CN104378976A

CN104378976A - 人源化il-7啮齿动物

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Publication number: CN104378976A
Application number: CN201380031333.4A
Authority: CN
Inventors: A·J·莫菲
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2012-06-18
Filing date: 2013-06-14
Publication date: 2015-02-25
Anticipated expiration: 2033-06-14
Also published as: PL2859793T3; MX363540B; US9737059B2; US20180360007A1; US20190343093A1; AU2013277457B2; SG11201407370QA; SG10201609569PA; NZ702943A; IL235773B; US9232776B2; JP6174134B2; US20160052986A1; ES2626965T3; US8962913B2; PT2859793T; CN104378976B; BR112014029892A2; US20130340104A1; SMT201700313T1

Abstract

包含人或人源化白介素-7(IL-7)基因的基因修饰非人动物。包含人或人源化IL-7基因的细胞、胚胎和非人动物。表达人或人源化IL-7蛋白的啮齿动物。在其种系中包含编码人或人源化IL-7的基因的基因修饰小鼠，其中所述编码人或人源化IL-7的基因处于内源小鼠IL-7调控序列的控制之下。

Description

人源化IL-7啮齿动物

发明领域

包含遗传修饰的非人动物(例如，哺乳动物，例如啮齿动物，诸如小鼠、大鼠和仓鼠)，所述遗传修饰包括在内源基因座处用人IL-7基因序列对非人IL-7基因序列进行置换。啮齿动物和其他非人动物，其从处于内源非人调控序列的控制之下的基因座中，或者从包含内源非人调控序列的内源非人IL-7基因座中，表达人IL-7或人源化IL-7。

发明背景

随机插入了包含人IL-7序列的转基因的转基因小鼠是本领域中已知的。然而，大多数(如果不是所有)的这些转基因小鼠在一个方面或另一个方面不是最佳的。例如，大多数的在人IL-7方面而言转基因的小鼠展现出异常水平和/或比例的某些细胞(包括T细胞)，这很可能归因于免疫细胞发育(例如T细胞发育)的失调。

在本领域中仍然需要包含编码人IL-7的序列的非人动物，其中所述编码人IL-7的序列位于内源非人IL-7基因座处，和需要在内源非人调控元件的控制之下表达人IL-7的非人动物。在本领域中需要这样的非人动物，其以尽可能地在该非人动物中在生理学上适当的方式表达人IL-7。在本领域中需要表达人IL-7的非人动物，其中所述非人动物在外周T细胞方面和/或在T细胞亚型的比例方面没有显著异常。

发明简述

提供了基因修饰非人动物、细胞、组织和核酸，其在内源非人IL-7基因座处包含人IL-7基因组序列。所述非人动物从经修饰的基因座中表达人源化IL-7蛋白，所述经修饰的基因座由该经修饰的内源IL-7基因座的一个或多个内源非人调控序列进行调控。在各种不同的实施方案中，所述非人动物为啮齿动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠等。在一个特别的实施方案中，所述啮齿动物为小鼠或大鼠。

在各种不同的实施方案和方面中，所述非人动物在该非人动物的种系中在经修饰的内源IL-7基因座处包含经修饰的IL-7基因，其中所述经修饰的内源IL-7基因座包含该内源IL-7基因的至少一部分的人源化。在各种不同的实施方案中，所述小鼠在经修饰的IL-7基因座方面而言是杂合的或纯合的。在一个实施方案中，提供了非人动物，其包含第一个内源IL-7等位基因的缺乏和第二个内源IL-7等位基因的人源化。在各种不同的实施方案和方面中，所述人源化涉及一个或多个外显子和/或内含子。在各种不同的实施方案和方面中，提供了具有经修饰的IL-7基因座的非人动物，其中在该经修饰的动物中保留了内源非人5’-非翻译区和内源非人3’-非翻译区之一或两者。

在一些方面，本发明的非人动物包含有包含在SEQ ID NO:1之内的5’-非翻译区。在一些方面，本发明的非人动物包含有包含在SEQID NO:2之内的3’-非翻译区。在一些实施方案中，本发明的非人动物包含有包含在SEQ ID NO:1之内的5’-非翻译区和包含在SEQ IDNO:2之内的3’-非翻译区。

在一些方面，本发明的非人动物包含是SEQ ID NO:1的5’-非翻译区。在一些方面，本发明的非人动物包含是SEQ ID NO:2的3’-非翻译区。在一些方面，本发明的非人动物包含是SEQ ID NO:1的5’-非翻译区和是SEQ ID NO:2的3’-非翻译区。

在一些方面，本发明的人源化IL-7基因具有与包含人IL-7基因的外显子2-6的连续序列至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)同一的序列。在一些确定的方面，本发明的人IL-7基因包含SEQ ID NO:3。在一些方面，本发明的人源化IL-7基因具有反映出图1中所示的人源化的序列。

在一个方面，提供了基因修饰啮齿动物，其在内源啮齿动物IL-7基因座处包含用人IL-7基因组序列对内源啮齿动物IL-7基因组序列进行的置换。

在一个实施方案中，所述基因修饰啮齿动物包含位于人IL-7基因组序列上游(相关于IL-7基因的转录方向而言)的第一啮齿动物调控序列和位于人IL-7基因组序列下游的第二啮齿动物调控序列。在一个实施方案中，所述第一啮齿动物调控序列包含啮齿动物启动子和/或增强子，和所述第二啮齿动物调控序列包含3’-UTR。

在一个实施方案中，所述啮齿动物为小鼠并且包含具有小鼠外显子1和人外显子2、3、4、5和6的内源小鼠IL-7基因座位。在一个实施方案中，所述内源小鼠IL-7基因座位从上游至下游(相关于转录方向而言)包含：小鼠外显子1，至少一部分的第一小鼠内含子，和邻接的包含人外显子2至人外显子6的人基因组片段。在一个实施方案中，所述小鼠进一步包含邻接的内源小鼠DNA序列，其包含完整的内源小鼠IL-7上游(相关于IL-7基因的转录方向而言)启动子和调控区，其中所述邻接的小鼠DNA位于所述人基因组片段的上游；和进一步包含邻接的位于所述人基因组片段的下游的内源小鼠DNA3’-UTR序列。

在一个实施方案中，所述小鼠包含与选自SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2及其组合的序列至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的小鼠序列。在一个特别的实施方案中，所述小鼠包含选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的小鼠序列。

在一个方面，提供了基因修饰小鼠，其在内源小鼠IL-7基因座处包含用人IL-7基因组序列对内源小鼠IL-7基因组序列进行的置换，从而形成经修饰的基因座，其中所述人IL-7基因组序列包含至少一个人外显子，并且所述经修饰的基因座包含选自SEQ ID NO:1的序列、SEQ ID NO:2的序列及其组合的小鼠序列。

在一个实施方案中，所述置换包括含有外显子2至6的人基因组片段，并且所述人基因组片段与小鼠外显子1相连接从而形成经修饰的内源小鼠IL-7基因座，其中所述经修饰的小鼠IL-7基因座包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及其组合的小鼠序列。

在一个方面，提供了基因修饰啮齿动物，其包含IL-7基因，该IL-7基因包含啮齿动物外显子1和至少一部分的啮齿动物内含子1，以及人IL-7外显子2、3、4、5和6的人IL-7基因序列，其中所述啮齿动物包含选自啮齿动物上游IL-7调控序列、啮齿动物IL-73’-UTR及其组合的序列。

