CN104459129A - 一种鉴别活动性与潜伏性结核分枝杆菌感染的诊断试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种利用细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4，CTLA-4)作为诊断标记物鉴别活动性结核分枝杆菌感染与潜伏性结核分枝杆菌感染的诊断试剂盒以及使用该诊断试剂盒鉴别结核分枝杆菌活动性与潜伏性感染的方法。所述诊断试剂盒包括CTLA-4、CD3、CD4、CD25、FoxP3荧光抗体，以及红细胞裂解液、破膜液、洗涤缓冲液、磷酸盐缓冲液、胎牛血清、固定液和流式管。采用本发明检测患者外周静脉血CTLA-4的表达量，可用于活动性结核分枝杆菌感染与潜伏感染的鉴别诊断，而且有较高的敏感性和准确度，可提为临床鉴别诊断提供有力依据。

Description

一种鉴别活动性与潜伏性结核分枝杆菌感染的诊断试剂盒

技术领域

本发明涉及生物医疗领域，尤其涉及一种利用CD4+CD25+FoxP3+T细胞的细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4，CTLA-4)鉴别活动性与潜伏性结核分枝杆菌感染的诊断试剂盒以及使用该诊断试剂盒鉴别活动性与潜伏性结核分枝杆菌感染的方法。

背景技术

结核病是严重危害人类健康的感染性疾病，是目前世界上死亡率最高的慢性传染病。上个世纪80年代人们曾经一度认为已控制了这种疾病，但近年来结核病的发病及死亡率呈上升趋势，据世界卫生组织结核病最新报告中显示：目前全球平均患病人数为1400万人，有880万新发活动性结核病患者，2010年平均有110万HIV阴性人口死于结核病，平均有35万人口死于HIV合并结核病；一个具有传染性的结核病患者每年可致10-15人感染结核分枝杆菌。结核仍然是日前威胁人类三大感染性疾病之一，是仅次于艾滋病的第一人致死性感染性疾病。因此，结核病对全人类的生命健康威胁仍然十分严峻。我国是个结核病高发国家，结核病长期危害着我国人民健康，同时HIV感染的快速增长使我国结核病的控制面临着巨大的挑战。

结核分枝杆菌是一种胞内需氧致病菌，通常先由呼吸道进入人体，然后通过淋巴管或血液播散到其他部位，淋巴细胞、巨噬细胞大量流向感染病灶部位形成肉芽肿，细菌在巨噬细胞内不断生长直至巨噬细胞死亡，细菌重新释放至感染病灶。在这一过程中结核分枝杆菌与机体免疫细胞相互作用主要发生在天然免疫和获得性免疫应答两个方面，而通常会出现三种结局：天然免疫系统清除结核菌、结核分枝杆菌在宿主体内大量增殖导致活动性结核(Active tuberculosis，ATB)或者结核分枝杆菌以静止状态长期存活于肉芽肿和巨噬细胞内其长期被宿主免疫反应所控制，但又不被清除，从而导致潜伏性结核分枝杆菌感染(Latenttuberculosis infection，LTBI)状态。保守估计全球约有三分之一约20亿人口是潜伏性结核感染，这部分患者终身发展为活动性结核几率为5-10％。

目前活动性结核的诊断主要包结核菌素皮试(TST)痰细菌学检查(抗酸染色涂片和结核分枝杆菌培养)、组织病理活检等。但上述检查方法的特异性和敏感性均较低。近年来，IFN-γ释放实验(IGRAs)被认为是结核病诊断方面的一个重大突破。QuantiFERON TB Gold In-Tube test(QFT-GIT)应用酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay，ELISA)的方法来检测受试者外周血淋巴细胞受结核分枝杆菌特异性抗原刺激后所释放的IFN-γ，它所使用的结核分枝杆菌抗原为RD1区的ESAT-6,CFP-10和RD11区的TB7.7(Rv2654)，这些抗原均为结核分枝杆菌所特有，与BCG不存在交叉反应。QFT-GIT试验已于2007年10月获美国FDA批准用于临床检测结核感染，并在美国疾病控制预防中心(CDC)的最新指南中被推荐作为一种替代TST的检测方法。

