物碱含量的大红罂粟

发明领域

本发明涉及遗传修饰的大红罂粟(Papaver bracteatum)物种植物，其中由所述植物产生的一种或多种生物碱的类型或量已被改变。

发明背景

许多国家在调控下商业化培育阿片罂粟(Opium poppies)(鸦片罂粟(Papaver somniferum))。通过切开特有的蒴果得到的胶乳称为阿片，并且是一些药理学上重要的生物碱的来源。吗啡、可待因、蒂巴因、那可丁和罂粟碱是由该植物产生的最重要的生物碱，并且在制药工业上用作止痛药、镇咳药和镇痉药。

然而，在商业规模上，罂粟秆和秆浓缩物(而不是胶乳)是用于生产吗啡和其他罂粟来源的生物碱的最常用的原料。例如，现在，世界上多于50％的吗啡是由罂粟秆或罂粟秆浓缩物制备的。

澳大利亚生产世界上很大部分的(2006年约为30％)用于吗啡生产的罂粟秆浓缩物。此外，澳大利亚的塔斯马尼亚是世界上最大的用于制药市场的阿片生物碱生产地。在塔斯马尼亚，播种罂粟的面积在2011年接近34,000ha。

目前，有价值的生物碱，如吗啡，由一年生罂粟物种鸦片罂粟(Papaversomniferum)产生。

然而，本发明人已经认识到，与一年生植物物种相比，多年生的植物物种提供多种农业益处，诸如增加的硬度，增加的水分和/或营养利用效率，消除每个季节重新种植的需要，减少与作物建立相关的风险以及基本上减少作物轮作的需要。已经认识到上文列出的益处中的一种或多种具有增加生物碱总产率和/或效率的潜力。

大红罂粟(本文称作P.bracteatum)是一种产生大量的生物碱蒂巴因的多年生罂粟物种。蒂巴因本身不用于治疗，然而，这种生物碱用作制备其他生物碱的给料，包括用作制备羟考酮的给料。

然而，在本领域中认识到，大红罂粟不产生大量的其他商业价值的生物碱，如可待因、东罂粟碱和/或吗啡。

此外，尽管已经利用诱变来改变由一年生罂粟物种鸦片罂粟(Papaversomniferum)产生的生物碱的类型(例如，参见WO 98/02033)，但是，本发明人没有获知任何描述改变大红罂粟(P.bracteatum)的生物碱类型的报道。

在至少一些罂粟种植地区(包括澳大利亚的塔斯马尼亚)影响大红罂粟的耕作的更显著的问题是多个品种在种子萌发后的第一个生长季不产生种皮和大量的生物碱。

因此，产生可提取量的可待因、东罂粟碱和/或吗啡中的一种或多种生物碱的多年生罂粟植物(诸如大红罂粟物种)将是特别合乎需要的。此外，在至少温带罂粟种植地区(如澳大利亚的塔斯马尼亚)，此类耕种品种在萌发后的第一个生长季产生如吗啡和/或可待因的生物碱的能力也将是合乎需要的。

在本说明书中对任意现有技术的引用不是，并且不应该视为承认或以任何形式暗示该现有技术在任何国家形成常识的一部分。

发明概述

在第一方面，本发明提供遗传修饰的大红罂粟物种的罂粟植物，或其杂交体，其中，相对于野生型大红罂粟，蒂巴因6-O-脱甲基酶、可待因O-脱甲基酶和/或可待因酮还原酶中的一种或多种的表达增加，并且，其中相对于野生型大红罂粟，所述遗传修饰的罂粟植物产生增加量的选自可待因、东罂粟碱和/或吗啡的生物碱。

在一个实施方案中，相对于野生型大红罂粟，至少蒂巴因6-O-脱甲基酶的表达增加。

在一些实施方案中，所述罂粟植物包含一种或多种编码蒂巴因6-O-脱甲基酶、可待因O-脱甲基酶和/或可待因酮还原酶的转基因。在一些实施方案中，所述一种或多种转基因包含SEQ ID NOs：1-8，12和13中的任一项或多项列出的核苷酸序列。

在一些实施方案中，蒂巴因6-O-脱甲基酶包含SEQ ID NOs：9-11之一列出的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述罂粟植物在温带罂粟种植地区在萌发后的第一个生长季产生种皮和选自可待因、东罂粟碱和/或吗啡的生物碱。

在一些实施方案中，所述罂粟植物在40°-44°的纬度在萌发后的第一个生长季产生种皮和选自可待因、东罂粟碱和/或吗啡的生物碱。

在一些实施方案中，所述罂粟植物在澳大利亚的塔斯马尼亚在萌发后的第一个生长季产生种皮和选自可待因、东罂粟碱和/或吗啡的生物碱。

在一些实施方案中，所述罂粟植物包括不开裂的种皮或开裂的种皮。

在第二方面，本发明提供以本发明第一方面的罂粟植物作为亲本的子代植物，其中，相对于野生型大红罂粟，所述子代植物包含蒂巴因6-O-脱甲基酶、可待因O-脱甲基酶和/或可待因酮还原酶中的一种或多种的增加的表达，并且，其中相对于野生型大红罂粟，所述子代植物产生增加量的选自可待因、东罂粟碱和/或吗啡的生物碱。

在第三方面，本发明提供本发明第一或第二方面的植物的突变体或衍生植物，其中，相对于野生型大红罂粟，所述突变体或衍生植物包含蒂巴因6-O-脱甲基酶、可待因O-脱甲基酶和/或可待因酮还原酶中的一种或多种的增加的表达，并且，其中相对于野生型大红罂粟，所述突变体或衍生植物产生增加量的选自可待因、东罂粟碱和/或吗啡的生物碱。

在第四方面，本发明提供来源于本发明的第一、第二或第三方面中的任一方面的植物的繁殖材料。在一些实施方案中，所述繁殖材料包括种子。

在第五方面，本发明提供由本发明的第一、第二或第三方面中任一方面的植物产生的秆。

在第六方面，本发明提供由本发明的第一、第二或第三方面中任一方面的植物产生的秆浓缩物。

在第七方面，本发明提供来源于本发明的第一、第二或第三方面中任一方面的植物的胶乳。

在第八方面，本发明提供一片稳定繁殖的本发明的第一、第二或第三方面中任一方面的罂粟植物。

在第九方面，本发明提供来源于本发明的第一、第二或第三方面中任一方面的植物的分离的细胞。

在第十方面，本发明提供包含本发明第九方面的细胞中的一种或多种的体外培养物。在一个实施方案中，所述培养物产生选自可待因、东罂粟碱和/或吗啡的生物碱。

在第十一方面，本发明提供生产选自可待因、东罂粟碱和/或吗啡的生物碱的方法，所述方法包括种植本发明第一、第二或第三方面中任一方面的植物，以使所述植物产生选自可待因、东罂粟碱和/或吗啡的生物碱；并且从所述罂粟植物或其部分提取可待因、东罂粟碱和/或吗啡。

在第十二方面，本发明提供按照本发明第十一方面的方法生产的选自可待因、东罂粟碱和/或吗啡的生物碱。

在第十三方面，本发明提供包含一种或多种编码蒂巴因6-O-脱甲基酶、可待因O-脱甲基酶和/或可待因酮还原酶的转基因的表达构建体，其中所述一种或多种转基因可操作性地连接到在大红罂粟中有活性的转录控制序列上。

在一些实施方案中，所述一种或多种转基因包括SEQ ID NOs：1-8，12和13中任一项或多项列出的核苷酸序列。

在本发明第十三方面的一些实施方案中，所述蒂巴因6-O-脱甲基酶包含SEQ ID NOs：9-11之一列出的氨基酸序列。

在第十四方面，本发明提供包含SEQ ID NOs：1-8，12和13中任一项列出的核苷酸序列的分离的核酸分子。

在第十五方面，本发明提供分离的核酸分子，所述分离的核酸分子选自由下述组成的组：

(i)包含与SEQ ID NOs：1-8，12和13中任一项列出的核苷酸序列至少50％相同的核苷酸序列的核酸分子；和

(ii)在严格条件下与包含SEQ ID NOs：1-8，12和13中任一项列出的核苷酸序列的核酸分子杂交的核酸分子。

在第十六方面，本发明提供包含SEQ ID NOs：9-11之一列出的氨基酸序列的分离的多肽。

在第十七方面，本发明提供包含与SEQ ID NOs：9-11中任一项列出的氨基酸序列至少50％相同的氨基酸序列的分离的多肽。

附图简述

图1是显示在鸦片罂粟中由蒂巴因生物合成吗啡的示意图。T6ODM-蒂巴因6-O-脱甲基酶；CODM-可待因O-脱甲基酶；COR-可待因酮还原酶。

图2时显示使用针对T6ODM和CODM基因的引物对由鸦片罂粟和大红罂粟分离的DNA的PCR扩增产物的电泳凝胶照片。与凝胶中的每个泳道相对应的引物组合提供在表2中。鸦片罂粟基因组DNA作为模板(上图)；大红罂粟基因组DNA作为模板(下图)。

图3是显示CODM和T6ODM基因中用PCR扩增图2种显示的产物的引物的位置的示意图。

图4是T6ODM变体(克隆21，22，23和11)与用于T6ODM的参比cDNA序列(GQ500139)(在比对中称为“cDNA”)的核苷酸序列比对。克隆序列以黑色框出，内含子序列以灰色框出。核苷酸序列差别以白色框出。

图5是由图4的核苷酸序列编码的T6ODM变体的氨基酸序列比对。与用于T6ODM的参比cDNA序列(GQ500139)(在比对中称为“cDNA”)编码的氨基酸序列相比较，显示变体克隆21、22和23的氨基酸序列。

图6是CODM变体(克隆21)与用于CODM的参比cDNA序列(GQ500141)(在比对中称为“cDNA”)的核苷酸序列比对。克隆序列以黑色框出，内含子序列以灰色框出。核苷酸序列差别以白色框出。

图7是显示在实施例4中产生的T6ODM的构建体的载体图谱的示意图。

图8是显示在实施例4中产生的bar(Basta)构建体的载体图谱的示意图。

图9时显示在实施例4中产生的CODM构建体的载体图谱的示意图。

图10是显示在实施例4中产生的COR1.1构建体的载体图谱的示意图。

图11提供证明大红罂粟var PB-1的愈伤组织诱导和植物再生的照片。(A)8周后来自种子的愈伤组织；(B)20周后茎再生；(C)24周后具有根的小植株；(D，E和F)在分别用35S：：Basta、35S：：CODM和35S：：T6ODM进行农杆菌介导的转化后，在选择条件下的新的愈伤组织生长。

