CN104434808A - 一种治疗性纳米粒子及其制备方法 - Google Patents
一种治疗性纳米粒子及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本公开提供一种治疗性纳米粒子及其制备方法。本公开的治疗性纳米粒子包含活性成分和人血清白蛋白，其中治疗性纳米粒子中人血清白蛋白和活性成分的重量比为0.01∶1至1∶1。本公开还提供一种药物组合物，含有上述的治疗性纳米粒子。本公开还提供一种制备上述治疗性纳米粒子和组合物的方法。
Description
技术领域
本公开涉及制药领域，更具体而言涉及一种含人血清白蛋白与疏水性药物的纳米粒子及其制备方法，特别是涉及特定物理属性药物的白蛋白纳米粒子及其制备方法。
背景技术
紫杉醇作为一种抗癌药物，属有丝分裂的微管抑制剂，其具有聚合和稳定细胞内微管的作用。有丝分裂阶段，紫杉醇使微管不能分开，从而将细胞阻断于细胞周期G2与M期。因此，紫杉醇致使快速分裂的肿瘤细胞被固定在有丝分裂阶段，使细胞复制受阻断而死亡。紫杉醇对多种癌症(例如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、膀胱癌等)具有重要的临床活性。
然而，由于水溶性较差，紫杉醇在人体的用药上遇到了困境。为了使紫杉醇适宜静脉内注射，百时美施贵宝(Bristol-Myers Squibb，BMS)开发了在其中表面活性剂聚氧乙烯蓖麻油(EL)和无水乙醇共同作为溶剂以增大紫杉醇的溶解度。泰素对卵巢癌、乳腺癌、肺癌、食管癌和头颈癌具有显著活性。然而，已经显示出泰素能够诱导与给药有关的毒性，以及显著的急性和累积毒性，如骨髓抑制、中性粒细胞减少性发热、过敏反应等。这些副作用与所用的表面活性剂聚氧乙烯蓖麻油有关(Anantbhushan等人，Asia Pac J Clin Oncol.2013；9：176-181)。根据临床研究报告及上市后安全性资料，泰素过敏反应的总体发生率约为39％。目前在使用泰素时，需预先给与患者抗组胺药和类固醇类激素以减弱表面活性剂引起的副作用。
也有研究人员为了改进紫杉醇的水溶解度，使用能够赋予较高水溶解度的官能团对其结构进行修饰，例如磺化衍生物(Kingston et al.，U.S.Patent 5059699(1991))和氨基酸酯衍生物(Mathew et al.，J.Med.Chem.35：145-151(1992))显示出明显的生物活性。然而，这种修饰会增加药物制剂成本，并且可能诱发不需要的副反应或降低药物疗效。
为了避免上述紫杉醇药物制剂使用中的各种不利影响，维沃RX药物公司(Vivorx Pharmaceuticals，Inc.)于1997年提交的中国专利申请CN1237901A，公开了一种含有水不溶性药理活性物质(如紫杉醇)的药物输送体系。这一体系中不含有乳化剂或增溶剂，因此可以避免由乳化剂或增溶剂而引起过敏反应。在这一药物输送体系中，水不溶性药理活性物质能够以微米颗粒或纳米颗粒输送。该输送体系中，含有药理活性物质和白蛋白。白蛋白出现在胶体药物颗粒表面(在除去有机溶剂时形成)上，由于电排斥和空间稳定的合并作用，促进了能长时间稳定的胶体分散体的形成。在这一药物输送体系中，一部分药理活性物质分子与蛋白质(例如，人血清白蛋白)结合形成复合物。其他部分的药理活性物质包含在蛋白质包裹的纳米颗粒内。该专利申请还公开了能在生理盐水中容易重组的粉末形式亚微米颗粒。这种粉末是在除去水分后经冷冻干燥得到的。
阿布拉西斯生物科学有限责任公司(Abraxis Bioscience，LLC.)在Vivorx Pharmaceuticals，Inc.的研发成果基础之上，于2006年提交了美国专利US7820788。US7820788公开了一种含有活性成分和药学可接受的载体的药物组合物，其中药学可接受的载体包括白蛋白。US7820788进一步明确了组合物中白蛋白和活性成分的比率。白蛋白和活性成分的比率(w/w)为0.01∶1至约100∶1；更优选地，比率为0.02∶1至约40∶1。通常二者的比率为约18∶1或更小。更优选地，比率为约0.2∶1至约12∶1，最优选地，比率为约1∶1至约9∶1。该专利还进一步具体公开了一种含有紫杉醇和药学可接受的载体的注射用药物组合物，其中药学可接受的载体包括白蛋白，白蛋白和紫杉醇形成粒子，粒径小于200nm，白蛋白和紫杉醇的比率(w/w)为1∶1至9∶1。
Abraxis Bioscience，LLC.还申请了多件相关美国专利，其中US7923536公开了以US7820788所保护的药物组合物治疗癌症的方法；US8314156公开了以US7820788所保护的药物组合物用于治疗肺癌和胰腺癌的方法。
人血清白蛋白(HSA)是高度可溶的球蛋白，由585个氨基酸组成。HSA是血浆中最丰富的蛋白质，并且占人血浆胶体渗透压的70-80％。HSA的氨基酸序列包含总共17个二硫键和一个游离的巯基。静脉内施用HSA溶液已经用于预防和治疗低血容量性休克。HSA具有多个疏水结合位点，这些位点可结合各种各样的药物，特别是中性或带负电的疏水化合物。
目前FDA批准上市销售的紫杉醇白蛋白纳米粒制剂就是Abraxis Bioscience，LLC.的产品，其每个单剂量产品中含有紫杉醇100mg和人血清白蛋白900mg。是一种无菌冻干粉末，不含任何溶剂，使用时以20ml生理盐水进行重组(re-constitution)。
在临床应用中可以避免EL引起的不良反应，从而可以使给药剂量由175mg/m2提高到260mg/m2。并且，由于给药剂量的提高，对肿瘤的治疗效果显著提高。在用紫杉醇注射液进行的两项随机对照临床研究中，在注射紫杉醇(白蛋白结合型)的欧美患者组中，确认的疗效为21.5％(95％可信区间：16.2％至26.7％)，而紫杉醇注射液组确认的疗效为11.1％(95％可信区间：6.9％至15.1％)；注射紫杉醇(白蛋白结合型)的中国患者组中确认的疗效为54％(95％可信区间：44.3％至63.4％)，紫杉醇注射液组确认的疗效为29％(95％可信区间：20.6％至37.9％)(参见说明书)。美国和欧盟的药品监管机构已经批准其用于治疗乳腺癌、胰腺癌和非小细胞肺癌，另有黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌等处于临床研究阶段。
虽然具有上述优势，但其仍有很多不足之处：
首先，其大量使用人血清白蛋白。已有初步研究表明，不同人种甚至不同个体的白蛋白可能有差异，这种差异不是来自于白蛋白一级结构(氨基酸顺序)的差异，而是来自白蛋白表达后修饰的差异。因此含大量白蛋白的制剂可能造成特定群体出现过敏反应。这与EL引起的过敏反应不同，是由同种异体白蛋白引起的。
其次，目前人血清白蛋白的来源仍是人类的血液，尚无基因工程的产品上市。由于血液采集、储存等过程中可能存在污染，使得血液制品的安全性存在隐患。因此，亦不希望在紫杉醇白蛋白制剂中过多使用人血清白蛋白。
第三，白蛋白价格高昂，在中国约为600元/10g，在制剂中大量使用白蛋白，会造成产品成本增加。对于一个患者而言，按照紫杉醇260mg/m2的剂量给药，每次治疗需要5-6g白蛋白，6个疗程的治疗则需要30-36g白蛋白。在没有需要的情况下，额外增加了约2000元的白蛋白费用，这也是一种浪费。
第四，很多疾病需要使用白蛋白进行治疗，然而中国很多地区的医院都面临人血清白蛋白短缺的窘境。在紫杉醇制剂中大量使用白蛋白造成对医疗资源的抢夺，不利于公众健康。
发明内容
本公开的一些实施方式提供了一种治疗性纳米粒子，其包含活性成分和人血清白蛋白或由其组成。在一些实施方式中，在治疗性纳米粒子的制备过程中，除去有机溶剂时，使得白蛋白出现在治疗性纳米粒子的表面。因此，在一些具体的实施方式中，活性成分包裹在人血清白蛋白内。
在一些实施方式中，治疗性纳米粒子中人血清白蛋白和活性成分的重量比选自0.01∶1、0.02∶1、0.04∶1、0.05∶1、0.06∶1、0.07∶1、0.08∶1、0.09∶1、0.10∶1、0.11∶1、0.12∶1、0.13∶1、0.14∶1、0.15∶1、0.16∶1、0.17∶1、0.18∶1、0.19∶1、0.2∶1、0.21∶1、0.22∶1、0.23∶1、0.24∶1、0.25∶1、0.26∶1、0.27∶1、0.28∶1、0.29∶1、0.3∶1、0.31∶1、0.32∶1、0.33∶1、0.34∶1、0.35∶1、0.36∶1、0.37∶1、0.38∶1、0.39∶1、0.4∶1、0.41∶1、0.42∶1、0.43∶1、0.44∶1、0.45∶1、0.46∶1、0.47∶1、0.48∶1、0.49∶1、0.5∶1、0.51∶1、0.52∶1、0.53∶1、0.54∶1、0.55∶1、0.56∶1、0.57∶1、0.58∶1、0.59∶1、0.6∶1、0.65∶1、0.70∶1、0.75∶1、0.8∶1、0.85∶1、0.9∶1、0.95∶1、1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1、3.5∶1、4∶1、4.5∶1、5∶1、5.5∶1、6∶1、6.5∶1、7∶1、7.5∶1、8∶1、8.5∶1或上述任意两个比例之间的范围。在一些具体的实施方式中，人血清白蛋白和活性成分的重量比选自0.03∶1、0.04∶1、0.05∶1、0.06∶1、0.07∶1、0.08∶1、0.09∶1、0.10∶1、0.11∶1、0.12∶1、0.13∶1、0.14∶1、0.15∶1、0.16∶1、0.17∶1、0.18∶1、0.19∶1、0.2∶1、0.21∶1、0.22∶1、0.23∶1、0.24∶1、0.25∶1、0.26∶1、0.27∶1、0.28∶1、0.29∶1、0.3∶1、0.31∶1、0.32∶1、0.33∶1、0.34∶1、0.35∶1、0.36∶1、0.37∶1、0.38∶1、0.39∶1、0.4∶1、0.41∶1、0.42∶1、0.43∶1、0.44∶1、0.45∶1、0.46∶1、0.47∶1、0.48∶1、0.49∶1、0.5∶1、0.6∶1、0.7∶1、0.8∶1、0.9∶1或上述任意两个比例之间的范围，例如0.03∶1至0.19∶1、0.21∶1至0.9∶1。更具体地，人血清白蛋白和活性成分的重量比是0.043∶1、0.071∶1、0.13∶1、0.15∶1、0.16∶1、0.17∶1、0.18∶1、0.24∶1、或0.57∶1、或上述任意两个比例之间的范围，例如0.043∶1至0.071∶1、0.043∶1至0.13∶1、0.043∶1至、0.043∶1至0.15∶1、0.043∶1至0.16∶1、0.043∶1至0.17∶1、0.043∶1至0.18∶1、0.043∶1至0.24∶1、0.043∶1至0.57∶1、0.071∶1至0.13∶1、0.071∶1至0.15∶1、0.071∶1至0.16∶1、0.071∶1至0.17∶1、0.071∶1至0.18∶1、0.071∶1至0.24∶1、0.071∶1至0.57∶1、0.13∶1至0.15∶1、0.13∶1至0.16∶1、0.13∶1至0.17∶1、0.13∶1至0.18∶1、0.13∶1至0.24∶1、0.13∶1至0.57∶1、0.15∶1至0.16∶1、0.15∶1至0.17∶1、0.15∶1至0.18∶1、0.15∶1至0.24∶1、0.15∶1至0.57∶1、0.16∶1至0.17∶1、0.16∶1至0.18∶1、0.16∶1至0.24∶1、0.16∶1至0.57∶1、0.17∶1至0.18∶1、0.17∶1至0.24∶1、0.17∶1至0.57∶1、0.18∶1至0.24∶1、0.18∶1至0.57∶1或者0.24∶1至0.57∶1。