在一个方面，提供了基因修饰小鼠，其包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及其组合的序列；其中所述小鼠缺乏编码小鼠IL-7蛋白的外显子2至5的内源序列，并且所述小鼠在内源小鼠IL-7基因座处包含核酸序列，其中该核酸序列编码人IL-7外显子2、3、4、5和6。

在一个方面，提供了基因修饰啮齿动物，其从经修饰从而表达至少一个人IL-7外显子的内源啮齿动物IL-7基因座中表达人或人源化IL-7蛋白。在一个实施方案中，修饰所述啮齿动物IL-7基因座以表达由包含至少两个人IL-7外显子的序列所编码的人或人源化IL-7蛋白。在一个实施方案中，修饰所述啮齿动物IL-7基因座以表达由包含至少三个人IL-7外显子的序列所编码的人或人源化IL-7蛋白。在一个实施方案中，修饰所述啮齿动物IL-7基因座以表达由至少包含人IL-7外显子2、3、4、5和6(即2至6)的序列所编码的人或人源化IL-7蛋白。在一个实施方案中，修饰所述啮齿动物IL-7基因座以表达人IL-7蛋白。在一些确定的方面，修饰所述啮齿动物IL-7基因座以表达其序列反映了由在图1中显示的基因座所编码的蛋白的人IL-7蛋白。在一些确定的方面，修饰所述啮齿动物IL-7基因座以表达包含由人IL-7基因的外显子2-6所编码的序列的人IL-7蛋白。在一些确定的方面，修饰所述啮齿动物IL-7基因座以表达包含由在SEQ ID NO:3中所示的人IL-7基因的外显子2-6所编码的序列的人IL-7蛋白。

在一个方面，提供了基因修饰啮齿动物，其从经修饰从而至少包含人IL-7外显子2至6(代替啮齿动物IL-7外显子2至5)的内源啮齿动物IL-7基因座中表达人或人源化IL-7蛋白。

在一个方面，提供了基因修饰啮齿动物，其从包含人源化内源啮齿动物IL-7编码区的人源化内源啮齿动物IL-7基因座中表达人或人源化IL-7蛋白，其中所述人源化内源啮齿动物IL-7基因座包含所有的在野生型啮齿动物中存在于野生型啮齿动物IL-7编码区上游和存在于野生型啮齿动物IL-7编码区下游的内源啮齿动物调控元件。

在一个方面，提供了基因修饰啮齿动物，其从包含位于编码人或人源化IL-7蛋白的核酸序列上游和下游的啮齿动物调控区的人源化啮齿动物IL-7基因座中表达人或人源化IL-7蛋白，其中所述人或人源化IL-7蛋白以与在野生型啮齿动物中啮齿动物IL-7蛋白的表达图式大致相同的表达图式进行表达。在一个实施方案中，所述人或人源化IL-7的血清表达水平与在野生型啮齿动物中啮齿动物IL-7蛋白的血清表达水平大致相同。

在一个方面，提供了基因修饰啮齿动物，其表达人源化IL-7蛋白，其中该啮齿动物的淋巴细胞群的特征为在数目上与在年龄匹配的野生型小鼠中的B细胞群大致相同的其B细胞群。在一个实施方案中，所述经修饰的啮齿动物的特征为在数目上与在年龄匹配的野生型小鼠中的成熟B细胞群大致相同的成熟B细胞群。在一个实施方案中，所述人源化IL-7蛋白与人IL-7蛋白是同一的。在一个实施方案中，所述人源化IL-7蛋白包含由至少人IL-7基因的外显子2至6所编码的人序列。

在一个方面，提供了基因修饰啮齿动物，其表达人源化IL-7蛋白，其中该啮齿动物的淋巴细胞群的特征为在数目上与在年龄匹配的野生型小鼠中的T细胞群大致相同的T细胞群。在一个实施方案中，所述经修饰的啮齿动物展现出在数目上与在年龄匹配的野生型小鼠中的成熟T细胞群大致相同的成熟T细胞群。在一个实施方案中，所述经修饰的啮齿动物展现出在数目上与在年龄匹配的野生型小鼠中的外周T细胞群大致相同的外周T细胞群。在一个实施方案中，所述人源化IL-7蛋白与人IL-7蛋白是同一的。在一个实施方案中，所述人源化IL-7蛋白包含由至少人IL-7基因的外显子2至6所编码的人序列。

在一个方面，提供了基因修饰啮齿动物，其表达人源化IL-7蛋白，其中该啮齿动物的淋巴细胞群的特征为这样的T细胞群，所述T细胞群展现出与在年龄匹配的野生型小鼠中的T细胞群的CD4:CD8比例大致相同的CD4:CD8比例。在一个实施方案中，所述人源化IL-7蛋白与人IL-7蛋白是同一的。在一个实施方案中，所述人源化IL-7蛋白包含由至少人IL-7基因的外显子2至6所编码的人序列。

在一个方面，提供了基因修饰啮齿动物，其表达人源化IL-7蛋白，其中所述啮齿动物包含选自下列的特征：没有发展出慢性结肠炎的倾向；没有在结肠粘膜淋巴细胞中IL-7的过表达；在结肠粘膜淋巴细胞中IL-7的正常的或野生型的表达；没有严重皮炎；没有以单核细胞的大量真皮浸润为特征的皮炎；在其T细胞群中展现出与年龄匹配的野生型小鼠的CD4:CD8比例大致相同的CD4:CD8比例；展现出与在野生型小鼠中小鼠IL-7的表达图式大致相同的人IL-7的表达图式；以及其组合。

在一个方面，提供了基因修饰啮齿动物，其表达人源化IL-7蛋白，其中所述啮齿动物没有发展出慢性结肠炎的倾向。

在一个方面，提供了基因修饰啮齿动物，其表达人源化IL-7蛋白，其中所述啮齿动物不展现出在结肠粘膜淋巴细胞中IL-7的过表达。

在一个方面，提供了基因修饰啮齿动物，其表达人源化IL-7蛋白，其中所述啮齿动物不展现出以单核细胞的大量真皮浸润为特征的皮炎。

在一个方面，提供了基因修饰啮齿动物，其表达人源化IL-7蛋白，其中所述啮齿动物不展现出进入真皮的淋巴组织增生。

在一个方面，提供了基因修饰啮齿动物，其表达人源化IL-7蛋白，其中所述啮齿动物不以比年龄匹配的野生型小鼠更高的频率展现出B和/或T细胞淋巴瘤。

在一个方面，提供了基因修饰小鼠，其表达人源化IL-7蛋白或人IL-7蛋白，其中所述小鼠不比野生型小鼠更倾向于发展出选自下列的病理学状态：结肠炎，慢性结肠炎，严重皮炎，单核细胞对于真皮的病理学和/或大量浸润，真皮的淋巴组织增生，B细胞淋巴瘤，T细胞淋巴瘤，成熟B和/或T细胞的数目减少，外周B和/或T细胞的数目减少，异常的CD4+T细胞数目，异常的CD8+T细胞数目，以及其组合。