发明描述

在本文中核苷酸和氨基酸序列由序列标识号(SEQ ID NO：)表示。表1中提供了序列识别的概述。在本说明书终了提供序列表。

表1

序列标识的概述

本文提及“罂粟植物”可以指整个罂粟植物，但是也可以指罂粟植物的一部分，包括，例如，来源于罂粟植物的繁殖材料(如种子)；来源于罂粟植物的细胞、组织或器官；等等。因此，在一些实施方案中，本发明还提供罂粟植物细胞、组织、器官、繁殖材料等。

如上文所述，本发明的罂粟植物是多年生罂粟物种，大红罂粟。典型的大红罂粟或波斯罂粟，生长至多至1.5米的高度。其具有6个颜色为血红色带有黑斑的花瓣。蒴果典型地直径约为40mm，具有凹形冠部和永久的苞片。如本领域技术人员应该理解的，上述形态描述可能不适用于该物种的所有成员，因此，所述形态描述不应该被认为是对本文所用的术语大红罂粟的范围的限制。

此外，本文提及本发明的罂粟植物应该理解为包括大红罂粟物种以及其中至少一个亲本是大红罂粟物种的植物的杂交植物。此类杂交体可以包括，例如，种内杂交植物，其中亲本之一是本发明第一方面的植物，并且另一个亲本是罂粟属(genus Papaver)的植物(例如，鸦片罂粟或鬼罂粟(Papaver orientale))。

在一些实施方案中，杂交体可以是种间杂交植物，其中亲本之一是本发明第一方面的植物，并且另一个亲本是除罂粟属之外的种属的植物。

如上文所述，本发明考虑遗传修饰的罂粟植物，其中，相对于野生型大红罂粟，蒂巴因6-O-脱甲基酶、可待因O-脱甲基酶和/或可待因酮还原酶中的一种或多种的表达增加。本文中提及“野生型大红罂粟”应该理解为是大红罂粟物种的天然的或未遗传修饰的或未杂交的植物。

如上文所述，相对于野生型大红罂粟，本发明的遗传修饰的罂粟植物包含蒂巴因6-O-脱甲基酶(T6ODM)、可待因O-脱甲基酶(CODM)和/或可待因酮还原酶(COR)中的一种或多种的增加的表达。

当用在本文中时，术语“增加的表达”旨在指，例如，相对于野生型大红罂粟，本发明的遗传修饰的罂粟植物中的T6ODM、CODM和/或COR的酶活性的1％，5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，2-倍，5-倍，10-倍，20-倍，50-倍，100-倍或更大的增加。在一些实施方案中，增加的表达可以包括向本发明的罂粟植物中引入T6ODM、CODM和/或COR活性，此类活性在野生型大红罂粟中是不存在的。

如图1所示，在吗啡生物碱的合成过程中，T6ODM催化蒂巴因去甲基化成为neopinone，并且还催化东罂粟碱去甲基化成为吗啡酮(morphinone)。CODM催化蒂巴因去甲基化成为东罂粟碱，并且还催化可待因去甲基化成为吗啡。COR催化可待因酮还原为可待因，并且还催化吗啡酮还原为吗啡。

本发明人已经注意到，野生型大红罂粟积聚显著量的蒂巴因，而后来，在野生型大红罂粟中，生物碱可待因、东罂粟碱和吗啡不存在或以非常低的水平存在。由此，本发明人已经确定，在野生型大红罂粟中，负责蒂巴因转化为吗啡(通过可待因和/或东罂粟碱)的生物合成酶中的一种或多种不存在或没有活性。

然而，本发明人还已经鉴定了在大红罂粟的至少一些栽培种或其杂交体中可以积聚低水平的东罂粟碱。因此，在这些栽培种中，已经确定CODM可能是有活性的，至少以低水平有活性。由此，在这些植物中，可以仅需要向该植物中引入T6ODM和任选的COR活性，以在该植物中产生吗啡和/或可待因。然而，甚至在CODM有活性的这样的栽培种中，增加CODM活性以增加该植物中吗啡和/或可待因的产量也可能是合乎需要的。备选地，在需要在该植物中产生占主要量的可待因和低的或者没有吗啡产生的情况下，具有非常低的CODM表达或没有其表达的大红罂粟栽培种可能是有益的。

如实施例2中所示，本发明人拥有数据表明COR基因存在于大红罂粟中。此外，Brochmann-Hanssen&Wunderly(J Pharm Sci(制药科学杂志)67(1)：103-106，1978)已经报道，当向活的大红罂粟施加可待因酮时，其被快速而有效地转化为可待因。由该报道本发明人已经确定，在至少一些大红罂粟栽培种中，COR可能也是有活性的。然而，甚至在COR有活性的这样的栽培种中，增加COR活性以增加该植物中吗啡和/或可待因的产量也是合乎需要的。

根据上文，本发明人已经确定，为了在大红罂粟中获得选自可待因、东罂粟碱和/或吗啡的生物碱的生产，可以在大红罂粟中增加T6ODM、CODM和/或COR活性中的一种或多种的表达。

在一些实施方案中，相对于野生型大红罂粟，在本发明的罂粟植物中，至少T6ODM的表达增加。

术语“遗传修饰的罂粟植物”用在本文中应该理解为指已经对其进行遗传修饰的罂粟植物。“遗传修饰”可以包括，相对于该植物的未遗传修饰的形式，在遗传修饰的植物中，使目的酶活性(例如，T6ODM、CODM和/或COR)的表达增加的任意遗传修饰。示例性的遗传修饰的类型包括：随机诱变，如转座子、化学、UV和噬菌体诱变以及选择过量表达目的酶活性的突变体；向细胞中瞬时或稳定引入在所述细胞中指导目的酶表达和/或过量表达的一种或多种核酸分子。

在一些实施方案中，本发明考虑通过在所述植物的一个或多个细胞中增加T6ODM、CODM和/或COR编码核酸的表达和/或在所述植物的一个或多个细胞中增加T6ODM、CODM和/或COR编码核酸的拷贝数来增加大红罂粟中T6ODM、CODM和/或COR的表达。

“增加T6ODM、CODM和/或COR编码核酸的表达”旨在指，例如，相对于野生型大红罂粟，T6ODM、CODM和/或COR编码核酸的转录和/或翻译增加1％，5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，2-倍，5-倍，10-倍，20-倍，50-倍，100-倍或更多。增加T6ODM、CODM和/或COR编码核酸的表达还应该理解为包括向本发明的罂粟植物中引入T6ODM、CODM和/或COR编码核酸的表达，所述活性在野生型大红罂粟中是不存在的。

因此，在一些实施方案中，本发明的遗传修饰的罂粟植物包含编码T6ODM、CODM和/或COR的一种或多种转基因。在一些实施方案中，所述遗传修饰的罂粟植物至少包含编码蒂巴因6-O-脱甲基酶的一种或多种转基因。

本文中提及的“转基因”应该理解为包括引入到野生型大红罂粟基因组中和/或对野生型大红罂粟基因组不是天然的任意核苷酸序列。因此，转基因可以是大红罂粟基因组中已经存在的核苷酸序列的另外的或替代拷贝，或者可以是针对野生型大红罂粟基因组是外源性的核苷酸序列。

在本文中提及“蒂巴因6-O-脱甲基酶”或“T6ODM”应该理解为包括能够催化蒂巴因O-去甲基化成为neopinone和/或催化东罂粟碱O-去甲基化成为吗啡酮的任意酶。因此，本文提及编码蒂巴因6-O-脱甲基酶的核苷酸序列应该理解为包括编码蒂巴因6-O-脱甲基酶的任意核苷酸序列。编码蒂巴因6-O-脱甲基酶的核苷酸序列的实例包括GenBank登记号GQ500139列出的核苷酸序列或其功能同系物或变体。

本文中提及“可待因O-脱甲基酶”或“CODM”应该理解为包括能够催化蒂巴因O-去甲基化成为东罂粟碱和/或催化可待因O-去甲基化成为吗啡的任意酶。因此，本文中应用编码可待因O-脱甲基酶的核苷酸序列应该理解为包括编码可待因O-脱甲基酶的任意核苷酸序列。编码可待因O-脱甲基酶的核苷酸序列的实例包括GenBank登记号GQ500141列出的核苷酸序列或其功能同系物或变体。

在本文中提及“可待因酮还原酶”或“COR”应该理解为包括能够催化可待因酮还原为可待因和/或催化吗啡酮还原为吗啡的任意酶。因此，本文提及编码可待因酮还原酶的核苷酸序列应该理解为包括编码可待因酮还原酶的任意核苷酸序列。编码可待因酮还原酶的核苷酸序列的实例包括GenBank登记号FJ596162列出的核苷酸序列或其功能同系物或变体。

本文提及特定参比序列(例如，GenBank登记号GQ500139，GQ500141或FJ596162任一个中列出的核苷酸序列)的“功能同系物或变体”可以是相对于所述参比序列，具有一个或多个核苷酸插入、缺失或置换的核酸；所述参比序列的突变形式或等位基因变体；所述参比序列的直向同系物；包含一个或多个为稳定性或为其他原因等而修饰的修饰的碱基或DNA或RNA骨架的类似物。“修饰的”碱基包括，例如，三苯甲基化和不常见的碱基，如肌苷，所述功能同系物或变体保留编码具有与参比序列等价的活性的酶的能力。

在一些实施方案中，所述功能同系物或变体包含与参比核苷酸序列至少50％的序列同一性，包括与参比核苷酸序列的至少55％的核苷酸序列同一性，至少60％的核苷酸序列同一性，至少65％的核苷酸序列同一性，至少70％的核苷酸序列同一性，至少75％的核苷酸序列同一性，至少80％的核苷酸序列同一性，至少85％的核苷酸序列同一性，至少90％的核苷酸序列同一性或至少95％，96％，97％，98％，99％或100％的核苷酸序列同一性。

例如，本发明人已经鉴定了关于T6ODM和CODM的参比序列的变体。关于T6ODM，已经鉴定了四种变体，其分别包含SEQ ID NOs：1-4中列出的cDNA核苷酸序列。这些核苷酸序列分别来源于包含SEQ IDNOs：5-8列出的核苷酸序列的基因组DNA克隆。所鉴定的T6ODM核苷酸序列变体共同地编码包含SEQ ID NOs：9-11中列出的氨基酸序列的T6ODM酶变体。

关于CODM，已经鉴定了单一核苷酸序列变体，其包含SEQ ID NO：12列出的cDNA核苷酸序列。该核苷酸序列来源于包含SEQ ID NO：13列出的核苷酸序列的基因组DNA克隆。所鉴定的CODM变体不编码变体CODM多肽。

在COR-编码核苷酸序列的情形中，在本领域中已知FJ596162列出的核苷酸序列(其编码COR酶)的多种功能同系物或变体。例如，下述GenBank登记号是已经报道编码COR的核苷酸序列：FJ596169.1，FJ596168.1，FJ596167.1，FJ596166.1，FJ596165.1，FJ596163.1，FJ596161.1，FJ596160.1，NC_008403.2，NC_008397.2，NC_008396.2，NM_001070581.1，NM_001070580.1，NM_001059452.1，NM_001059451.1，NM_001056028.1，AF108435.1，AF108434.1，AF108433.1，AF108432.1，AF108437.1和FJ624147.1。