在一些实施方式中，适于被包裹在人血清白蛋白中的活性成分应具有以下特性：水中不溶或微溶、在特定有机溶剂中可溶或易溶，其中特定有机溶剂为：水中溶解度低、沸点低的纯溶剂或者其与乙醇、叔丁醇、异丙醇等小分子醇类的混合溶剂，包括但不限于三氯甲烷、二氯甲烷等。尤其适用于本公开的活性成分是紫杉烷类药物，其包括但不限于紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛、多西他赛亲脂衍生物；大环内酯类药物，其包括但不限于雷帕霉素及其衍生物、埃博霉素B及其衍生物，坦螺旋霉素及其衍生物等；喜树碱类药物，其包括但不限于10-羟基喜树碱、SN38及其衍生物等；蒽环类药物，其包括但不限于阿柔比星、吡柔比星等；以及其他活性成分包括秋水仙碱及其衍生物、硫代秋水仙碱二聚体、胺碘达隆、碘塞罗宁、环孢菌素、依西美坦、氟他胺、氟维司群、罗米地辛、司莫司汀、长春碱、布洛芬等等。在一些实施方式中，活性成分选自紫杉醇和多西他赛中的一种或多种，在另一些实施方式中，活性成分是多西他赛、雷帕霉素及其衍生物、依西美坦、氟他胺、氟维司群等。
在一些实施方式中，治疗性纳米粒子的平均粒径选自30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、165、170、175、180、185、190、195、200nm、或上述任意两个数值之间的范围。技术人员理解，可以使用任何现有的或未来适当方法测量粒子的粒径，包括但不限于沉降法、筛分法、显微镜观察、或激光粒度测量仪。还应当理解的是，当本公开的治疗性纳米粒子是多个时，并非每一个治疗性纳米粒子的粒径都是一致的，只要其平均粒径满足上述限定，也包含在本公开所涵盖的范围内。在一些具体的实施方式中，粒径是采用激光粒度测定仪确定的；治疗性纳米粒子的平均粒径在选自50、60、70、80、90、100、110、120、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160nm、或上述任意两个数值之间的范围。
在一个具体的实施方式中，提供了一种治疗性纳米粒子，其包含紫杉醇和人血清白蛋白，紫杉醇包裹在人血清白蛋白内；人血清白蛋白和紫杉醇的重量为0.043∶1，治疗性纳米粒子的平均粒径为140nm。
在另一个具体的实施方式中，提供了一种治疗性纳米粒子，其包含紫杉醇和人血清白蛋白，紫杉醇包裹在人血清白蛋白内；人血清白蛋白和紫杉醇的重量为0.071∶1，治疗性纳米粒子的平均粒径为134nm。
在另一个具体的实施方式中，提供了一种治疗性纳米粒子，其包含紫杉醇和人血清白蛋白，紫杉醇包裹在人血清白蛋白内；人血清白蛋白和紫杉醇的重量为0.13∶1，治疗性纳米粒子的平均粒径为125nm。
在另一个具体的实施方式中，提供了一种治疗性纳米粒子，其包含紫杉醇和人血清白蛋白，紫杉醇包裹在人血清白蛋白内；人血清白蛋白和紫杉醇的重量为0.15∶1，治疗性纳米粒子的平均粒径为136nm。
在另一个具体的实施方式中，提供了一种治疗性纳米粒子，其包含紫杉醇和人血清白蛋白，紫杉醇包裹在人血清白蛋白内；人血清白蛋白和紫杉醇的重量为0.16∶1，治疗性纳米粒子的平均粒径为133nm。
在另一个具体的实施方式中，提供了一种治疗性纳米粒子，其包含紫杉醇和人血清白蛋白，紫杉醇包裹在人血清白蛋白内；人血清白蛋白和紫杉醇的重量为0.17∶1，治疗性纳米粒子的平均粒径为136nm。
在另一个具体的实施方式中，提供了一种治疗性纳米粒子，其包含紫杉醇和人血清白蛋白，紫杉醇包裹在人血清白蛋白内；人血清白蛋白和紫杉醇的重量为0.18∶1，治疗性纳米粒子的平均粒径为138nm。
在另一个具体的实施方式中，提供了一种治疗性纳米粒子，其包含紫杉醇和人血清白蛋白，紫杉醇包裹在人血清白蛋白内；人血清白蛋白和紫杉醇的重量为0.24∶1，治疗性纳米粒子的平均粒径为141nm。
在另一个具体的实施方式中，提供了一种治疗性纳米粒子，其包含紫杉醇和人血清白蛋白，紫杉醇包裹在人血清白蛋白内；人血清白蛋白和紫杉醇的重量为0.57∶1，治疗性纳米粒子的平均粒径为145nm。
在另一个具体的实施方式中，提供了一种治疗性纳米粒子，其包含多西他赛和人血清白蛋白，多西他赛包裹在人血清白蛋白内；人血清白蛋白和多西他赛的重量为0.1∶1，治疗性纳米粒子的粒径在110至150nm范围内。
在某些具体实施方式中，本发明的治疗性纳米粒子是经过分离和/纯化的治疗性纳米粒子，优选地其基本上不包含作为支撑剂的人血清白蛋白和/或其基本上仅包含与活性成分一起构成纳米粒子的人血清白蛋白，即本发明的治疗性纳米粒子所包含的人血清白蛋白基本上不以支撑剂的形式存在和/或基本上全部与活性成分一起构成纳米粒子。更优选地，所述分离和/纯化是通过离心、透析或柱层析实现的。
另一方面，本公开的一些实施方式提供了一种药物组合物，其含有根据本公开的治疗性纳米粒子。在一些实施方式中，以液体形式提供药物组合物，包括但不限于适于向受试者注射施用的形式。在一个具体的实施方式中，药物组合物制备成注射液。在另一些实施方式中，以固体的形式提供药物组合物，包括但不限于干粉或冻干粉。
在某些具体实施方式中，本发明的纳米粒子或者药物组合物不含去铁胺或其盐，例如去铁胺甲磺酸盐。
在某些具体实施方案中，本发明的纳米粒子或者药物组合物不含额外的稳定剂。
当药物组合物以液体形式提供时，药物组合物包含本公开的治疗性纳米粒子和可药用载体。治疗性纳米粒子悬浮于可药用载体中。可药用载体包括但不限于缓冲液、防腐剂、注射用水、生理盐水、等渗溶液。在一些具体的实施方式中，治疗性纳米粒子在液体形式的药物组合物中的浓度为5mg/ml。
当药物组合物以固体形式提供时，药物组合物包含或由如下组成：本公开的治疗性纳米粒子和冻干赋形剂。在一些具体的实施方式中，冻干赋形剂选自甘露醇、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、右旋糖酐、人血清白蛋白中的一种或多种。在某些具体的实施方式中，治疗性纳米粒子悬浮于5％至10％的冻干赋形剂溶液中，然后经冻干制备成冻干粉形式的药物组合物。在具体的实施方式中，冻干赋形剂溶液选自5％甘露醇溶液、10％蔗糖溶液、5％右旋糖酐溶液、10％乳糖溶液、10％海藻糖溶液、10％麦芽糖溶液、10％人血白蛋白溶液中的一种或多种。在一些具体的实施方式中，治疗性纳米粒子在固体形式的药物组合物中的含量为按重量计4.8％-10％。
本发明还提供了制备本发明治疗性纳米粒子的方法，其包括：(1)通过将活性成分与人血清白蛋白相接触制备含治疗性纳米粒子的混悬液，和(2)分离和/纯化上述混悬液得到基本上纯的治疗性纳米粒子。
本发明还提供了制备本发明治疗性纳米粒子的方法，其包括：(1)通过将活性成分相(例如在有机溶剂中的油相)与人血清白蛋白相(例如在水中的水相)相混合制备含治疗性纳米粒子的混悬液，和(2)分离和/纯化上述混悬液得到基本上纯的治疗性纳米粒子。
另一方面，本发明还提供了由本发明的方法制得的治疗性纳米粒子。
另一方面，本公开的一些实施方式提供了一种制备治疗性纳米粒子的方法，包括或由如下步骤组成：
1)将活性成分溶解于有机溶剂中形成油相，将人血清白蛋白溶解于水中形成水相；
2)将油相和水相形成水包油的乳剂；
3)去除乳剂中的有机溶剂，得到含治疗性纳米粒子的混悬液；
4)分离获得治疗性纳米粒子。
技术人员能够根据活性成分的性质选择适当的有机溶剂。在一些具体的实施方式中，当活性成分是紫杉烷类药物时，可用的有机溶剂选自氯仿和乙醇中的一种或多种。更具体而言，当活性成分是紫杉醇或多西他赛时，可用的有机溶剂是氯仿和乙醇的混合体系。在一些具体的实施方式中，氯仿和乙醇的体积比在1∶1至20∶1范围内；例如选自1∶1、4∶1、9∶1和11∶1。在一些具体的实施方式中，人血清白蛋白在水相中的浓度在2％至10％w/v范围内；例如选自2％、4％、5％和10％。在一些实施方式中，油相中的活性成分与有机溶剂的比例在0.3-7.5g/15-20ml范围之间。在一些具体的实施方式中，油相中的活性成分与有机溶剂的比例选自：0.3g/15ml、0.6g/15ml、1g/20ml、1.25g/15ml、1.8g/15ml、2g/15ml、2.5g/15ml、3g/20ml、3g/15ml、5g/15ml、7.5g/15ml、或上述任意两个数值之间的范围。
当油相和水相形成水包油的乳剂时，油相和水相的体积比选自1∶10至1∶100的范围内。在一些实施方式中，油相和水相的混合比例是3∶100或1∶25。采用本领域已知的方法形成水包油的乳剂，包括但不限于均质法。在具体的实施方式中，采用高剪切分散机将油相和水相的混合物进行匀浆，然后采用高压均质机进行均质，得到水包油的乳剂。在具体的实施方式中，采用高剪切分散机将油相和水相的混合物匀浆2-10分钟，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到水包油的乳剂。
任何适当的方法均可用于去除乳剂中的有机溶剂。在一些实施方式中，采用旋转蒸发的方法去除乳剂中的有机溶剂。在具体的实施方式中，用旋转蒸发仪将乳剂在40℃下，以40mbar减压去除乳剂中的有机溶剂。去除有机溶剂之后，得到的混悬液中即包含了本公开的治疗性纳米粒子。然而，此时的混悬液中还包含了过量的白蛋白，而这些白蛋白实际上并没有参与纳米粒子的构成。
因此，随后需要将其从混悬液中分离出来而获得本公开的纯或基本上纯的治疗性纳米粒子。在一些实施方式中，分离是通过选自如下的方法进行的：离心、透析、和排阻色谱。在具体的实施方式中，去除有机溶剂之后得到的混悬液可以直接进行分离处理。或者，也可以也留待后续使用。本公开所涉及的治疗性纳米粒子是希望通过静脉输注的方式给药，因此需保证产品的无菌。纳米粒子以及人血清白蛋白均是温度敏感的，因此无法通过加热灭菌的方式除菌，可行的除菌方案包括全程无菌生产，或通过除菌过滤。在这种情况下，去除有机溶剂之后得到的混悬液经过滤膜过滤除菌，随后进行冷冻干燥而得到固体。将这种固体重悬于氯化钠溶液中。在一些实施方式中，将这种固体重悬于0.9％氯化钠溶液中，使紫杉醇调整至5mg/ml附近。
当采用离分方式分离治疗性纳米粒子时，在21000×g下离心60分钟或等同的离心条件。
当采用透析方式分离治疗性纳米粒子时，采用超滤膜对根据本发明的方法所得到的纳米粒子液体进行透析。在具体的实施方式中，采用截留分子量为300K的再生纤维素超滤膜，以5％甘露醇为透析液对根据本发明的方法所得到的纳米粒子液体进行等体积透析，透析倍数为5倍。
