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CN104471056A - 葡萄球菌属的两阶段发酵增加硝酸还原酶活性 - Google Patents

葡萄球菌属的两阶段发酵增加硝酸还原酶活性 Download PDF

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CN104471056A
CN104471056A CN201380030236.3A CN201380030236A CN104471056A CN 104471056 A CN104471056 A CN 104471056A CN 201380030236 A CN201380030236 A CN 201380030236A CN 104471056 A CN104471056 A CN 104471056A
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calf
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Chr Hansen AS
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Abstract

本发明涉及使食品变红的领域。具体地说，本发明涉及用于增强具有硝酸还原酶活性的葡萄球菌属(Staphylococcus)菌株的硝酸还原酶活性的两阶段发酵方法，所述方法包括不存在硝酸盐的第一有氧阶段和连续进给硝酸盐并且使用所述葡萄球菌属菌株使肉制品变红的第二无氧或限氧阶段。

Description

葡萄球菌属的两阶段发酵增加硝酸还原酶活性
技术领域
本发明涉及使食品变红的领域。具体地说，本发明涉及用于增强具有硝酸还原酶活性的葡萄球菌属(Staphylococcus)菌株的硝酸还原酶活性的两阶段发酵方法，所述方法包括不存在硝酸盐的第一有氧阶段和连续进给硝酸盐并且使用所述葡萄球菌属菌株使肉制品变红的第二无氧或限氧阶段。
背景技术
颜色形成和颜色稳定性属于经加工肉制品的最关键的质量特性，因此对于肉类工业极为重要。特征性的腌制颜色源自血红素色素(肌红蛋白、血红蛋白)的浓集、它们的化学状态和诸如氮氧化物和还原剂等添加剂。在诸如萨拉米香肠(salami)等标准的发酵肉制品中，特征性的腌制颜色是衍生自所添加亚硝酸盐/硝酸盐的化合物与天然存在的红色肌红蛋白之间的化学反应结果，所述反应导致同时形成鲜红色亚硝酰基肌红蛋白，其中轴向配体一氧化氮(NO)与血红素中的中心Fe2+配位。
虽然具有所有所需的特性(颜色形成、微生物学安全性)，但是亚硝酸盐对人类健康的安全性已经受到质疑。亚硝酸盐可导致腌制肉中形成不想要的化合物，像对于健康有问题的N-亚硝胺类。这些化合物原则上可因为亚硝酸盐与肌肉蛋白以及胃肠道中的仲胺和氨基酸反应而形成。
葡萄球菌属菌株用于颜色形成的用途基于它们将无机硝酸盐还原成亚硝酸盐的能力，所述亚硝酸盐进一步降解成上述一氧化氮(NO)，即颜色形成过程中的活性化合物。硝酸盐可以作为硝酸盐直接提供或以天然硝酸盐来源(植物粉末)间接提供。即使加入亚硝酸盐，也推荐加入葡萄球菌属菌株，因为亚硝酸盐被部分地再转化成硝酸盐。
肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)和较不常用的木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)是用于硝酸盐还原和颜色形成目的的标准葡萄球菌属菌株。这些菌株在较高的发酵温度下恰当地工作，但是在低于6℃的低温下活性较小。因为所述工业由于卫生原因而优选低的生产温度，因此想要在低温下具有硝酸还原酶活性的葡萄球菌属菌株。
小牛葡萄球菌(Staphylococcus vitulinus)是已知在低温下具有硝酸还原酶活性的菌株，并且已经将其与乳酸细菌组合用于使肉变红(WO2010/067148)。
然而，需要以下方法：所述方法改进食品中的硝酸盐还原和颜色形成，因此可减少实现食品所需变红所必需的生产时间并由此可降低所述产品的生产成本。
发明内容
本发明的发明人惊讶地发现，当通过两阶段发酵生产具有硝酸还原酶活性的葡萄球菌属菌株时，所述葡萄球菌属菌株产生增加的硝酸还原酶活性，导致当用于使含有肌红蛋白的食品着色时变红增强，其中所述两阶段发酵涉及在不存在硝酸盐下在高通气下使所述菌株发酵的第一阶段和在低通气下同时连续进给硝酸盐使所述菌株发酵的第二阶段。
因此，在第一个方面，本发明涉及增加具有硝酸还原酶的葡萄球菌属菌株的硝酸还原酶活性的方法，其包括以下步骤：
a)在不存在硝酸盐下在有氧条件下使所述菌株发酵；
b)在无氧或限氧条件下同时向发酵培养基中连续进给硝酸盐使所述菌株发酵；和
c)将所述菌株任选地制粒和任选地冷冻干燥。
在第二个方面，本发明涉及可通过根据第一个方面的方法得到的葡萄球菌属菌株，其中所述菌株的硝酸还原酶活性不能被改进超过50％。
在第三个方面，本发明涉及选自由以保藏号DSM 25789保藏于德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，DSMZ)的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896和从其衍生的突变体组成的组的小牛葡萄球菌菌株。
本发明的第四个方面涉及用于使食品变红的方法，其包括以下步骤：
a)根据本发明的第一个方面的方法预处理具有硝酸还原酶活性的葡萄球菌属菌株；
b)向食品中加入所述预处理的葡萄球菌属菌株；和
c)用所述预处理的葡萄球菌属菌株对所述食品进行发酵、熟化或腌制。
本发明的第五个方面涉及包含根据本发明第二或第三个方面的葡萄球菌属菌株的食品。
本发明的第六个方面涉及根据第二或第三个方面的葡萄球菌属菌株用于使食品变红的用途。
第七个方面涉及可通过根据本发明第一个方面的方法得到的食品或可通过根据本发明的第六个方面的用途得到的食品。
附图说明
图1描绘在使用小牛葡萄球菌菌株CHCC10896进行标准发酵期间硝酸盐/亚硝酸盐浓度以及硝酸还原酶活性(NRA)的发展。
图2显示在使用小牛葡萄球菌菌株CHCC10896进行两阶段发酵期间硝酸盐/亚硝酸盐浓度的发展。在6.3小时时间点，通气显著减少并且开始进给硝酸盐。没有向分批培养基中添加硝酸盐。
图3描绘使用小牛葡萄球菌菌株CHCC10896进行两阶段发酵期间硝酸盐/亚硝酸盐浓度的发展。在6.3小时时间点，通气显著减少并且开始进给硝酸盐。向分批培养基中添加硝酸盐。
图4显示在烹饪前使用通过标准发酵生产的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896(小牛葡萄球菌–标准)、通过两阶段发酵生产的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896(小牛葡萄球菌–硝酸盐进料)或CS-300(CS-300)于4℃发酵21小时的摩泰台拉(mortadella)型香肠中的硝酸盐/亚硝酸盐浓度。
图5显示在烹饪前使用通过标准发酵生产的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896(小牛葡萄球菌–标准)、通过两阶段发酵生产的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896(小牛葡萄球菌–硝酸盐进料)或CS-300(CS-300)于12℃发酵21小时的摩泰台拉型香肠中的硝酸盐/亚硝酸盐浓度。
图6显示在烹饪前使用通过标准发酵生产的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896(小牛葡萄球菌–标准)、通过两阶段发酵生产的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896(小牛葡萄球菌–硝酸盐进料)或CS-300(CS-300)于18℃发酵21小时的摩泰台拉型香肠中的硝酸盐/亚硝酸盐浓度。