当比较核苷酸序列以计算百分比同一性时，所比较的序列应该在至少100个核苷酸残基、至少200个核苷酸残基、至少300个核苷酸残基、至少400个核苷酸残基、至少500个核苷酸残基、至少600个核苷酸残基、至少800个核苷酸残基、至少1000个核苷酸残基的比较窗口或参比序列的全长进行比较。为了两种序列的最佳比较，比较窗口可以包含与参比序列(其不包含添加或缺失)相比约20％以下的添加或缺失(即，缺口)。用于比对比较窗口的最佳序列比对可以通过算法的计算机执行而进行，所述算法如例如由Altschul等1997(Nucl.AcidsRes.25：3389-3402)公开的BLAST程序组。整体比对程序也可以用来比对大致相同尺寸的相似序列。整体比对程序的实例包括NEEDLE(www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/可用)，其为EMBOSS包(Rice P等，2000，Trends Genet.，16：276-277)的一部分，和GGSEARCH程序(fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_www.cgi？rm＝compare&pgm＝gnw可用)，其为FASTA包(Pearson W和Lipman D，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，85：2444-2448)的一部分。这些程序二者都是基于用于沿着其全长发现两个序列的最佳比对(包括缺口)的Needleman-Wunsch算法。序列分析的详细讨论还可见于Ausubel等(″Current Protocols in Molecular Biology(当代分子生物学流程)″JohnWiley&Sons Inc，1994-1998，第15章，1998)的Unit 19.3。在一些实施方案中，可以仅比较功能同系物与参比序列的蛋白编码区。

为了实现转基因在遗传修饰的植物的一个或多个细胞中的表达，适当时，转基因可以可操作性地连接一种或多种转录控制序列和/或启动子。在一些实施方案中，T6ODM、CODM和/或COR编码转基因可以可操作性地连接转录控制序列，如天然T6ODM、CODM和/或COR启动子或异源启动子。

为了本说明书的目的，当转录控制序列能够促使、抑制或另外调节所述基因或其他核苷酸序列的转录时，认为所述转录控制序列与给定的基因或其他核苷酸序列“可操作性连接”。

关于表达发生的细胞、组织、器官或发育阶段，启动子可以响应外部刺激，其中如生理胁迫、病原体或金属离子，或响应一种或多种转录激活剂，而组成型或差异型地调节可操作性连接的核苷酸序列的表达。因此，按照本发明的方法使用的启动子可以包括，例如，组成型启动子，可诱导的启动子，组织-特异性启动子或可激活的启动子。

植物组成型启动子典型地在植物几乎所有的组织中指导表达，并且很大程度上不依赖于环境和发育因素。可以按照本发明使用的组成型启动子的实例包括植物病毒来源的启动子，如花椰菜花叶病毒35S和19S(CaMV35S和CaMV 19S)启动子；细菌植物病原体来源的启动子，如来源于土壤杆菌物种(Agrobacterium spp.)的鸦片启动子，例如，土壤杆菌来源的胆脂碱合酶(nos)启动子；和植物来源的启动子，如核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(rubisco)小亚基基因(rbcS)启动子，植物泛素启动子(Pubi)和水稻肌动蛋白启动子(Pact)。

此外，可以使用上文提及的启动子的变体。例如，可以使用包含双重增强子基序的CaMV 35S启动子(参见实施例4)。所述启动子由SEQ IDNO：14列出的序列表示。

“可诱导的”启动子包括，但不限于，化学可诱导的启动子和物理可诱导的启动子。化学可诱导的启动子包括具有通过化学化合物(如醇、抗生素、类固醇、金属离子或其他化合物)调节的活性的启动子。化学可诱导的启动子的实例包括：醇调节的启动子(例如，参见欧洲专利637 339)；四环素调节的启动子(例如，参见美国专利5,851,796和美国专利5,464,758)；类固醇响应的启动子，如糖皮质激素受体启动子(例如，参见美国专利5,512,483)，雌激素受体启动子(例如，参见欧洲专利申请1 232273)，蜕皮激素受体启动子(例如，参见美国专利6,379,945)等；金属-响应性启动子，如金属硫蛋白启动子(例如，参见美国专利4,940,661，美国专利4,579,821和US 4,601,978)；以及致病相关的启动子，如壳多糖酶或溶菌酶启动子(例如，参见美国专利5,654,414)或PR蛋白启动子(例如，参见美国专利5,689,044，美国专利5,789,214，澳大利亚专利708850，美国专利6,429,362)。

可诱导的启动子也可以是物理调节的启动子，其由非化学环境因素(如温度(热和冷二者)、光等)调节。物理调节的启动子的实例包括热激启动子(例如，参见美国专利5,447858，澳大利亚专利732872，加拿大专利申请1324097)；冷诱导的启动子(例如，参见美国专利6,479,260，美国专利6,184,443和美国专利5,847,102)；光诱导的启动子(例如，参见美国专利5,750,385和加拿大专利132 1563)；光抑制性启动子(例如，参见新西兰专利508103和美国专利5,639,952)。

“组织特异性启动子”包括优先或特异性在生物体的一种或多种特定的细胞、组织或器官中和/或生物体的一个或多个发育阶段表达的启动子。应该理解，组织特异性启动子也可以是可诱导的。

植物组织特异性启动子的实例包括：根特异性启动子，如美国专利申请2001047525中所述的那些；果实特异性启动子，包括子房特异性和花托组织特异性启动子，如欧洲专利316 441、美国专利5,753,475和欧洲专利申请973 922中所述的那些；和种子特异性启动子，如澳大利亚专利612326和欧洲专利申请0 781 849以及澳大利亚专利746032中所述的那些。

启动子也可以是可被一种或多种转录激活剂激活的启动子，在本文中称为“可激活的启动子”。例如，可激活的启动子可以包括与上游活化序列(UAS)可操作性地连接的最小的启动子，上游活化序列特别包含用于一种或多种转录激活剂的DNA结合位点。

当在本文中提及时，术语“最小的启动子”应该理解为包括结合至少RNA聚合酶结合位点和任选的TATA盒和转录起始位点和/或一个或多个CAAT盒的任意启动子。在其中细胞是植物细胞的一些实施方案中，最小的启动子可以来源于花椰菜花叶病毒35S(CaMV 35S)启动子。CaMV 35S来源的最小的启动子可以包含，例如，基本上与CaMV 35S启动子的-90至+1位置(转录起始位点)对应的序列(还称为-90CaMV 35S最小的启动子)，与CaMV 35S启动子的-60至+1对应的序列(还称为-60CaMV 35S最小的启动子)或与CaMV 35S启动子的-45至+1对应的序列(还称为-45CaMV 35S最小的启动子).

如上文所述，可激活的启动子可以包含与上游活化序列(UAS)融合的最小的启动子。UAS可以是能够结合转录激活剂以激活最小的启动子的任意序列。示意性的转录激活剂包括，例如：酵母来源的转录激活剂，如Gal4，Pdr1，Gcn4和Ace1；病毒来源的转录激活剂，VP16；Hap1(Hach等，J Biol Chem 278：248-254，2000)；Gaf1(Hoe等，基因215(2)：319-328，1998)；E2F(Albani等，J Biol Chem(生物化学杂志)275：19258-19267，2000)；HAND2(Dai和Cserjesi，J Biol Chem(生物化学杂志)277：12604-12612，2002)；NRF-1和EWG(Herzig等，J Cell Sci(细胞科学杂志)113：4263-4273，2000)；P/CAF(Itoh等，NuclAcidsRes(核酸研究)28：4291-4298，2000)；MafA(Kataoka等，J Biol Chem(生物化学杂志)277：49903-49910，2002)；人激活转录因子4(Liang和Hai，J Biol Chem(生物化学杂志)272：24088-24095，1997)；Bcl10(Liu等，Biochem Biophys ResComm(生物化学和生物物理研究通讯)320(1)：1-6，2004)；CREB-H(Omori等，Nucl Acids Res(核酸研究)29：2154-2162，2001)；ARR1和ARR2(Sakai等，Plant J(植物学杂志)24(6)：703-711，2000)；Fos(Szuts和Bienz，ProcNatl 4cad Sci USA(美国国家科学院学报)97：5351-5356，2000)；HSF4(Tanabe等，J Biol Chem(生物化学杂志)274：27845-27856，1999)；MAML1(Wu等，Nat Genet(自然遗传学)26：484-489，2000)。

在一些实施方案中，UAS包含能够至少结合GAL4转录激活剂的DNA结合结构域的核苷酸序列。能够结合至少包含GAL4 DNA结合结构域的转录激活剂的UAS序列在本文中称为UAS_G。

可激活的启动子中的UAS序列可以包含DNA结合结构域靶序列的多个串联重复。例如，在其天然状态，UAS_G包含DNA结合结构域靶序列的四个串联重复。因此，在本文中所用的关于DNA结合结构域靶序列的串联重复数的术语“多个”应该理解为包括，例如，至少2个串联重复，至少3个串联重复或至少4个串联重复。

转录控制序列还可以包括终止子。术语“终止子”是指在转录单位的末端传导转录终止信号的DNA序列。终止子是通常包含多聚腺苷酸化信号的3′-非翻译DNA序列，其促使向一级转录物的3′-端添加多聚腺苷酸序列。如启动子序列，所述终止子可以是在意欲使用其的细胞、组织或器官中可操作的任意终止子序列。可以用于植物细胞的适当的终止子序列的实例包括：胆脂碱合酶(nos)终止子，CaMV 35S终止子，章鱼氨酸(octopine)合酶(ocs)终止子，马铃薯蛋白酶抑制剂基因(pin)终止子，如pinII和pinIII终止子等。

连接转基因的转录控制序列可以与转基因一起引入到细胞中，或者备选地，转基因可以插入到植物细胞的基因组中，以使其与内源转录控制序列可操作性连接。在后种实施方案中，转基因插入到基因组中以使其受控于内源转录控制序列可以是非位点定向或随机DNA插入(例如，T-DNA或转座子介导的插入)的结果或是位点定向插入(例如，如在Terada等，Nat.Biotechnol.20：1030-1034，2002中所述)的结果。

所述一个或多个转基因可以包含在载体或构建体中用于转化到大红罂粟中。当载体或构建体包含所述一个或多个与在大红罂粟中有活性的转录控制序列可操作性连接的转基因时，所述载体或构建体可以称为表达载体或构建体。