当采用排阻色谱的方式分离治疗性纳米粒子时，采用排阻色谱柱分离治疗性纳米粒子。在具体的实施方式中，采用琼脂糖凝胶色谱柱对根据本发明的方法所得到的纳米粒子液体进行分离，收集对应于治疗性纳米粒子的洗脱峰。
另一方面，本公开的一些实施方式还提供了一种制备包含治疗性纳米粒子的药物组合物的方法，包括或由如下步骤组成：
1)将活性成分溶解于有机溶剂中形成油相，将人血清白蛋白溶解于水中形成水相；
2)将油相和水相形成水包油的乳剂；
3)去除乳剂中的有机溶剂，得到含治疗性纳米粒子的混悬液；
4)分离获得治疗性纳米粒子；
5)用含有可药用载体的溶液将治疗性纳米粒子重悬，得到所述药物组合物；
6)任选地，当制备固体形式的药物组合物时，还包括冻干的步骤。
在一些实施方式中，含有可药用载体的溶液是含有冻干赋形剂的溶液。在一些具体的实施方式中，冻干赋形剂选自甘露醇、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、右旋糖酐、人血清白蛋白中的一种或多种。在具体实施方式中，治疗性纳米粒子悬浮于5％至10％的冻干赋形剂溶液中。任选地，然后经冻干制备成冻干粉形式的药物组合物。在具体的实施方式中，冻干赋形剂溶液选自5％甘露醇溶液、10％蔗糖溶液、5％右旋糖酐溶液、10％乳糖溶液、10％海藻糖溶液、10％麦芽糖溶液、10％人血白蛋白溶液中的一种或多种。在一些具体的实施方式中，治疗性纳米粒子在液体形式的药物组合物中的含量为0.1％-30％，优选0.2％-10％，更优选0.5％-5％，例如1％。在一些具体的实施方式中，本发明的液体形式药物组合物中活性药物(例如紫杉醇)的含量为0.1-100mg/ml，优选0.5-50mg/ml，更优选1-20mg/ml，例如5mg/ml。治疗性纳米粒子在固体形式的药物组合物中的含量为按重量计0.1％-80％，优选0.5％-50％，更优选1％-30％，例如2％-10％。在一些具体的实施方式中，本发明的液体形式药物组合物中活性药物(例如紫杉醇)的含量为按重量计0.1％-80％，优选0.5％-50％，更优选1％-30％，例如2％-10％。
作为一个替代，还可以采用另一种透析方式制备本公开的药物组合物，方法包括或由如下步骤组成：
1)将活性成分溶解于有机溶剂中形成油相，将人血清白蛋白溶解于水中形成水相；
2)将上述油相和水相形成水包油的乳剂；
3)去除乳剂中的有机溶剂，得到含治疗性纳米粒子的混悬液；
4)使用含有可药用载体的溶液对去除有机溶剂后得到的混悬液进行透析，得到所述药物组合物；
5)任选地，当制备固体形式的药物组合物时，还包括冻干的步骤。
在一些实施方式中，含有可药用载体的溶液作为透析液，其是含有冻干赋形剂的溶液。在一些具体的实施方式中，冻干赋形剂选自甘露醇、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、右旋糖酐、人血清白蛋白中的一种或多种。在具体实施方式中，治疗性纳米粒子悬浮于5％至10％的冻干赋形剂溶液中。任选地，然后经冻干制备成冻干粉形式的药物组合物。在具体的实施方式中，冻干赋形剂溶液选自5％甘露醇溶液、10％蔗糖溶液、5％右旋糖酐溶液、10％乳糖溶液、10％海藻糖溶液、10％麦芽糖溶液、10％人血白蛋白溶液中的一种或多种。在一些实施方式中，采用300k的超滤膜进行透析。
另一方面，本公开的一些实施方式还提供了治疗性纳米粒子在制备用于治疗癌症的药物中的用途。癌症选自肝癌、前列腺癌和肺癌。
另一方面，本公开的一些实施方式还提供了治疗性纳米粒子，其用于治疗癌症。优选地，所述癌症选自肝癌、前列腺癌和肺癌。
另一方面，本公开还提供了一种药盒，其含有根据本公开的治疗性纳米粒子或药物组合物。根据需要，药盒还包含使用说明书、包装、容纳治疗性纳米粒子或药物组合物的容器。
另一方面，本公开还提供了一种治疗癌症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的所述治疗性纳米粒子或所述药物组合物的步骤。在具体实施方式中，受试者是哺乳动物，包括但不限于人类、犬、小鼠、大鼠。
本发明人出人意料地发现，白蛋白与活性成分形成的初始纳米粒子(或者组合物)实际上是少量粒子分散(或者镶嵌)于大量支撑剂(白蛋白)中，而通过分离或者纯化的手段就能够得到性质更加优异的纯或基本上纯的纳米粒子。
本发明人出人意料地发现，与现有技术中的教导不同，即便大大降低人血清白蛋白与活性成分的比例，仍然能够得到稳定且具有功能的治疗性纳米粒子。相比于高血清白蛋白∶活性成分比例的组合物，本发明的治疗性纳米粒子大大降低了致敏性，降低了副作用，改善或者至少保持稳定性、药代动力学性质。
进一步地，本发明人还出人意料地发现，通过将初始纳米粒子分离和/纯化成为纯或基本上纯的纳米粒子，就进一步改善了纳米粒子的性能，例如大大降低了致敏性，降低了副作用，改善或者至少保持稳定性、药代动力学性质。优选地，所述纯化通过离子、透析、柱层析等方式进行。
在一些方面，本发明的纳米粒子具有特定的粒径，例如30nm-200nm，优选50-190nm。优选地，所述粒径是基本均一的。这些性质至少部分地贡献于本发明粒子的优异性能。
在另一些方面，本发明的纳米粒子具有较高的zeta电位，使得本发明的纳米粒子十分稳定。
附图说明
图1.实施例5的样品的电镜扫描照片。
图2.从实施例5的样品制得的纳米粒子的电镜扫描照片。
图3.紫杉醇的X衍射图谱。
图4.白蛋白冻干粉的X衍射图谱。
图5.对应于实施例2的紫杉醇白蛋白纳米粒子的X衍射图谱。
图6.对应于实施例4的紫杉醇白蛋白纳米粒子的X衍射图谱。
图7.对应于实施例6的紫杉醇白蛋白纳米粒子的X衍射图谱。
图8.对应于实施例8的紫杉醇白蛋白纳米粒子的X衍射图谱。
图9.不同制剂纯粒子的体外释放曲线。
图10.纯粒子与普通制剂体外释放曲线。
图11.纯粒子与普通制剂的犬药代动力学曲线。
具体实施方式
定义
除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。
尽管本发明的广义范围所示的数字范围和参数近似值，但是具体实施例中所示的数值尽可能准确的进行记载。然而，任何数值本来就必然含有一定的误差，其是由它们各自的测量中存在的标准偏差所致。另外，本文公开的所有范围应理解为涵盖其中包含的任何和所有子范围。例如记载的“1至10”的范围应认为包含最小值1和最大值10之间(包含端点)的任何和所有子范围；也就是说，所有以最小值1或更大起始的子范围，例如1至6.1，以及以最大值10或更小终止的子范围，例如5.5至10。另外，任何称为“并入本文”的参考文献应理解为以其整体并入。
另外应注意，如本说明书中所使用的，单数形式包括其所指对象的复数形式，除非清楚且明确的限于一个所指对象。术语“或”可与术语“和/或”互换使用，除非上下文另有清楚指明。
本文使用的术语“纳米粒子”表示在至少一个维度(例如一个、两个或三个维度)上具有纳米级尺寸的粒子，例如约1nm、约10nm、约100nm级别的尺寸。
本文使用的术语“治疗性纳米粒子”表示可用于治疗或预防疾病的纳米粒子，所述疾病例如癌症，优选肝癌、前列腺癌和肺癌。
本文使用的术语“活性成分”表示药物活性成分。特别地，所述活性成分表示能够起到治疗作用(例如治疗、预防、缓解或抑制任何疾病和/或病症)的任何物质或实体(entity)，其包括但不限于：化学治疗剂、放射治疗剂、免疫治疗剂、热治疗剂(thermally therapeutic agent)等。例如氨鲁米特、硫唑嘌呤、硫酸博来霉素、白消安、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、环孢霉素、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、阿霉素、紫杉醇、依托泊苷、氟尿嘧啶、干扰素-α、洛莫司汀、巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托坦、盐酸丙卡巴肼、硫鸟嘌呤、硫酸长春碱和硫酸长春新碱。
根据本发明的药物组合物、疫苗或者药物制剂可通过任何适宜的途径施用，例如可口服、鼻、皮内、皮下、肌内或静脉内施用。
实施例
下述实施例旨在为了更好的揭示本公开的治疗性纳米粒子及药物组合物，而非限制本公开的任何方面。
实施例1
将3g的紫杉醇(CAS：33069-62-4，云南汉德生物技术有限公司)溶解在20ml的氯仿/乙醇(9∶1，v/v)中，然后上述溶液加入500ml的人血白蛋白溶液(5％w/v)(CAS：70024-90-7，广东双林生物制药有限公司)，将混合物采用高剪切分散机(型号F22E，上海弗鲁克流体机械制造有限公司)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机(型号M110-EH30K，美国MFIC公司)在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪(型号R-210，瑞士Buchi公司)中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的紫杉醇白蛋白纳米粒子平均直径为136nm，混悬液呈半透明状。
混悬液可顺利经0.22微米的除菌滤膜(德国赛多利斯公司)过滤，滤后粒子粒径未发生显著改变，混悬液室温放置48小时未见有显著变化。将混悬液分装后置于冻干机(型号LD-85S，美国Millrock公司)中冷冻干燥24小时，得到稳定的类白色饼块。
实施例2
将0.32g的紫杉醇(CAS：33069-62-4，云南汉德生物技术有限公司)溶解在15ml的氯仿/乙醇(11∶1，v/v)中，然后上述溶液加入500ml的人血白蛋白溶液(4％w/v)(CAS：70024-90-7，广东双林生物制药有限公司)，将混合物采用高剪切分散机(型号F22E，上海弗鲁克流体机械制造有限公司)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机(型号M110-EH30K，美国MFIC公司)在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪(型号R-210，瑞士Buchi公司)中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的紫杉醇白蛋白纳米粒子平均直径为145nm，混悬液呈半透明状。
混悬液可顺利经0.22微米的除菌滤膜(德国赛多利斯公司)过滤，滤后粒子粒径未发生显著改变，混悬液室温放置48小时未见有显著变化。将混悬液分装后置于冻干机(型号LD-85S，美国Millrock公司)中冷冻干燥24小时，得到稳定的类白色饼块。
实施例3