在一些方面，提供了基因修饰小鼠，其表达人IL-7蛋白，所述人IL-7蛋白的序列反映了用人IL-7基因序列对小鼠IL-7基因序列进行的置换，其中所述人IL-7基因序列包含人IL-7基因的外显子2-6。在一些确定的方面，所述置换涉及包含小鼠IL-7基因的外显子2-5的序列。在一些确定的方面，人IL-7基因包含SEQ ID NO:3。在一些确定的方面，所述人IL-7蛋白的表达处于小鼠调控元件的控制之下。

在一些方面，提供了基因修饰小鼠，其没有可检测地表达小鼠IL-7蛋白。在一些确定的方面，在本文中所描述的小鼠基因组包含小鼠IL-7基因的全部或部分缺失。在一些确定的方面，在本文中所描述的小鼠基因组包含相应于外显子2-5的内源IL-7基因序列的缺失。

在一个方面，提供了基因修饰非人动物，其在其种系中包含用至少一个人IL-7外显子对至少一个非人IL-7外显子进行的置换，从而形成编码人或人源化IL-7的基因，其中所述置换位于内源非人IL-7基因座处，其中所述编码人或人源化IL-7的基因处于内源非人调控元件的控制之下。

在一个实施方案中，所述基因修饰非人动物为啮齿动物。在一个实施方案中，所述啮齿动物选自大鼠和小鼠。

在一个实施方案中，所述编码人或人源化IL-7的基因包含选自下列的人外显子：人外显子1、人外显子2、人外显子3、人外显子4、人外显子5、人外显子6及其组合。在一个实施方案中，所述编码人或人源化IL-7的基因包含选不多于五个人外显子。

在一个实施方案中，所述基因修饰非人动物为啮齿动物，所述啮齿动物为小鼠，并且所述经修饰的基因座包含用包含人IL-7外显子2、3、4、5和6的人基因组区段对小鼠外显子2、3、4和5进行的置换。

在一个实施方案中，所述编码人或人源化IL-7的基因包含编码人或人源化IL-7蛋白的cDNA。

在一个方面，提供了基因修饰非人动物，其在其种系中包含转基因，所述转基因包含编码人或人源化IL-7基因的核酸序列，其中所述人或人源化IL-7基因在上游和下游在侧翼与内源非人调控序列相接。

在一个方面，所述基因修饰非人动物为啮齿动物。在一个实施方案中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。

在一个实施方案中，所述基因修饰非人动物包含选自下列的人外显子：人外显子1、人外显子2、人外显子3、人外显子4、人外显子5、人外显子6及其组合。在一个实施方案中，所述人或人源化IL-7基因包含至少五个人外显子。

在一个方面，提供了人源化IL-7基因座，其包含非人外显子1、人外显子2、人外显子3、人外显子4、人外显子5和人外显子6。在一些确定的方面，所述人源化IL-7基因座进一步包含位于非人外显子1和人外显子6侧翼的5’和3’非人非翻译区。在一些确定的实施方案中，所述人源化IL-7基因座包含与非人3’非翻译区邻接的3’人非翻译区或其部分。在一些确定的方面，所述人源化IL-7基因座包含5’非人非翻译区或其部分，和非人外显子1，其与人外显子2邻接。在一些确定的方面，人源化IL-7基因座包含图1中所示的结构。

在一个方面，提供了人源化IL-7基因座，其包含可操作地连接至非人IL-7调控序列的人IL-7基因的人外显子2-6。在一些确定的方面，本发明的人源化IL-7基因座包含非人IL-7外显子1。在一些确定的方面，本发明的人源化IL-7基因座包含非人IL-7外显子1和非人IL-7内含子1。在一些确定的实施方案中，本发明的人源化IL-7基因座包含与非人IL-73’非翻译区或其部分邻接的3’人IL-7非翻译区或其部分。在一些确定的方面，本发明的人源化IL-7基因座包含5’非人非翻译区或其部分，和非人外显子1，其与人IL-7外显子2邻接。

在一个方面，提供了人源化IL-7基因座，其包含编码实质上是人的IL-7蛋白的序列。在一些确定的方面，本发明的人源化IL-7基因座包含与SEQ ID NO:3至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一的序列。在一些确定的方面，本发明的人源化IL-7基因座包含SEQ ID NO:3。在一些确定的方面，本发明的IL-7蛋白由与SEQ ID NO:3至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一的序列编码。在一些确定的方面，本发明的IL-7蛋白由SEQ ID NO:3编码。

在一个方面，提供了用于制备具有编码人或人源化IL-7的基因的非人动物的方法，所述方法包括修饰所述非人动物的种系以包含编码人或人源化IL-7的基因，该编码人或人源化IL-7的基因在上游和下游在侧翼与内源非人IL-7调控序列相接。

在所述方法的一个实施方案中，所述修饰位于内源非人IL-7基因座处。

在所述方法的一个实施方案中，所述非人动物为啮齿动物。在一个实施方案中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。

在一个方面，提供了基因修饰非人动物，其进行了基因修饰从而以与对于相同属和种的野生型非人动物所观察到的表达图式相同的表达图式来表达人IL-7。在一个实施方案中，所述非人动物为啮齿动物。在一个特别的实施方案中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。

在一个实施方案中，在所述非人动物中表达的人IL-7的水平与在相应的野生型小鼠中非人IL-7的水平大致相同。在一个实施方案中，所述非人动物为啮齿动物。在一个特别的实施方案中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。

在一个方面，提供了DNA构建体，其从5’至3’(相关于转录方向而言)包含：与小鼠IL-75’非编码序列同源的核酸序列；编码人IL-7蛋白但不包含位于编码人IL-7蛋白的序列上游或下游的人调控序列的人基因组片段；和与小鼠IL-73’非编码序列同源的核酸序列。

在一个方面，提供了DNA构建体，其从5’至3’(相关于转录方向而言)包含：包含与小鼠IL-7外显子1序列具有同源性的区域的核酸序列；编码人IL-7蛋白但不包含位于编码人IL-7蛋白的序列上游或下游的人调控序列的人基因组片段；和与小鼠IL-73’非编码序列同源的核酸序列。

在一个方面，提供了基因修饰啮齿动物，其中所述啮齿动物包含在本文中所描述的DNA构建体。

在一个方面，提供了在本文中所描述的DNA构建体用于制备表达人IL-7蛋白的啮齿动物或啮齿动物细胞的用途。在一些确定的方面，所述啮齿动物或啮齿动物细胞没有可检测地表达啮齿动物IL-7蛋白。

在一个方面，提供了基因修饰啮齿动物细胞，其中所述啮齿动物细胞在内源啮齿动物IL-7基因座处包含用编码人IL-7的人基因组序列对编码啮齿动物IL-7的基因序列进行的置换。在一些确定的方面，所述置换用在本文中所描述的DNA构建体来进行。在一些确定的方面，所述啮齿动物细胞为大鼠细胞。在一些确定的方面，所述啮齿动物细胞为小鼠细胞。

在一个实施方案中，所述人基因组序列包含邻接的跨越人IL-7外显子2至人IL-7外显子6的人核酸序列。

在一个实施方案中，所述基因修饰啮齿动物在内源啮齿动物IL-7基因座处包含小鼠IL-7启动子。

在一个实施方案中，所述细胞选自多能细胞、诱导型多能细胞、全能细胞、ES细胞和卵子。

在一个实施方案中，所述细胞分泌人IL-7。在一个实施方案中，所述分泌人IL-7的细胞选自上皮细胞(例如，肠上皮细胞)、肝细胞、角质形成细胞、树突细胞和小结树突细胞。在一个实施方案中，所述啮齿动物细胞为骨髓树突细胞。在一个实施方案中，所述分泌人IL-7的细胞为胸腺基质细胞；在一个特别的实施方案中，所述胸腺基质细胞为皮质上皮细胞。