所述载体或构建体还可以包含，例如，下述中的一种或多种：用于一种或多种宿主(包括细菌，如大肠杆菌(E.coli)或土壤杆菌物种)的复制起点；在一种或多种宿主中有活性的选择标记基因；和/或一种或多种另外的转录控制序列。

当用于本文时，术语“选择标记基因”包括非表达其的细胞赋予表型的任意基因，其促使对用本发明的遗传构建体转染或转化的细胞的鉴定和/或选择。

“选择标记基因”包括在由细胞表达时赋予细胞促使这些转化的细胞的鉴定和/或选择的任意核苷酸序列。编码合适的选择标记的一定范围的核苷酸序列在本领域中是已知的。特别地，示例性的编码选择标记的核苷酸序列包括：抗生素抗性基因，如氨苄青霉素抗性基因，四环素抗性基因，卡那霉素抗性基因，赋予针对抗生素金担子素A(aureobasidin A)的抗性的AURI-C基因、新霉素磷酸转移酶基因(例如，nptI和nptII)和潮霉素磷酸转移酶基因(例如hpt)；除草剂抗性基因，包括草铵膦(glufosinate)，草丁膦(phosphinothricin)或双丙氨膦(bialaphos)抗性基因，如草丁膦(phosphinothricin)乙酰基转移酶编码基因(例如bar)，草甘膦抗性基因，包括3-烯酰丙酮莽草酰-5-磷酸合酶(3-enoyl pyruvyl shikimate 5-phosphatesynthase)编码基因(例如aroA)，溴苯腈(bromyxnil)抗性基因，包括溴苯腈腈水解酶编码基因，氨苯磺胺抗性基因，包括二氢蝶酸(dihydropterate)合酶编码基因(例如sul)，以及磺酰脲抗性基因，包括乙酰乳酸合酶编码基因；酶编码报道基因，如GUS和氯霉素乙酰转移酶(CAT)编码基因；荧光报道基因，如绿色荧光蛋白编码基因；和基于发光的报道基因，如荧光素酶基因，等等。

在一些实施方案中，所述载体或构建体适合通过土壤杆菌介导的转化至少部分被转移到植物细胞中。因此，在一些实施方案中，所述构建体可以包含左和/或右T-DNA边界序列。

本领域技术人员容易确定适当的T-DNA边界序列。然而，术语“T-DNA边界序列”应该理解为包括，例如，划定由土壤杆菌物种细胞转移至易于土壤杆菌介导的转化的植物细胞中的核酸分子的界限的任意基本上同源的和基本上直接重复的核苷酸序列。例如，参考Peralta和Ream(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，82(15)：5112-5116，1985)的论文和Gelvin(Microbiology and Molecular Biology Reviews(微生物学和分子生物学综述)，67(1)：16-37，2003)的综述。

在一些实施方案中，所述载体或构建体适合通过土壤杆菌介导的转化转移到植物中，然而，本发明还考虑对遗传构建体的任意适当的修饰，所述修饰促使通过除土壤杆菌物种之外的细菌的对植物细胞的细菌介导的插入，例如，如Broothaerts等(Nature(自然)433：629-633，2005)所述。

本领域的技术人员知晓怎样产生本文所述的构建体和在这样需要时在特定细胞或细胞型中在需要的条件下获得其表达的需要。特别地，本领域技术人员应该知道进行本发明所需要的遗传操作可能需要在原核细胞(如大肠杆菌细胞)或植物细胞或动物细胞中增殖本文所述的遗传构建体或其衍生物。用于克隆核酸分子的示例性方法记述在Sambrook等(Molecular Cloning-A Laboratory Manual(分子克隆-实验室手册)，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)，2000)中。

因此，在另一方面，本发明提供包含编码蒂巴因6-O-脱甲基酶、可待因O-脱甲基酶和/或可待因酮还原酶的一种或多种转基因的表达构建体，其中所述一种或多种转基因可操作性地连接到在大红罂粟中有活性的转录控制序列上。

为了实现转基因在大红罂粟中的表达，必须通过适当的转化方法将转基因或包含转基因的构建体引入到大红罂粟中。

用于转化植物细胞的方法包括，例如：土壤杆菌介导的转化，基于微粒轰击的转化法和基于直接DNA摄入的方法。Roa-Rodriguez等(Agrobacterium-mediated transformation of plants(土壤杆菌介导的植物转化)，第3版.CAMBIA Intellectual Property Resource，Canberra，澳大利亚，2003)总结了用于宽泛植物物种的宽泛的适当的土壤杆菌介导的植物转化法。还可以使用除土壤杆菌物种外的细菌的细菌介导的转化，例如，如在Broothaerts等(Nature(自然)433：629-633，2005)中所述。微粒轰击也可以用来转化植物组织和用于转化植物的方法，所述植物包括谷类植物，并且所述方法由Casas等(Plant Breeding Rev.(植物育种综述)13：235-264，1995)综述。直接的DNA摄入转化流程如原生质体转化和电穿孔详细记述在Galbraith等(编)，Methods in Cell Biology(细胞生物学方法)Vol.50，Academic Press，San Diego，1995)中。除了上文提及的方法外，也可以使用多种其他转化流程。这些包括浸入、细胞和组织的电穿孔，胚胎电穿孔，显微注射，花粉管途径，碳化硅-和脂质体介导的转化。诸如这些的方法由Rakoczy-Trojanowska(Cell.Mol.Biol.Lett.(细胞分子生物学通信)7：849-8582002)综述。多种其他植物转化法也可以是本领域技术人员显而易见的。进一步举例来说，还参考Zhao等(Mol Breeding DOI10.1007/s11032-006-9005-6，2006)，Katsuhara等(Plant Cell Physiol(植物细胞生理学)44(12)：1378-1383，2003)，Ohta等(FEBS Letters 532：279-282，2002)和Wu等(Plant Science(植物科学)169：65-73，2005)。

在一些实施方案中，Solouki等(Trakia Journal of Sciences(Trakia科学杂志)7(2)：1-7，2009)的方法是已知的适于大红罂粟转化的方法的实例。

在其他实施方案中，大红罂粟可以按照实施例(见下文)所述的方法转化。

如上文所述，相对于野生型大红罂粟，本发明的遗传修饰的罂粟植物产生增加量的选自可待因、东罂粟碱和/或吗啡的生物碱。

相对于野生型大红罂粟，“增加量的可待因、东罂粟碱和/或吗啡”可以存在于所述遗传修饰的罂粟植物的一个或多个组织中，或存在于所述遗传修饰的罂粟植物的胶乳中。例如，在一些实施方案中，在本发明的遗传修饰的罂粟植物中的增加量的可待因、东罂粟碱和/或吗啡可以存在于胶乳中和/或存在于选自根组织、叶组织和/或种皮的一种或多种组织中。

“增加量”旨在指，相对于野生型大红罂粟，在本发明的罂粟植物中的可待因、东罂粟碱和/或吗啡的量的1％，5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，2-倍，5-倍，10-倍，20-倍，50-倍，100-倍或更多的增加。

在一些实施方案中，本发明的罂粟植物产生可提取量的可待因、东罂粟碱和/或吗啡。“可提取量”的可待因、东罂粟碱和/或吗啡应该理解为包括可从植物的一种或多种组织中提取和检测的可待因、东罂粟碱和/或吗啡的量。所述一种或多种组织可以选自上文提及的那些。在一些实施方案中，“可提取量的”可待因、东罂粟碱和/或吗啡应该理解为包括，其中，可待因、东罂粟碱和/或吗啡中的任一种或可待因、东罂粟碱和/或吗啡的组合占来自本发明的罂粟植物的胶乳、种皮、根或叶的任一种或多种的总可提取生物碱的重量的至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。

如上文所述，本发明所涉及的遗传修饰的罂粟植物典型地是多年生的。如本文所述，“多年生的”罂粟植物包括在多于一个生长季产生种皮和增加量的和/或可提取量的生物碱(如可待因、东罂粟碱和/或吗啡)，而不要再种植。

在一些实施方案中，本发明的罂粟植物在温带罂粟生长地区在萌发后的第一个生长季产生种皮和增加量的和/或可提取量的可待因、东罂粟碱和/或吗啡。

“在萌发后的第一个生长季”产生种皮和增加量的和/或可提取量的可待因、东罂粟碱和/或吗啡应该理解为在种子萌发的一年内产生种皮和增加量的和/或可提取量的可待因、东罂粟碱和/或吗啡的植物。

如本文所述，“温带罂粟种植地区”应该理解为位于处在热带与极圈之间的纬度的可以培育罂粟植物的地区。具体地，北温带从在北纬约23.5度的北回归线延伸至在北纬约66.5度的北极圈。南温带从在南纬约23.5度的南回归线延伸至在南纬约66.5度的南极圈。

在一些实施方案中，温带罂粟种植地区包括本发明的罂粟植物生长的地区，其位于约34°、约35°、约36°、约37°、约38°、约39°、约40°、约41°、约42°、约43°、约44°、约45°、约46°、约47°、约48°、约49°和/或约50°中的一个或多个北纬或南纬。

在一些实施方案中，本发明的罂粟植物在南半球的至少温带罂粟生长地区在萌发后的第一个生长季产生种皮和增加量的和/或可提取量的可待因、东罂粟碱和/或吗啡。因此，在一些实施方案中，本发明的罂粟植物可以在约34°S、约35°S、约36°S、约37°S、约38°S、约39°S、约40°S、约41°S、约42°S、约43°S、约44°S、约45°S、约46°S、约47°S、约48°S、约49°S和/或约50°S的一个或多个纬度在萌发后的第一个生长季产生种皮和增加量的和/或可提取量的可待因、东罂粟碱和/或吗啡。

本文提及纬度，“约”特定的纬度应该理解为包括该限定纬度的±0.5°的纬度。另外，提及“一个或多个纬度”应该理解为包括由上文提及的任意对具体纬度为边界的不连续的纬度范围。

在一些实施方案中，本发明的罂粟植物在约40°S与约44°S之间的纬度在萌发后的第一个生长季产生种皮和增加量的和/或可提取量的可待因、东罂粟碱和/或吗啡。

在一些实施方案中，本发明的罂粟植物在澳大利亚塔斯马尼亚或具有基本上等价的气候的地区在萌发后的第一个生长季产生种皮和增加量的和/或可提取量的可待因、东罂粟碱和/或吗啡。

塔斯马尼亚的平均降雨和温度在州内变化相当大。然而，在州内西北和中部的主要的罂粟种植地区，典型的降雨在600-800mm范围内，并且七月的最低/最高温度分别为2℃和12℃，一月和二月的最低/最高温度分为为12℃和24℃。典型地，在塔斯马尼亚的罂粟种植地区，罂粟在三月种植，并且在次年二月收获干的罂粟头。

本文中提及“具有基本上等价的气候的地区”是指具有等价的日长、降雨和或季节温度最低值和最大值以使在所述条件下罂粟可以与在澳大利亚的塔斯马尼亚的罂粟种植地区的那些罂粟相等地生长的地区。