将0.63g的紫杉醇(CAS：33069-62-4，云南汉德生物技术有限公司)溶解在15ml的氯仿/乙醇(11∶1，v/v)中，然后上述溶液加入500ml的人血白蛋白溶液(4％w/v)(CAS：70024-90-7，广东双林生物制药有限公司)，将混合物采用高剪切分散机(fluko FZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机(型号M110-EH30K，美国MFIC公司)在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪(型号R-210，瑞士Buchi公司)中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的紫杉醇白蛋白纳米粒子平均直径为141nm，混悬液呈半透明状。
混悬液可顺利经0.22微米的除菌滤膜(德国赛多利斯公司)过滤，滤后粒子粒径未发生显著改变，混悬液室温放置48小时未见有显著变化。将混悬液分装后置于冻干机(型号LD-85S，美国Millrock公司)中冷冻干燥24小时，得到稳定的类白色饼块。
实施例4
将1.25g的紫杉醇(CAS：33069-62-4，云南汉德生物技术有限公司)溶解在15ml的氯仿/乙醇(11∶1，v/v)中，然后上述溶液加入500ml的人血白蛋白溶液(4％w/v)(CAS：70024-90-7，广东双林生物制药有限公司)，将混合物采用高剪切分散机(F22Z型，fluko)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机(型号M110-EH30K，美国MFIC公司)在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪(型号R-210，瑞士Buchi公司)中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的紫杉醇白蛋白纳米粒子平均直径为138nm，混悬液呈半透明状。
混悬液可顺利经0.22微米的除菌滤膜(德国赛多利斯公司)过滤，滤后粒子粒径未发生显著改变，混悬液室温放置48小时未见有显著变化。将混悬液分装后置于冻干机(型号LD-85S，美国Millrock公司)中冷冻干燥24小时，得到稳定的类白色饼块。
实施例5
将1.88g的紫杉醇(CAS：33069-62-4，云南汉德生物技术有限公司)溶解在15ml的氯仿/乙醇(11∶1，v/v)中，然后上述溶液加入500ml的人血白蛋白溶液(4％w/v)(CAS：70024-90-7，广东双林生物制药有限公司)，将混合物采用高剪切分散机(fluko FZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机(型号M110-EH30K，美国MFIC公司)在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪(型号R-210，瑞士Buchi公司)中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的紫杉醇白蛋白纳米粒子平均直径为133nm，混悬液呈半透明状。
混悬液可顺利经0.22微米的除菌滤膜(德国赛多利斯公司)过滤，滤后粒子粒径未发生显著改变，混悬液室温放置48小时未见有显著变化。将混悬液分装后置于冻干机(型号LD-85S，美国Millrock公司)中冷冻干燥24小时，得到稳定的类白色饼块。
实施例6
将2.5g的紫杉醇(CAS：33069-62-4，云南汉德生物技术有限公司)溶解在15ml的氯仿/乙醇(11∶1，v/v)中，然后上述溶液加入500ml的人血白蛋白溶液(4％w/v)(CAS：70024-90-7，广东双林生物制药有限公司)，将混合物采用高剪切分散机(fluko FZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机(型号M110-EH30K，美国MFIC公司)在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪(型号R-210，瑞士Buchi公司)中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的紫杉醇白蛋白纳米粒子平均直径为125nm，混悬液呈半透明状。
混悬液可顺利经0.22微米的除菌滤膜(德国赛多利斯公司)过滤，滤后粒子粒径未发生显著改变，混悬液室温放置48小时未见有显著变化。将混悬液分装后置于冻干机(型号LD-85S，美国Millrock公司)中冷冻干燥24小时，得到稳定的类白色饼块。
实施例7
将5g的紫杉醇(CAS：33069-62-4，云南汉德生物技术有限公司)溶解在15ml的氯仿/乙醇(11∶1，v/v)中，然后上述溶液加入500ml的人血白蛋白溶液(4％w/v)(CAS：70024-90-7，广东双林生物制药有限公司)，将混合物采用高剪切分散机(fluko FZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机(型号M110-EH30K，美国MFIC公司)在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪(型号R-210，瑞士Buchi公司)中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的紫杉醇白蛋白纳米粒子平均直径为134nm，混悬液呈半透明状。
混悬液可顺利经0.22微米的除菌滤膜(德国赛多利斯公司)过滤，滤后粒子粒径未发生显著改变，混悬液室温放置48小时未见有显著变化。将混悬液分装后置于冻干机(型号LD-85S，美国Millrock公司)中冷冻干燥24小时，得到稳定的类白色饼块。
实施例8
将7.5g的紫杉醇(CAS：33069-62-4，云南汉德生物技术有限公司)溶解在15ml的氯仿/乙醇(11∶1，v/v)中，然后上述溶液加入500ml的人血白蛋白溶液(4％w/v)(CAS：70024-90-7，广东双林生物制药有限公司)，将混合物采用高剪切分散机(fluko FZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机(型号M110-EH30K，美国MFIC公司)在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪(型号R-210，瑞士Buchi公司)中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的紫杉醇白蛋白纳米粒子平均直径为140nm，混悬液呈半透明状。
混悬液可顺利经0.22微米的除菌滤膜(德国赛多利斯公司)过滤，滤后粒子粒径未发生显著改变，混悬液室温放置48小时未见有显著变化。将混悬液分装后置于冻干机(型号LD-85S，美国Millrock公司)中冷冻干燥24小时，得到稳定的类白色饼块。
实施例9
将1g的紫杉醇(CAS：33069-62-4，云南汉德生物技术有限公司)溶解在20ml的氯仿/乙醇(4∶1，v/v)中，然后上述溶液加入500ml的人血白蛋白溶液(2％w/v)(CAS：70024-90-7，广东双林生物制药有限公司)，将混合物采用高剪切分散机(fluko FZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机(型号Mll0-EH30K，美国MFIC公司)在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪(型号R-210，瑞士Buchi公司)中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的紫杉醇白蛋白纳米粒子平均直径为136nm，混悬液呈半透明状。
混悬液可顺利经0.22微米的除菌滤膜(德国赛多利斯公司)过滤，滤后粒子粒径未发生显著改变，混悬液室温放置48小时未见有显著变化。将混悬液分装后置于冻干机(型号LD-85S，美国Millrock公司)中冷冻干燥24小时，得到稳定的类白色饼块。
实施例10.人血白蛋白和紫杉醇含量的测定方法
人血白蛋白含量测定采用HPLC法。在228nm的检测波长下，使用配有Tosohaas TSK G3000SWXL凝胶色谱柱的紫外检测器(1260VWDG1314B，Agilent technologies)，流动相为0.1mol/L磷酸氢二钾溶液，进样体积10μl，采用外标法计算白蛋白含量。
供试品溶液制备：采用0.9％氯化钠溶液将待测溶液稀释至白蛋白浓度低于3mg/ml，作为供试品溶液。
紫杉醇含量测定采用HPLC法。使用配有C18反相色谱柱的紫外检测器(1260VWD G1314B，Agilent technologies)，检测波长228nm，流动相为乙腈-水(1∶1，v/v)，进样体积10μl，采用外标法计算紫杉醇含量。
供试品溶液制备：采用乙腈将待测溶液稀释至紫杉醇完全溶解，浓度20-200μg/ml，作为供试品溶液。
实施例11
取实施例1所得产品加入0.9％氯化钠溶液复溶得到样品1，使得紫杉醇含量为5mg/ml。然后，使用含5％白蛋白的模拟血浆稀释样品1，使得紫杉醇含量至20μg/ml，得到样品2(该条件下粒子已完全崩解，无紫杉醇和人血清白蛋白结合的粒子存在)。分别取样品1和样品2各1ml，在21000×g条件下离心不同时间。采用实施例10中的方法测定上清液中紫杉醇和白蛋白浓度，结果见表1。
表1.不同离心时间上清液中紫杉醇和白蛋白浓度
结果显示，对于完全崩解的样品(样品2)离心不会产生沉淀。不同离心时间，上清液中紫杉醇和白蛋白浓度无显著改变，即溶液中无紫杉醇结晶或较重的粒子。
未崩解样品(样品1)离心后底部出现沉淀。上清液中紫杉醇浓度随离心时间而降低，并最终达到平衡。白蛋白浓度也是随着时间而略微升高，最终达到平衡(上清液体积约为总体积的90％)。因此，样品中的纳米粒子可通过离心的方式分离。
离心60分钟后，上清中紫杉醇浓度达到平衡。因此，采用21000×g离心60分钟，可以获得分离的紫杉醇白蛋白粒子。
实施例12.纳米粒子的制备
采用实施例11中离心方法，分别从实施例1-9中所得样品中分离粒子。离心后，弃去上清液，得到的沉淀即为紫杉醇白蛋白纳米粒子，对应于上述实施例1-9分别称为粒子1、2、3、4、5、6、7、8和9。
实施例13.扫描电镜观察分离前后粒子形态
取实施例5中所得样品冻干粉末及在实施例12中分离得到的实施例5所得样品的沉淀(粒子5)于扫描电镜(S-4800，Hitachi)下观察。图1结果可见，实施例5样品中少量粒子镶嵌于大量白蛋白形成的支撑剂中。而粒子5中，粒子独立存在(参见图2)。可以判断，通过实施例11的分离方法得到的沉淀为纯的纳米粒子。
实施例14.粒子中白蛋白与紫杉醇的比例
将实施例12所得紫杉醇白蛋白纳米粒子(对应着实施例1至9)分别加入0.9％氯化钠溶液1ml重悬。采用实施例10中的测定方法分别测定样品中紫杉醇和白蛋白含量，结果如下：
表2.离心得到的不同纯粒子中白蛋白与紫杉醇的比例
上述结果显示，不同制剂工艺所得的产品中纯粒子中白蛋白与紫杉醇的比例是不相同的，并且具有一定规律性。可以看出，油相浓度的提高与白蛋白量是成反比的。