在一个方面，提供了啮齿动物胚胎，其中所述胚胎包含至少一个啮齿动物供体细胞(例如，ES细胞、多能细胞、全能细胞等)，所述啮齿动物供体细胞在内源啮齿动物IL-7基因座处包含用编码人IL-7的核酸序列对内源的编码啮齿动物IL-7的核酸序列进行的置换。在一个实施方案中，所述供体细胞为小鼠ES细胞，并且所述胚胎为宿主小鼠胚胎，其是前桑椹胚、桑椹胚或胚泡。

在一个方面，提供了在内源啮齿动物IL-7基因座处包含人源化IL-7基因的啮齿动物组织，其中所述啮齿动物组织选自胸腺组织、脾组织、表皮组织和肠组织。

在一个方面，提供了基因修饰小鼠，其包含编码人IL-7的DNA序列，其中所述小鼠不表达小鼠IL-7，并且其中所述小鼠展现出具有与野生型小鼠的T细胞群大致相同的大小的T细胞群。

在一个实施方案中，所述小鼠展现出具有与野生型小鼠的外周T细胞群大致相同的大小的外周T细胞群。

在一个实施方案中，所述T细胞群为小鼠T细胞群。

在一个实施方案中，所述小鼠不比野生型小鼠更倾向于发展出包含原B细胞或前B细胞的B细胞肿瘤。

在一个实施方案中，所述小鼠不比野生型小鼠更倾向于发展出淋巴样肿瘤。

在一个实施方案中，所述小鼠在已知的淋巴组织增生致病因子不存在下不展现出淋巴组织增生性病症。

在一个实施方案中，所述小鼠不展现出在皮肤层中T细胞的病理学浸润。在一个实施方案中，所述小鼠不展现出脱发的症状。

在一个实施方案中，所述基因修饰小鼠的大多数T细胞在大小分布上与在年龄匹配的野生型小鼠中大致相同。在一个特别的实施方案中，所述基因修饰小鼠不展现出T细胞的扩大。

在一个实施方案中，提供了啮齿动物，其从内源的经修饰的啮齿动物IL-7基因座中表达人源化或人IL-7蛋白，其中在所述啮齿动物中人IL-7的血清浓度是在生理学上正常的。

在一个方面，提供了人源化啮齿动物，其以在生理学上正常的浓度在所述啮齿动物的血清中表达人源化IL-7基因。

在一个实施方案中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。

在一个实施方案中，人IL-7的在生理学上正常的血清浓度小于10pg/mL。在一个实施方案中，人IL-7的在生理学上正常的血清浓度小于5pg/mL。在一个实施方案中，在啮齿动物中人IL-7的在生理学上正常的血清浓度为大约2pg/mL至大约4pg/mL。在一个实施方案中，在啮齿动物血清中人IL-7的在生理学上正常的血清浓度为大约2.4pg/mL至大约3.2pg/mL。

在一个方面，提供了用于制备人IL-7蛋白的方法，所述方法包括在非人动物的种系中插入处于内源非人调控元件的控制之下的编码人或人源化IL-7的基因，允许所述非人动物产生人或人源化IL-7，和从所述非人动物(例如，哺乳动物，例如啮齿动物，诸如小鼠或大鼠或仓鼠)中分离人或人源化IL-7。

在一个方面，提供了用于制备人IL-7蛋白的方法，所述方法包括从在本文中所描述的非人动物(例如，哺乳动物，例如啮齿动物，诸如小鼠或大鼠或仓鼠)中分离。

在一个方面，提供了用于制备在其种系中包含人或人源化IL-7基因的非人动物的方法，所述方法包括在所述非人动物的种系中插入编码人或人源化IL-7的核酸序列或其片段，其中所述编码人或人源化IL-7的核酸序列或其片段处于内源非人调控元件的调控控制之下。在一个实施方案中，所述人或人源化IL-7基因位于内源非人IL-7基因座处(即，插入在所述内源非人IL-7基因座处在上游和下游非人调控元件之间，其中所述编码人或人源化IL-7的核酸序列置换了全部或部分的野生型的现存的非人IL-7编码序列)。在一个实施方案中，所述非人动物为哺乳动物，例如啮齿动物。在一个实施方案中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。

在一个方面，提供了用于制备包含人或人源化IL-7基因的非人动物的方法，所述方法包括将包含人IL-7基因的外显子2-6的DNA构建体插入非人细胞的内源非人IL-7基因中。

在一个方面，提供了用于从非人动物中分离已被暴露至人或人源化IL-7蛋白的T细胞的方法，所述方法包括从在本文中所描述的非人动物中分离T细胞的步骤。在一个实施方案中，所述非人动物为小鼠或大鼠。在一个实施方案中，所述T细胞为非人T细胞，例如啮齿动物T细胞，例如小鼠或大鼠的T细胞。在一个实施方案中，所述T细胞选自在胸腺中的T细胞和外周T细胞。

在一个方面，提供用于鉴定是人IL-7的拮抗剂的试剂的方法，所述方法包括下述步骤：向在本文中所描述的基因修饰啮齿动物施用试剂，测定所述试剂对于在啮齿动物中由人IL-7介导的功能的影响，和如果其拮抗在所述基因修饰啮齿动物中人IL-7的功能，则将所述试剂鉴定为IL-7拮抗剂。

在一个方面，提供了在本文中所描述的基因修饰啮齿动物用于鉴定是人IL-7的拮抗剂的试剂的用途，其包括：向所述基因修饰啮齿动物施用试剂，测定所述试剂对于在啮齿动物中由人IL-7介导的功能的影响，和如果其拮抗在所述基因修饰啮齿动物中人IL-7的功能，则将所述试剂鉴定为IL-7拮抗剂。

在一个实施方案中，所述试剂包括结合IL-7的免疫球蛋白可变结构域。在一个实施方案中，所述试剂特异地结合人IL-7而不结合啮齿动物IL-7。在一个实施方案中，所述试剂为抗体。

在一个方面，提供了用于确定试剂是否减少由IL-7介导的外周T细胞群的方法，所述方法包括下述步骤：向在本文中所描述的基因修饰啮齿动物施用IL-7拮抗剂一段时间，在施用之后在一个或多个时限处测量所述啮齿动物的外周T细胞群数目，和确定所述IL-7拮抗剂是否减少外周T细胞群。

在一个方面，提供了在本文中所描述的基因修饰啮齿动物用于确定试剂是否减少由IL-7介导的外周T细胞群的用途，其包括向所述基因修饰啮齿动物施用IL-7拮抗剂一段时间，在施用之后在一个或多个时限处测量所述啮齿动物的外周T细胞群数目，和确定所述IL-7拮抗剂是否减少外周T细胞群。

在一个方面，所述基因修饰非人动物对于编码人或人源化IL-7的基因而言是杂合的。在一个实施方案中，所述非人动物不能够表达内源IL-7蛋白。在一个特别的实施方案中，所述非人动物包含两个内源IL-7等位基因的敲除。