图7描绘在烹饪前使用通过标准发酵生产的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896(STAvi_标准)、通过两阶段发酵生产的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896(STAvi_硝酸盐)或CS-300(CS-300)于4℃、12℃或18℃发酵21小时的摩泰台拉型香肠的红色强度(根据L*a*b*系统的a*值)。
图8显示在烹饪前使用通过从一开始有硝酸盐的两阶段发酵生产的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896(1)、通过从一开始无硝酸盐的两阶段发酵生产的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896(2)、CS-300(3)或NatuRed LT(4)于4℃达不同孵育间隔(7小时、12小时和24小时)后的摩泰台拉型香肠碎末的硝酸盐和亚硝酸盐浓度。
图9描绘在烹饪前使用通过从一开始有硝酸盐的两阶段发酵生产的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896(1)、通过从一开始无硝酸盐的两阶段发酵生产的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896(2)、CS-300(3)或NatuRed LT(4)于4℃、8℃或12℃发酵7小时后的摩泰台拉型香肠的红色强度(根据L*a*b*系统的a*值)。
图10描绘在烹饪前使用通过从一开始有硝酸盐的两阶段发酵生产的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896(1)、通过从一开始无硝酸盐的两阶段发酵生产的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896(2)、CS-300(3)或NatuRed LT(4)于4℃、8℃或12℃发酵12小时后的摩泰台拉型香肠的红色强度(根据L*a*b*系统的a*值)。
图11描绘在烹饪前使用通过从一开始有硝酸盐的两阶段发酵生产的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896(1)、通过从一开始无硝酸盐的两阶段发酵生产的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896(2)、CS-300(3)或NatuRed LT(4)于4℃、8℃或12℃发酵24小时后的摩泰台拉型香肠的红色强度(根据L*a*b*系统的a*值)
图12描绘使用通过从一开始无硝酸盐的两阶段发酵生产的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896(STAvi)或CS-299(CS-299)于6℃发酵16小时的熟火腿的红色强度(根据L*a*b*系统的a*值)。
图13显示具有使用CS-299(CS-299)或通过从一开始无硝酸盐的两阶段发酵生产的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896(小牛葡萄球菌CHCC10896)发酵的研碎的熟火腿的培养皿。
图14描绘在烹饪前使用通过标准发酵生产的小牛葡萄球菌菌株CHCC111576(CHCC11576–标准)、通过两阶段发酵生产的小牛葡萄球菌菌株CHCC11576(CHCC11576–进料)或通过标准发酵生产的肉葡萄球菌菌株A(肉葡萄球菌)于4℃发酵20小时的摩泰台拉型香肠的红色强度(根据L*a*b*系统的a*值)。
图15描绘在烹饪前使用通过标准发酵生产的小牛葡萄球菌菌株CHCC111576(CHCC11576–标准)、通过两阶段发酵生产的小牛葡萄球菌菌株CHCC11576(CHCC11576–进料)、或通过标准发酵生产的肉葡萄球菌菌株A(肉葡萄球菌)于8℃发酵18小时的摩泰台拉型香肠的红色强度(根据L*a*b*系统的a*值)。
图16显示在烹饪前使用通过标准发酵生产的小牛葡萄球菌菌株CHCC111576(CHCC11576–标准)、通过两阶段发酵生产的小牛葡萄球菌菌株CHCC11576(CHCC11576–进料)或通过标准发酵生产的肉葡萄球菌菌株A(肉葡萄球菌-标准)于4℃发酵20小时的摩泰台拉型香肠。
图17显示在烹饪前使用通过标准发酵生产的小牛葡萄球菌菌株CHCC111576(CHCC11576–标准)、通过两阶段发酵生产的小牛葡萄球菌菌株CHCC11576(CHCC11576–进料)或通过标准发酵生产的肉葡萄球菌菌株A(肉葡萄球菌-标准)于8℃发酵18小时的摩泰台拉型香肠。
图18描绘在烹饪前使用通过标准发酵生产的小牛葡萄球菌菌株CHCC111576(1)、通过两阶段发酵生产的小牛葡萄球菌菌株CHCC11576(2)或通过标准发酵生产的肉葡萄球菌菌株A(3)于4℃发酵20小时(4℃)或于8℃发酵18小时(8℃)的摩泰台拉型香肠中的硝酸盐/亚硝酸盐浓度。
图19描绘在烹饪前使用通过仅在第二阶段开始时给予一次高浓度的硝酸盐掺料(spike)的两阶段发酵生产的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896(CHCC10896–掺料)、通过在第二阶段期间连续进给硝酸盐的两阶段发酵生产的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896(CHCC10896-进料)、或通过标准发酵生产的肉葡萄球菌菌株A(肉葡萄球菌)于4℃发酵20小时的摩泰台拉型香肠的红色强度(根据L*a*b*系统的a*值)。
图20描绘在烹饪前使用通过仅在第二阶段开始时给予一次高浓度硝酸盐掺料的两阶段发酵生产的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896(CHCC10896–掺料)、通过在第二阶段期间连续进给硝酸盐的两阶段发酵生产的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896(CHCC10896-进料)或通过标准发酵生产的肉葡萄球菌菌株A(肉葡萄球菌)于8℃发酵18小时的摩泰台拉型香肠的红色强度(根据L*a*b*系统的a*值)。
图21显示在烹饪前使用通过仅在第二阶段开始时给予一次高浓度硝酸盐掺料的两阶段发酵生产的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896(CHCC10896–掺料)、通过在第二阶段期间连续进给硝酸盐的两阶段发酵生产的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896(CHCC10896-进料)或通过标准发酵生产的肉葡萄球菌菌株A(肉葡萄球菌-标准)于4℃发酵20小时的摩泰台拉型香肠。
图22显示在烹饪前使用通过仅在第二阶段开始时给予一次高浓度硝酸盐掺料的两阶段发酵生产的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896(CHCC10896–掺料)、通过在第二阶段期间连续进给硝酸盐的两阶段发酵生产的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896(CHCC10896-进料)或通过标准发酵生产的肉葡萄球菌菌株A(肉葡萄球菌-标准)于8℃发酵18小时的摩泰台拉型香肠。
图23描绘在烹饪前使用通过仅在第二阶段开始时给予一次高浓度硝酸盐掺料的两阶段发酵生产的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896(1)、通过在第二阶段期间连续进给硝酸盐的两阶段发酵生产的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896(2)或通过标准发酵生产的肉葡萄球菌菌株A(3)于4℃发酵20小时(4℃)或于8℃发酵18小时(8℃)的摩泰台拉型香肠中的硝酸盐/亚硝酸盐浓度。