我国为结核病高发区，据报道潜伏结核分枝杆菌感染患者占人群比例为15-30％，而IFN-γ释放实验(IGRAs)无法鉴别活动性与潜伏性结核分枝杆菌感染，无法满足临床需要，目前临床缺乏鉴别诊断手段；因此开发鉴别诊断标记物非常必要。多项研究表明，多种T细胞亚群参及细胞因子与结核获得性免疫反应，如CD4+T细胞、CD8+T细胞、Vγ2Vδ2+T细胞和Treg细胞等。但到目前为止，鉴别活动性与潜伏性结核分枝杆菌感染相关生物学标记物及方法仍在探索之中。

CTLA-4是免疫球蛋白超家族的糖蛋白，也是T淋巴细胞表面重要的协同刺激分子受体，为T细胞的活化提供第二信号，阻断协同刺激通路。CTLA-4是B7/CD28家族成员，主要表达于激活的T细胞和调节性T细胞。CTLA-4为CD28的分子拮抗剂，与CD28共同表达在激活的T细胞上，二者结合的抗原提呈细胞(APC)配体相同，均为B7(CD80/86)，CTLA-4通过竞争性与B7分子的结合来阻止共刺激信号的传递，抑制抗原特异性T淋巴细胞的增殖活化，从而起到抑制免疫反应及诱导免疫耐受的作用。CTLA-4在自身免疫性疾病作用已得到证实，其多态性与多种自身免疫性疾病的易感性相关，包括糖尿病、甲状腺炎、多发性硬化等。CTLA-4分子参与活动性结核的免疫应答反应，CTLA-4分子在T细胞中的表达情况及其基因多态性在活动性结核分枝杆菌感染与健康人群中的差别有相关研究，但在活动性与潜伏性结核分枝杆菌感染人群中国内外无相关研究。

发明内容

本发明为解决现有技术中的上述问题提出的，其目的是提供一种利用CTLA-4鉴别活动性与潜伏性结核分枝杆菌感染诊断试剂盒以及使用该诊断试剂盒鉴别活动性与潜伏性结核分枝杆菌感染方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种利用CTLA-4鉴别活动性与潜伏性结核分枝杆菌感染诊断试剂盒，其特征在于，该诊断试剂盒包括CTLA-4、CD3、CD4、CD25、FoxP3荧光抗体及同型对照抗体，以作为鉴别活动性与潜伏性结核分枝杆菌感染的诊断标记物。

优选地，所述诊断试剂盒还包括红细胞裂解液、破膜液、洗涤缓冲液、固定液和流式管等。

优选地，所述缓冲液胎牛血清、磷酸盐缓冲液、福尔马林、小牛血清白蛋白、EDTA、碳酸氢钠、氯化铵中的一种或几种。

优选地，所述红细胞裂解液包括EDTA、碳酸氢钠、氯化铵中的一种或几种；所述洗涤缓冲液为磷酸盐、胎牛血清一种或几种；所述洗涤缓冲液包括磷酸盐、、胎牛血清、蒸馏水中的一种或几种。

优选地，所述诊断试剂盒还包括流式染色管。

一种应用如上述诊断试剂盒鉴别活动性与潜伏性结核分枝杆菌感染的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

步骤(1)、采集患者外周静脉血：无菌条件下用EDTA抗凝采血管，采集2ml外周静脉血；

步骤(2)、外周静脉血中CTLA-4的检测：用如权利要求1、2所述的CTLA-4、CD3、CD4、CD25、FoxP3流式荧光抗体及同型对照抗体，检测患者外周静脉血中CTLA-4表达量。

优选地，所述步骤(2)中检测患者外周静脉血中CTLA-4表达量包括以下步骤：

1.每例检测样本设同型对照，空白对照(Blank)和缺失对照；

2.检测样本时设检测荧光标记的单染对照管；

3.外周静脉血用红细胞裂解液裂解红细胞后，加入荧光抗体进行染色；

4.包括CD3、CD4、CD25三种抗体的表面染色荧光抗体在破细胞膜前进行染色；

5.应用专用流式细胞仪分析软件分析CTLA-4表达量，在CD3、CD4、CD25和FoxP3阳性门(Gate)下进行分析比较。

优选地，以CTLA-4≥10.76-13.25％区间结果判断为活动性结核分枝杆菌感染，以CTLA-4＜10.76-13.25％区间结果判断为潜伏性结核分枝杆菌感染，在本实施例的65例样本中，使用该判定方法判断活动性结核分枝杆菌感染的敏感性为87.5--100.0％，特异性为88.0-100.0％。