上面和下面所描述的方面和实施方案中的每一个可以一起使用，除非另有说明和除非另外从上下文看是清楚的。

附图简述

图1描绘了(不是按比例地)野生型小鼠IL-7基因座位(上)和人源化内源小鼠IL-7基因座(下)的示意图。空心符号表明人序列；实心符号表明小鼠序列；加阴影的项目表明非翻译区；加点的区域表明其他序列。

图2描绘了在具有75％C57B6和25％129/SvJ的遗传背景的野生型小鼠(75/25WT)和对于本文中所描述的人源化内源IL-7基因座而言杂合的小鼠(5148Het)的血清中的人IL-7浓度。

发明详述

在各种不同的实施方案中，描述了包含本文中所描述的基因修饰的非人动物。所述基因修饰非人动物可以选自小鼠、大鼠、兔、猪、牛(例如，母牛、公牛、野牛)、鹿、绵羊、山羊、鸡、猫、狗、雪貂、灵长类动物(例如，狨猴、猕猴)。对于其中合适的可进行基因修饰的ES细胞不容易得到的非人动物，使用其他方法来制备包含基因修饰的非人动物。此类方法包括例如，修饰非ES细胞基因组(例如，成纤维细胞或诱导型多能细胞)和采用核转移以将所述经修饰的基因组转移至合适的细胞例如卵母细胞，和在合适的条件下在非人动物中孕育所述经修饰的细胞(例如，经修饰的卵母细胞)以形成胚胎。

在一个方面，所述非人动物为哺乳动物。在一个方面，所述非人动物为小型哺乳动物，例如跳鼠总科(Dipodoidea)或鼠总科(Muroidea)的小型哺乳动物。在一个实施方案中，所述基因修饰动物为啮齿动物。在一个实施方案中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方案中，所述啮齿动物选自鼠总科。在一个实施方案中，所述基因修饰动物来自选自下列的科：美仓鼠科(Calomyscidae)(例如，美仓鼠)，仓鼠科(Cricetidae)(例如，仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)，鼠科(Muridae)(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺鼠、冠毛鼠)，马岛鼠科(Nesomyidae)(攀鼠、岩鼠、白尾鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)，刺睡鼠科(Platacanthomyidae)(例如，刺睡鼠)和瞎鼠科(Spalacidae)(例如，瞎鼠、竹鼠和鼢鼠)。在一个特别的实施方案中，所述基因修饰啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠科)、沙鼠、刺鼠和冠毛鼠。在一个实施方案中，所述基因修饰小鼠来自鼠科的成员。在一个实施方案中，所述动物为啮齿动物。在一个特别的实施方案中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方案中，所述非人动物为小鼠。

在各种不同的实施方案中，所述非人动物为啮齿动物，所述啮齿动物为选自C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL品系的小鼠。在另一个实施方案中，所述小鼠为选自下列品系的129品系：129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例如，129S1/SV、129S1/SvIm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2(参见例如，Festing等人(1999)Revisednomenclature for strain 129 mice,Mammalian Genome 10:836；还参见Auerbach等人(2000)Establishment and Chimera Analysis of129/SvEv-and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines)。在一个特别的实施方案中，所述基因修饰小鼠为前面提及的129品系和前面提及的C57BL/6品系的杂交种。在另一个特别的实施方案中，所述小鼠为前面提及的那些129品系的杂交种，或前面提及的那些BL/6品系的杂交种。在一个特别的实施方案中，所述杂交种的129品系为129S6(129/SvEvTac)品系。在另一个实施方案中，所述小鼠为BALB品系，例如BALB/c品系。在一个实施方案中，所述小鼠为BALB品系和另一个前面提及的品系的杂交种。

在一个实施方案中，所述非人动物为大鼠。在一个实施方案中，所述大鼠选自Wistar大鼠、LEA品系、Sprague Dawley品系、Fischer品系、F344、F6和Dark Agouti。在一个实施方案中，所述大鼠品系为两个或更多个选自下列的品系的杂交种：Wistar、LEA、SpragueDawley、Fischer、F344、F6和Dark Agouti。

提供了基因修饰非人动物，其包含用人IL-7基因序列对非人IL-7基因序列进行的置换。提供了啮齿动物，其在内源啮齿动物IL-7基因座处包含IL-7基因的人源化。用于制备啮齿动物例如小鼠的方法，所述啮齿动物在内源IL-7基因座处包含用人源化IL-7基因或其片段(例如，包含一个或多个外显子的片段)对内源IL-7基因或其片段(例如，包含一个或多个外显子的片段)进行的置换。提供了包含人源化基因的细胞、组织和小鼠，以及从内源非人IL-7基因座中表达人IL-7的细胞、组织和小鼠。本发明的人源化IL-7基因的示例性的侧翼基因组序列提供在SEQ ID NO:1(5’侧翼序列)和SEQ ID NO:2(3’侧翼序列)中。本发明的示例性的人IL-7基因提供在SEQ ID NO:3中。

IL-7是对于幼B和T细胞的发育来说和在某种程度上对于成熟T细胞的发育来说必不可少的细胞因子；IL-7敲除小鼠展示出成熟B和T细胞的严重耗竭(von Freeden-Jeffry U.等人(1995)Lymphopeniain interleukin(IL)-7 gene-deleted mice identifies IL-7 as anonredundant cytokine,J.Exp.Med.181:1519-1526)。该耗竭显然是由于原B细胞和前B细胞之间的阻断，以及T细胞增殖中的阻断(而非T细胞分化中的阻断；在IL-7 KO小鼠中T细胞类型的比例是大致正常的)，其导致降低的T细胞和成熟B细胞群(同上)。IL-7在胸腺和肠中由上皮细胞产生，在角质形成细胞、肝脏和树突细胞中产生－但不由正常的淋巴细胞产生(例如在Fry T.J.和Mackall,C.L.(2002)Interleukin-7:from bench to clinic,Blood 99(11):3892-3904中作了综述)。

简而言之，IL-7增加T细胞数目并增强T细胞功能(参见例如Morrissey,J.J.(1991)Administration of IL-7 to normal micestimulates B-lymphopoiesis and peripheral lymphadenopathy,J.Immunol.147:561-568；Faltynek,C.R.等人(1992)Administration ofhuman recombinant IL-7 to normal and irradiated mice increases thenumbers of lymphocytes and some immature cells of the myeloidlineage,J.Immunol.149:1276-1282；Risdon,G.J.等人(1994)Proliferative and cytotoxic responses of human cord blood Tlymphocytes following allegenic stimulation,Cell.Immunol.154:14-24)。T细胞的功能增强可以通过短持续时间的IL-7暴露来实现，而T细胞数目的增加反映了用较长持续时间暴露实现的增殖效应(Geiselhart,L.A.等人(2001)IL-7 Administration Alters theCD4:CD8 Ratio Increases T Cell Numbers,and Increases T CellFunction in the Absence of Activation,J.Immunol.166:3019-3027；还参见，Tan J.T.等人(2001)IL-7 is critical for homeostaticproliferation and survival ofT cells,Proc.Natl.Acad.Sci.USA98(15):8732-8737)。