具体实施方式
除非本文另外指出或上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(尤其是在下文权利要求书的上下文中)使用的术语“一(a或an)”和“所述”以及相似指代物应当解释为涵盖单数和复数两者。除非另外指出，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应当解释为开放性的术语(即，意指“包括但不限于”)。除非本文另外指出，否则本文中叙述的值的范围仅仅打算作为个别地指处于该范围内的每个单独值的简化方法，并且每个单独值都被并入本说明书中，就如同其在本文中被个别地叙述一样。除非本文另外指出或上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法都可以按任何适合的顺序进行。除非另外要求，否则使用本文所提供的任何和所有示例或示例性用语(例如，“诸如”)仅仅打算用于更好地阐明本发明，而并不对本发明的范围构成限制。本说明书中的用语都不应当解释为表明是任何非实施本发明必不可少的要求要素。
本发明涉及使具有硝酸还原酶活性的葡萄球菌属菌株在某些条件下发酵以增加葡萄球菌属菌株的硝酸还原酶活性的方法。
如本文所使用的术语“具有硝酸还原酶活性的葡萄球菌属菌株”是指能够将硝酸盐转化成亚硝酸盐的葡萄球菌属菌株。
发酵是作为两阶段发酵实施的，其中第一阶段包括在不存在硝酸盐下在有氧条件下使菌株发酵并且其中第二阶段包括在无氧或限氧条件下同时向发酵培养基中连续进给硝酸盐使菌株发酵。最后，可任选地将菌株制粒和/或冷冻干燥。
如本文所使用的术语“在不存在硝酸盐下”是指在没有加入硝酸盐的发酵培养基中实施的发酵。
术语“发酵培养基”打算意指允许细菌代谢物产生和/或生物量生长的发酵培养基。
在优选的实施方案中，第一阶段的有氧条件包括在至少0.5vvm(每分钟每体积的体积)、诸如至少0.6vvm、诸如至少0.7vvm、诸如至少0.8vvm的高通气下使菌株发酵。
在优选的实施方案中，第一阶段持续5至12小时，诸如6至10小时。
在另一个优选实施方案中，第一阶段持续直到培养基的氧分压(pO2)达到0。
发酵培养基的pO2可以用如本文实施例2中所述的光学溶解氧传感器测量。
如本文所使用的术语“连续进给硝酸盐”是指向发酵培养基稳定地添加硝酸盐或以每次添加恒定量硝酸盐之间不长于15分钟的脉冲向发酵培养基添加硝酸盐。
在优选的实施方案中，硝酸盐以不长于10分钟的脉冲、诸如不长于8分钟的脉冲、诸如不长于6分钟的脉冲、诸如不长于5分钟的脉冲添加。
可用于根据本发明方法的硝酸盐可以是化学来源的。它们可以是例如硝酸钾、硝酸钠、硝石及其混合物。
硝酸盐还可以是天然来源的。它们可以通过例如植物和/或植物提取物提供，所述植物有利地选自天然富含硝酸盐的植物，例如韭菜、芹菜、洋葱、菠菜和卷心菜。
硝酸盐可以以液体和固体形式提供。
在优选的实施方案中，第二阶段中硝酸盐的进给速率为0.5g/(l*h)至2.0g/(l*h)，诸如0.8g/(l*h)至1.8g/(l*h)。
如本文所使用的术语“限氧条件”打算涵盖通常通过受控的通氧限制可用氧的任何条件，包括使得菌株有效地经历接近无氧生长的低通气。
在优选的实施方案中，第二无氧或限氧阶段包括在至多0.08vvm、诸如至多0.07vvm、诸如至多0.06vvm、诸如至多0.05vvm、诸如至多0.04vvm、诸如至多0.03vvm的通气下使菌株发酵。
不希望受理论束缚，据信第二阶段中氧的缺乏迫使菌株增加负责硝酸还原酶活性的nar操纵子的表达，所述硝酸还原酶活性受持续高浓度的硝酸盐的促进。在有氧呼吸期间，由电子供体如NADH提供的电子通过电子传递链转移至末端还原酶，再转移至最终的电子受体O2。在该过程中，通过膜分开电子和质子而形成蛋白质基序力。通过质子经由膜结合的ATP-合酶流入细胞中而形成ATP。在无氧条件下，在氧缺乏期间，需要替代的电子受体来保持该过程运行，例如硝酸盐。由此，硝酸还原酶将硝酸盐还原成亚硝酸盐。
葡萄球菌属菌株可以是任何具有硝酸还原酶活性的葡萄球菌属菌株，例如小牛葡萄球菌菌株、肉葡萄球菌菌株或木糖葡萄球菌菌株。
在本发明的优选的实施方案中，具有硝酸还原酶活性的葡萄球菌属菌株是具有硝酸还原酶活性的小牛葡萄球菌菌株或肉葡萄球菌菌株。
在更优选的实施方案中，具有硝酸还原酶活性的葡萄球菌属菌株是小牛葡萄球菌菌株。
在本发明的非常优选的实施方案中，小牛葡萄球菌菌株选自由以保藏号DSM 25789保藏于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896、以保藏号DSM 27311保藏于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)的小牛葡萄球菌菌株CHCC11576和从其衍生的突变体组成的组。
在本上下文中，术语“突变体”应当理解为借助例如基因工程、放射和/或化学处理从本发明的菌株衍生的菌株。优选地，突变体是功能上等效的突变体，例如具有与亲本菌株基本上相同或改进的性质(例如关于硝酸还原酶活性)的突变体。所述突变体是本发明的一部分。特别地，术语“突变体”是指通过使本发明的菌株经受任何常规使用的诱变处理(包括用诸如甲磺酸乙酯(EMS)或N-甲基-N'-硝基-N-硝基胍(NTG)等化学诱变剂、UV光处理)而得到的菌株，或自发地发生的突变体。突变体可能已经经受数次诱变处理(单次处理应当理解为一个诱变步骤，之后是一个筛选/选择步骤)，但是目前优选实施不超过20次、或不超过10次、或不超过5次处理(或筛选/选择步骤)。在目前优选的突变体中，与亲本菌株相比，细菌基因组中小于1％、小于0.1、小于0.01、小于0.001％或甚至小于0.0001％的核苷酸已经被另一种核苷酸替换，或被缺失。
本发明还涉及可通过上述方法得到的葡萄球菌属菌株。已经经受上述两阶段发酵方法的葡萄球菌属菌株的硝酸还原酶活性不能被改进到与没有经受本发明的两阶段发酵的葡萄球菌属菌株的硝酸还原酶活性相同的程度。
因此，使已经经受一次两阶段发酵方法的葡萄球菌属菌株在接下来的数小时内经受例如第二轮两阶段发酵方法不会将所述菌株的硝酸还原酶活性改进到与使所述菌株第一次经受两阶段发酵方法时相同的程度。菌株经受第一轮和第二轮两阶段发酵方法并且仍维持高的硝酸还原酶活性的时间点之间的确切时段取决于多种条件，例如氧的存在和保持样品时的温度。
优选地，使菌株经受两阶段发酵方法在产生菌株后不超过3小时将菌株保持在低于5℃的温度和无氧条件下来确定硝酸还原酶活性可被改进的百分数。
不希望受理论束缚，据信除了本发明的两阶段发酵方法之外，还可存在用于将硝酸还原酶活性增加至高于通过葡萄球菌属菌株标准发酵所实现水平的水平的其它方法。可例如通过使菌株经受其它应激因素来诱导负责硝酸还原酶活性的nar操纵子。
在优选的实施方案中，不能将菌株的硝酸还原酶活性改进超过50％，诸如超过40％，诸如超过30％，诸如超过20％，诸如超过10％。
所讨论的葡萄球菌属菌株的硝酸还原酶活性改进百分数可以通过使用如本文实施例中所述的用于确定硝酸还原酶活性的方法来容易地确定：确定所讨论的菌株在经受根据本发明的两阶段发酵方法之前和之后的硝酸还原酶活性，并且可通过确定硝酸还原酶活性的增加来计算硝酸还原酶活性的改进。
在优选的实施方案中，通过上述方法得到葡萄球菌属菌株。
在另一个优选的实施方案中，当以3.6×1010CFU/kg肉的量加入并且用于在12℃发酵21小时制备摩泰台拉型香肠时，葡萄球菌属菌株能够使肉变红至根据L*a*b*系统至少14的红色强度(a*值)。
摩泰台拉型香肠可以根据本文实施例3和4制备。
在本发明的再一优选实施方案中，当以1.5×1010CFU/kg肉的量加入并且用于在6℃发酵16小时制备熟火腿时，葡萄球菌属菌株能够使肉变红至根据L*a*b*系统至少10、诸如至少11、诸如至少12的红色强度(a*值)。
熟火腿可以根据本文实施例5制备。