本发明的罂粟植物在种子成熟时可以具有开裂的(开放的)种皮或不开裂的(封闭的)种皮。

野生型大红罂粟，和大部分其他罂粟物种，在种子成熟时在种皮中形成开裂的孔，这允许种皮中成熟的种子从种皮中释放出来。然而，在本发明的一些实施方案中，罂粟栽培种在种皮内的种子已经成熟时可以具有减小的开裂孔或没有开裂孔。因此，成熟时不开裂的或封闭的种皮的特点使得成熟的种子保留在具有该特点的栽培种的种皮内。

在成熟时不开裂或封闭的种皮的特点的一个显著的优点是在收获时种子保留，并且种子的传播基本上更可控，使得多年生物种的过高的植物密度最小化。另外，来自具有不开裂的种皮的栽培种的种子可以容易地从种皮收集并且进一步使用。

本发明还提供子代植物，其中所述子代植物具有本发明的第一方面的植物作为亲本，其中，相对于野生型大红罂粟，所述子代植物包含蒂巴因6-O-脱甲基酶、可待因O-脱甲基酶和/或可待因酮还原酶中的一种或多种的增加的表达，并且其中，相对于野生型大红罂粟，所述子代植物产生增加量的和/或可提取量的选自可待因、东罂粟碱和/或吗啡的生物碱。

如本文所提及，“子代”植物可以是本发明第一方面的植物作为至少一个亲本的任意植物。因此，所述子代植物可以是由本发明第一方面的植物自体受精产生的植物；非自体受精产生的植物，其中本发明第一方面的植物是雄性或雌性亲本；种内杂交植物，其中亲本之一是本发明第一方面的植物，并且另一个亲本是罂粟属内的植物(例如，鸦片罂粟或鬼罂粟)；种间杂交植物，其中亲本之一是本发明第一方面的植物，并且另一个亲本是除罂粟属之外的种属的植物；本发明第一方面的植物的无性产生的子代，如营养体繁殖的子代或通过无融合生殖产生的子代。

在另一方面，本发明还提供本发明第一方面的罂粟植物的突变体或衍生植物，其中，相对于野生型大红罂粟，所述突变体或衍生植物包含蒂巴因6-O-脱甲基酶、可待因O-脱甲基酶和/或可待因酮还原酶中的一种或多种的增加的表达，并且其中，相对于野生型大红罂粟，所述突变体或衍生植物产生增加量的和/或可提取量的选自可待因、东罂粟碱和/或吗啡的生物碱。

所述罂粟植物的“突变体或衍生植物”应该理解为包括，例如，本发明第一方面的罂粟植物的任何自发的或诱导的突变体，育种后代或进一步遗传修饰的形式。

可以用来产生本发明的罂粟植物的衍生植物或突变体的诱变技术包括，例如，化学诱变(例如，EMS诱变)，离子化辐射诱导的诱变(例如，X射线诱变，γ射线诱变和UV诱变)，遗传插入诱变法(例如，转座子诱变或T-DNA诱变)等。用于产生诱变的种子的技术在本领域中是公知的。例如，种子诱变的方法以及适用于这些方法的化学诱变剂记述在，例如，The Manual on Mutation Breeding(诱变育种手册)，第2版，(I.A.EA.，Vienna，1977)或在Plant Breeding，Principles and Prospects(植物育种，原理和展望)(Chapman和Hall，London，1993)中。诱变剂实例包括甲磺酸乙酯(EMS)、二氧桥丁烷(DEB)乙基-2-氯乙基硫化物、2-氯乙基-二甲基胺、环氧乙烷、乙醇胺、二甲基磺酸盐、二乙基磺酸盐、丙烷砜、β-丙内酯、重氮甲烷、N-甲基-N-亚硝基氨基甲酸乙酯、吖啶橙和叠氮化钠。Filippetti等(Euphytica 35：49-59，1986)记述了离子化辐射诱导的诱变的实例，特别是X射线诱变，并且与EMS诱变比较。

在一些实施方案中，本发明的子代、突变体或衍生植物在前文所述的一个或多个地理区域在萌发后的第一个生长季产生种皮和增加量的和/或可提取量的可待因、东罂粟碱和/或吗啡。

本发明还提供来源于本文所述的植物的繁殖材料。术语“繁殖材料”应该理解为植物可以由其繁殖的任意材料。例如，“繁殖材料”可以包括种子、花、插条(cuttings)、子房、胚珠、胚囊、卵细胞、花药、花粉、再生去分化的植物组织，如愈伤组织、胚形成的愈伤组织或混悬的培养物，分离的植物胚等。

在一些实施方案中，所述繁殖材料包括种子。如本文提及，植物“种子”应该理解为指成熟的或不成熟的植物种子。因此，术语“种子”包括，例如，由亲本植物携带的不成熟的种子或由亲本植物释放的种子。术语“种子”还应该理解为包括在受精和发芽的发育阶段之间的任意种子植物孢子体。然而，在一些实施方案中，术语种子是指成熟的植物种子。

在另一个方面中，本发明还提供由本发明第一方面的植物或其子代、突变体或衍生植物产生的秆。

如本文定义，子代植物的“秆”包括罂粟植物的新鲜的或干燥的组织。该组织可以包括植物的全部或部分，诸如根组织、茎组织、花组织或种皮。在一些实施方案中，罂粟“秆”包括新鲜的或干燥的罂粟植物组织，其包括成熟的种皮。所提及的种皮可以包括种子，或可以是其中已经取出种子的种皮。

用于罂粟秆处理以获得生物碱的方法在本领域中是公知的。然而，例如，参考法国专利748308，其公开了一个用于从罂粟秆提取生物碱的方法的实例。

还可以使用溶剂(例如，水或超临界流体，如超临界CO₂)从秆提取生物碱。按照所述方法产生的提取物包括“秆浓缩物”。

因此，在另一方面，本发明还提供由本发明第一方面的植物或其子代、突变体或衍生植物产生的罂粟秆浓缩物。

术语“罂粟秆浓缩物”应该理解为包括在罂粟秆进入其生物碱浓缩过程时产生的任意物质。与前述定义一致的，“罂粟秆浓缩物”还应该理解为包括液体、固体或粉末形式的任意罂粟秆粗提物或纯化的提取物，其包含阿片罂粟的一种或多种菲生物碱。

当以液体形式存在时，罂粟秆浓缩物可以由粗提物进一步浓缩。所述浓缩物可以是液体浓缩物，其中一部分溶剂已被去除，或可以是粉末形式浓缩物，其由去除基本上所有用于提取罂粟秆的溶剂产生。

如本文定义的罂粟秆浓缩物可以包含可以由罂粟秆提取的所有的生物碱，或可以包含可提取的生物碱的子集。通常，本发明的罂粟秆浓缩物至少包含吗啡和/或可待因。

在另一方面，本发明还提供来源于本发明第一方面的植物或其子代、突变体或衍生植物的胶乳。

用于从包括大红罂粟的罂粟植物获得胶乳的方法在本领域中是公知的。通常，胶乳可以通过切开所述植物的不成熟的种皮，从种皮中流出胶乳而获得。

在另一方面，本发明还提供一片稳定繁殖的罂粟植物，该片植物包括一株或多株本发明第一方面的植物或其子代、突变体或衍生植物。

在另一个方面，本发明提供来源于本发明第一方面的植物或其子代植物的分离的细胞、组织或器官。

本发明还提供包含上述细胞中的一种或多种的体外培养物。本文涉及的示例性的“体外培养物”包括，例如，愈伤组织培养物，胚性愈伤组织培养物，胚培养物，秧苗培养物和包含本发明的一种或多种细胞的混悬培养物。用于建立并维持植物细胞或组织培养物的技术在本领域中是公知的。在这一点上，参考‘Plant Tissue Culture：An Alternative for Production ofUseful Metabolites(植物组织培养：生产有用代谢物的备选方案)’(FAOAgricultural Services Bulletin No.108，Food and Agriculture Organization ofthe United Nations Rome(罗马共和国食品和农业组织)，1994)。

在一些实施方案中，大红罂粟的体外培养物可以使用美国专利4,114,314种所述的方法建立，所述方法的修改之处在于使用来源于本发明的植物的细胞而不是美国专利4,114,314中公开的那些细胞。

在一些实施方案中，本发明的体外培养物可以用于产生可待因、东罂粟碱和/或吗啡。通过所述培养物产生可待因、东罂粟碱和/或吗啡可以是从头产生，或可以是通过复杂底物的转化，所述底物如在吗啡或可待因生物合成途径中的中间物。

在另一方面，本发明还提供生产选自可待因、东罂粟碱和/或吗啡的生物碱的方法，所述方法包括种植本发明第一方面的罂粟植物，或其子代、突变体或衍生植物，以使所述植物产生选自可待因、东罂粟碱和/或吗啡的生物碱；并且从所述罂粟植物或其部分、或其子代、突变体或衍生植物提取可待因、东罂粟碱和/或吗啡。

在不同的实施方案中，本发明的方法包括在上文所述的一个或多个地理地区生产可待因、东罂粟碱和/或吗啡的方法。

在另一方面，本发明还提供按照上述方法生产的可待因、东罂粟碱和/或吗啡。

如上文所示，本发明人已经鉴定了T6ODM和CODM酶的核苷酸序列变体。因此，在另一方面，本发明提供包含SEQ ID NOs：1-8，12和13中任一项列出的核苷酸序列的分离的核酸分子。

在一些实施方案中，本发明还提供T6ODM和CODM核苷酸序列变体，其表现出与SEQ ID NOs：1-8，12和13中任一项列出的核苷酸序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。

在一些实施方案中，本发明上述方面提供的T6ODM和CODM核苷酸序列变体不是分别由GenBank登记号GQ500139和GQ500141列出的关于T6ODM和CODM的cDNA序列组成。

当比较核苷酸序列以计算同一性百分数时，比较的序列应该在SEQID NOs：1-8，12和13中相关的一种的至少100个核苷酸残基、至少200个核苷酸残基、至少400个核苷酸残基、至少600个核苷酸残基的比较窗口或全长进行比较。当与参比序列(其不包含添加或缺失)比较时，比较窗口可以包括约20％或更少的添加或缺失(即，缺口)以进行两个序列的最佳比对。用于比对比较窗口的最佳序列比对可以通过计算机执行的算法进行，诸如例如通过Altschul等(Nucl.Acids Res.(核酸研究)25：3389-3402，1997)公开的BLAST程序家族进行。更详细的序列分析的讨论可见于Ausubel等(“Current Protocols in Molecular Biology”(现代分子生物学流程)，John Wiley&Sons Inc，1994-1998，第15章，1998)Unit 19.3。