实施例15.透析法制备纯粒子
采用截留分子量300K、材质为再生纤维素的超滤膜包(PXC300C50，Millipore)，使用5％甘露醇为透析液分别对实施例2、实施例5、实施例8所制备样品用注射水复溶后进行等体积透析，透析倍数为5倍。将透析后的粒子采用实施例10中的测定方法分别测定样品中紫杉醇和白蛋白含量，结果如下：
表3.透析法得到的不同制剂纯粒子中白蛋白与紫杉醇比例
上述结果显示采用超滤膜透析得到的粒子中白蛋白与紫杉醇的重量比与离心法得到的粒子基本相似，因此也可以用于分离混悬液中的粒子与多余的白蛋白，并将粒子外围的溶液进行置换。
实施例16.采用柱分离法制备纯粒子
将sepharose 4B的凝胶装入直径10mm的玻璃柱(Φ10mm*230mm，北京满仓科技有限公司)中，共填装20ml凝胶。采用0.9％氯化钠平衡3倍柱体积。分别取实施例2、实施例5、实施例8所制备样品各1ml在凝胶柱顶端上样，0.9％氯化钠作为洗脱液，使用在线紫外检测器280nm波长进行监测。在监测图上第一个峰出现时，流出液为略显浊光的混悬液，收集该部分混悬液用于测定紫杉醇和白蛋白。继续记录直至第二个峰完毕。两峰分离度良好，因此采用sepharose 4B凝胶柱可以将混悬液中的粒子和游离白蛋白有效分离。采用实施例10中的测定方法分别测定粒子中紫杉醇和白蛋白含量，结果如下：
表4.柱分离法得到的不同制剂纯粒子中白蛋白与紫杉醇比例
上述结果显示采用凝胶柱分离得到的粒子中白蛋白与紫杉醇的重量比与离心法和透析法得到的粒子基本相似，因此也可以用于分离混悬液中的粒子与多余的白蛋白。
实施例17.采用离心法检测透析法所制备纯粒子中游离白蛋白量
将实施例15中通过透析法得到的粒子混悬液，采用实施例11中的离心条件进行离心分离，粒子全部沉淀于离心管底部后，取上清液测定白蛋白浓度，结果见表5，
表5.透析法得到的不同制剂纯粒子离心前后白蛋白浓度变化
| 离心前浓度(mg/ml) | 离心后上清(mg/ml) | |
| 实施例2 | 2.19 | 0.02 |
| 实施例5 | 0.73 | 0.01 |
| 实施例8 | 0.25 | ND |
由上述结果可以看出，通过透析法制备得到的紫杉醇白蛋白纳米粒子混悬液中，游离的白蛋白所占比例非常少，绝大部分白蛋白是与紫杉醇结合形成纳米粒子的。
实施例18.采用离心法检测柱分离法所制备纯粒子中游离白蛋白量
将实施例16中通过柱分离法得到的粒子混悬液，采用实施例11中的离心条件进行离心分离，粒子全部沉淀于离心管底部后，取上清液测定白蛋白浓度，结果见表6，
表6.柱分离法得到的不同制剂纯粒子离心前后白蛋白浓度变化
| 离心前浓度(mg/ml) | 离心后上清(mg/ml) | |
| 实施例2 | 0.68 | ND |
| 实施例5 | 0.33 | ND |
| 实施例8 | 0.10 | ND |
由上述结果可以看出，通过柱分离法制备得到的紫杉醇白蛋白纳米粒子混悬液中，几乎没有游离的白蛋白，绝大部分白蛋白是与紫杉醇结合形成纳米粒子的。
实施例19.采用柱分离法检测离心法所制备纯粒子中游离白蛋白量
将实施例12所得紫杉醇白蛋白纳米粒子分别加入0.9％氯化钠溶液重悬得到粒子混悬液，采用实施例16中的sepharose 4B柱分离方法分离纯粒子和可能存在的游离白蛋白。在洗脱过程中观察紫外监测曲线，在粒子完全流出后，收集后续洗脱液，测定白蛋白浓度，结果见表7。
表7.离心法得到的不同制剂纯粒子采用柱分离峰测定白蛋白浓度变化
| 柱分离前浓度(mg/ml) | 柱分离后白蛋白(mg/ml) | |
| 实施例2 | 0.57 | ND |
| 实施例5 | 0.16 | ND |
| 实施例8 | 0.043 | ND |
由上述结果可以看出，通过离心法制备得到的紫杉醇白蛋白纳米粒子混悬液中，几乎没有游离的白蛋白，绝大部分白蛋白是与紫杉醇结合形成纳米粒子的。在实施例17、18、19中，三种粒子分离的手段互相印证，均证明了三种方法可以得到几乎没有游离白蛋白的纯粒子。
实施例20.粒径及电位的测定
将实施例12对应于实施例1-9所得紫杉醇白蛋白纳米粒子分别加入纯化水使之重悬。采用马尔文NANO-ZS激光粒度测定仪分别测定纯粒子的粒径及zeta电位，结果如下：
表8.离心所得纯粒子的粒径及电位
由结果可以看出，经过离心所得到纯粒子的平均粒径与初始制备所得粒子的初始平均粒径基本一致，粒子的zeta电位仍较高，因此能够利用其电荷稳定作用使粒子的混悬液保持稳定。
实施例21.X衍射图谱
取紫杉醇原料与白蛋白冻干粉于粉末X光射线衍射仪中测定其结晶形式，结果见图3和图4。可见，紫杉醇原料为结晶性粉末，白蛋白冻干粉为无定形粉末。取实施例12中有代表性的纯粒子(对应于实施例2、4、6和8)，于冻干机中冷冻干燥得到固体粉末，于粉末X光射线衍射仪中测定其结晶形式，结果见图5、6、7和8。由X衍射图谱可以看出，在粒子中白蛋白对紫杉醇的比例在0.043∶1至0.57∶1范围内，白蛋白和紫杉醇均是以无定形存在的，与紫杉醇原料药显著不同，与白蛋白冻干粉略有差异。
实施例22.紫杉醇从粒子中的释放
采用实施例11中建立的粒子分离方法，可以有效分离游离的组分和以纳米粒子形式存在的组分。因此，该方法可以用来测定不同浓度时紫杉醇从粒子中释放的情况，具体操作如下：
将实施例12所得紫杉醇白蛋白纳米粒子(分别对应于实施例1-9)，根据白蛋白与紫杉醇的比例，挑选其中有代表性的纯粒子(对应于实施例2、4、6和8，分别称为粒子2、4、6和8)加0.9％氯化钠溶液，配制成紫杉醇浓度为5mg/ml的储备液。将储备液和模拟血浆溶液分别于37℃恒温。取储备液用模拟血浆溶液稀释，得到紫杉醇浓度分别为5000、1000、200、150、100、80、50、30、10μg/ml的溶液。
释放率测定：取配制好的样品溶液分别测定紫杉醇浓度，同时取各样品1ml于21000×g离心60分钟后取上清液测定紫杉醇浓度。用上清液中紫杉醇浓度除以离心前样品紫杉醇浓度计算各浓度点紫杉醇释放比例，并绘制释放曲线的图，见图9和图10。由释放曲线图可以看出，粒子中白蛋白对紫杉醇的比例在0.043∶1至0.057∶1范围内，粒子中紫杉醇的释放行为基本一致，均与浓度相关。
实施例23.含治疗性纳米粒子的组合物的制备
方法一(离心-重悬法)：将实施例12得到的对应于实施例1-9的治疗性纳米粒子(以下称为粒子1、2、3、4、5、6、7、8和9)分别采用5％甘露醇溶液、10％蔗糖溶液、5％右旋糖酐溶液、10％乳糖溶液、10％海藻糖溶液、10％麦芽糖溶液、10％人血白蛋白溶液重悬，使得紫杉醇浓度为5mg/ml。将重悬液经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变。将各混悬液置于冻干机中冷冻干燥，即得含药物纳米粒子的组合物。
方法二(透析法)：将实施例1-9得到的样品复溶至紫杉醇浓度为5mg/ml后采用300k的超滤膜进行透析，透析液分别采用5％甘露醇溶液、10％蔗糖溶液、5％右旋糖苷溶液、10％乳糖溶液、10％麦芽糖、10％海藻糖溶液、10％人血白蛋白溶液，透析5倍体积后混悬液中游离的人血白蛋白被全部置换。将混悬液经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，将各混悬液置于冻干机中冷冻干燥，即得含治疗性纳米粒子的组合物。
实施例24.
将实施例23中方法一(离心-重悬法)和方法二(透析法)所得的含治疗性纳米粒子的组合物分别加入注射水复溶至紫杉醇浓度为5mg/ml后，观察各溶液稳定性，判断室温下12h稳定性。可见，常规冻干保护剂均可对纯紫杉醇白蛋白纳米粒子起到保护作用。结果见表9和表10：
表9.离心-重悬法所得的组合物的稳定性
表10.透析法所得组合物的稳定性
可见采用离心分离-重悬的方式(方法一)与透析的方式(方法二)置换粒子周围的白蛋白均可保证粒子的稳定性。
实施例25.豚鼠致敏实验
试验药物选用实施例6得到的产品及实施例24中包含粒子6的5％甘露醇制剂，其中所述制剂中紫杉醇浓度为如下表所示的浓度。致敏剂量选择3mg/只和1.25mg/只，致敏采用腹腔注射的方式，隔日一次，共三次。同时设阳性对照组(0.2％卵白蛋白)和阴性对照组(0.9％氯化钠注射液组)。具体给药情况见下表。
表11.豚鼠致敏实验方案
致敏给药方法：用左手手掌成杯状紧握豚鼠背使得腹部皮肤伸展，固定好动物。使豚鼠腹部抬高，头部放低，用酒精棉球将注射部位消毒后，右手持2ml一次性注射器的针头刺入皮肤。其部位是从下腹部腹中线稍偏左1mm的位置进针。针头到达皮下后，继续向前进针5mm-10mm后，再以45°角刺入腹腔。固定针尖，缓慢注入药液。注射完毕后，用干棉球压迫针眼，以防药物外流。致敏3次后实施例6制剂，3mg/只剂量组的豚鼠消瘦、死亡。其他组未见异常。
过敏激发：激发采用静脉注射方式，在末次致敏后第10天一次激发，激发剂量为6mg/只和2.5mg/只。
激发给药方法：外侧跖静脉注射，由助手将豚鼠固定好。操作者从后膝关节抓住动物肢体，压迫静脉，将腿呈伸展状态。剪去注射部位的毛(或者剪开注射部位的皮肤)，酒精棉球擦拭消毒后，可见粗大的外侧跖静脉，右手持1ml一次性注射器沿向心方向刺入血管注射。注射完后，用干棉球压迫针眼，以防流血。
激发后立刻至30min详细观察每只动物的反应，过敏症状出现及消失的时间。最长观察3小时。过敏反应结果见表14。
表12.过敏反应症状
表13.全身过敏反应评价标准
表14.豚鼠主动过敏试验结果
＊表示动物致敏后全部消瘦、死亡。
豚鼠主动致敏试验结果显示，含过量白蛋白的纳米粒子制剂对于豚鼠具有较强的致敏性，而含纯粒子的制剂能够显著降低药物的致敏反应。
实施例26.犬药代研究
试验药物选用实施例6得到的产品及实施例24中包含粒子6的5％甘露醇制剂，其中紫杉醇浓度为5mg/ml。采用比格(beagle)犬进行两个制剂的体内药代动力学研究。每组3只比格犬，给药剂量为5mg/kg，给药时间控制在30分钟。于给药前(0h)、输液过程中15min(从给药开始计0.25h)、拔针点(从给药开始计0.5h)以及从给药开始计0.58、0.75、1.0、1.5、2.5、3.5、4.5、6.5、8.5、24.5h由比格犬前肢头静脉采血2ml，分别置于肝素抗凝管中，摇匀，3000rpm离心10min，分取血浆。采用HPLC/MS/MS测定血浆中紫杉醇浓度，并绘制药物浓度与时间曲线，见图11。由两种制剂的药物浓度-时间曲线图可以看出，两者的体内行为几乎完全一致，因此产品中多余的白蛋白对粒子的体内行为无影响。
实施例27.犬药代研究中的过敏现象
在实施例26进行的犬药代研究中，在给药过程中观察了两种制剂对于犬产生的不良反应情况。在实施例6样品组中，三只犬均出现不同程度的明显过敏反应，主要为给药过程中的剧烈挣扎、大量流涎、口周围皮肤出现红斑、个别实验动物给药过程中出现呕吐、尿失禁等。而粒子6样品组仅部分动物出现轻微挣扎、流涎、口周围皮肤红斑，且症状较轻。可见，纯粒子的制剂能够显著降低药物的致敏反应。
实施例28.