本发明还涉及选自由以保藏号DSM 25789保藏于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896和从其衍生的突变体的小牛葡萄球菌菌株组成的组。
在本上下文中，术语“突变体”应当理解为借助例如基因工程、放射和/或化学处理从本发明的菌株衍生的菌株。优选地，突变体是功能上等效的突变体，例如具有与亲本菌株基本上相同或改进的性质(例如关于硝酸还原酶活性)的突变体。所述突变体是本发明的一部分。特别地，术语“突变体”是指通过使本发明的菌株经受任何常规使用的诱变处理(包括用诸如甲磺酸乙酯(EMS)或N-甲基-N'-硝基-N-硝基胍(NTG)等化学诱变剂、UV光处理)而得到的菌株，或自发地发生的突变体。突变体可能已经经受数次诱变处理(单次处理应当理解为一个诱变步骤，之后是一个筛选/选择步骤)，但是目前优选实施不超过20次、或不超过10次、或不超过5次处理(或筛选/选择步骤)。在目前优选的突变体中，与亲本菌株相比，细菌基因组中小于1％、小于0.1、小于0.01、小于0.001％或甚至小于0.0001％的核苷酸已经被另一种核苷酸替换，或被缺失。
此外，本发明涉及用于使食品变红的方法，其包括以下步骤：根据上述使具有硝酸还原酶活性的葡萄球菌属菌株发酵的方法预处理具有硝酸还原酶活性的葡萄球菌属菌株，向食品中加入所述预处理的葡萄球菌属，和用所述预处理的葡萄球菌属菌株对所述食品进行发酵、熟化或腌制。
食品可以是基于含有肌红蛋白的食物来源的任何产品。
在优选的实施方案中，食品是肉制品。
肉制品可以是具有一定含量的肉的任何产品。肉可以是牛肉、猪肉、家禽肉、野味肉或任何其它种类的肉。
食品还可以是基于鱼和/或基于甲壳类的产品。
在优选的实施方案中，葡萄球菌属菌株以1.0×108CFU/kg至1.0×1012CFU/kg、诸如1.0×109CFU/kg至1.0×1011CFU/kg的量加入。优选地，葡萄球菌属菌株以2.0×109CFU/kg至5.0×1010CFU/kg的量加入。
在优选的实施方案中，用预处理的葡萄球菌属菌株对食品发酵、熟化或腌制在4℃至45℃的温度下，诸如在4℃至30℃的温度下，诸如在4℃至25℃的温度下进行。
食品的发酵、熟化或腌制可以持续8小时至数天/数周。
在优选的实施方案中，葡萄球菌属菌株是小牛葡萄球菌菌株或肉葡萄球菌菌株。
在更优选的实施方案中，葡萄球菌属菌株是小牛葡萄球菌菌株。
在非常优选的实施方案中，小牛葡萄球菌菌株选自由以保藏号DSM 25789保藏于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896、以保藏号DSM 27311保藏于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)的小牛葡萄球菌菌株CHCC11576和从其衍生的突变体组成的组。
在本上下文中，术语“突变体”应当理解为借助例如基因工程、放射和/或化学处理从本发明的菌株衍生的菌株。优选地，突变体是功能上等效的突变体，例如具有与亲本菌株基本上相同或改进的性质(例如关于硝酸还原酶活性)的突变体。所述突变体是本发明的一部分。特别地，术语“突变体”是指通过使本发明的菌株经受任何常规使用的诱变处理(包括用诸如甲磺酸乙酯(EMS)或N-甲基-N'-硝基-N-硝基胍(NTG)等化学诱变剂、UV光处理)而得到的菌株，或自发地发生的突变体。突变体可以是已经经受数次诱变处理(单次处理应当理解为一个诱变步骤，之后是一个筛选/选择步骤)，但是目前优选实施不超过20次、或不超过10次、或不超过5次处理(或筛选/选择步骤)。在目前优选的突变体中，与亲本菌株相比，细菌基因组中小于1％、小于0.1、小于0.01、小于0.001％或甚至小于0.0001％的核苷酸已经被另一种核苷酸替换，或被缺失。
此外，本发明涉及包含葡萄球菌属菌株的食品，所述葡萄球菌属菌株是可通过如上所述的两阶段发酵方法得到的葡萄球菌属菌株、或选自由已经经受如上所述的两阶段发酵方法的以保藏号DSM 25789保藏于DSMZ的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896、以保藏号DSM 27311保藏于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)的小牛葡萄球菌菌株CHCC11576和从其衍生的突变体组成的组的葡萄球菌属菌株。
在本发明的优选的实施方案中，通过如上所述的两阶段发酵方法得到葡萄球菌属菌株。
在优选的实施方案中，食品是肉制品。
在优选的实施方案中，肉制品是摩泰台拉型香肠，其中所述摩泰台拉型香肠具有根据L*a*b*系统至少14的红色强度(a*值)。
在另一个优选的实施方案中，肉制品是熟火腿，其中所述熟火腿具有根据L*a*b*系统至少10、诸如至少11、诸如至少12的红色强度(a*值)。
此外，本发明涉及葡萄球菌属菌株用于使食品变红的用途，所述葡萄球菌属菌株是可通过如上所述的两阶段发酵方法得到的葡萄球菌属菌株、或已经经受如上所述的两阶段发酵方法并且选自由以保藏号DSM 25789保藏于DSMZ的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896、以保藏号DSM 27311保藏于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)的小牛葡萄球菌菌株CHCC11576和从其衍生的突变体组成的组的葡萄球菌属菌株。
在优选的实施方案中，通过如上所述的两阶段发酵方法得到葡萄球菌属菌株。
优选地，食品是肉制品。
本发明还涉及可通过上述使食品变红的方法得到的食品或可通过上述用途得到的食品。
下面以非限定性实施例的方式来描述本发明的实施方案。
实施例
确定硝酸还原酶活性的方法
可使用下列方法来确定硝酸还原酶活性(NRA)：
在第一步中，在Eppendorf反应杯中将约5×108cfu/ml在诱导缓冲液(10g/l胰蛋白胨，1g半胱氨酸，1g KNO3；pH 7.0)中于30℃静止孵育。温度和孵育时间针对要评价的特定问题来调整。重要的是通过例如通过使用矿物油进行覆盖使悬浮液上方的空气相最小化来将诱导缓冲液内细胞的氧供应减少至最低。因为每次使用相同的细胞计数、孵育时间和温度，所以一次测定与另一次测定之间的结果是相当的，但如果需要快速分析并且没有细胞计数可利用时，则通过OD600测量来测定细胞的剂量也是合适的。例如当要测试琼脂板上储存的分离物的硝酸还原酶活性时，应当根据OD600测量来实施诱导缓冲液的接种。这里重要的是在合适培养基中将来自琼脂平皿的菌落孵育一天并且在傍晚接种合适体积的新鲜培养基，然后孵育过夜。将要彼此进行比较的样品应当具有相当的光密度，使得可按照以下假定进行比较：所有样品均显示大致相同的活细胞与死细胞的比率，这使得通过OD600测量进行剂量测定是可行的。可将这些过夜培养物接种到诱导缓冲液中至所有样品的OD600相同。OD600应当不超过0.6，因为高于0.6的光密度影响结果。
诱导步骤是重要的，因为它以某种方式模拟了当为了颜色稳定性而在肉中应用培养物时在终产品中也会发生的情况。葡萄球菌的硝酸还原酶系统被存在硝酸盐的无氧条件诱导，如同肉制品内的情况那样。诱导硝酸盐还原系统的调节过程(转录、蛋白质生物合成)在肉制品内需要一些时间，因此认为使用诱导步骤来给予细胞时间去“再活化”硝酸盐还原系统，如会在肉制品中发生的那样。
测定本身基于Lowe和Evans(Lowe和Evans(1964).Biochimica et biophysicaacta 85；377-389)研发的方法，其中通过测量连二亚硫酸盐/苄基紫精系统内亚硝酸盐自硝酸盐的产量来确定反应速度。
使用由磷酸钾缓冲液(100mM；pH 7.0)、作为人工电子供体的苄基紫精(30mM)、硝酸钾(12mM)和还原剂连二亚硫酸盐(141mM)组成的反应混合物。加入过量的连二亚硫酸盐有助于无缺氧室的实验室条件下的操作。通过加入细菌细胞开始反应。
反应混合物：
0.2ml   预先诱导的细胞悬浮液