在一些实施方案中，本发明提供在严格条件下与包含SEQ ID NOs：1-8，12和13中任一项列出的核苷酸序列的核酸杂交的核苷酸序列。

用在本文中时，“严格”杂交条件是这样的条件，其中在pH 7.0-8.3盐浓度小于约1.5M Na离子，典型地约0.01-1.0M Na离子浓度(或其他盐)，并且温度为至少30℃。严格条件还可以用加入不稳定剂如甲酰胺获得。在一些实施方案中，严格杂交条件可以是低严格性条件、中严格性条件或高严格性条件。示例性的低严格性条件包括在37℃用30-35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲液进行杂交，并在50-55℃在1x至2xSSC(20xSSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性的中严格性条件包括在37℃用40-45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS进行杂交，并在55-60℃在0.5x至1xSSC中洗涤。示例性的高严格性条件包括在37℃在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中进行杂交，并在60-65℃在0.1xSSC中洗涤。任选地，洗涤缓冲液可以包含约0.1％至约1％SDS。杂交的持续时间通常小于约24小时，通常约4至约12小时。

杂交特异性也是杂交后洗涤的函数，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，热解链温度(T_m)可以由Meinkoth和Wahl(Anal.Biochem.138：267-284，1984)等式近似获得，即，T_m＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M是单价阳离子的摩尔数，％GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分数，％form是杂交溶液中甲酰胺的百分数，L是以碱基对为单位的杂交体的长度。T_m是50％的互补性靶序列与完美匹配的探针杂交时的温度(在限定的离子强度和pH下)。每1％错配，T_m减小约1℃；因此，可以调节T_m、杂交和/或洗涤条件以与不同互补性程度的序列杂交。例如，具有≥90％同一性的序列可以通过降低T_m约10℃进行杂交。通常，选择严格条件低于特定的序列与其互补物在限定的离子强度和pH下的T_m约5℃。然而，高严格性条件可以使用例如在比T_m低1，2，3或4℃进行杂交和/或洗涤；中严格性条件可以使用例如在比T_m低6，7，8，9或10℃进行杂交和/或洗涤；低严格性条件可以使用例如比T_m低11，12，13，14，15或20℃进行杂交和/或洗涤。利用该等式、杂交和洗涤组合物以及需要的T_m，普通技术人员应该理解杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化是固有描述的。如果需要的错配程度导致T_m低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选增加SSC浓度，以便可以使用更高的温度。对核酸杂交的深入指导可见于Tijssen(Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridisation with Nucleic Acid Probes(生物化学合分子生物学实验室技术-与核酸探针杂交)，Pt I，第2章，Elsevier，New York，1993)，Ausubel等，编.(Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学流程)，第2章，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York，1995)和Sambrook等(Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)，Plainview，NY，1989)。

本发明人所述的T6ODM核苷酸序列变体编码具有变异氨基酸序列的T6ODM酶。因此，在另一方面，本发明提供包含SEQ ID NOs：9-11中任一项列出的氨基酸序列的分离的多肽。

在一些实施方案中，本发明提供T6ODM氨基酸序列变体，其展示与包含SEQ ID NOs：9-11中任一项列出的氨基酸序列的多肽至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。

在一些实施方案中，按照本发明这一方面提供的T6ODM氨基酸序列变体不是由GenBank登记号ADD85329.1所示的关于T6ODM的参比序列所编码的氨基酸序列组成。

当比较氨基酸序列以计算同一性百分数时，比较的序列应该在SEQID NOs：9-11中相关的一种的至少50个氨基酸残基至少100个氨基酸残基至少150个氨基酸残基的比较窗口或全长进行比较。当与参比序列(其不包含添加或缺失)比较时，比较窗口可以包括约20％或更少的添加或缺失(即，缺口)以进行两个序列的最佳比对。用于比对比较窗口的最佳序列比对可以通过计算机执行的算法进行，诸如例如通过Altschul等(Nucl.Acids Res.(核酸研究)25：3389-3402，1997)公开的BLAST程序家族进行。更详细的序列分析的讨论可见于Ausubel等(“Current Protocols inMolecular Biology”(现代分子生物学流程)，John Wiley&Sons Inc，1994-1998，第15章，1998)Unit 19.3。

在整个本说明书中，除非上下文另外需要，词语“包含(comprise)”或其变化形式如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”应该理解为暗示包括所述的元件或整数或元件或整数的组，但是不排除任意其他的元件或整数或元件或整数的组。

用于本文时，单数形式“一个(“a”，“an”)”和“这个(the)”包括复数方面，除非上下文已经另外指明。

“约”用在本说明书中意指近似的或接近的，并且在本文列出的数值或范围的情形中，意指所述或所要求的数值或范围的±10％。

本领域技术人员应该理解，本文所述的本发明易于进行不同于具体描述的那些的变化和改进。应该理解本发明包括所有这样的改变和改进。本发明还包括在本说明书中单独的或笼统的提及或指明的步骤、特征、组合物和化合物，以及任意两个以上步骤或特征的任意和所有的组合。

最后，引入包含用于实施本发明所涉及的基本技术的方法的分子生物学标准教科书，所述基本技术包括用于产生本文所述的各种遗传构建体的DNA限制和连接。例如，参见Sambrook和Russell，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(分子克隆：实验室手册)(第3版).Cold Spring HarborLaboratory Press(冷泉港实验室出版社)，2001。

本发明通过下述非限制性实施例进行进一步的描述。应该理解，下述描述仅是用于描述具体实施方案的目的，并不是意欲限制上述描述。

实施例1

在大红罂粟中产生可待因/东罂粟碱和/或吗啡

将GenBank登记号GQ500139列出的核苷酸序列(其编码T6ODM)克隆到适当的表达载体中，如pBI121(Clontech)，使其处在花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV 35S)的控制下，该启动子指导在大红罂粟中的组成型表达。将转基因使用Solouki等(2009，同前所述)所述的方法通过土壤杆菌-介导的转化引入到大红罂粟中。使用巴龙霉素选择转化体，并且按照Solouki等(2009，同前所述)所述的方法再生。然后，筛查转化体的生物碱含量。

在所述转化体中，提议T6ODM的强组成型表达以及COR的表达导致在该转化体中积聚可待因。

为了增加吗啡在所述转化体中的积聚，也可以在大红罂粟中增加CODM活性，从而增加可待因向吗啡的转化，并且还增加蒂巴因向orpiavine的转化。增加转化体中的CODM活性可以通过使用与上文所述的用T6ODM转化大红罂粟相似的方法用GQ500141列出的核苷酸序列(其编码CODM)转化大红罂粟获得。在这些实施方案中，T6ODM和CODM可以在单一构建体上被共同转化到大红罂粟中，或者备选地，这两种转基因可以被先后转化到大红罂粟中。当进行先后转化时，其可能需要随每一顺序转化引入另外的选择标记基因，以允许选择转化了两种转基因的转化体。

反之，为了进一步减少转化体中吗啡生产水平，并由此使得植物具有更高的可待因产量或纯度，可以降低该植物中任意残留的CODM活性。降低大红罂粟中的CODM活性可以使用适当的大红罂粟遗传修饰实现。减少CODM表达的适当的遗传修饰可以包括，例如：

随机诱变，如转座子、化学、UV和噬菌体诱变以及选择低表达CODM的突变体；

用敲除构建体插入诱变CODM编码核酸(对于在植物中靶向基因破坏的实例参见Terada等，Nat.Biotechnol.(自然生物技术)20：1030-1034，2002)；

CODM编码核酸的转录后基因沉默(PTGS)或RNAi(关于PTGS和RNAi的综述，参见Sharp，Genes Dev.(基因发育)15(5)：485-490，2001；和Hannon，Nature(自然)418：244-51，2002)；

用针对CODM编码核酸的反义构建体转化细胞(关于在植物中反义抑制的实例参见van der Krol等，Nature(自然)333：866-869；van der Krol等，Bio Techniques(生物技术)6：958-967；和van der Krol等，Gen.Genet.(基因遗传学)220：204-212)；

用针对CODM编码核酸的共同抑制构建体转化细胞(关于在植物中共同抑制的实例参见van der Krol等，Plant Cell(植物细胞)2(4)：291-299)；

用编码针对CODM编码核酸的双链RNA的构建体转化细胞(关于dsRNA介导的基因沉默的实例参见Waterhouse等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)95：13959-13964，1998)；和

用编码针对CODM编码核酸的siRNA或发夹RNA的构建体转化细胞(关于在植物中siRNA或发夹RNA介导的基因沉默的实例参见Lu等，Nucl.Acids Res.(核酸研究)32(21)：e171；doi：10.1093/nar/gnh170，2004)。

如上文所述，至少一些大红罂粟栽培种中表达COR。然而，当栽培种不表达COR，或需要增加COR的表达来增加转化的大红罂粟中可待因、东罂粟碱和/或吗啡的产量时，可以通过用COR-编码核苷酸序列转化而在转化的大红罂粟中增加COR的表达，如前文所述。同样地，COR-编码核苷酸序列可以用Solouki等(2009，同前所述)的方法转化到大红罂粟中，并且可以用T6ODM和/或CODM共同转化或者可以先后转化。同样地，当进行先后转化时，随每次顺序转化引入另外的选择标记基因可能是有必要的。

实施例2

针对T6ODM、CODM和COR筛选大红罂粟

利用一系列引物来扩增在鸦片罂粟(P.somniferum)的T6ODM和CODM基因不同位置的不同尺寸的PCR产物。相同的引物还用来检测大红罂粟(P.bracteatum)基因组中是否存在T6ODM和CODM基因或相似的序列。所用的PCR扩增条件如下：在95℃初始变性120秒；在95℃变性30秒，在59℃引物退火30秒和在72℃延伸150秒，共30个循环；以及最后的延伸步骤，72℃15分钟。反应使用GoTaq Green PolymeraseMix(Promega)按照供应商的使用说明进行。

下表2提供用于扩增T6ODM和CODM基因的不同区域的引物组合的总结。PCR扩增的结果显示在图2中，并且所述引物在CODM和T6ODM基因中的位置显示在图3中。

表2

凝胶泳道	正向引物	反向引物
			1	F1(SEQ ID NO：15)	R4(SEQ ID NO：16)
2	F1(SEQ ID NO：15)	R5(SEQ ID NO：17)
			3	F1(SEQ ID NO：15)	R7(SEQ ID NO：18)
4	F1(SEQ ID NO：15)	R8(SEQ ID NO：19)
			6	F2(SEQ ID NO：20)	R4(SEQ ID NO：16)
7	F2(SEQ ID NO：20)	R5(SEQ ID NO：17)
			8	F2(SEQ ID NO：20)	R6(SEQ ID NO：21)