更优选地，以CTLA-4检测值为11.36％为诊断界值，以CTLA-4≥11.36％结果判断为活动性结核分枝杆菌感染，以IL-31＜11.36％结果判断为潜伏性结核分枝杆菌感染，在本实施例的65例样本中，使用该判定方法判断活动性结核分枝杆菌感染的敏感性为97.5％，特异性为92.0％。

一种使用上述方法利用CTLA-4鉴别活动性与潜伏性结核分枝杆菌感染诊断试剂盒，其特征在于，该诊断试剂盒包括CTLA-4、CD3、CD4、CD25、FoxP3荧光抗体；红细胞裂解液、破膜液、permwash、洗涤缓冲液和流式管等。

本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

1)采用本发明检测患者外周静脉血中CTLA-4表达量，可用于活动性结核分枝杆菌感染诊断；

2)采用本发明检测患者外周静脉血中CTLA-4表达量，活动性结核的诊断有较高的敏感性和准确度；

3)采用本发明检测患者外周静脉血中CTLA-4表达量，操作快速、合理可行，可以提高活动性结核分枝杆菌感染的诊断效率；

4)采用本发明检测患者外周静脉血中CTLA-4表达量，可用于活动性与潜伏性结核分枝杆菌感染的鉴别诊断。

附图说明

图1：患者外周静脉血CD4+CD25+FoxP3+TregCTLA-4表达情况流式图；

图2：活动性与潜伏性结核分枝杆菌感染外周静脉血中CD4+CD25+FoxP3+T细胞上CTLA-4量的统计结果图；

图3：以CTLA-4的表达水平作为诊断活动性结核分枝杆菌感染的ROC曲线。

具体实施方式

本发明提供了一种利用CTLA-4鉴别活动性与潜伏性结核分枝杆菌感染诊断试剂盒以及使用该诊断试剂盒鉴别活动性与潜伏性结核分枝杆菌感染的方法。

下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

本实施例中，提供鉴别活动性与潜伏性结核分枝杆菌感染的诊断试剂盒，该诊断试剂盒包括CTLA-4、CD3、CD4、CD25、FoxP3荧光抗体；红细胞裂解液、破膜液、permwash、洗涤缓冲液和流式管等。

本实施例中，使用上述诊断试剂盒鉴别标记物鉴别活动性与潜伏性结核分枝杆菌感染的方法，该方法包括如下步骤：

步骤1、采集外周静脉血：

采集包括活动性与潜伏性结核分枝杆菌感染患者外周静脉血：

1.1活动性结核感染组(ATB组)：总计入选活动性结核40例，其中包括活动性肺结核23例，结核性胸膜炎17例，活动性结核入选标准分别如下：

·活动性肺结核组入选标准：

1)2次痰涂片抗酸杆菌阳性和/或痰培养分枝杆菌阳性；

2)胸部X线片有活动性肺结核征象

3)有持续低热、盗汗、乏力、咳嗽、咳痰、血痰或咯血、胸闷、气短、胸痛等临床表现；

本部分研究入选所有肺结核患者均同时合上述3个条件，同时HIV抗体阴性，排除肿瘤、自身免疫性疾病及其他慢性感染(如慢性HBV/HCV感染等)。年龄超过18岁，且尚未接受抗结核治疗或抗结核治疗小于1周者。

·结核性胸膜炎组入选标准：

1)胸腔积液为渗出液，普通细菌培养阴性，结核杆菌培养阳性或胸腔积液涂片抗酸杆菌阳性或痰培养/涂片抗酸杆菌阳性；

2)胸膜组织病理学检查符合结核；

3)符合结核性胸腔积液的临床表现：低热，盗汗，乏力，胸闷，渗出性胸腔积液等且抗结核治疗有效者，同时IGRAs阳性；

符合1，2两项这任意一项者为确诊结核性胸膜炎患者，符合第3项者为临床诊断结核性胸膜炎患者。所有患者为HIV阴性，未接受抗结核治疗或治疗小于1周者。

1.2潜伏性结核感染组(LTBI组)：本组总计入选患者25例，入选标准为：无任何活动性结核感染临床证据，但γ干扰素释放试验(IGRAs)检测为阳性结果者入选为潜伏性结核感染组LTB组。同时HIV抗体阴性，排除肿瘤、自身免疫性疾病及其他慢性感染(如慢性HBV/HCV感染等)。