10.8ml  磷酸钾缓冲液(100mM；pH 7.0)
0.4ml   KNO3溶液(12mM)
0.4ml   苄基紫精溶液(30mM)
通过缓慢搅拌将试管于30℃水浴中预热2分钟。
0.4ml   连二亚硫酸盐溶液(141mM)
·将试管在水浴内孵育并且以不同时间间隔(例如0分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟和60分钟)将0.4ml该溶液转移至Eppendorf杯中
·应当通过在取样后立即摇动对样品通氧直到还原的苄基紫精退色
·然后将杯以10,000×g离心3分钟
·将50μl上清液转移至96孔微量滴定板的孔(至少5个孔)中
·向每一孔中加入250μl格里斯(Griess)试剂
·将板在黑暗中储存10分钟
·用微孔板阅读仪读取540nm下的吸光度
·吸光度应当不超过0.8，否则需要稀释
备注
作为对照合适的是不加入任何细胞或硝酸盐。可以使用已知亚硝酸盐浓度的样品产生标准曲线，并且计算对应于所述线的斜率的摩尔消光系数。借助于摩尔消光系数和测量的吸光度可以计算特定时间下的亚硝酸盐浓度。虽然通过执行时间因素可以计算酶活性，但是仅采用540nm下的吸光度作为硝酸还原酶活性的直接指示也是合适的。
确定肉和肉制品中硝酸盐和亚硝酸盐的方法。
可以使用下列方法来确定硝酸盐和亚硝酸盐的浓度：
确定原理
将样品用热水提取并且在蛋白质内容物变性后将提取物过滤。滤液含有提取的硝酸盐和亚硝酸盐。亚硝酸盐可以通过加入磺胺(显色试剂I)和N-(1-萘基-)-乙二铵二氯化物(显色试剂II)进行格里斯反应来直接确定。该反应的产物是在546nm下具有最大吸收的发色团(chromphor)，其显示粉红色并且可以通过分光光度法确定。硝酸盐不能直接确定，必须首先将其还原成亚硝酸盐。通过使滤液流经含金属镉作为还原剂的还原柱进行还原。经由镉柱还原后确定的亚硝酸盐的量(总亚硝酸盐)减去提取后立即在滤液内确定的量(亚硝酸盐)的差得到样品内硝酸盐的量。
实验
通过将60-70g硫酸镉(3CdSO4×8H2O)溶解于600ml去离子水中来制备镉浆。为了使镉沉淀，将3-5个锌棒浸泡到所述溶液中。在6-8小时后通过倾析收获沉淀的镉。将沉淀物在2×1000ml去离子水中洗涤。将洗涤的沉淀物与400ml0.1M HCl混合并且在HCl中孵育过夜。
通过将玻璃棉放置到玻璃柱锥形体内用于保持镉浆来准备还原柱。在HCl倾析之后，用去离子水将镉浆洗涤到柱中直到达到约170mm的高度。应当避免夹杂物和气泡，如果出现，则需要去除。所述柱应当允许6-9ml/min的流经量。
通过研磨将肉样品均质化。将约10g样品(记录确切重量用于计算)称入100ml锥形瓶中。
加入10ml饱和硼酸钠溶液(50g/l四硼酸二钠-十水合物溶解于加热的去离子水中)和50ml去离子水。将悬浮液充分混合并加热到95℃达15分钟。然后，将悬浮液定量转移至200ml容量瓶中并再次于95℃加热15分钟。将悬浮液定期混合。接着加入5ml卡利兹(Carrez)I溶液(106g/l六氰铁(II)酸钾-三水合物溶解于去离子水中；溶液必须储存在棕色瓶中并且必须每周制备)和卡利兹II溶液(220g乙酸锌于30ml纯乙酸中并用去离子水填充至1000ml)使残留的蛋白质变性。将悬浮液充分混合。如果需要，取决于样品的性质(例如高脂肪含量)，可以增加卡利兹溶液的量。在冷却至室温后，将容量瓶用去离子水填充至标记处并混合。通过用于中细沉淀物的过滤器将样品溶液过滤。丢弃滤液的第一部分；滤液必须是澄清的和无色的。
对于亚硝酸盐的确定来说，将10ml滤液转移至100ml烧瓶中，加入5ml显色试剂I(通过加热将6g磺胺溶解于500ml去离子水中，冷却后通过持续搅拌加入250ml HCl(37％)，然后冷却并用去离子水填充至1000ml)和显色试剂II(0.25g N-(1-萘基)乙二铵二氯化物溶解于250ml去离子水中；溶液必须储存在棕色瓶中并且必须每周制备)。将溶液在黑暗中在室温下孵育30分钟。接着使用通过分光光度法相对于盲对照(blind)(1:2比例的显色试剂I和II+去离子水)在546nm下确定溶液的消光度。
对于硝酸盐的确定来说，将20ml滤液转移至100ml烧瓶中，加入5ml氨缓冲液(20ml HCl(37％)稀释于500ml去离子水中，加入10g Titriplex III(EDTA)和55ml氨溶液(25％)并用去离子水填充至1000ml；pH 9,.6-9.,7)。将混合的溶液转移至还原柱。柱必须之前通过流经25ml HCl(0.1M)、50ml去离子水和25ml稀释的氨缓冲液溶液(以1:10稀释于去离子水中)来准备。所述柱应决不在干燥下运行。将用于硝酸盐确定的洗脱液收集在100ml容量瓶中。在加入全部滤液之后，将柱用约15ml去离子水洗涤3-4次。还将流经物收集在容量瓶中。将现已含有还原的样品溶液的容量瓶用去离子水填充至标记处并充分混合。
对于亚硝酸盐/还原的硝酸盐的确定来说，将10ml滤液转移至100ml烧瓶中，加入5ml显色试剂I和II。将溶液在黑暗中在室温下孵育30分钟。接着，通过分光光度法相对于盲对照(1:2比例的显色试剂I和II+去离子水)在546nm下确定溶液的消光度。
计算
表示为NaNO2(ppm)[mg/kg]的亚硝酸盐浓度计算如下：
亚硝酸盐浓度[ppm]＝a*V/EW，其中
a：提取后立即于样品内的μg NaNO2(该值可以从确定样品在546nm下的消光度之后的校准线直接读取。该校准线是通过确定具有已知亚硝酸盐浓度的溶液在547nm下的消光度产生的)。
V：稀释因子。
EW：样品重量(g)。
表示为NaNO2(ppm)[mg/kg]的总亚硝酸盐浓度计算如下：
总亚硝酸盐浓度[ppm]＝b*V/EW，其中
b：样品中最初的μg NaNO2(该值可以从确定样品在546nm下的消光度之后的校准线直接读取。该校准线是通过确定具有已知亚硝酸盐浓度的溶液在547nm下的消光度产生的)加上通过镉柱还原从硝酸盐衍生的亚硝酸盐。
V：稀释因子。
EW：样品重量(g)。
表示为KNO3(ppm)[mg/kg]的硝酸盐浓度计算如下：
来自硝酸盐的亚硝酸盐浓度[ppm]＝总亚硝酸盐浓度[ppm]–亚硝酸盐浓度[ppm]
硝酸盐浓度[ppm]＝来自硝酸盐的亚硝酸盐浓度[ppm]×1.465(从亚硝酸盐转化成硝酸盐的转化因子)
实施例1：用于葡萄球菌属种的标准发酵程序
实验：
在用于肉葡萄球菌MIII的改良形式的标准甘油培养基中实施发酵。甘油含量与用于肉葡萄球菌MIII的标准培养基相比降低以确保充足的氧供应。
发酵培养基：
制备发酵培养基并且将pH调节至7.2，之后通过于121℃高压蒸汽灭菌20分钟来灭菌。将pH调节至7.2并且以0.1％(约2.6×107CFU/ml)接种小牛葡萄球菌菌株CHCC10896。
在37℃下利用500rpm的搅拌和0.5vvm(6L/min)的空气流量实施15.5小时发酵。
在整个发酵过程期间于图1所示的时间点取出样品。分析样品的硝酸盐/亚硝酸盐浓度。
结果
结果显示，菌株(小牛葡萄球菌CHCC10896)在发酵约6-8小时后将硝酸盐还原成亚硝酸盐。这表明该时间点处最有可能由细胞密度增加引起的氧供应的下降。nar操纵子的转录(硝酸盐还原)在存在硝酸盐的无氧条件下被诱导并且被氧的存在所抑制。图1显示，NRA在8小时与9小时之间增加到一定水平，其中最有可能发生氧供应的下降。NRA在发酵9小时左右时最高，然后最有可能因为缺乏硝酸盐而再次降低，当不再向菌株供应充足的氧时，所述硝酸盐被迅速还原。然而，还已知高水平的不被小牛葡萄球菌进一步还原成氨的亚硝酸盐诱导nar操纵子。这可以解释在发酵结束时NRA仅稍微降低。从所示数据可以清楚地看出，菌株快速耗尽硝酸盐并且这可以解释当通过标准的1-阶段发酵程序生产菌株时，所述菌株的降低的NRA。
为了改进小牛葡萄球菌的NRA，建议运行分成两阶段的发酵程序。在第一阶段内，必须向菌株供应充足的氧以有效地产生生物量。在第二阶段内，将所述过程从有氧条件转换成无氧或限氧条件并伴随硝酸盐的连续进给。必须避免菌株在无氧或限氧生长期间耗尽硝酸盐直到发酵结束。