IL-7对于早期和晚期T细胞调节两者来说均是必需的。IL-7不由T细胞表达，后者必须遇到在外周由非胸腺细胞释放并且据信对于外周T细胞增殖和维持负责的IL-7(例如在Guimond,M(2005)CytokineSignals in T-Cell Homeostasis,J.Immunother.28(4):289-294中作了综述)。IL-7饥饿导致严重受损的T细胞发育和幼稚T细胞的存活。IL-7还看起来对于成熟T细胞的存活来说是必需的；当小鼠缺乏IL-7基因时，通过过继转移入IL-7缺陷型小鼠中而获得的成熟T细胞进入凋亡，但在缺乏IL-7R基因的表达IL-7的小鼠中则不是这样(Schluns,K.S.等人(2000)Interleukin-7 mediates the homeostasis ofandmemory CD8 T cells in vivo,Nat.Immunol.1(5):426-432)。IL-7功能的丧失在小鼠中导致SCID-样表型(Puel,A.和Leonard,W.J.(2000)Mutations in the gene for the IL-7 receptor result in T(-)B(+)NK(+)severe combined immunodeficiency disease,Curr.Opin.Immunol.12:468-473)，据推测这归因于通过在IL-7刺激不存在下可能由糖酵解不足介导的降低的生长速率而引起的T细胞萎缩和死亡(Jacobs,S.R.等人(2010)IL-7 Is Essential for Homeostatic Control of T CellMetabolism In Vivo,J.Immunol.184:3461-3469)。

人IL-7基因包含6个外显子(其延伸达到33 kb)并且位于染色体8上于8q12-13处。小鼠IL-7包含5个外显子(在小鼠中不存在相对于人外显子5的对应物)并且与人基因大约80％同源；人和小鼠基因的非编码序列的分析揭示了少量的对基因表达的转录和调控负责的可识别的调控基序(Lupton,S.D.等人(1990)Characterization of theHuman and Murine IL-7 Genes,J.Immunol.144(9):3592-3601)，这暗示IL-7表达的调控可能是复杂的。但是，已经在小鼠中表达了在hIL-7基因座处包含报道基因的小鼠BAC片段，从而成功地查明在小鼠中IL-7的表达图式(参见例如，Avles,N.L.等人(2009)Characterization of the thymic IL-7 niche in vivo,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 106(5):1512-1517；Mazzucchelli,R.I.(2009)Visualizationand Identification of IL-7 Producing Cells in Reporter Mice,PLoSONE 4(11):e7637；Repas,J.F.等人(2009)IL7-hCD25 and IL7-CreBAC transgenic mouse lines:new tools for analysis of IL-7 expressingcells,Genesis 47:281-287)。在至少一种情况下，用报道基因对IL-7外显子进行基于BAC的置换需要整个43 kb IL-7基因座以及96 kb的5’侧翼序列和17 kb的3’侧翼序列，以期忠实地重演野生型小鼠的IL-7表达(Repass,J.F.等人(2009))。无论如何，来自关于由推定的IL-7调控元件驱动的报道基因表达的不同研究的数据在相互之间以及相对于较早的观察结果稍微有些变化，从而支持了这样的推论：IL-7调控在这些报道基因小鼠中可能未被忠实地重演(IL-7报道基因转基因小鼠在Kim,G.Y.等人(2011)Seeing Is Believing:Illuminating theSource of In Vivo Interleukin-7,Immune Network 11(1):1-10中作了综述)。人IL-7对于小鼠细胞是有功能的，但小鼠IL-7对于人细胞却不是有功能的。

表达异常地或差地被调节的人IL-7的转基因小鼠展现出众多病理学状态或综合征。对于鼠类IL-7 cDNA(其处于小鼠Ig重链增强子、κ轻链增强子和轻链启动子的控制之下，以靶向在淋巴区室中的表达)而言转基因的小鼠展现出显著增高的B细胞前体数目以及胸腺中所有亚群的胸腺细胞和外周T细胞的全面扩展(Samaridis,J.等人(1991)Development of lymphocytes in interleukin 7-transgenic mice,Eur.J.Immunol.21:453-460)。

从处于SRα启动子的控制之下的小鼠cDNA来表达IL-7的转基因小鼠发展出众多病理学状态，包括慢性结肠炎，其在组织病理学上模仿人的慢性结肠炎，并且其特征至少为在结肠粘膜淋巴细胞(但不是结肠上皮细胞)中IL-7的瞬时过表达以及IL-7在结肠粘膜杯形细胞的粘液中的明显积累(Watanabe,M.等人(1998)Interleukin 7Transgenic Mice Develop Chronic Colitis with Decreased Interleukin7 Protein Accumulation in the Colonic Mucosa,J.Exp Med.187(3):389-402；Takebe,Y.等人(1988)sR alpha promoter:anefficient and versatile mammalian cDNA expression system composedof the simian virus 40 early promoter and the R-U5 segment of humanT-cell leukemia virus type 1 long terminal repeat,Mol.Cell Biol.8(1):466-472)。在转基因小鼠中由相同启动子驱动的小鼠IL-7的组成型表达也发展出严重皮炎，其特征在于十分明显的变形和大多数为细胞的单核细胞的大量真皮浸润(Uehira,M.等人,Thedevelopment of dermatitis infiltrated byT cells in IL-7 transgenicmice,Intl.Immunol.5(12):1619-1627)。表达由鼠类重链启动子和增强子驱动的鼠类IL-7 cDNA的转基因小鼠也展现出皮炎和进入真皮的淋巴组织增生，但据报道其涉及TCRαβ细胞和表达Thy-1、CD3和CD5但缺乏CD4和CD8的细胞(CD4+/CD8+胸腺细胞实质上从这些转基因小鼠中缺失)；这些小鼠也发展出B和T细胞淋巴瘤，据推测其与在这些小鼠中观察到的延长的淋巴组织增生相关(参见，Rich,B.E.等人(1993)Cutaneous lymphoproliferation and lymphomas ininterleukin 7 transgenic mice,J.Exp.Med.177:305-316)。

IL-7基因的失调与各种各样的病理学状态相关。表达处于II类MHC Eα启动子的控制之下的转基因小鼠IL-7的小鼠高度倾向于淋巴样肿瘤(参见例如，Fisher,A.G.等人(1995)Lymphoproliferativedisorders in IL-7 transgenic mice:expansion of immature B cellswhich retain macrophage potential,Int.Immunol.7(3):414-423；还参见，Ceredig,R.等人(1999)Effect of deregulated IL-7 transgeneexpression on B lymphocyte development in mice expressing mutatedpre-B cell receptors,Eur.J.Immunol.29(9):2797-2807)。T细胞大小在转基因小鼠中也更大，并且观察到多克隆T细胞扩展(占优势地，CD8+，这表明在这些小鼠中被扰乱的调节)(Mertsching,E.等人,IL-7transgenic mice:analysis of the role of IL-7 in the differentiation ofthymocytes in vivo and in vitro,Intl.Immunol.7(3):401-414)。其他通过II类MHC Eα启动子过表达mIL-7(大约25-50倍)的转基因小鼠看起来是总体上健康的(如果没有低的B细胞肿瘤发病率的话)，并且展现出相对于野生型小鼠而言10-20倍的T细胞数目增加，其特征在于大数目的CD8+细胞，所述CD8+细胞还是CD44^hi和CD122^hi的(Kieper W.C.等人(2002)Overexpression of Interleukin(IL)-7Leads to IL-15-independent Generation of Memory Phenotype CD8+T Cells,J.Exp.Med.195(12):1533-1539)。