无菌条件下应用EDTA抗凝采血管采集外周静脉血2ml，采集血液时应轻轻摇匀，避免凝血4小时之内进行流式染色。

步骤2、患者外周静脉血中CTLA-4表达量检测：

本实施例提供的诊断试剂盒是应用全血流式细胞表面及细胞内染色方法，检测人外周静脉血中CTLA-4表达量，其它类型标本包括血浆、血清、细胞培养上清和脑脊液等并不推荐应用该试剂盒。

步骤2.1、检测前准备：

(a).诊断试剂盒保存在2-8℃，使用将红细胞裂解液、洗涤液试剂平衡至室温；

(b).将流式染色管标管，包括空白管、单染管、缺失对照管、同型对照管及实验管；

(c).洗涤缓冲液A配制：950ml 1×PBS中加入50ml胎牛血清，以0.45μmStericup抽滤，使用前新鲜配制；

(d).洗涤缓冲液B配制：900ml ddH2O中加入100ml 10×洗涤缓冲液2，以0.45μm Stericup抽滤

(e).固定液配制800ml 1×PBS中加入200ml 10％Buffered Formalin，以0.45μm Stericup抽滤

步骤2.2、CTLA-4表达情况检测：

1)标管，染色组合如下：

·CD3-PECy-7/CD4-FITC/C25-PE/Foxp3-APC/CTLA-4-Pacific Blue；

·CD3-PECy-7/CD4-FITC/C25-PE/Foxp3-APC/CTLA-4-Pacific Blue同型对照

·缺失对照组CD3-PECy-7/CD4-FITC/C25-PE/Foxp3-APC；

·PECy-7、APC、Pacific Blue、FITC、PE各单色对照管；

·Unstained空白对照管；

2)各管选取入选者肝素抗凝血100μl，加入红细胞裂解液2ml，室温孵育10-15分钟破红，直至液体澄清；

3)1500rpm离心5分钟，弃上清，留细胞沉淀，涡旋震荡仪或轻轻拍打混匀，加入洗涤缓冲液A 2ml洗涤一次(1500rpm水平离心5分钟)，弃上清，留细胞沉淀，涡旋振荡仪轻轻拍打混匀，加入洗涤缓冲液A 1ml再洗涤一次(同前)；

4)组合中加入CD3-PECy-72.5μl、CD4-FITC 2.5μl、CD25-PE 5μl混匀，室温避光孵育10分钟；

5)每管加入2ml洗涤缓冲液A洗涤一次(1500rpm水平离心5分钟)，弃上清，留细胞沉淀，涡旋振荡仪轻轻拍打混匀；加入洗涤缓冲液A 1ml再洗涤一次(同前)；

6)每管加入破膜液1ml，置4℃冰箱避光孵育45分钟；

7)每管加入稀释的洗涤缓冲液B 1ml，洗2次(1500rpm水平离心5分钟)，弃上清，留细胞沉淀，涡旋振荡仪轻轻拍打混匀；

8)每管加入CD152(CTLA-4)-Biotinylated 10μl或同型对照10μl，混匀，置4℃冰箱避光孵育45分钟；(注：缺失对照组不加入上述抗体)

9)每管加入稀释的洗涤缓冲液B 1ml，洗2次(1500rpm水平离心5分钟)，弃上清，留细胞沉淀，涡旋振荡仪轻轻拍打混匀；

10)每管加入Streptavidin-Pacific Blue 1μl，Foxp3-APC抗体5μl，混匀，置4℃冰箱避光孵育45分钟；

11)每管加入稀释的洗涤缓冲液B 1ml，洗2次(1500rpm水平离心5分钟)，弃上清，留细胞沉淀，涡旋振荡仪轻轻拍打混匀；

12)每管加入200μl固定液固定细胞，加盖，4℃避光保存待检测；

13)流式细胞仪检测及数据分析：

将全血细胞染色后样品在流式细胞仪上进行CD4+CD25+T细胞、CD4+CD25+Foxp3+T细胞和CD4+CD25+Foxp3+CTLA-4+T细胞的检测。所得数据以FCS Express V3软件进行分析，CD3+CD4+CD25+Foxp3+CTLA-4+T细胞的组成比例。