实施例2：将标准发酵程序调整为2-步过程。
用于优化小牛葡萄球菌菌株CHCC10896的NRA的经调整的发酵程序可被分为两阶段。第一阶段的目的是在对菌株充分通气的同时产生生物量，而第二阶段用于通过减少通气并连续脉冲进给硝酸盐直到发酵结束进行调节以优化/增加NRA。通过应用上文概略描述的过程来实施总共两次发酵。在用于肉葡萄球菌MIII的改良形式的标准甘油培养基中实施发酵。甘油含量与用于肉葡萄球菌MIII的标准培养基相比降低以确保第一通气发酵阶段期间的充足氧供应。总共实施4次发酵，其中2次排除硝酸盐，硝酸盐是默认在标准甘油培养基中使用的。然而，在两种情况下在减少通气后均应用了硝酸盐进给。
实验
根据实施例1中的配方制备一批发酵培养基并且制备一批不含硝酸盐的发酵培养基。将两种培养基的pH均调节至7.2，之后通过121℃高压蒸汽灭菌20分钟来灭菌。再次将pH调节至7.2并且将小牛葡萄球菌菌株CHCC10896以0.1％(约2.6×107CFU/ml)接种到每一种发酵培养基中。
使用光学溶解氧传感器(Mettler Toledo InPro6870i/120)测量发酵培养基中的溶解氧含量(pO2)。
于37℃下利用500rpm的搅拌和0.5vvm(6L/min)的空气流量实施发酵直到pO2达到0(大约6.3小时)。然后将空气流量减少至0.08vvm(1L/min)并且开始硝酸盐进料(0.17g/L硝酸钾，以10分钟的脉冲＝1.02g/(l*h))。
发酵实施总共约19小时。
然后将发酵物冷却至15℃并收获细胞。
在不同时间点取出上述发酵的样品并分析硝酸盐和亚硝酸盐浓度。分析结果示于图2(没有向初始发酵培养基添加硝酸盐)和图3(向初始发酵培养基添加硝酸盐)中。
结果
结果(图2和3)清楚地显示，一旦菌株小牛葡萄球菌CHCC10896不再被供应充足的氧，它就会将硝酸盐充分地转化/还原成亚硝酸盐。由于在进料阶段期间没有硝酸盐积累，所以NRA似乎相当高。然而，可能尚未达到CHCC10896的最大活性，因为在硝酸盐被完全还原时，亚硝酸盐浓度仍在增加。如果已经达到最大活性，则硝酸盐应当已经积累并且亚硝酸盐浓度将不再以相同的斜率加速或甚至将达到平稳期/静止期。
当从一开始在培养基中加入硝酸盐时(图3)，亚硝酸盐累积的斜率与从一开始没有加入硝酸盐的发酵(图2)相比稍陡。因此，决定使用在从一开始没有加入硝酸盐的分批培养基，因为无论如何直到通气减少硝酸盐才会被小牛葡萄球菌还原。
实施例3：摩泰台拉型香肠应用试验
为了在应用测试中测试新研发的2-阶段发酵程序的效果，实施2种不同的发酵：一种是按照标准发酵的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896发酵，一种是按照如上所述的2-阶段方法的发酵。
收获两种发酵的细胞并通过加入低温添加剂冷冻干燥。两个批次均通过生产3批乳化香肠用于应用背景中，其中1批使用通过标准程序发酵的小牛葡萄球菌，1批使用通过在第二阶段内进给硝酸盐的2-阶段发酵所发酵的小牛葡萄球菌，并且1批使用由2种肉葡萄球菌菌株组成的商用培养物CS-300(Chr.Hansen，Denmark)，其充当对照。
实验
冷冻干燥的颗粒物的细胞计数确定。
通过流式细胞术实施细胞计数确定：
CV：变异系数，SD：标准差。
乳化香肠
·通过2mm板研碎所有肉和脂肪
·将包括细菌培养物在内的所有成分置于钵中(Mado Supra 35)，以
4000rpm和钵速度2剁切并切割
·10轮后清洁并加入500g CO2(较低的剁切温度)
·20轮(总共30轮)后清洁
·20轮(总共50轮)以完成切割
·将掺合物填塞到75mm Nalo TOP肠衣(casing)(+8杯用于分析)中
·在4℃、12℃和18℃下腌制处理21小时
·在箱中于80℃热处理直到中心达到72℃
·20分钟冷淋
·留在冷却室中于4℃下达24小时
靶细胞计数/接种水平
由于使用CS-300作为对照，因此两种小牛葡萄球菌样品均根据100kg肉中CS-300的靶细胞计数来给予。最初，CS-300中的两种菌株是以相同水平给予的，但由于MIII发酵培养基的转换，因此该菌株的剂量超过安全界限20％：
CS-300的靶细胞计数＝3.2×1012CFU/100kg
对于每一产品向靶细胞计数增加20％的安全界限。
小牛葡萄球菌样品的靶细胞计数＝3.0×1012CFU/100kg肉+20％安全界限
小牛葡萄球菌–标准(1)＝6.03g/100kg
小牛葡萄球菌–硝酸盐进料(2)＝7.27g/100kg
批次命名
1)小牛葡萄球菌–标准
2)小牛葡萄球菌–硝酸盐进料
3)CS-300
孵育/发酵
在每一情况中，使三批中的每一批的3种香肠在烹饪前在下列温度下发酵21小时以模拟滚揉过程：
·  4℃
·  12℃
·  18℃
结果
化学分析
通过上述方法确定填料前原料、发酵21小时后的原料和烹饪后终产物的硝酸盐/亚硝酸盐浓度(图4-6)。
微生物学分析
在发酵后和烹饪前取出原料。
1)-4℃5.0×106CFU/g
2)-4℃3.9×107CFU/g
3)-4℃4.4×107CFU/g
1)-12℃8.2×106CFU/g
2)-12℃4.7×107CFU/g
3)-12℃4.2×107CFU/g
1)-18℃7.6×106CFU/g
2)-18℃5.9×107CFU/g
3)-18℃5.1×107CFU/g
红色强度的确定
在Konica Minolta比色计中测量样品并且根据L*a*b*颜色系统确定a*值(图7)。
讨论
可以清楚地显示，对小牛葡萄球菌菌株CHCC10896发酵程序的修改使肉应用中的硝酸还原酶活性显著改进。通过在限氧生长阶段期间进给硝酸盐所生产的菌株甚至在低温下也会导致很好地变红，这是通过硝酸盐/亚硝酸盐确定结果和红色强度确定结果反映的。与标准发酵过程相比，在限氧阶段进给硝酸盐存在明显的优点。特别是在低温度(4℃和12℃)下可以看出红色强度的显著差异。此外显示，通过硝酸盐进给生产的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896显示在4℃和12℃下比CS-300显著更好的变红性能。
实施例4：第二次摩泰台拉型香肠应用试验
为了证实第一次应用试验和第二次应用试验的结果，使用新生产的冷冻干燥材料进行另一应用试验以确保2-步发酵程序的稳健性。
通过应用通过从一开始添加或不添加硝酸盐的2-步发酵程序生产的小牛葡萄球菌、CS-300和NatuRed LT生产4个不同批次的乳化香肠。将所述香肠在不同温度(4℃、8℃和12℃)下孵育并且在这些温度下发酵7小时、12小时和24小时以追踪硝酸盐还原和变红过程的发展。
实验
如实施例2中所述生产的冷冻干燥颗粒物的细胞计数确定
通过流式细胞术实施细胞计数确定：
CV：变异系数，SD：标准差。
乳化香肠
·通过2mm板研碎所有肉和脂肪
·将包括细菌培养物在内的所有成分置于钵中(Mado Supra 35)中，以4000rpm和钵速度2剁切并切割
·10轮后清洁并加入500g CO2(较低的剁切温度)
·20轮(总共30轮)后清洁
·30轮(总共60轮)以完成切割
·将掺合物分成3批，各5kg
·进一步以2000rpm和钵速度1切割15轮
·将掺合物填塞到75mm Nalo TOP肠衣(+数杯用于分析)中
·在4℃、8℃和12℃下腌制处理24小时
·在箱中于80℃热处理直到中心达到72℃
·20分钟冷淋
·留在冷却室中于4℃下达24小时。
靶细胞计数/接种水平
如前面所提到的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896的靶细胞计数为3.0×1012CFU/100kg肉。CS-300和NaturRed LT如根据产品信息所推荐的应用。
批次命名
1)小牛葡萄球菌–硝酸盐进料；从一开始有硝酸盐
2)小牛葡萄球菌–硝酸盐进料；从一开始无硝酸盐
3)CS-300
4)NatuRed LT
孵育/发酵
在每一情况中，使四批中的每一批的4种香肠在下列温度下发酵以模拟滚揉过程：
·  4℃
·  12℃
·  18℃
烹饪前的孵育时间
·  7小时
·  12小时