将实施例24方法一中以甘露醇为冻干保护剂的含治疗性纳米粒子的组合物(对应于实施例2、6和8的纳米粒子，以下称为粒子2、粒子6、粒子8)，与实施例6所得产品、Cremophor制剂的进行最大耐受剂量考察的试验。
根据美国NCI的推荐，对确定药物单次给药急性毒性最大耐受剂量实验方法加以改进。对于粒子2、粒子6、粒子8和实施例6冻干粉，选取400mg/kg作为最大给药剂量，以1.2比率递减给药剂量，即剂量分别为400、333、278、231和193mg/kg。对于选取48mg/kg作为最大给药剂量，以1.2比率递减给药剂量，即剂量分别为48、40、33.3、27.8、23.1和19.3mg/kg。每个剂量组分别给予3只KM雄性小鼠。观察给药后动物一般状况及动物体重变化，观察期10天。如在观察期内动物没有出现死亡、不可恢复的毒性反应，或者与实验前体重比较体重减轻无连续3天超过15％的最大给药剂量即被认为是单次给药的最大耐受剂量。
结果显示最大耐受剂量为33.3mg/kg。所有给药组中，在给药时小鼠剧烈挣扎，给药后昏迷、呼吸加快，40mg/kg和48mg/kg组出现死亡例，其余剂量组小鼠在给药后逐渐恢复正常，毒性症状的严重程度和症状恢复时间与给药剂量相关。实施例6和粒子2、粒子6、粒子8的最大耐受剂量均为193mg/kg。193mg/kg以上剂量小鼠主要不良症状为体重减轻、肛门处污垢、后肢无力/瘫痪和死亡，随给药剂量增加不良症状增强。粒子2、粒子6、粒子8和实施例6产品之间对小鼠的毒性无明显差异，但毒性均显著低于Cremophor制剂
实施例29对小鼠肝癌H22肿瘤的抑制作用
采用粒子2、粒子6、粒子8，与实施例6产品、Cremophor制剂对小鼠肝癌H22肿瘤的抑制作用进行考察试验。
将动物按体重分层，肝癌H22腹水细胞皮下接种于雄性KM小鼠前肢腋部皮下组织，接种体积为0.2mL，含瘤细胞约1.0×106个。根据接瘤时间先后将动物均衡分成6组。
接种24h后，粒子2、粒子6、粒子8、实施例6产品、以小鼠最大耐受剂量单次静脉给药。即：粒子2、粒子6、粒子8、实施例6产品给药剂量为193mg/kg，给药剂量为33.3mg/kg，空白对照组单次静脉给予0.9％氯化钠注射液。给药第12天，采用CO2窒息处死小鼠，剖取瘤块并称重。根据公式计算肿瘤抑制率(％)，肿瘤抑制率＝(1-给药组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％。实验结果采用SPSS 19.0统计软件，One-way ANOVA统计分析。
实验结果见表15。以小鼠最大耐受剂量单次静脉给药，所有组别均可显著抑制小鼠H22肿瘤生长。粒子2、粒子6、粒子8和实施例6产品对H22肿瘤的抑制作用组间无差异。粒子2、粒子8和实施例6产品对肿瘤的抑制率显著高于
表15.对荷瘤H22小鼠体重的影响(n＝10，)
实施例30对小鼠前列腺癌RM-1肿瘤的抑制作用
采用粒子2、粒子6、粒子8，与实施例6产品、Cremophor制剂对小鼠前列腺癌RM-1肿瘤的抑制作用进行考察试验。
收集对数生长期RM-1肿瘤细胞，调整细胞数为2.5×106个细胞/ml。将瘤细胞悬液接种于体重7-8周C57雄性小鼠前肢腋下皮下组织，接种体积为0.2ml，含瘤细胞约5×105个。接种完成后，剩余的瘤细胞悬液在光镜下计数，活瘤细胞数＞95％。按照接种时间将小鼠分成6组。
接种72h后，粒子2、粒子6、粒子8、实施例6产品、以小鼠最大耐受剂量单次静脉给药，即粒子2、粒子6、粒子8、实施例6产品给药剂量为193mg/kg，给药剂量为33.3mg/kg，空白对照组单次静脉给予0.9％氯化钠注射液。至肿瘤长出后，采用以游标卡尺测量瘤径的方法，动态观察受试药的抗肿瘤作用。肿瘤体积(tumor volume，TV)的计算公式为：V＝1/2×a×b2。其中a和b分别表示肿瘤长和宽。根据测量结果计算出肿瘤体积。根据公式计算肿瘤体积抑制率(％)，肿瘤抑制率＝(1-给药组平均肿瘤体积/对照组平均肿瘤体积)×100％。实验结果采用SPSS 19.0统计软件，Repeated Measure过程分析随时间变化多次测量间肿瘤体积变化，Multivariate过程比较各次测量时组间肿瘤体积差异。
实验结果见表16。各药物以小鼠最大耐受剂量，在接种小鼠前列腺癌RM-1肿瘤细胞3d时单次静脉给药，与空白对照组相比，粒子2、粒子6、粒子8和实施例6产品对小鼠前列腺癌RM-1肿瘤的生长具有显著抑制作用，而Cremophor制剂对肿瘤无抑制作用。粒子2、粒子6、粒子8和实施例6产品对小鼠RM-1肿瘤的抑制作用无明显差异，但与相比，均显著抑制肿瘤生长。
表16.对小鼠前列腺癌RM-1肿瘤的抑制作用(n＝10，)
实施例31：
对小鼠Lewis肺癌肿瘤的抑制作用
采用粒子2、粒子6、粒子8，与实施例6产品、Cremophor制剂对小鼠肺癌Lewis肿瘤的抑制作用进行考察试验。
收集对数生长期Lewis肿瘤细胞，调整细胞数为2.5×106个细胞/ml。将瘤细胞悬液接种于体重7-8周C57雄性小鼠前肢腋下皮下组织，接种体积为0.2ml，含瘤细胞约5×105个。
同实施例18的分组、给药、指标观察及数据统计方法。
实验结果见表17。各药物以小鼠最大耐受剂量，在接种小鼠肺癌Lewis肿瘤细胞3d时单次静脉给药，与空白对照组相比，粒子2、粒子6、粒子8和实施例6产品对小鼠肺癌Lewis肿瘤的生长具有显著抑制作用，而Cremophor制剂对肿瘤无抑制作用。粒子2、粒子6、粒子8和实施例6产品对小鼠Lewis肺癌肿瘤的抑制作用无明显差异，但与相比，均显著抑制肿瘤生长。
表17.对小鼠Lewis肺癌肿瘤的抑制作用(n＝10，)
实施例32
人血清白蛋白作为一种市售药物，其质量标准中规定产品中聚合体比例不得超过5％，因为白蛋白聚合体可能产生过敏反应。采用实施例10中白蛋白的测定方法能够区分白蛋白单体和聚合体。采用实施例10中白蛋白和紫杉醇的检测方法分别检测实施例1-9(称为初始制剂)以及实施例24方法一中分别以甘露醇和人血清白蛋白为冻干保护剂的对应于实施例1-9的组合物中，白蛋白聚合体和紫杉醇的含量，并计算每毫克紫杉醇对应的白蛋白聚合体量，结果见表18。
表18.不同制剂产品中白蛋白聚合体与紫杉醇相对量
结果显示采用现有技术的方法(均质法)直接制备出的产品中白蛋白聚合体的量显著高于本公开的组合物制备方法中后加入的白蛋白中的量。这是由于在现有技术的均质过程中或蒸发过程中产生了新的白蛋白聚合体，而甘露醇保护剂的制剂中白蛋白聚合体的含量更低这是因为制剂中仅含有极少量的白蛋白，其总量就低于初始制剂中聚合体的量。
实施例33.回收白蛋白用于制备纳米粒子
收集实施例15中透析过程中的透过液，使用10K截留分子量、材质为再生纤维素的超滤膜包进行超滤浓缩，浓缩至白蛋白含量约为4％时，采用纯水作为透析液进行等体积透析，透析5倍体积后结束，可得到回收的4％白蛋白溶液。
按照实施例5中制备方法采用回收的白蛋白溶液制备紫杉醇白蛋白纳米粒子。结果，所制备紫杉醇白蛋白纳米粒平均直径在134nm，混悬液呈半透明状，与实施例5的产品相近。
混悬液可顺利经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤后粒子粒径未发生显著改变，混悬液室温放置48小时未见有显著变化。将混悬液分装后置于冻干机中冷冻干燥24小时，得到稳定的类白色饼块。
实施例34.多西他赛白蛋白纯粒子的制备
将3g的多西他赛溶解在15ml的氯仿/乙醇(1∶1，v/v)中，然后上述溶液加入500ml的人血白蛋白溶液(4％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(fluko FZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的多西他赛白蛋白纳米粒直径在110-150nm，混悬液呈半透明状。
所得多西他赛白蛋白纳米粒混悬液采用实施例11中离心的方式分离纳米粒子，离心条件为21000×g离心60分钟，弃去上清液得到纯粒子。纯粒子加入5％甘露醇溶液重悬，将重悬液经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中多西他赛含量，根据含量调整装量，为50mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥48小时即可。
所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和多西他赛含量，得出白蛋白与多西他赛的比例为0.1∶1。
实施例35.多西他赛己酰衍生物白蛋白纯粒子的制备
将695mg的多西他赛己酰衍生物溶解在6ml的氯仿/乙醇(10∶1，v/v)中，然后上述溶液加入102ml的人血白蛋白溶液(10％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(fluko FZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在18000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的多西他赛己酰衍生物白蛋白纳米粒直径在75-100nm，混悬液呈半透明状。
所得多西他赛己酰衍生物蛋白纳米粒混悬液采用实施例15中5％甘露醇透析的方法得到纯粒子，经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中多西他赛己酰衍生物含量，根据含量调整装量，为50mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥48小时即可。
所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和多西他赛己酰衍生物含量，得出白蛋白与多西他赛己酰衍生物的比例为0.27∶1。
实施例36.多西他赛苯酰衍生物白蛋白纯粒子的制备
将226mg的多西他赛苯酰衍生物溶解在2ml的氯仿/乙醇(9∶1，v/v)中，然后上述溶液加入35ml的人血白蛋白溶液(5％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(fluko FZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在18000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的多西他赛苯酰衍生物白蛋白纳米粒直径在30-60nm，混悬液呈半透明状。
所得多西他赛苯酰衍生物白蛋白纳米粒混悬液使用10％乳糖溶液作为透析液，采用实施例16中柱分离的方式得到纯粒子，经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中多西他赛苯酰衍生物含量，根据含量调整装量，为50mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥48小时即可。
所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和多西他赛苯酰衍生物含量，得出白蛋白与多西他赛苯酰衍生物的比例为0.95∶1。
实施例37.雷帕霉素白蛋白纯粒子的制备
将166mg的雷帕霉素溶解在1ml的氯仿/乙醇(11∶1，v/v)中，然后上述溶液加入37ml的人血白蛋白溶液(5％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(fluko FZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的雷帕霉素白蛋白纳米粒直径在50-85nm，混悬液呈半透明状。
所得雷帕霉素白蛋白纳米粒混悬液使用5％右旋糖酐溶液作为透析液，采用实施例16中柱分离的方式分离纳米粒子，经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中雷帕霉素含量，根据含量调整装量，为10mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥48小时即可。
所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和雷帕霉素含量，得出白蛋白与雷帕霉素的比例为0.63∶1。
实施例38.替西罗莫司白蛋白纯粒子的制备
将101mg的替西罗莫司溶解在0.5ml的氯仿/乙醇(7∶1，v/v)中，然后上述溶液加入19.5ml的人血白蛋白溶液(5％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(fluko FZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的替西罗莫司白蛋白纳米粒直径在80-115nm，混悬液呈半透明状。
所得替西罗莫司白蛋白纳米粒混悬液采用实施例11中离心的方式分离纳米粒子，离心条件为21000×g离心60分钟，弃去上清液得到纯粒子。纯粒子加入5％甘露醇溶液重悬，将重悬液经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中替西罗莫司含量，根据含量调整装量，为10mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥48小时即可。
所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和替西罗莫司含量，得出白蛋白与替西罗莫司的比例为0.16∶1。
实施例39.依维莫司白蛋白纯粒子的制备
将78mg的依维莫司溶解在0.6ml的氯仿/乙醇(9∶1，v/v)中，然后上述溶液加入22ml的人血白蛋白溶液(8％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(fluko FZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的依维莫司白蛋白纳米粒直径在80-110nm，混悬液呈半透明状。
所得依维莫司白蛋白纳米粒混悬液采用实施例15中5％右旋糖酐透析的方式得到纯粒子，经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中依维莫司含量，根据含量调整装量，为10mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥60小时即可。
所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和依维莫司含量，得出白蛋白与替西罗莫司的比例为0.32∶1。
实施例40.罗米地辛白蛋白纯粒子的制备
将113mg的罗米地辛溶解在2ml的氯仿/乙醇(8∶1，v/v)中，然后上述溶液加入35ml的人血白蛋白溶液(10％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(fluko FZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的罗米地辛白蛋白纳米粒直径在120-150nm，混悬液呈半透明状。