9	F2(SEQ ID NO：20)	R8(SEQ ID NO：19)
			10	F2(SEQ ID NO：20)	R9(SEQ ID NO：22)
12	F3(SEQ ID NO：23)	R5(SEQ ID NO：17)
			13	F3(SEQ ID NO：23)	R6(SEQ ID NO：21)
14	F3(SEQ ID NO：23)	R7(SEQ ID NO：18)
			15	F3(SEQ ID NO：23)	R8(SEQ ID NO：19)
16	F3(SEQ ID NO：23)	R9(SEQ ID NO：22)
			17	F10(SEQ ID NO：24)	R11(SEQ ID NO：25)

从图2中可看出，所有的PCR反应使用200ng鸦片罂粟基因组DNA作为模板(上图)进行，产生预计尺寸的PCR产物。

然而，使用200ng大红罂粟基因组DNA作为模板没有获得PCR产物(下图)。作为阳性对照，使用相同的方法从两种基因组扩增COR1.1基因。

这些结果表明，大红罂粟基因组不包含可检测水平的T6ODM和CODM基因，但是确实包含COR1.1基因。

实施例3

T6ODM和CODM基因的鉴定和分离

使用下述引物组从鸦片罂粟的基因组扩增T6ODM和CODM基因：

关于T6ODM：

5’-ATGGAGAAAGCAAAACTTATGAAGCTAGG-3′(SEQ ID NO：26)和

5’-TTTCTGAAAGTAAAGGTACATTACATGTGG-3′(SEQ ID NO：27)；以及

关于CODM：

5’-ATCTGACAAGAAAGTTCATCAAATATAGAGTTC-3′(SEQ ID NO：28)和

5’-CTTATTTCATCATATATTAAACACAATGTGGAG-3′(SEQ ID NO：29)。

通过在液氮中碾磨组织样品并与样品体积三倍的提取缓冲液(1％十二烷基肌氨酸钠，100mM Tris-Cl，100mM NaCl，10mM EDTA，pH 8.5)混合然后酚氯仿提取，用0.1体积的3M乙酸钠(pH 4.8)和1体积的100％异丙醇沉淀，用1mL 70％乙醇洗涤，并重悬在适当体积的具有40μg/mLRNA酶A的无菌蒸馏水中，而从鸦片罂粟中分离基因组DNA。

PCR条件如下：在98℃初始变性30秒；在98℃变性10秒，在59℃引物退火15秒，在72℃延伸120秒，共25个循环；以及最后的延伸步骤：72℃10分钟。反应用Phusion高保真度DNA聚合酶(Thermo Scientific)按照供应商的使用说明使用200ng基因组DNA作为模板进行。凝胶提取(Qiagen)PCR产物，并且克隆到pGEM-T Easy(Promega)中，并转化到JM109感受态细胞(Promega)中，均按照供应商的使用说明进行。对克隆的产物进行测序，并且这揭示2288bp的T6ODM基因(相对于1095bp的T6ODM mRNA)和1663bp的CODM基因(相对于1083bp的CODMmRNA)。

当与关于T6ODM(GQ500139)和CODM(GQ500141)基因的Genbank参比cDNA序列比较时，多种克隆产物的测序导致序列变体的鉴定。例如，鉴定了四种T6ODM基因的核苷酸序列变体，其分别包含SEQ ID NOs：1-4中列出的cDNA核苷酸序列。这些cDNA核苷酸序列变体分别来源于包含SEQ ID NOs：5-8中列出的核苷酸序列的基因组DNA克隆。这些序列变体一起编码包含SEQ ID NOs：9-11中列出的氨基酸序列的T6ODM酶变体。图4和5分别显示鉴定的T6ODM变体与关于T6ODM的参比序列(即，GQ500139和GenBank登记号ADD85329.1所示的所编码的多肽)进行比较的核苷酸和氨基酸序列比对。

鉴定了CODM基因的单个核苷酸序列变体，其包含SEQ ID NO：12列出的cDNA核苷酸序列。该cDNA核苷酸序列变体来源于包含SEQ IDNOs：13列出的核苷酸序列的基因组DNA克隆。然而，该核苷酸序列变体编码具有由GenBank登记号ADD85331.1所示的CODM参比所编码的氨基酸序列相同的氨基酸序列。图6显示所鉴定的CODM变体与关于CODM的参比序列(即GQ500141)相比较的核苷酸序列比对。

实施例4

构建体组装

基于Hagel和Facchini(Nat.Chem.Biol.(自然化学生物学)6：273-275，2010)以及Unterlinner等(Plant J.(植物杂志)18：465-475，1999)之前公布的cDNA序列，商业合成(Mr Gene：www.mrgene.com)T6ODM、CODM和可待因酮还原酶1.1(COR1.1)的编码序列。在合成的构建体中，cDNA序列位于胆脂碱合酶(nos)基因的终止子区域上游，其含有用于终止基因转录的信号(Bevan等，Nucl.Acids Res.(核酸研究)11：369-385，1983)。从由Curtis和Grossniklaus(Plant Phys.(植物生理学)133：462-469，2003)构建的pMDC32质粒扩增具有双重增强子基序的花椰菜花叶病毒35S启动子，并将其插入所述cDNA序列的上游，以驱动表达。该35S启动子使用5′-CAAACGCGTCAGGTCAACATGGTGGAGCAC-3′(SEQ ID NO：30)和5′-CAAAGATCTGATCCTCTAGAGTCGAGGTCCTCTC-3′(SEQ IDNO：31)引物通过PCR获得，所述引物分别包含MluI和BglII限制酶识别位点，以从5ng的pMDC32质粒扩增该启动子。所用的PCR扩增条件如下：在98℃初始变性30秒；在98℃变性10秒，在72℃引物退火15秒，在72℃延伸60秒，共30个循环；以及最后的延伸步骤：72℃10分钟。反应用Phusion高保真度DNA聚合酶(Thermo Scientific)按照供应商的使用说明进行。凝胶提取(Qiagen)PCR产物，并且克隆到pGEM-TEasy(Promega)中，并转化到JM109感受态细胞(Promega)中，均按照供应商的使用说明进行。扩增的启动子的序列在SEQ ID NO：14中列出。通过限制性消化从pGEM-T Easy上切下启动子，并且通过将该片段连接到MrGene的合成载体中的MluI和BglII限制酶识别位点而插入到所述cDNA序列的上游。

通过限制酶消化切下35S：：cDNA：：nos终止子DNA盒，并且将其插入到pCAMBIA 1200植物转化载体的多克隆位点。将35S：：T6ODM：：nos终止子DNA盒插入到含有选择标记基因hptII的编码潮霉素磷酸转移酶的天然pCAMBIA 1200载体中。关于T6ODM构建体的载体图谱显示在图7中。

将35S：：CODM：：nos终止子和35S：：COR1.1：：nos终止子DNA盒转移到改造的pCAMBIA 1200载体中，该载体已被改造为赋予针对草铵膦和双草醚(Bis-pyribac sodium，BPS)的抗性。通过PCR从pTOOL2载体(Invitrogen)分离Basta-抗性基因(pat)，并且从BPS-抗性苜蓿属(Medicago)品种(“Angel”)的种子分离BPS-抗性基因等位基因(乙酰乳酸合酶-als)，该基因最初由Oldach等(Annals of Botany(植物学年刊)101：997-1005，2008)描述。

两种抗性基因用Phusion高保真度DNA聚合酶(Thermo Scientific)按照供应商的使用说明通过PCR分离。凝胶提取(Qiagen)PCR产物，克隆到pGEM-T Easy(Promega)中，并转化到JM109感受态细胞(Promega)中，均按照供应商的使用说明进行。通过用XhoI限制性消化从pGEM-T Easy切下基因，并且插入到pCAMBIA 1200载体骨架中，该载体先前已经通过用XhoI消化切下潮霉素抗性基因。使用5′-GATCTCGAGCTTTCGATGAGCCCAGAACGACGC-3′(SEQ ID NO：32)和5′-AAACTCGAGCTTGTCGATCGACATCAGATTTCGGTGACGGG-3′(SEQ ID NO：33)引物和下述扩增条件由5ng pTOOL2 DNA扩增pat基因：在98℃初始变性30秒；在98℃变性10秒，在60℃引物退火15秒，并在72℃延伸60秒，共进行25个循环；和最后的延伸步骤：72℃10分钟。使用5′-GTTCTCGAGCTTTCGATGGCAGCCACCACCACC-3′(SEQID NO：34)和5′-TTACTCGAGCTTGTCGATCGACATCAATAACTCCTTCTTCCATCACC-3′(SEQ ID NO：35)引物和下述扩增条件从100ng“Angle”基因组DNA扩增als基因：在98℃初始变性30秒；在98℃变性10秒，在62℃引物退火15秒，并在72℃延伸120秒，共进行25个循环；和最后的延伸步骤：72℃10分钟。显示bar、CODM和COR1.1构建体的载体图谱分别显示在图8-10中。

实施例5

种子消毒和萌发

将鸦片罂粟(Papaver somniferum)和两种大红罂粟品种(P.bracteatumvar.PB-1和P.bracteatum var.PB-2；参见WO 2009/092134)的种子通过在70％乙醇中搅拌5分钟进行洗涤，然后在无菌Milli-Q水中润洗3次。然后，将种子叫补充有几滴吐温20的5％(v/v)次氯酸钠溶液中搅拌7分钟，然后用无菌Milli-Q水润洗5次。将表面消毒的种子种植在具有Gamborg’s维生素、3％蔗糖和0.3％植物凝胶(phytagel)的1/2 MS(Murashige和Skoog)培养基上。用1M KOH调节pH至5.7。将培养板在22℃ D/N在10小时光照/14小时黑暗循环下培育进行种子萌发。

实施例6

愈伤组织诱导

将一周龄的秧苗转移至愈伤组织诱导培养基(CIM)上，所述愈伤组织诱导培养基由3/4 MS、3％蔗糖、酪蛋白(300mgL^-1)，肌醇(100mg L^-1)和0.3％植物凝胶组成。调节pH至5.7，并且在121℃高压灭菌20分钟对培养基灭菌。高压灭菌后，将培养基补充过滤除菌(Filter Unit 0.22μM)的2，4-二氯苯氧乙酸(1mg L^-1)、激动素(kinetin)(0.1mg L^-1)和抗坏血酸(15mg L^-1)的储液。将平板保持在20℃的暗处。愈伤组织每两周在新鲜培养基上继代培养。

实施例7

土壤杆菌转化

使用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株AGL0进行转化。将细菌细胞保持在-80℃的40％甘油储液中。利用冷冻-解冻法用不同的二元载体(表3)转化AGL0感受态细胞.