·  24小时
结果
化学分析
对于烹饪前的每一培养物、孵育时间和温度
·分析了总共36个样品(红盖烧杯)
对于烹饪后的每一培养物、孵育时间和温度
·分析了总共36个样品(最终的香肠)
图8。
红色强度的确定
在Konica Minolta比色计中测量样品并且根据L*a*b*颜色系统确定a*值(图9-11)
讨论
数据证实了先前试验的结果(实施例3和4)。小牛葡萄球菌菌株CHCC10896显示在所有测试温度下均比CS-300更有效的硝酸盐至亚硝酸盐的转化并且至少与NatuRed相当。通过小牛葡萄球菌菌株CHCC10896生产的香肠更强的红色也证明了更好的硝酸盐至亚硝酸盐的转化。然而，从发酵开始在分批培养基中存在硝酸盐似乎对硝酸盐转化和红色形成具有负面影响，因为该批次的效率与直到开始进料才存在硝酸盐的批次相比似乎更低。
试验显示通过2-步发酵过程生产的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896的明显优点，所述2-步发酵过程是在分批培养基中不存在硝酸盐的第一有氧阶段和连续进给硝酸盐的第二无氧或限氧阶段。
实施例5：熟火腿应用试验。
与CS-299(Chr.Hansen，Denmark)相比以熟火腿模式测试小牛葡萄球菌菌株CHCC10896，所述CS-299是除CS-300之外最常用于该应用领域的培养物。CS-299仅由一种肉葡萄球菌菌株构成，而CS-300由两种不同的肉葡萄球菌菌株构成。CS-300的细胞计数是CS-299的细胞计数的两倍。
实验
比较通过应用通过2-阶段发酵程序生产的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896生产熟火腿与通过应用CS-299生产熟火腿。小牛葡萄球菌菌株CHCC10896的接种水平对应于CS-299的靶细胞计数(1.5×1012CFU/kg)。
熟火腿
1.在猪腿肌肉(肉核(nut))周围进行切割以便得到瘦肉。
2.通过仅用螺旋钻运行的研磨机(Mado MEW 718)将肉“粉碎”。
3.向肉中加入细菌培养物和盐水。通过滚揉器(Rühle MKR 150)于6℃下滚揉16小时。总共5220圈。以10rpm运行15分钟并静息15分钟。
4.真空装填在PE/PA袋中。
5.模制。
6.在自热箱中通过80℃蒸汽热处理直到中心达到75℃，接着是10分钟的冷淋。
7.在冷却室中于3-4℃下最终冷却。
8.脱模和切割。
100kg肉加15kg盐水(15％)
进行盐水计算以实现：终产品(115kg，无重量损失)中的2％食盐
0.2％   右旋糖
0.3％   二磷酸盐
0.01％  硝酸钾
结果
红色强度的确定
由于熟火腿通常不具有均质表面的事实，所以通过研磨将每一批次的0.5cm薄片均质化。将每一批次的经研磨的材料分层置于培养皿中，得到均质表面用于红色确定。
在Konica Minolta比色计CR-400中测量样品并且根据L*a*b*颜色系统确定a*值(图12)。
此外，目视检查红色强度(图13)。
讨论
根据目视观察和红色强度确定，可以得出以下结论：当在低温(6℃)下滚揉时，与CS-299相比，通过使用2-步发酵程序生产的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896得到更好的颜色。与使用CS-299制备的熟火腿相比，使用以两阶段发酵方法预处理的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896制备的熟火腿具有更强和更亮的红色(图13)。这还可以被测量为使用以两阶段发酵方法预处理的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896制备的熟火腿根据L*a*b*系统的更高a*值(红色强度)(图12)。更强的红色最有可能是因为硝酸盐至亚硝酸盐的更有效转化/还原。
实施例6：在乳化香肠应用中比较根据标准发酵程序发酵的小牛葡萄球菌菌株CHCC11576与根据2-阶段发酵程序发酵的小牛葡萄球菌菌株CHCC11576
为了测试2-阶段发酵程序是否还改进不同的小牛葡萄球菌菌株在低温下将高铁肌红蛋白转化成亚硝酰基肌红蛋白以产生稳定红色的能力，如前文所述根据标准发酵程序并且根据2-阶段发酵程序使小牛葡萄球菌菌株CHCC11576发酵。收获两种发酵的细胞并冷冻干燥。两个批次均通过生产3批乳化香肠用于应用测试中：1批使用通过标准程序发酵的小牛葡萄球菌菌株CHCC11576，1批使用通过在第二阶段内进给硝酸盐的2-阶段发酵所发酵的小牛葡萄球菌菌株CHCC11576，并且1批使用通过标准程序发酵的肉葡萄球菌菌株A。
实验
冷冻干燥颗粒物的细胞计数确定。
通过流式细胞术实施细胞计数确定：
CV：变异系数，SD：标准差。
乳化香肠：
摩泰台拉型香肠–配方(5kg批次)：
摩泰台拉型：
根据前述程序制备摩泰台拉型香肠。
靶细胞计数/接种水平
靶细胞计数＝3.2E12CFU/100kg(包括20％安全界限)
根据相同的靶细胞计数对每一批次进行接种。
批次命名
1)CHCC11576–标准
2)CHCC11576–硝酸盐进料
3)肉葡萄球菌
孵育/发酵
在每一情况中，使三批中的每一批的3种香肠在烹饪前在下列温度下分别发酵20小时、18小时以模拟熟火腿的滚揉过程：
·4℃
·8℃
结果
红色强度的确定
在Konica Minolta比色计中测量样品并且根据L*a*b*颜色系统确定a*值(图14和15)。
此外，目视检查红色强度(图16和17)。
硝酸盐/亚硝酸盐浓度的确定：
将每一批次的样品填充于红盖烧杯中并于4℃和8℃与香肠一起孵育相同的持续时间。在孵育(4℃＝20h；8℃＝18h)后立即将样品储存于-20℃。如AmtlicheSammlung von Untersuchungsverfahren§64Lebensmittel-undFuttermittelgesetzbuch(LFGB；German Food and Feed Act)(L 07.00-60)中所述的对样品中的硝酸盐/亚硝酸盐浓度进行酶法分析并且将结果描绘于图18中。
1)小牛葡萄球菌CHCC11576–标准
2)小牛葡萄球菌CHCC11576–硝酸盐进料
3)肉葡萄球菌
结论：
可以清楚地显示，对小牛葡萄球菌菌株CHCC11576发酵程序的修改使肉应用中的硝酸还原酶活性显著改进。通过在限氧生长阶段期间进给硝酸盐所生产的菌株在4℃和8℃的相对低的温度下导致很好地变红，这是通过红色强度确定和照相文件反映的，所述红色强度确定显示比使用通过标准发酵生产的小牛葡萄球菌CHCC11576或通过标准发酵生产的葡萄球菌属菌株A制备的香肠所量测的a*值显著更高的根据L*a*b*系统的a*值(红色强度)(图14和15)并且所述照相文件显示使用本发明的两阶段发酵方法生产的小牛葡萄球菌CHCC11576制备的香肠的更红着色(图16和17)。此外，可以显示，当根据两阶段发酵程序通过在无氧阶段期间进给硝酸盐来发酵时，小牛葡萄球菌CHCC11576将更多的硝酸盐还原并且产生更多的亚硝酸盐(图18)。在小牛葡萄球菌CHCC111576的情况下，当其经受标准发酵时，在肉样品内不能检测到亚硝酸盐并且硝酸盐浓度显著更高。与标准发酵过程相比，在限氧阶段期间进给硝酸盐存在明显的优点。小牛葡萄球菌CHCC11576的改进与小牛葡萄球菌CHCC10896已经显示的改进相当，因此可以得出以下结论：如前所述通过2-阶段发酵对硝酸还原酶活性的优化并非排他性地针对小牛葡萄球菌CHCC10896，而且也针对不同的菌株，在这种情况下是菌株小牛葡萄球菌CHCC11576。最有可能的是，所述2-阶段发酵还可以实现对葡萄球菌属其它种(诸如肉葡萄球菌)的硝酸还原酶活性的改进。
实施例7：进料发酵和掺料发酵的比较
进行两种发酵，测试是否需要在发酵的第二低通气阶段连续进料，或仅在第二阶段开始时给予一次高浓度硝酸盐掺料在分别改进硝酸还原酶活性和将高铁肌红蛋白有效地转化成亚硝酰基肌红蛋白的能力方面是否同样有效。