步骤3、诊断结果的判定：

本实施提供了一种独立的诊断判定方法，根据患者外周静脉血中CTLA-4的表达水平活动性与潜伏性结核分枝杆菌感染进行鉴别诊断。

分别以CTLA-4≥10.76-13.25％区间结果判断为活动性结核分枝杆菌感染，以CTLA-4＜10.76-13.25％区间结果判断为潜伏性结核分枝杆菌感染。在本实施例的65例样本中，使用该判定方法判断活动性结核分枝杆菌感染的敏感性为87.5--100.0％，特异性为88.0-100.0％。

优化的以CTLA-4检测值为11.36％为诊断界值，以CTLA-4≥11.36％结果判断为活动性结核分枝杆菌感染，以CTLA-4＜11.36％结果判断为潜伏性结核分枝杆菌感染。在本实施例的65例样本中，使用该判定方法判断活动性结核分枝杆菌感染的敏感性为97.5％，特异性为92.0％。

本实施例的65例外周血样本通过流式软件数据分析计算出的CTLA-4表达量的检测值绘制在图2中，所示横坐标为分组，纵坐标为CTLA-4表达量(％)。其中ATB(Active tuberculous)表示活动性结核分枝杆菌感染，共40例；LTBI(latent tuberculosis infection)表示潜伏性结核分枝杆菌感染，共25例；短线代表中位数，两组比较P＜0.0001，差别具有统计学意义。

图3为CTLA-4作为活动性结核分枝杆菌感染诊断的ROC曲线，横坐标为特异性，纵坐标为敏感性，AUC＝99.1％；其中，ROC表示受试者工作曲线，AUC表示曲线下面积。

采用本发明检测患者外周血中CTLA-4表达量，可用于活动性与潜伏性结核分枝杆菌感染的鉴别诊断，而且有较高的敏感性和准确度，同时操作快速，可提活动性结核分枝杆菌感染的诊断效率。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种利用CTLA-4鉴别活动性结核分枝杆菌感染与潜伏性结核分枝杆菌感染的诊断试剂盒，其特征在于，该诊断试剂盒至少包括CTLA-4荧光检测抗体，作为鉴别结核分枝杆菌活动性与潜伏性感染诊断标记物。

2.根据权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒还包括红细胞裂解液、磷酸缓冲液、破膜液、permwash缓冲液中的一种或几种，以及CD3、CD4、CD25、FoxP3荧光抗体及同型对照抗体。

3.根据权利要求2所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述红细胞裂解液和缓冲液包括胎牛血清、磷酸盐缓冲液、福尔马林、小牛血清白蛋白、EDTA、碳酸氢钠氯化铵中的一种或几种。

4.根据权利要求2所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断标记物为流式荧光标记物抗体。

5.根据权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒还包括固流式离心管。

6.一种应用如权利要求1-5任意一项所述的诊断试剂盒鉴别结核分枝杆菌活动性与潜伏性感染的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

步骤(1)、采集患者外周静脉血：无菌条件下用EDTA抗凝采血管，采集2ml外周静脉血；

步骤(2)、外周静脉血中CTLA-4的检测：用如权利要求1、2所述的CTLA-4、CD3、CD4、CD25、FoxP3流式荧光抗体及同型对照抗体，检测患者外周静脉血中CTLA-4表达量。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中检测患者外周静脉血中CTLA-4表达量包括以下步骤：

步骤(2.1)、每例检测样本设同型对照，空白对照(Blank)和缺失对照；

步骤(2.2)、检测样本时设检测荧光标记的单染对照管；

步骤(2.3)、外周静脉血用红细胞裂解液裂解红细胞后，加入荧光抗体进行染色；

步骤(2.4)、包括CD3、CD4、CD25三种抗体的表面染色荧光抗体在破细胞膜前进行染色；

步骤(2.5)、应用专用流式细胞仪分析软件分析CTLA-4表达量，在CD3、CD4、CD25和FoxP3阳性门下进行分析比较。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，

以CTLA-4≥10.76-13.25％区间结果判断为活动性结核分枝杆菌感染，以CTLA-4＜10.76-13.25％区间结果判断为潜伏性结核分枝杆菌感染。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，判断活动性结核分枝杆菌感染的敏感性为87.5--100.0％，特异性为88.0-100.0％。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，

以CTLA-4检测值为11.36％为诊断界值，以CTLA-4≥11.36％结果判断为活动性结核分枝杆菌感染，以IL-31＜11.36％结果判断为潜伏性结核分枝杆菌感染，使用该判定方法判断活动性结核分枝杆菌感染的敏感性为97.5％，特异性为92.0％。