表3

用于转化根癌土壤杆菌菌株AGL0的二元构建体

允许冷冻的AGL0感受态细胞的管在室温下解冻。向100μl AGL0中加入5μl质粒DNA，并且通过轻弹管进行混合。将细菌细胞在液氮中冷冻1分钟，然后在37℃水浴中进行热激5分钟。加入500μl LB(Luria-Bertani)肉汤，然后将管在摇动(150rpm)下在28℃温育2小时。将150μl的每种转化培养物一式两份涂布在补充有抗生素利福平(50μg ml^-1)和氯霉素(100μg ml^-1)的LB琼脂培养基上。将平板在28℃温育2-4天。进行集落PCR，以扩增目的基因，并且选出阳性克隆进行植物转化。

实施例8

愈伤组织转化

将PCR选出的土壤杆菌菌落在补充有抗生素利福平(50μg ml^-1)和氯霉素(100μg ml^-1)的10ml LB肉汤中培养，并且在28℃温育4天。将细菌培养物在4℃以4000rpm离心10分钟，并且收集细胞。通过向滤器除菌(Millipore Express^TM PLUS 0.22μM)预处理的培养基(MS 4.4g L^-1，葡萄糖18g L^-1，蔗糖30g L^-1，乙酰丁香酮10μM，pH 5.2)中加入小体积的收集的细胞而制备土壤杆菌感染溶液，并将OD₆₀₀调节至0.5-1.5。

6-8周龄的老的愈伤组织用于转化(见图11A)。将愈伤组织在预处理的培养基中温育5分钟，然后转移至土壤杆菌感染溶液中5分钟。将感染的愈伤组织从感染溶液中取出，并且在层流操作台中放置在无菌滤纸上进行晾干。一旦晾干后，将所述愈伤组织转移至共培养的培养基(MS 4.4gL^-1，葡萄糖10g L^-1，蔗糖30g L^-1，酪蛋白300mg L^-1，肌醇100mg L^-1乙酰丁香酮10μM，2，4-D 1mg L^-1，激动素0.1mg L^-1，抗坏血酸15mg L^-1，pH 5.2)上。将具有转化的愈伤组织的培养板在Sanyo通用环境室(Sanyoversatile environmental chamber)(MLR-351)中在20℃ D/N在暗处培育3天。

实施例9

转化体的选择和再生

在与土壤杆菌共同培育3天后，将愈伤组织用不含乙酰丁香酮而含有抗生素头孢噻肟(400mg L^-1)的预处理培养基洗涤5次，以使土壤杆菌生长停滞。将洗涤的愈伤组织干印在无菌滤纸上，并且转移至再生培养基中。再生培养基由3/4 MS，蔗糖30g L^-1，植物凝胶0.3％，pH 5.7组成，在高压灭菌后，该培养基补充有滤器过滤的萘乙酸-1mg L^-1，苄胺嘌呤(benzylaminepurine)-0.5mg L^-1，头孢噻肟-400mg L^-1和适当浓度的选择剂(表4)的储液。愈伤组织保持在选择下(见图11D，E和F)，并且每两周在新鲜培养基上继代培养，直到观察到根再生。

表4

通过对所有三种罂粟物种品种进行杀伤曲线实验确定的选择剂的浓度

在茎再生(图11B)和子叶形成后，将再生物转移至在具有通风盖的培养瓶中制备的生根培养基中(图11C)。所述生根培养基含有1/2 MS，3％蔗糖，0.3％植物凝胶。将pH调节至5.7，并且在高压灭菌后向培养基中加入适当的选择剂。

如前文所示，图11提供了表明大红罂粟var PB-1的愈伤组织诱导和植物再生的照片。

实施例10

筛选转化体

可以使用本领域已知的标准技术(例如，PCR，Q-PCR，Southern印迹，Northern印迹)对再生的大红罂粟小植株筛选转基因的存在和/或表达。然而，这不是完全必要的，鉴于在转基因植物中鉴定可待因、东罂粟碱和/或吗啡的存在将有效表示证实该转基因存在并被表达。

在这一点上，使转化的大红罂粟植物以及野生型“对照”大红罂粟生长约三个月。每组收集5株小的不成熟的植物(总共约0.10g)，并合并，将合并的植物材料使用研钵和研棒碾磨。在5ml 10％乙酸溶液中从合并的植物中提取生物碱。在这一点上，分离液体与植物物质，提取的液体样品用于后续的生物碱含量分析。

使用Agilent 1200 HPLC系统，利用280nm测量的吸光度，筛查提取的液体样品的生物碱含量。该系统使用下表5所示的方式的梯度洗脱。所用的HPLC柱为具有下述规格的Phenonex Luna柱：

a.C18，5μm，压帽(Encapped)

b.id：4.6mm

c.长度＝150mm

表5

梯度洗脱HPLC条件

注：洗脱剂A：在水中的0.1％TFA；洗脱剂B：在乙腈中的0.1％TFA；流速＝1.0mL/min

将100μl提取的液体样品注入HPLC柱。在植物样品之前运行吗啡、可待因、东罂粟碱和蒂巴因的校正标准品，以确定化合物特征。针对四种生物碱筛查每种样品。这一分析的结果显示在表6中。

表6

转化的植物的生物碱含量分析

注：不存在生物碱；存在生物碱

从上表中可以看出，对照植物(即，缺少T6ODM和CODM基因的植物)不能产生生物碱吗啡、可待因和东罂粟碱。然而，如预计的，对照植物确实产生蒂巴因。表明转化了T6ODM构建体的植物产生生物碱可待因，由此确定在该转化体中已经恢复从蒂巴因到可待因的途径。显示转化了CODM构建体的植物产生东罂粟碱，由此确定在该转化体中已经恢复从蒂巴因到东罂粟碱的途径。最终，转化了CODM和T6ODM构建体的植物能够产生所有四种生物碱，这证实从蒂巴因到吗啡的途径(见图1)已被恢复。

上述生物碱分析程序也可以对更成熟的植物进行，测定根组织、叶组织、胶乳和/或种皮的生物碱含量。

Claims

1.遗传修饰的大红罂粟(Papaver bracteatum)物种的罂粟植物，或其杂交体，其中，相对于野生型大红罂粟(P.bracteatum)，蒂巴因6-O-脱甲基酶、可待因O-脱甲基酶和/或可待因酮还原酶中的一种或多种的表达增加，并且，其中相对于野生型大红罂粟，所述遗传修饰的罂粟植物产生增加量的选自可待因、东罂粟碱和/或吗啡的生物碱。

2.权利要求1的罂粟植物，其中，相对于野生型大红罂粟，至少蒂巴因6-O-脱甲基酶的表达增加。

3.权利要求1或2的罂粟植物，其中所述罂粟植物包含编码蒂巴因6-O-脱甲基酶、可待因O-脱甲基酶和/或可待因酮还原酶的一种或多种转基因。

4.权利要求1-3中任一项的罂粟植物，其中所述罂粟植物包含编码蒂巴因6-O-脱甲基酶的一种或多种转基因。

5.权利要求4的罂粟植物，其中所述一种或多种转基因包含SEQ IDNOs：1-8，12和13中的任一项或多项列出的核苷酸序列。

6.权利要求1-5中任一项或多项的罂粟植物，其中所述蒂巴因6-O-脱甲基酶包含SEQ ID NOs：9-11之一列出的氨基酸序列。

7.权利要求1-6中任一项的罂粟植物，其中所述植物在温带罂粟种植地区在萌发后的第一个生长季产生种皮和选自可待因、东罂粟碱和/或吗啡的生物碱。

8.权利要求1-7中任一项的罂粟植物，其中所述植物在40°-44°的纬度在萌发后的第一个生长季产生种皮和选自可待因、东罂粟碱和/或吗啡的生物碱。

9.权利要求1-10中任一项的罂粟植物，其中所述植物在澳大利亚的塔斯马尼亚在萌发后的第一个生长季产生种皮和选自可待因、东罂粟碱和/或吗啡的生物碱。

10.权利要求1-9中任一项的罂粟植物，其中所述植物包括不开裂的种皮。

11.权利要求1-9中任一项的罂粟植物，其中所述植物包括开裂的种皮。

12.以权利要求1-11中任一项的罂粟植物作为亲本的子代植物，其中，相对于野生型大红罂粟，所述子代植物包含蒂巴因6-O-脱甲基酶、可待因O-脱甲基酶和/或可待因酮还原酶中的一种或多种的增加的表达，并且，其中相对于野生型大红罂粟，所述子代植物产生增加量的选自可待因、东罂粟碱和/或吗啡的生物碱。

13.权利要求1-12中任一项的植物的突变体或衍生植物，其中，相对于野生型大红罂粟，所述突变体或衍生植物包含蒂巴因6-O-脱甲基酶、可待因O-脱甲基酶和/或可待因酮还原酶中的一种或多种的增加的表达，并且，其中相对于野生型大红罂粟，所述突变体或衍生植物产生增加量的选自可待因、东罂粟碱和/或吗啡的生物碱。

14.来源于权利要求1-13中任一项的植物的繁殖材料。

15.权利要求14的繁殖材料，其中所述繁殖材料包括种子。

16.由权利要求1-13中任一项的植物产生的秆。

17.由权利要求1-13中任一项的植物或由权利要求16的秆产生的秆浓缩物。

18.来源于权利要求1-13中任一项的植物的胶乳。

19.一片稳定繁殖的权利要求1-13中任一项的罂粟植物。

20.来源于权利要求1-13中任一项的植物的分离的细胞。

21.包含权利要求20的细胞中的一种或多种的体外培养物。

22.权利要求21的体外培养物，其中所述培养物产生选自可待因、东罂粟碱和/或吗啡的生物碱。

23.一种生产选自可待因、东罂粟碱和/或吗啡的生物碱的方法，所述方法包括种植权利要求1-13中任一项的植物，以使所述植物产生选自可待因、东罂粟碱和/或吗啡的生物碱；并且从所述罂粟植物或其部分提取所述可待因、东罂粟碱和/或吗啡。

24.根据权利要求23的方法产生的选自可待因、东罂粟碱和/或吗啡的生物碱。

25.包含编码蒂巴因6-O-脱甲基酶、可待因O-脱甲基酶和/或可待因酮还原酶的一种或多种转基因的表达构建体，其中所述一种或多种转基因可操作性地连接到在大红罂粟中有活性的转录控制序列。

26.权利要求25的表达构建体，其中所述一种或多种转基因包含SEQID NOs：1-8，12和13中任一项或多项列出的核苷酸序列。

27.权利要求25或权利要求26的表达构建体，其中所述蒂巴因6-O-脱甲基酶包含SEQ ID NOs：9-11之一列出的氨基酸序列。

28.包含SEQ ID NOs：1-8，12和13中任一项中列出的核苷酸序列的分离的核酸分子。

29.一种分离的核酸分子，其选自由下述组成的组：

30.包含SEQ ID NOs：9-11之一列出的氨基酸序列的分离的多肽。

31.包含与SEQ ID NOs：9-11之一列出的氨基酸序列至少50％相同的氨基酸序列的分离的多肽。