所得罗米地辛白蛋白纳米粒混悬液使用10％蔗糖溶液作为透析液，采用实施例16中柱分离的方式分离纳米粒子。纯粒子加入5％甘露醇溶液重悬，将重悬液经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中罗米地辛含量，根据含量调整装量，为50mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥48小时即可。
所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和罗米地辛含量，得出白蛋白与罗米地辛的比例为0.25∶1。
实施例41.吡柔比星白蛋白纯粒子的制备
将147mg的吡柔比星溶解在0.75ml的氯仿/乙醇(5∶1，v/v)中，然后上述溶液加入19.5ml的人血白蛋白溶液(5％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(fluko FZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的吡柔比星白蛋白纳米粒直径在100-120nm，混悬液呈半透明状。
所得吡柔比星白蛋白纳米粒混悬液实施例15中采用5％甘露醇透析的方式分离纳米粒子，经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中吡柔比星含量，根据含量调整装量，为10mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥48小时即可。
所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和吡柔比星含量，得出白蛋白与吡柔比星的比例为0.47∶1。
实施例42.阿柔比星白蛋白纯粒子的制备
将135mg的阿柔比星溶解在2ml的氯仿/乙醇(8∶1，v/v)中，然后上述溶液加入25ml的人血白蛋白溶液(8％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(fluko FZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的阿柔比星白蛋白纳米粒直径在80-150nm，混悬液呈半透明状。
所得阿柔比星白蛋白纳米粒混悬液使用5％甘露醇溶液作为透析液，采用实施例16中柱分离的方法得到纯粒子。纯粒子加入5％甘露醇溶液重悬，将重悬液经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中阿柔比星含量，根据含量调整装量，为10mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥48小时即可。
所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和阿柔比星含量，得出白蛋白与阿柔比星的比例为0.13∶1。
实施例43.卡巴他赛白蛋白纯粒子的制备
将289mg的卡巴他赛溶解在3ml的氯仿/乙醇(10∶1，v/v)中，然后上述溶液加入67ml的人血白蛋白溶液(5％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(fluko FZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的卡巴他赛白蛋白纳米粒直径在65-85nm，混悬液呈半透明状。
所得卡巴他赛白蛋白纳米粒混悬液采用实施例15中5％甘露醇透析的方法得到纯粒子。经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中卡巴他赛含量，根据含量调整装量，为50mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥55小时即可。
所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和卡巴他赛含量，得出白蛋白与卡巴他赛的比例为0.27∶1。
实施例44.胺碘达隆白蛋白纯粒子的制备
将90mg的胺碘达隆溶解在2ml的氯仿/乙醇(11∶1，v/v)中，然后上述溶液加入58ml的人血白蛋白溶液(8％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(fluko FZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的胺碘达隆白蛋白纳米粒直径在70-105nm，混悬液呈半透明状。
所得胺碘达隆白蛋白纳米粒混悬液采用实施例17中实施例11中离心的方式分离纳米粒子，离心条件为21000×g离心60分钟，弃去上清液得到纯粒子。纯粒子加入5％甘露醇溶液重悬，将重悬液经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中胺碘达隆含量，根据含量调整装量，为10mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥57小时即可。
所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和胺碘达隆含量，得出白蛋白与胺碘达隆的比例为0.43∶1。
实施例45.碘塞罗宁白蛋白纯粒子的制备
将93mg的碘塞罗宁溶解在2ml的氯仿/乙醇(9∶1，v/v)中，然后上述溶液加入46ml的人血白蛋白溶液(8％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(fluko FZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的碘塞罗宁白蛋白纳米粒直径在85-125nm，混悬液呈半透明状。
所得碘塞罗宁白蛋白纳米粒混悬液采用实施例17中离心的方法分离纳米粒子，离心条件为21000×g离心60分钟，弃去上清液得到纯粒子。纯粒子加入5％甘露醇溶液重悬，将重悬液经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中碘塞罗宁含量，根据含量调整装量，为10mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥50小时即可。
所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和碘塞罗宁含量，得出白蛋白与碘塞罗宁的比例为0.39∶1。
实施例46.埃博霉素B白蛋白纯粒子的制备
将127mg的埃博霉素B溶解在2ml的氯仿/乙醇(10∶1，v/v)中，然后上述溶液加入52ml的人血白蛋白溶液(5％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(fluko FZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的埃博霉素B白蛋白纳米粒直径在80-115nm，混悬液呈半透明状。
所得埃博霉素B白蛋白纳米粒混悬液采用实施例15中5％甘露醇透析的方法得到纯粒子，经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中埃博霉素B含量，根据含量调整装量，为10mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥65小时即可。
所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和埃博霉素B含量，得出白蛋白与埃博霉素B的比例为0.14∶1。
实施例47.10-羟喜树碱白蛋白纯粒子的制备
将93mg的10-羟喜树碱溶解在2ml的氯仿/乙醇(10∶1，v/v)中，然后上述溶液加入48ml的人血白蛋白溶液(5％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(fluko FZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的10-羟喜树碱白蛋白纳米粒直径在100-135nm，混悬液呈半透明状。
所得10-羟喜树碱白蛋白纳米粒混悬液采用实施例17中离心的方法分离纳米粒子，离心条件为21000×g离心60分钟，弃去上清液得到纯粒子。纯粒子加入5％甘露醇溶液重悬，将重悬液经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中10-羟喜树碱含量，根据含量调整装量，为20mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥72小时即可。
所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和10-羟喜树碱含量，得出白蛋白与10-羟喜树碱的比例为0.26∶1。
实施例48.环孢菌素白蛋白纯粒子的制备
将148mg的环孢菌素溶解在1.5ml的氯仿/乙醇(11∶1，v/v)中，然后上述溶液加入18.5ml的人血白蛋白溶液(4％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(fluko FZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的环孢菌素蛋白纳米粒直径在100-135nm，混悬液呈半透明状。
所得环孢菌素白蛋白纳米粒混悬液使用10％乳糖溶液作为透析液，采用实施例16中柱分离的方法得到纯粒子，经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中环孢菌素含量，根据含量调整装量，为50mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥72小时即可。
所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和环孢菌素含量，得出白蛋白与环孢菌素的比例为0.26∶1。
实施例49.坦螺旋霉素白蛋白纯粒子的制备
将88mg的坦螺旋霉素溶解在2ml的氯仿/乙醇(8∶1，v/v)中，然后上述溶液加入18.5ml的人血白蛋白溶液(10％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(fluko FZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的坦螺旋霉素蛋白纳米粒直径在85-105nm，混悬液呈半透明状。
所得坦螺旋霉素白蛋白纳米粒混悬液使用5％甘露醇溶液作为透析液，采用实施例16中柱分离的方法得到纯粒子，经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中环孢菌素含量，根据含量调整装量，为50mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥72小时即可。
所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和坦螺旋霉素含量，得出白蛋白与坦螺旋霉素的比例为0.62∶1。
实施例50.异丙酚白蛋白纯粒子的制备
将603mg的异丙酚溶解在6ml的氯仿/乙醇(10∶1，v/v)中，然后上述溶液加入73ml的人血白蛋白溶液(10％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(fluko FZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的异丙酚白蛋白纳米粒直径在70-115nm，混悬液呈半透明状。
所得异丙酚白蛋白纳米粒混悬液采用实施例17中离心的方法分离纳米粒子，离心条件为21000×g离心60分钟，弃去上清液得到纯粒子。纯粒子加入5％甘露醇溶液重悬，将重悬液经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中异丙酚含量，根据含量调整装量，为50mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥72小时即可。
所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和异丙酚含量，得出白蛋白与异丙酚的比例为0.58∶1。
实施例51.硫酸长春碱白蛋白纯粒子的制备
将1.25g的硫酸长春碱溶解在10ml的氯仿/乙醇(10∶1，v/v)中，然后上述溶液加入202ml的人血白蛋白溶液(5％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(fluko FZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的硫酸长春碱白蛋白纳米粒直径在90-130nm，混悬液呈半透明状。
所得硫酸长春碱白蛋白纳米粒混悬液采用实施例15中5％甘露醇透析的方法得到纯粒子。经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中硫酸长春碱含量，根据含量调整装量，为50mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥72小时即可。
所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和硫酸长春碱含量，得出白蛋白与硫酸长春碱的比例为0.23∶1。
实施例52.依西美坦白蛋白纯粒子的制备
将155mg的依西美坦溶解在3ml的氯仿/乙醇(6∶1，v/v)中，然后上述溶液加入27ml的人血白蛋白溶液(5％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(fluko FZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的依西美坦白蛋白纳米粒直径在70-100nm，混悬液呈半透明状。
所得依西美坦白蛋白纳米粒混悬液采用实施例15中5％甘露醇透析的方法得到纯粒子，经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中依西美坦含量，根据含量调整装量，为50mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥72小时即可。
所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和依西美坦含量，得出白蛋白与依西美坦的比例为0.19∶1。
实施例53.氟他胺白蛋白纯粒子的制备
将189mg的氟他胺溶解在2ml的氯仿/乙醇(6∶1，v/v)中，然后上述溶液加入38ml的人血白蛋白溶液(8％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(fluko FZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的氟他胺白蛋白纳米粒直径在100-120nm，混悬液呈半透明状。