两阶段发酵在有氧条件下运行直到溶解氧水平达到0％(pO2＝0)。此时，将通气从6L/min调小至1L/min并且开始硝酸盐进给(约1g/L*h–每10分钟以脉冲进料给予)。持续进料直到培养基中的所有甘油碳源均已耗尽(基本停止)。
对掺料发酵充分通气直到基本停止。在基本停止(EFT:10h)时，将通气调小至1L/min并且向培养基中加入掺料(含有约72g/L甘油和216g/L硝酸钾，这等于发酵罐中的3g/L甘油和9g/L硝酸盐)(掺料的体积是500mL)。将甘油与硝酸盐掺料给予，因为如果没有碳源可利用，则硝酸盐不会被还原成亚硝酸盐。
实验
冷冻干燥颗粒物的细胞计数确定
通过流式细胞术实施细胞计数确定：
CV：变异系数，SD：标准差。
乳化香肠：
摩泰台拉型香肠–配方(5kg批次)：
摩泰台拉型：
根据前述程序制备摩泰台拉型香肠。
靶细胞计数/接种水平
靶细胞计数＝3.2E12CFU/100kg(包括20％安全界限)
根据相同的靶细胞计数对每一批次进行接种。
批次命名
1)CHCC10896–掺料
2)CHCC10896-进料
3)肉葡萄球菌
孵育/发酵
在每一情况中，使三批中的每一批的3种香肠在烹饪前在下列温度下分别发酵20小时、18小时以模拟熟火腿的滚揉过程：
·4℃
·8℃
结果
红色强度的确定
在Konica Minolta比色计中测量样品并且根据L*a*b*颜色系统确定a*值(图19和20)。
此外，目视检查红色强度(图21和22)。
硝酸盐/亚硝酸盐浓度的确定：
将每一批次的样品填充于红盖烧杯中并于4℃和8℃与香肠一起孵育相同的持续时间。在孵育(4℃＝20h；8℃＝18h)后立即将样品储存于-20℃。如AmtlicheSammlung von Untersuchungsverfahren§64Lebensmittel-undFuttermittelgesetzbuch(LFGB；German Food and Feed Act)(L 07.00-60)中所述的对样品中的硝酸盐/亚硝酸盐浓度进行酶法分析并且将结果描绘于图23中。
1)小牛葡萄球菌CHCC10896–掺料
2)小牛葡萄球菌CHCC10896-进料
3)肉葡萄球菌
结论：
可以清楚地显示，与肉葡萄球菌菌株A的标准发酵相比，在所述过程的第二低通气阶段期间连续进给硝酸盐的2-阶段发酵分别显著改进硝酸还原酶活性和将褐色高铁肌红蛋白转化成其红色衍生物亚硝酰基肌红蛋白的能力。当仅在第二阶段开始给予一次高浓度硝酸盐掺料时(掺料发酵)，如通过根据L*a*b*系统的a*值所确定的所得香肠的红色强度高于使用通过标准发酵生产的肉葡萄球菌所制备的香肠的红色强度，但是显著低于使用经受根据本发明的两阶段发酵方法(在两阶段发酵方法的第二阶段期间连续进给硝酸盐)的菌株所制备的香肠的红色强度。照相文件反映了显示使用进料发酵生产的小牛葡萄球菌制备的香肠的这些确定。与之相比，在无氧生长阶段开始进行硝酸盐峰添加的2-阶段发酵没有导致硝酸还原酶活性的任何改进，因为红色强度与使用通过标准发酵所发酵的肉葡萄球菌菌株A所制备的香肠的红色强度相当。这还通过肉样品在孵育后烹饪前其中的硝酸盐和亚硝酸盐浓度来反映。根据2-阶段发酵程序发酵的菌株能够在给定的发酵温度和时间段将硝酸盐还原成亚硝酸盐，而通过掺料发酵所发酵的CHCC10896没有将将硝酸盐显著地还原成亚硝酸盐。
不希望受理论束缚，预期需要连续进给硝酸盐以维持负责硝酸盐还原的nar操纵子的高水平表达。
保藏物与专家解决方案
申请人请求下述保藏的微生物样品仅可供专家可得，直到本专利被授权之日。
小牛葡萄球菌菌株CHCC10896于2012年3月15日保藏于布伦瑞克豪丰大街7B(D-38124)(Inhoffenstr.7B，D-38124Braunschweig)的DSMZ-德国微生物菌种保藏中心GmbH并且被给予保藏号DSM 25789。
小牛葡萄球菌菌株CHCC11576于2013年6月11日保藏于布伦瑞克豪丰大街7B(D-38124)的DSMZ-德国微生物菌种保藏中心GmbH并且被给予保藏号DSM 27311。
根据国际承认用于专利程序目的的微生物保藏布达佩斯条约(Budapesttreaty on the international recognition of the deposit of microorganisms for thepurposes of patent procedure)进行保藏。
参考文献
WO2010/067148
PCT/RO/134表

Claims (15)

1.一种增加具有硝酸还原酶活性的葡萄球菌属(Staphylococcus)菌株的硝酸还原酶活性的方法，其包括以下步骤：
a)在不存在硝酸盐下在有氧条件下使所述菌株发酵；
b)在无氧或限氧条件下同时向发酵培养基中连续进给硝酸盐使所述菌株发酵；和
c)将所述菌株任选地制粒和任选地冷冻干燥。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述具有硝酸还原酶活性的葡萄球菌属菌株是小牛葡萄球菌(Staphylococcus vitulinus)菌株或肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)菌株。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述小牛葡萄球菌菌株选自由以保藏号DSM 25789保藏于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896、以保藏号DSM 27311保藏于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)的小牛葡萄球菌菌株CHCC11576、和从其衍生的突变体组成的组。
4.一种可通过根据权利要求1到3中任一权利要求所述的方法得到的葡萄球菌属菌株，其中所述菌株的所述硝酸还原酶活性不能被改进超过50％。
5.一种小牛葡萄球菌菌株，其选自由以保藏号DSM 25789保藏于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896和从其衍生的突变体组成的组。
6.一种使食品变红的方法，其包括以下步骤：
a)根据权利要求1到3中任一权利要求所述的方法预处理具有硝酸还原酶活性的葡萄球菌属菌株；
b)向肉制品中加入所述预处理的葡萄球菌属菌株；和
c)用所述预处理的葡萄球菌属菌株对所述肉制品进行发酵、熟化或腌制。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述食品是肉制品。
8.根据权利要求6或7中任一权利要求所述的方法，其中所述葡萄球菌属菌株是小牛葡萄球菌菌株或肉葡萄球菌菌株。
9.根据权利要求6到8中任一权利要求所述的方法，其中所述小牛葡萄球菌菌株选自由以保藏号DSM 25789保藏于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896、以保藏号DSM 27311保藏于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)的小牛葡萄球菌菌株CHCC11576、和从其衍生的突变体组成的组。
10.一种包含葡萄球菌属菌株的食品，所述葡萄球菌属菌株可通过根据权利要求1到3中任一权利要求所述的方法得到。
11.根据权利要求10所述的食品，其中所述食品是肉制品。
12.根据权利要求11所述的肉制品，其中所述肉制品是摩泰台拉型香肠并且其中所述摩泰台拉型香肠具有根据L*a*b*系统至少14的红色强度(a*值)。
13.根据权利要求11所述的肉制品，其中所述肉制品是熟火腿并且其中所述熟火腿具有根据L*a*b*系统至少10的红色强度(a*值)。
14.可通过根据权利要求1到3中任一权利要求所述方法得到的葡萄球菌属菌株用于使食品变红的用途。
15.一种食品，其可通过根据权利要求6到9中任一权利要求所述的方法或通过根据权利要求14所述的用途得到。
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