从处于II类MHC Eα启动子的控制之下的cDNA来组成性地表达小鼠IL-7的小鼠选择性地扩展IL-7-应答性早期B细胞，并且是包含原B细胞和前B细胞的肿瘤的良好来源。表达由人K14启动子驱动的IL-7的小鼠发展出淋巴组织增生性应答，其导致类似于脱发的皮肤的T细胞浸润。

对于IL-7R而言转基因的小鼠展示出在胸腺中双阴性(CD4-CD8-)前体细胞的大量减少，据推测这归因于在该转基因小鼠中大数目的双阳性胸腺细胞耗竭了IL-7，这暗示IL-7水平必须受到精巧的控制以促进正常的胸腺细胞发育(参见例如，Malek,T.R.(2004)IL-7:a limited resource during thymopoiesis,Blood,104(13):2842)。

早在克隆人IL-7时，就已经知道人IL-7可以诱导鼠类前B细胞的增殖(Goodwin,R.G.等人(1989)Human interleukin 7:Molecularcloning and growth factor activity on human and murine B-lineagelines,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:302-306)。尽管在某些慢性淋巴细胞白血病细胞中表达，但小鼠IL-7在植入到小鼠中的肿瘤细胞之中的表达诱导炎症和降低的致瘤性，然而矛盾的是，对于IL-7而言转基因的小鼠倾向于淋巴瘤(在Foss,H.-D.等人(1995)FrequentExpression of IL-7 Gene Transcripts in Tumor Cells of ClassicalHodgkin’s Disease,Am.J.Pathol.146(1):33-39中作了综述)。因此，希望获得以在生理学上适当的方式从内源小鼠IL-7基因座中表达人IL-7(而非小鼠IL-7)的小鼠，特别是但不限于包含人或小鼠肿瘤(例如，淋巴细胞肿瘤)的小鼠。

以在生理学上适当的方式表达人IL-7的小鼠对于在小鼠中的人实体瘤异种移植物模型之中评价推定的治疗剂(包括人IL-7及其类似物)的抗肿瘤特性来说也是有用的。例如，向SCID小鼠植入HT29人结肠腺癌并在各种各样的条件下(例如，除去幼稚T细胞和添加人T细胞；添加重组人IL-7；等等)进行了测试(参见，Murphy,W.J.等人(1993)Antitumor Effects of Interleukin-7 and AdoptiveImmunotherapy on Human Colon Carcinoma Xenografts,J.Clin.Invest.92:1918-1924)。那个研究发现，当与人T细胞一起施用时，人IL-7导致比在人IL-7不存在下显著延长的存活(同上)。

因此，表达人IL-7的小鼠，特别是能够支持异种移植物(例如，人肿瘤)的小鼠，例如免疫缺陷小鼠，具有特定的和充分确立的功用。已显示IL-7信号传导在体外和体内对于人T细胞急性成淋巴细胞白血病(T-ALL)的发展和存活来说是必需的(Touw,I.等人(1990)Interleukin-7 is a growth factor of precursor B and T acutelymphoblastic leukemia.Blood 75,2097–2101)。T-ALL是一种具有差的预后的侵袭性血液学癌症；对于驱动T-ALL细胞的增殖和存活的机制的理解依然是相对贫乏的，这是由于缺乏可以支持源自患者的肿瘤在体内生长的异种移植物模型。因此，表达人IL-7的免疫缺陷动物可以充当无价的体内系统，以用于测试针对此类与T细胞相关的恶性肿瘤的药物组合物，例如，测试药物组合物在表达人IL-7并且具有植入的源自T细胞的肿瘤的小鼠中靶向由IL-7介导的信号传导的功效，其中所述肿瘤需要IL-7信号传导以用于发展和存活。

实施例

实施例1.使小鼠IL-7基因座人源化

使用基因工程技术，修饰ES细胞以在内源小鼠IL-7基因座处用人IL-7基因序列置换小鼠IL-7基因(在小鼠IL-7调控元件的控制之下)，从而产生在图1中所显示的人源化基因座。

靶向构建体。通过使用标准的BHR技术(参见，Valenzuela等人(2003)High-throughput engineering of the mouse genome coupledwith high-resolution expression analysis,Nature Biotech.21(6):652-659)来进行细菌同源重组(BHR)，以构建用于靶向小鼠IL-7基因座的包含人IL-7基因的大的靶向载体(LTVEC)。通过下述方式来产生线性片段：将经PCR产生的同源盒与经克隆的盒相连接，随后对连接产物进行凝胶分离，和将其电穿孔入拥有靶细菌人工染色体(BAC)的符合BHR要求的细菌中。小鼠BAC bMQ-271g18用作小鼠序列的来源；人BAC RP11-625K1用作人序列的来源。在选择步骤之后，通过越过新接头的PCR和通过限制性酶切分析来鉴定正确重组的克隆。制备出包含同源性臂和人IL-7基因序列的大的靶向载体(LTVEC)。小鼠ES细胞用LTVEC构建体进行电穿孔，使其在选择培养基上生长，并将其用作供体ES细胞以制备人源化IL-7小鼠。

通过下述方式来修饰小鼠IL-7基因(小鼠Gene ID:96561；RefSeq转录物:NM_008371.4)：删除外显子2至5(删除坐标NCBIM37:ch3:7604650-7573021；负链)，并用人IL-7(Entrez GeneID:6023；Ref Seq转录物NM_000880.3)外显子2至6置换它们(置换坐标GRCh37Lch*:79711168-79644608；负链)。人基因组IL-7序列提供在SEQ ID NO:3中(NC#166E2F2)。小鼠基因组IL-7基因座是已知的，并且被报道为41,351nt序列，以登录号NC0000696(通过提及而合并入本文)；小鼠IL-7基因组座位的相关的5’和3’序列提供在SEQ ID NO:1(5’侧翼)和SEQ ID NO:2(3’侧翼)中。

包含人源化IL-7基因的LTVEC具有在上游侧翼有着NotI位点的48kb上游小鼠靶向臂，和在下游侧翼有着NotI位点的77kb下游小鼠靶向臂。将LTVEC用NotI进行线性化以用于电穿孔。

在构建了LTVEC之后，获得越过小鼠/人5’接头的LTVEC的核苷酸序列，其从5’(小鼠)至3’(人)包括下述序列(其中小鼠/人接头核苷酸在括号中)：5’-TGCAAGCACC AAAAAGGTGACCACACTTCA CATTGGCGAT CGC(GG)GTTTC TATCTGAGGATGTGAATTTA TTTACAGA-3’(SED ID NO:4)。

测定了越过人插入物和盒的5’末端的接头的LTVEC的核苷酸序列(参见图1)，并且其包括从5’至3’具有人序列/限制性酶切位点/loxp/盒序列的下述序列(其中人序列/限制性酶切位点接头核苷酸在括号中)：5’-GTTATGTGCT GATGGGCTTT ATTTGATCTACAGAAGATGC TCTGGTGACA CCCTCAGTGT GTGTTGGTAACACCTTCCTG(CC)TCGAGATA ACTTCGTATA ATGTATGCTATACGAAGTTA TATGCATGGC CTCCGCGCCG GGTTTTGGCGCC-3’(SEQ ID NO:5)。

测定了越过盒的末端和小鼠序列的开头部分的接头的LTVEC的核苷酸序列，并且其包括从5’至3’具有盒序列/限制性酶切位点/小鼠序列的下述序列(其中接头核苷酸在括号中)：5’-GTATGCTATACGAAGTTATG CTAGTAACTA TAACGGTCCT AAGGTAGCGAGCTAG(CC)CAA TTGCGTACTT TGGATAGTGT CTCTTTTTAACCTAAATGAC CTTTATTAAC ACTGTCAGGT TCCCTTACTCTCGAGAGTGT TCATTGCTGC ACT-3’(SEQ ID NO:6)。

在对ES细胞进行电穿孔之后，进行天然等位基因损失测定法(参见例如，Valenzuela等人(2003))，以检测由于靶向而引起的内源IL-7序列的损失。引物对、片段大小和TAQMAN^TM探针显示在表1中。C1探针在核苷酸9,635-9,664处结合小鼠IL-7基因组序列(NC0000696)；C2探针在核苷酸39,793-39,825处结合小鼠IL-7基因组序列(NC0000696)。对于等位基因增长测定法，C3探针在核苷酸29,214-29,242处结合人IL-7基因组序列(NC#166E2F2)。

表1.LTVEC引物和探针

实施例2.人源化IL-7小鼠

产生人源化IL-7小鼠。通过方法(Poueymirou等人(2007)F0 generation mice fully derived from gene-targetedembryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses,NatBiotechnol 25:91-99)，将包含人源化IL-7基因座的供体小鼠ES细胞引入到早期阶段小鼠胚胎中。获得了四只完全来自供体ES细胞的F0小鼠，其对于内源小鼠IL-7基因座的人源化而言是杂合的。对F0小鼠进行繁育以达到关于人源化而言的纯合性。测定纯合小鼠的基因型以确认纯合性。所有的小鼠研究均由Regeneron’s Institutional AnimalCare and Use Committee(IACUC)进行监督和批准。

实施例3.人IL-7在小鼠中的表达

将对于IL-7基因而言人源化的小鼠和其非人源化的同窝小鼠对照进行放血，并且使用来自R&D Systems,Inc.的QuantikineHSHuman IL-7 Immunoassay试剂盒来测量人IL-7的血清浓度。使用Microsoft Excel来分析数据，并且使用Prism统计学分析软件将数据进行绘图。对于人源化IL-7基因座而言杂合的小鼠(命名为MAID5148het)以在生理学上适当的浓度在血清中表达人IL-7。这与在双敲除小鼠中携带经慢病毒转导的人IL-7的转基因人IL-7小鼠相反，后者展现出在血清中的非生理学地和潜在地严重有害的高水平的人IL-7(10至100pg/mL)(O’Connell,R.M.等人(2010)LentiviralVector Delivery of Human Interleukin-7(hIL-7)to Human ImmuneSystem(HIS)Mice Expands T Lymphocyte Populations,PLoS ONE5(8):e12009)。相反地，对于人源化内源IL-7基因座而言杂合的小鼠展现出在血清中大约2.4至大约3.2pg/mL(图2)，这反映了正常的或在生理学上合适的IL-7水平。

Claims

1.基因修饰非人动物，其在其种系中包含用至少一个人IL-7外显子对至少一个非人IL-7外显子进行的置换，从而形成编码人或人源化IL-7的基因，其中所述置换位于内源非人IL-7基因座处，其中所述编码人或人源化IL-7的基因处于内源非人调控元件的控制之下。

2.权利要求1的基因修饰非人动物，其为啮齿动物。

3.权利要求2的基因修饰啮齿动物，其中所述啮齿动物选自大鼠和小鼠。

4.权利要求2的基因修饰啮齿动物，其中所述编码人或人源化IL-7的基因包含选自下列的人外显子：人外显子1、人外显子2、人外显子3、人外显子4、人外显子5、人外显子6及其组合。

5.权利要求4的基因修饰啮齿动物，其中所述编码人或人源化IL-7的基因包含不多于五个人外显子。

6.权利要求3的基因修饰啮齿动物，其中所述啮齿动物为小鼠，并且所述经修饰的基因座包含用包含人IL-7外显子2、3、4、5和6的人基因组区段对小鼠外显子2、3、4和5进行的置换。

7.权利要求1的基因修饰非人动物，其中所述编码人或人源化IL-7的基因包含编码人或人源化IL-7蛋白的cDNA。

8.在其种系中包含转基因的基因修饰非人动物，所述转基因包含编码人或人源化IL-7基因的核酸序列，其中所述人或人源化IL-7基因在上游和下游在侧翼与内源非人调控序列相接。

9.权利要求8的基因修饰非人动物，其为啮齿动物。

10.权利要求9的啮齿动物，其选自小鼠、大鼠和仓鼠。

11.权利要求8的基因修饰非人动物，其中所述人或人源化IL-7基因包含选自下列的人外显子：人外显子1、人外显子2、人外显子3、人外显子4、人外显子5、人外显子6及其组合。

12.权利要求11的基因修饰非人动物，其中所述人或人源化IL-7基因包含至少五个人外显子。

13.用于制备具有编码人或人源化IL-7的基因的非人动物的方法，所述方法包括修饰所述非人动物的种系以包含编码人或人源化IL-7的基因，该编码人或人源化IL-7的基因在上游和下游在侧翼与内源非人IL-7调控序列相接。

14.权利要求13的方法，其中所述修饰位于内源非人IL-7基因座处。

15.权利要求13的方法，其中所述非人动物为啮齿动物。

16.权利要求15的方法，其中所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。

17.基因修饰非人动物，其进行了基因修饰从而以与对于相同属和种的野生型非人动物所观察到的表达图式相同的表达图式来表达人IL-7。

18.权利要求17的基因修饰非人动物，其中在所述非人动物中表达的人IL-7的水平与在相应的野生型小鼠中非人IL-7的水平大致相同。

19.权利要求17的基因修饰非人动物，其为啮齿动物。

20.权利要求18的基因修饰非人动物，其为啮齿动物。

21.人源化IL-7基因座，其包含非人IL-7外显子1、人IL-7外显子2、人IL-7外显子3、人IL-7外显子4、人IL-7外显子5和人IL-7外显子6。

22.权利要求21的人源化IL-7基因座，其中所述人源化IL-7基因座进一步包含位于非人IL-7外显子1和人IL-7外显子6侧翼的5’和3’非人IL-7非翻译区。

23.权利要求21或22的人源化IL-7基因座，其中所述人源化IL-7基因座包含与非人3’非翻译区邻接的3’人非翻译区或其部分。

24.权利要求21-23中任一项的人源化IL-7基因座，其中所述人源化IL-7基因座包含5’非人IL-7非翻译区或其部分，和非人IL-7外显子1，其与人IL-7外显子2邻接。

25.权利要求21-24中任一项的人源化IL-7基因座，其中所述人源化IL-7基因座包含图1中所示的结构。

26.包含权利要求21-25中任一项的人源化IL-7基因座的细胞。

27.权利要求26的细胞，其中所述细胞为胚胎干细胞。

28.分离自权利要求1-12和17-20中任一项的非人动物的细胞或组织。

29.权利要求28的细胞或组织，其中所述组织选自胸腺组织、脾组织、表皮组织和肠组织。

30.权利要求29的细胞或组织，其中所述组织为胸腺组织。