所得氟他胺白蛋白纳米粒混悬液使用5％右旋糖酐溶液作为透析液，采用实施例16中柱分离的方法得到纯粒子，经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中氟他胺含量，根据含量调整装量，为50mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥60小时即可。
所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和氟他胺含量，得出白蛋白与氟他胺的比例为0.35∶1。
实施例54.氟维司群白蛋白纯粒子的制备
将350mg的氟维司群溶解在3ml的氯仿/乙醇(6∶1，v/v)中，然后上述溶液加入67ml的人血白蛋白溶液(5％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(fluko FZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的氟维司群白蛋白纳米粒直径在105-150nm，混悬液呈半透明状。
所得氟维司群白蛋白纳米粒混悬液使用10％乳糖溶液作为透析液，采用实施例16中柱分离的方法得到纯粒子，经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中氟维司群含量，根据含量调整装量，为20mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥60小时即可。
所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和氟维司群含量，得出白蛋白与氟维司群的比例为0.29∶1。
实施例55.司莫司汀白蛋白纯粒子的制备
将650mg的司莫司汀溶解在5ml的氯仿/乙醇(6∶1，v/v)中，然后上述溶液加入89ml的人血白蛋白溶液(4％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(fluko FZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的司莫司汀白蛋白纳米粒直径在85-120nm，混悬液呈半透明状。
所得司莫司汀白蛋白纳米粒混悬液采用实施例11中离心的方法分离纳米粒子，离心条件为21000×g离心60分钟，弃去上清液得到纯粒子。纯粒子加入5％甘露醇溶液重悬，将重悬液经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中司莫司汀含量，根据含量调整装量，为20mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥70小时即可。
所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和司莫司汀含量，得出白蛋白与司莫司汀的比例为0.58∶1。
实施例55.司莫司汀白蛋白纯粒子的制备
将650mg的司莫司汀溶解在5ml的氯仿/乙醇(6∶1，v/v)中，然后上述溶液加入89ml的人血白蛋白溶液(4％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(fluko FZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的司莫司汀白蛋白纳米粒直径在85-120nm，混悬液呈半透明状。
所得司莫司汀白蛋白纳米粒混悬液采用实施例11中离心的方法分离纳米粒子，离心条件为21000×g离心60分钟，弃去上清液得到纯粒子。纯粒子加入5％甘露醇溶液重悬，将重悬液经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中司莫司汀含量，根据含量调整装量，为20mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥70小时即可。
所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和司莫司汀含量，得出白蛋白与司莫司汀的比例为0.58∶1。
实施例56.硫代秋水仙碱二聚体白蛋白纯粒子的制备
将456mg的硫代秋水仙碱二聚体溶解在5ml的氯仿/乙醇(9∶1，v/v)中，然后上述溶液加入58ml的人血白蛋白溶液(8％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(fluko FZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的硫代秋水仙碱二聚体白蛋白纳米粒直径在65-90nm，混悬液呈半透明状。
所得硫代秋水仙碱二聚体白蛋白纳米粒混悬液使用10％乳糖溶液作为透析液，采用实施例16中柱分离的方法得到纯粒子，经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中硫代秋水仙碱二聚体含量，根据含量调整装量，为20mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥70小时即可。
所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和硫代秋水仙碱二聚体含量，得出白蛋白与硫代秋水仙碱二聚体的比例为0.37∶1。
实施例57.布洛芬白蛋白纯粒子的制备
将348mg的布洛芬溶解在3ml的氯仿/乙醇(11∶1，v/v)中，然后上述溶液加入62ml的人血白蛋白溶液(5％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(fluko FZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的布洛芬白蛋白纳米粒直径在65-90nm，混悬液呈半透明状。
所得布洛芬白蛋白纳米粒混悬液使用5％右旋糖酐作为透析液，采用实施例16中柱分离的方法得到纯粒子，经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中布洛芬含量，根据含量调整装量，为20mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥50小时即可。
所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和布洛芬含量，得出白蛋白与布洛芬的比例为0.19∶1。
讨论：
在本发明之前，已有现有技术，例如CN1237901A和US7820788公开了人血清白蛋白与药物活性成分形成的组合物，但是其中所采用的都是较高的白蛋白：活性成分比例(例如9∶1)。本发明人出人意料地发现，在以较高的白蛋白：活性成分比例(例如9∶1)制得的制剂中，大量的白蛋白仅仅作为冻干制品中的保护剂和支撑剂存在，绝大多数药物(例如紫杉醇)包裹于纳米粒子中，未形成粒子的白蛋白基本上不含有药物。在现有技术的制剂中，大量的人血清白蛋白并没有与药物结合。在这些现有技术制剂给药以后，粒子迅速崩解，药物与人体内的人血清白蛋白结合成复合物，因此多余的人血清白蛋白并不会对制剂的疗效做出贡献(参见实施例26)，反而由于其可能存在的免疫原性增加安全风险(参见实施例25和27)，并且由于白蛋白自身聚集(参见实施例32)或降解引起的安全风险也是值得考虑的。
基于此，本发明人通过降低白蛋白：活性成分比例获得了本发明的纳米粒子，并且证实仅需要少量的人血清白蛋白就可以与药物形成稳定的纳米粒子，而且本发明的纳米粒子表现出了更加优异的性质。
本公开得到的纳米粒子包含极少量人血清白蛋白与大量活性物质，可以保证在储存期内纳米粒子之间不会聚集，在给药后粒子能够迅速崩解与自身白蛋白结合在体内循环。本公开的纳米粒子与现有白蛋白结合药物的技术相比能显著降低普通剂型制剂的不良反应，提高给药剂量，两者在动物安全性和有效性上并未发现显著差异，但是本公开可以降低外源白蛋白可能引起的不良反应的发生机率，降低制剂中辅料成本，并且可以避免与其他患者争夺紧缺的白蛋白资源。
在本申请中，引用了多个出版物，这些出版物的公开以整体通过引用并入本申请，以更完整的描述与本发明相关的技术的状态。
尽管通过公开的实施方案描述了本发明，本领域技术人员应当容易理解，具体的实施例和上文详述的研究只是对本发明的举例说明。应当理解在不脱离本发明精神的情况下，可作出各种修改。因此，本发明只受所附权利要求的限制。
Claims (19)
1.一种治疗性纳米粒子，其包含活性成分和人血清白蛋白，其中所述治疗性纳米粒子中人血清白蛋白和活性成分的重量比选自0.01∶1、0.02∶1、0.04∶1、0.05∶1、0.06∶1、0.07∶1、0.08∶1、0.09∶1、0.10∶1、0.11∶1、0.12∶1、0.13∶1、0.14∶1、0.15∶1、0.16∶1、0.17∶1、0.18∶1、0.19∶1、0.2∶1、0.21∶1、0.22∶1、0.23∶1、0.24∶1、0.25∶1、0.26∶1、0.27∶1、0.28∶1、0.29∶1、0.3∶1、0.31∶1、0.32∶1、0.33∶1、0.34∶1、0.35∶1、0.36∶1、0.37∶1、0.38∶1、0.39∶1、0.4∶1、0.41∶1、0.42∶1、0.43∶1、0.44∶1、0.45∶1、0.46∶1、0.47∶1、0.48∶1、0.49∶1、0.5∶1、0.51∶1、0.52∶1、0.53∶1、0.54∶1、0.55∶1、0.56∶1、0.57∶1、0.58∶1、0.59∶1、0.6∶1、0.65∶1、0.70∶1、0.75∶1、0.8∶1、0.85∶1、0.9∶1、0.95∶1、1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1、3.5∶1、4∶1、4.5∶1、5∶1、5.5∶1、6∶1、6.5∶1、7∶1、7.5∶1、8∶1、8.5∶1或上述任意两个比例之间的范围。
2.如权利要求1所述的治疗性纳米粒子，其中人血清白蛋白和活性成分的重量比选自0.03∶1、0.04∶1、0.05∶1、0.06∶1、0.07∶1、0.08∶1、0.09∶1、0.10∶1、0.11∶1、0.12∶1、0.13∶1、0.14∶1、0.15∶1、0.16∶1、0.17∶1、0.18∶1、0.19∶1、0.2∶1、0.21∶1、0.22∶1、0.23∶1、0.24∶1、0.25∶1、0.26∶1、0.27∶1、0.28∶1、0.29∶1、0.3∶1、0.31∶1、0.32∶1、0.33∶1、0.34∶1、0.35∶1、0.36∶1、0.37∶1、0.38∶1、0.39∶1、0.4∶1、0.41∶1、0.42∶1、0.43∶1、0.44∶1、0.45∶1、0.46∶1、0.47∶1、0.48∶1、0.49∶1、0.5∶1、、0.6∶1、0.7∶1、0.8∶1、0.9∶1或上述任意两个比例之间的范围，例如0.03∶1至0.19∶1或0.21∶1至0.9∶1。
3.如权利要求1所述的治疗性纳米粒子，其中所述活性成分具有以下特性：水中不溶或微溶、在特定有机溶剂中可溶或易溶。
4.如权利要求3所述的治疗性纳米粒子，其中所述活性成分选自紫杉烷类药物，其包括但不限于紫杉醇、多烯紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛、多西他赛亲脂衍生物；大环内酯类药物，其包括但不限于雷帕霉素及其衍生物、埃博霉素B及其衍生物，坦螺旋霉素及其衍生物等；喜树碱类药物，其包括但不限于10-羟基喜树碱、SN38及其衍生物等；蒽环类药物，其包括但不限于阿柔比星、吡柔比星等；以及其他活性成分包括秋水仙碱及其衍生物、硫代秋水仙碱二聚体、胺碘达隆、碘塞罗宁、环孢菌素、依西美坦、氟他胺、氟维司群、罗米地辛、司莫司汀、长春碱、布洛芬等。
5.如权利要求4所述的治疗性纳米粒子，其中所述活性成分选自紫杉烷类，优选地选自紫杉醇和多西他赛中的一种或多种。
6.如权利要求3所述的治疗性纳米粒子，其中所述特定有机溶剂为水中溶解度低、沸点低的纯溶剂或者其与乙醇、叔丁醇、异丙醇等小分子醇类的混合溶剂，包括但不限于三氯甲烷、二氯甲烷等。
7.如权利要求1所述的治疗性纳米粒子，其中所述活性成分包裹在人血清白蛋白内。
8.如权利要求1所述的治疗性纳米粒子，其中治疗性纳米粒子的平均粒径选自：30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、165、170、175、180、185、190、195、200nm、或上述任意两个数值之间的范围。
9.一种治疗性纳米粒子，其包含活性成分和人血清白蛋白，活性成分包裹在人血清白蛋白内；人血清白蛋白和活性成分的重量比在0.03∶1至0.7∶1之间；治疗性纳米粒子的平均粒径在50nm至190nm之间。
10.一种药物组合物，其含有如权利要求1-9任一项所述的治疗性纳米粒子。
11.如权利要求10所述的药物组合物，其中所述药物组合物为液体或冻干粉形式。
12.如权利要求10所述的药物组合物，当所述药物组合物为冻干粉形式时，还含有冻干赋形剂。
13.如权利要求12所述的药物组合物，其中所述冻干赋形剂选自甘露醇、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、右旋糖酐、人血清白蛋白中的一种或多种。
14.一种制备如权利要求1-9中任一项所述的治疗性纳米粒子的方法，含有如下步骤：
1)将活性成分溶解于有机溶剂中形成油相，将人血清白蛋白溶解于水中形成水相；
2)将上述油相和水相形成水包油的乳剂；
3)去除乳剂中的有机溶剂，得到含治疗性纳米粒子的混悬液；
4)分离获得治疗性纳米粒子。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述有机溶剂选自氯仿和乙醇中的一种或多种。
16.如权利要求14所述的方法，其中步骤4)中所述分离是通过选自如下的方法进行的：离心、透析、和排阻色谱。
17.一种制备如权利要求10-13中任一项所述的药物组合物的方法，含有如下步骤：
1)将活性成分溶解于有机溶剂中形成油相，将人血清白蛋白溶解于水中形成水相；
2)将上述油相和水相形成水包油的乳剂；
3)去除乳剂中的有机溶剂，得到含治疗性纳米粒子的混悬液；
4)分离获得治疗性纳米粒子；
5)采用含有赋形剂的溶液将治疗性纳米粒子重悬；
6)任选地冻干，得到所述药物组合物。
18.一种制备如权利要求10-13中任一项所述的药物组合物的方法，含有如下步骤：
1)将活性成分溶解于有机溶剂中形成油相，将人血清白蛋白溶解于水中形成水相；
2)将上述油相和水相形成水包油的乳剂；
3)去除乳剂中的有机溶剂，得到含治疗性纳米粒子的混悬液；
4)使用含有赋形剂的溶液对去除有机溶剂后得到的混悬液进行透析；
5)任选地冻干，得到所述药物组合物。
19.一种治疗癌症的方法，其包括：
向受试者施用治疗有效量的如权利要求1-9任一项所述治疗性纳米粒子或如权利要求10-13任一项所述药物组合物的步骤。
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |