CN104334161A

CN104334161A - 可电离的阳离子脂质

Info

Publication number: CN104334161A
Application number: CN201380026332.0A
Authority: CN
Inventors: F·德罗莎; B·C·吉尔德; M·哈特莱因
Original assignee: Transkaryotic Therapies Inc
Current assignee: Shire Human Genetics Therapies Inc
Priority date: 2012-03-29
Filing date: 2013-03-29
Publication date: 2015-02-04
Also published as: US20210009503A1; EP2830595A1; ES2868174T3; JP2018095653A; AU2018201766A1; DK2830595T3; US20240425442A1; US10065919B2; EP2830595A4; JP2019214617A; US20150166462A1; CA2868034C; EP3620447A1; US11999675B2; US12331005B2; HK1206645A1; AU2018201766B2; US20190185410A1; ES2762873T3; US20180362443A1

Abstract

本发明提供了新型的化合物、包括该化合物的药物组合物以及它们的相关使用方法。本发明所述的化合物可以用作例如脂质体传递媒介物，从而促进囊封的多核苷酸向靶细胞的传递，以及所述的靶细胞的随后的转染，并且在某些实施方案中，本发明所述的化合物可以表征为具有一种或多种性质，这些性质使得此类化合物比其他同类脂质有利。

Description

可电离的阳离子脂质

相关申请

本申请要求2012年3月29日提交的美国临时申请No.61/617,468的权益，该申请的公开内容以引用方式并入本文。

背景技术

核酸的脂质体传递已经用作实施囊封质粒DNA、反义寡核苷酸、短干扰RNA和基于microRNA疗法的定点特异性传递的手段，然而，核酸向靶细胞和组织的有效传递、以及此类靶细胞和组织随后的转染都具有技术上的挑战。尽管促进治疗剂传递至靶细胞的、多脂质体基的系统及媒介物具有可利用性，但是在体内和体外应用中仍存在许多问题。例如脂质体传递系统的显著缺点涉及脂质体的构建，其中所述的脂质体具有用于研究所需的靶细胞和/或细胞内分隔区的足够的细胞培养物或体内稳定性，以及此类脂质体传递系统将它们的囊封材料高效地释放到此类靶细胞中的能力。

此外，用于构建此类脂质体基媒介物的许多阳离子脂质通常对靶细胞是有毒的。具体而言，传递治疗有效量的囊封剂所需的此类阳离子脂质的量对靶细胞可能是有毒的。因此，与阳离子脂质有关的毒性代表了它们作为非病毒载体的一般用途的主要障碍，特别是将治疗有效量的囊封材料成功传递至靶细胞所需的量很大时更是如此。

尽管之前所述的局限，以及它们保护和促进囊封材料传递至一个或多个靶细胞的能力，脂质体基媒介物被认为是用于治疗剂的具有吸引力的载体，并保持该主题为不断研发的努力。尽管就囊封、稳定性和位点定位而言，包括阳离子脂质成分的脂质体基媒介物显示出有前途的结果，很大程度仍需要改善脂质体基传递系统。具体而言，仍需要改善的阳离子和可电离的脂质，改善的阳离子和可电离的脂质证明了改善的药代动力学性质，并且能够以增强的效率将诸如核酸之类的大分子传递至多种类型的细胞和组织。重要的是，仍特别需要新型的阳离子可电离的脂质，该脂质可表征为毒性降低，并且能够高效地将囊封核酸和多核苷酸传递至靶细胞、组织和器官。

发明概述

本发明描述了新型阳离子和可电离的脂质化合物，包括该化合物的药物组合物，以及它们的相关使用方法。在某些实施方案中，本发明所述的化合物可用作脂质体组合物或脂质体组合物的成分，从而有利于传递至一个或多个靶细胞及随后该一个或多个靶细胞的转染。在某些实施方案中，本发明所述的脂质组合物为阳离子和/或可电离的脂质。例如本发明所述的脂质化合物可以包括碱性可电离的官能团，例如胺。在一些实施方案中，本发明所述的化合物是基于一种或多种所需的特征或性质(例如增强转染的效率或促进特异性的生物学结果)而设计的。

在本发明所述的某些实施方案中，脂质化合物通常包括极性亲水性的头部基团和非极性疏水性的尾部基团。例如本发明所述的脂质化合物通常Kay包括一个或多个阳离子和/或可电离的官能头部基团，例如具有一个或多个烷基或芳基取代基的胺基官能团。在某些实施方案中，本发明所述的脂质化合物可以包括结合(共价结合)有2个烷基官能团、取代基或部分(例如R₁基团和R₂基团，其中R₁和R₂均独立地选自C₁-C₁₀烷基)的阳离子可电离的氨基官能头部基团。

在一些实施方案中，亲水性头部基团(例如烷基氨基)与疏水性(亲脂性)尾部基团结合(例如共价结合)。例如本发明所公开的化合物的亲脂性尾部基团(例如L₁基团和L₂基团中的一个或多个)可以包括一个或多个非极性基团，例如胆固醇或可任选地取代的、可变的不饱和烷基(例如可任选地取代的十八碳-9，12-二烯或十八碳-6，9-二烯)。

在某些实施方案中，本发明涉及具有式(I)结构的化合物：

其中R₁和R₂均独立地选自氢，可任选地取代的、可变的饱和或不饱和C₁-C₂₀烷基，和可任选地取代的、可变的饱和或不饱和C₆-C₂₀酰基；其中L₁和L₂均独立地选自氢，可任选地取代的C₁-C₃₀烷基，可任选地取代的、可变的不饱和C₁-C₃₀烯基，和可任选地取代的C₁-C₃₀炔基；其中m和o均独立地选自0，和任意的正整数(例如其中m为3)；以及其中n为0或任意的正整数(例如其中n为1)。

在某些实施方案中，所述的化合物具有式(I)的结构，其中R₁和R₂均为甲基。在此类实施方案中，所述的化合物的极性阳离子头部基团包括可电离的二甲基氨基。

在一些实施方案中，所述的化合物具有式(I)的结构，其中L₁和L₂均为可任选地取代的、多不饱和C₆-C₂₀烯基。例如考虑了其中L₁和L₂均为可任选地取代的多不饱和C₁₈烯基。在其他实施方案中，L₁和L₂均为未被取代的多不饱和C₁₈烯基。在其他实施方案中，L₁和L₂均为可任选地取代的十八碳-9，12-二烯(或十八碳-6，9-二烯)。在其他实施方案中，L₁为氢，L₂为胆固醇。

在本发明所公开的某些实施方案中，本发明涉及具有式(I)结构的化合物，其中o为0。备选地，在其他实施方案中，o为正整数(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多)。

在本发明所公开的某些实施方案中，本发明涉及具有式(I)结构的化合物，其中m为正整数(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多)。在一些具体的实施方案中，本发明涉及具有式(I)结构的化合物，其中m为4。在一些具体的实施方案中，本发明涉及具有式(I)结构的化合物，其中m为3。

此外，本发明还公开了具有式(I)结构的化合物，其中n为正整数(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多)。在其他具体的实施方案中，本发明涉及具有式(I)结构的化合物，其中n为0。

在一些具体的实施方案中，本发明涉及具有式(I)结构的化合物，其中R₁和R₂均为甲基；其中L₁和L₂均为十八碳-9，12-二烯(或十八碳-6，9-二烯)；其中m为4；其中n为0；并且其中o为1。例如在某些实施方案中，本发明涉及化合物(15Z，18Z)-N，N-二甲基-6-(9Z，12Z)-十八碳-9，12-二烯-1-基)二十碳-15，18-二烯-1-胺。在某些实施方案中，本发明涉及具有式(II)结构的化合物(本发明称为“HGT5000”)。

在一些具体的实施方案中，本发明涉及具有式(I)结构的化合物，其中R₁和R₂均为甲基；其中L₁和L₂均为十八碳-9，12-二烯(或十八碳-6，9-二烯)；其中m为3；其中n为1；并且其中o为0。例如在某些实施方案中，本发明涉及化合物(15Z，18Z)-N，N-二甲基-6-((9Z，12Z)-十八碳-9，12-二烯-1-基)二十碳-4，15，18-三-1-胺。在某些实施方案中，本发明涉及具有式(III)结构的化合物(本发明称为“HGT5001”)。

应该理解的是，在本发明所公开的那些实施方案(其中n为1)中，此类化合物可以为顺式异构体、反式异构体或备选地它们的外消旋混合物。例如在其中n为1的某些实施方案中，n为顺式异构体，其由具有式(IV)结构的化合物来表示：

备选地，在其中n为1的其他实施方案中，n为反式异构体，其由具有式(V)结构的化合物来表示：

此外，还公开了具有式(VI)结构的化合物：

其中R₁和R₂均独立地选自氢，可任选地取代的、可变的饱和或不饱和C₁-C₂₀烷基，和可任选地取代的、可变的饱和或不饱和C₆-C₂₀酰基；其中L₁和L₂均独立地选自氢，可任选地取代的C₁-C₃₀烷基，可任选地取代的、可变的不饱和C₁-C₃₀烯基，和可任选地取代的C₁-C₃₀炔基；其中m、n和o均独立地选自0，和任意的正整数。

在一些具体的实施方案中，本发明涉及具有式(VI)结构的化合物，其中R₁和R₂均为甲基。在其他实施方案中，本发明涉及具有式(VI)结构的化合物，其中R₁和R₂均独立地选自氢和甲基。

此外，还考虑了具有式(VI)结构的化合物，其中L₁和L₂均为可任选地取代的、多不饱和C₆-C₂₀烯基(例如其中L₁和L₂均为可任选地取代的多不饱和C₁₈烯基，或者其中L₁和L₂均为未被取代的多不饱和C₁₈烯基)。在本发明所公开的某些实施方案中，L₁和L₂均为可任选地取代的十八碳-9，12-二烯(或十八碳-6，9-二烯)。在其他实施方案中，L₁为氢，L₂为胆固醇。

在本发明所公开的某些实施方案中，本发明涉及具有式(VI)结构的化合物，其中m为正整数(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多)。在一些具体的实施方案中，本发明涉及具有式(VI)结构的化合物，其中m为4。在某些实施方案中，本发明涉及具有式(VI)结构的化合物，其中m致少为5(例如m为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多)。

此外，本发明还公开了具有式(VI)结构的化合物，其中n为正整数(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多)。在其他具体的实施方案中，本发明涉及具有式(VI)结构的化合物，其中n为0。

在本发明所公开的某些实施方案中，本发明涉及具有式(VI)结构的化合物，其中o为正整数(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多)。在某些实施方案中，本发明涉及具有式(VI)结构的化合物，其中o致少为5(例如o为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多)。备选地，在其他具体的实施方案中，本发明涉及具有式(VI)结构的化合物，其中o为0。

此外，还考虑了具有式(VI)结构的化合物，其中R₁和R₂均为甲基；其中L₁和L₂均为十八碳-9，12-二烯(或十八碳-6，9-二烯)；其中m为4；并且其中n和o均为0。例如在某些实施方案中，本发明涉及化合物(15Z，18Z)-N，N-二甲基-6-((9Z，12Z)-十八碳-9，12-二烯-1-基)二十碳-5，15，18-三-1-胺。在某些实施方案中，本发明涉及具有式(VII)结构的化合物(本发明称为“HGT5002”)：

此外，本发明还公开了具有式(VIII)结构的化合物：

其中R₁和R₂均独立地选自可任选地取代的、可变的饱和或不饱和C₁-C₂₀烷基或烯基，和可任选地取代的、可变的饱和或不饱和C₆-C₂₀酰基；其中L₁和L₂均独立地选自可任选地取代的C₁-C₃₀烷基，可任选地取代的、可变的不饱和C₁-C₃₀烯基，和可任选地取代的C₁-C₃₀炔基；并且其中x选自C₁-C₂₀烷基，和可变的不饱和C₁-C₂₀烯基。

在某些实施方案中，所公开的化合物具有式(VIII)的结构，其中R₁和R₂均为甲基。在其他实施方案中，所公开的化合物具有式(VIII)的结构，其中R₁和R₂均独立地选自氢和C₁-C₆烷基。

在其他实施方案中，本发明涉及具有式(VIII)结构的化合物，其中L₁和L₂均为未被取代的、多不饱和C₁₈烯基。例如在某些实施方案中，LL₁和L₂均为可任选地取代的十八碳-9，12-二烯(例如L₁和L₂均为未被取代的十八碳-9，12-二烯或十八碳-6，9-二烯)。在某些其他的实施方案中，L₁为氢，L₂为胆固醇。

在某些实施方案中，所公开的化合物具有式(VIII)的结构，其中x为C₆烯基。在其他实施方案中，所公开的化合物具有式(VIII)的结构，其中x为己烷。在其他的实施方案中，所公开的化合物具有式(VIII)的结构，其中x为己-1-烯。在其他实施方案中，所公开的化合物具有式(VIII)的结构，其中x为己-2-烯。在某些实施方案中，x不为己烷。在其他的实施方案中，所公开的化合物具有式(VIII)的结构，其中x为C₆-C₁₀烯基或C₆-C₁₀烷基。

在一个具体的实施方案中，本发明涉及具有式(VIII)结构的化合物，其中R₁和R₂均为甲基；其中L₁和L₂均为十八碳-9，12-二烯(或十八碳-6，9-二烯)；并且其中x为己烷。在其他具体的实施方案中，本发明涉及具有式(VIII)结构的化合物，其中R₁和R₂均为甲基；其中L₁和L₂均为十八碳-9，12-二烯(或十八碳-6，9-二烯)；并且其中x为己-1-烯。在另一个具体的实施方案中，本发明涉及具有式(VIII)结构的化合物，其中R₁和R₂均为甲基；其中L₁和L₂均为十八碳-9，12-二烯(或十八碳-6，9-二烯)；并且其中x为己-2-烯。

应该理解的是，在本发明所述的那些实施方案(其中所述的化合物具有一个或多个不对称的或手性的分子，例如一个或多个不饱和的碳-碳双键)中，顺式(Z)和反式(E)异构体在本发明的范围内。

本发明所公开的组合物可以用于制备一种或多种药物组合物和/或脂质体的媒介物(例如脂质纳米颗粒)。在此类实施方案中，此类药物组合物或媒介物可以进一步包括一种或多种选自阳离子脂质、PEG改性的脂质、非阳离子脂质和辅助脂质的化合物。因此，在某些实施方案中，本发明所述的化合物(例如HGT5000、HGT5001和/或HGT5002)为阳离子或可电离的脂质，其可以用作脂质体组合物的成分，从而促进或增强囊封材料(例如一种或多种治疗剂)向一个或多个靶细胞中的传递和释放(例如通过渗透或与此类靶细胞的脂质膜融合)。富集具有本发明所公开的一种或多种化合物的脂质体组合物可以用作改善(例如降低)毒性或以其他方式赋予此类富集的脂质体组合物以一种或多种所需的性质(例如改善的囊封的多核苷酸向一个或多个靶细胞的传递和/或降低的脂质体组合物的体内毒性)的手段。因此，还考虑了包括本发明所公开的一种或多种化合物的药物组合物，具体而言为脂质体组合物。在某些实施方案中，此类药物和脂质体组合物包括PEG改性的脂质、非阳离子脂质和辅助脂质的一种或多种。例如考虑了药物和脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)，其包括本发明所公开的一种或多种化合物(例如HGT5000、HGT5001和/或HGT5002)，以及辅助脂质、非阳离子脂质和PGE改性的脂质成分中的一种或多种。此外，还考虑了药物和脂质体组合物，其包括一种或多种本发明所公开的化合物，并且进一步包括一种或多种其他的阳离子脂质。类似地，还考虑了脂质体组合物和药物组合物(例如脂质纳米颗粒)，其包括HGT5000、HGT5001和/或HGT5002化合物中的一种或多种，以及C12-200、DLinDMA、CHOL、DOPE、DMG-PEG-2000、ICE、DSPC、DODAP、DOTAP和C8-PEG-2000中的一种或多种。在某些实施方案中，此类药物组合物和脂质体组合物装有其他的囊封材料，例如一种或多种生物活性的多核苷酸。

在某些实施方案中，本发明所述的一种或多种药物和脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)包括本发明所公开的化合物的一种或多种，以及一种或多种其他的脂质。例如包括或以其他方式富集有本发明所公开的一种或多种化合物的脂质纳米颗粒可以进一步包括DOTAP(1，2-二油基-3-三甲基铵丙烷)、DODAP(1，2-二油基-3-二甲基铵丙烷)、DOTMA(1，2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷)、DLinDMA、DLin-KC2-DMA、C12-200和ICE中的一种或多种。在一个实施方案中，药物组合物包括含有HGT5000、DOPE、胆固醇和/或DMG-PEG2000的脂质纳米颗粒。在另一个实施方案中，药物组合物包括含有HGT5001、DOPE、胆固醇和/或DMG-PEG2000的脂质纳米颗粒。在另一个实施方案中，药物组合物包括含有HGT5002、DOPE、胆固醇和/或DMG-PEG2000的脂质纳米颗粒。

在某些实施方案中，本发明所述的一种或多种药物组合物可以包括一种或多种PEG改性的脂质。例如包括或以其他方式富集有一种或多种本发明所公开的化合物的脂质纳米颗粒可以进一步包括一种或多种PEG改性的脂质，该脂质包括长度至多为5kDa、且与包括一个或多个C₆-C₂₀烷基的脂质共价连接的聚乙二醇链。

类似地，本发明所公开的药物组合物(例如脂质纳米颗粒)可以包括或者可以以其他方式富集有一种或多种本发明所公开的化合物，并且可以进一步包括一种或多种辅助脂质，其选自DSPC(1，2-二硬脂酰-锡-甘油-3-磷酸胆碱)、DPPC(1，2-二棕榈酰-锡-甘油-3-磷酸胆碱)、DOPE(1，2-二油基-锡-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DPPE(1，2-二棕榈酰-锡-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DMPE(1，2-二肉豆蔻酰-锡-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DOPG(2-二油酰基-锡-甘油-3-二氧磷基-(1′-rac-甘油))、DOPE(1，2-二油酰基-锡-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DSPE(1，2-二硬脂酰-锡-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DLPE(1，2-二月桂酰-锡-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DPPS(1，2-二棕榈酰-锡-甘油-3-二氧磷基-L-丝氨酸)、神经酰胺、鞘磷脂和胆固醇。

在某些实施方案中，所述的化合物以及包括此类化合物的药物和脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)包括一种或多种多核苷酸(例如囊封的DNA或RNA)。在其他的实施方案中，一种或多种多核苷酸包括至少一种锁核酸(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、16、18、20或更多的锁核酸残基或单体)。其中一种或多种囊封多核苷酸包括RNA，例如RNA可以包括例如mRNA、siRNA、snoRNA、microRNA和它们的组合。

在某些实施方案中，囊封于药物和其脂质体组合物中的多核苷酸包括编码例如功能多肽、蛋白质或酶的mRNA，并且在被一个或多个靶细胞表达(例如翻译)时，产生功能表达产物(例如多肽、蛋白质或酶)，并且在一些情况下，被靶细胞分泌到受试对象的外周循环(例如血浆)中。在某些实施方案中，包括(或者以其他方式装入或囊封于)本发明所述的化合物以及药物和脂质体组合物的一种或多种多核苷酸编码了被受试对象异常表达的核酸(例如多肽)。在某些实施方案中，包括所述的化合物、以及脂质体或药物组合物(例如脂质纳米颗粒)的一种或多种囊封的多核苷酸编码了功能蛋白质或酶。例如多核苷酸(例如mRNA)可以编码选自以下的蛋白质或酶：红细胞生成素、人类生长激素、囊性纤维化跨膜转运调节因子(CFTR)、α-葡萄糖苷酶、芳基硫酸酯酶A、α-半乳糖苷酶A、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖酸酯-2-硫酸酯酶、艾杜糖酸酯硫酸酯酶、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶、N-乙酰氨基葡糖苷酶、α-氨基葡糖苷乙酰基转移酶、N-乙酰葡糖胺6-硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶、β-葡萄糖苷酶、半乳糖-6-硫酸酯酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、葡萄糖脑苷脂酶、硫酸乙酰肝素硫酸脂酶、肝素-N-硫酸酯酶、溶酶体酸脂酶、透明质酸酶、半乳糖脑苷脂酶、鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)、氨甲酰磷酸合成酶1(CPS1)、精氨酸琥珀酸合成酶(ASS1)、精氨酸代琥珀酸裂解酶(ASL)和精氨酸酶1(ARG1)。

在某些实施方案中，囊封的多核苷酸编码了酶，此类酶可以为尿素循环酶(例如鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)、氨甲酰磷酸合成酶1(CPS1)、精氨酸琥珀酸合成酶(ASS1)、精氨酸代琥珀酸裂解酶(ASL)或精氨酸酶1(ARG1))。在某些实施方案中，一种或多种囊封的多核苷酸包括mRNA，其编码了与溶酶体储存紊乱有关的酶(囊封的多核苷酸为编码α-半乳糖苷酶A、艾杜糖酸酯-2-硫酸酯酶、艾杜糖酸酯硫酸酯酶、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶、β-葡萄糖苷酶和半乳糖脑苷脂酶中的一种或多种的mRNA)。

此外，本发明还考虑了药物和脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)，其包括本发明所公开的一种或多种化合物，以及一种或多种多核苷酸(例如反义寡核苷酸)，具体为包括一种或多种化学改性的多核苷酸。所考虑的多核苷酸改性可以包括例如糖的改性或取代(例如2′-O-烷基改性、锁多核苷酸(LNA)或肽多核苷酸(PNA)中的一种或多种)。在其中糖改性为2′-O-烷基的实施方案中，此类改性可以包括但不限于2′-脱氧-2′-氟代改性、2′-O-甲基改性、2′-O-甲氧基乙基改性和2′-脱氧改性。在其中改性为核碱基改性的某些实施方案中，此类改性可以选自5-甲基胞苷、假尿苷、2-硫代尿苷、5-甲基胞核嘧啶、异胞核嘧啶、假异胞核嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤、2-氯-6-氨基嘌呤胞核嘧啶和它们的组合。

在其中多核苷酸为mRNA的那些实施方案中，此类化学改性优选地使mRNA更稳定(例如对核酸酶的降解更具有抗性)，并且可以包括例如封闭了mRNA的5’或3’非翻译区的改性的末端。在某些实施方案中，化学改性包括将CMV即刻早基因1(IE1)的部分序列包含到mRNA的5’非翻译区。在其他的实施方案中，化学改性包括将poly A尾部包含到mRNA的3’非翻译区。此外，还考虑了将Cap1结构包含到mRNA的5’非翻译区的化学改性。在其他实施方案中，化学改性包括将编码人类生长激素(hGH)的序列包含到mRNA的3’非翻译区。

本发明所述的化合物和药物组合物可以配制成特异性地靶向和/或转染一种或多种靶细胞、组织和器官。在某些实施方案中，此类化合物和药物组合物通过一种或多种机制来促进此类靶细胞的转染(例如靶细胞的脂质双层膜的膜融合基的释放和/或质子海绵介导的破裂)。所考虑的靶细胞包括例如选自以下的一种或多种细胞：肝细胞、造血细胞、上皮细胞、内皮细胞、肺细胞、骨细胞、干细胞、间充质细胞、神经细胞、心脏细胞、脂肪细胞、血管平滑肌细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、β细胞、垂体细胞、滑膜衬里细胞、卵巢细胞、睾丸细胞、成纤维细胞、B细胞、T细胞、网状细胞、白细胞、粒细胞和肿瘤细胞。

此外，还公开了治疗受试对象的疾病(例如与基因或核酸的异常表达有关的疾病)的方法，其中所述的方法包括向受试对象给予本发明所述的化合物和/或药物组合物的一种或多种。此外，还考虑了使用一种或多种多核苷酸转染一种或多种靶细胞的方法，其中所述的方法包括使一种或多种靶细胞与本发明所述的化合物或药物组合物接触，使得一种或多种靶细胞被囊封的一种或多种多核苷酸转染。

通过参照下文的发明详述(此时在联系随后的实施例)，上文所讨论的以及本发明的许多其他特征及伴随而来的益处将本更好地理解。本发明所述的多种实施方案是互补的，并且可以与本领域的技术人员根据本发明所包含的教导而理解的方式结合或一起使用。

附图简述

图1示出了在野生型(WT)小鼠的血清中检测到的人类α-半乳糖苷酶(GLA)蛋白质的浓度，其中所述的小鼠经过一周的时间，在第1天和第5天(再次)时2次静脉给予90μg、60μg、30μg、20μg或10μg中单一剂量的GLA mRNA，其被囊封于HGT5000基脂质纳米颗粒中。在给予第二静脉剂量后，在6小时、24小时、48小时和72小时时测定GLA蛋白质的血清浓度。在第8天时，在给予第二静脉剂量后的72小时处死小鼠。如图1所示，在静脉输第二剂量的注囊封于HGT5000基脂质纳米颗粒中的GLA mRNA后，在6小时内，在小鼠的血清中可以检测到相当高水平的人类GLA蛋白质，并且在给予后的48小时，GLA蛋白质是可以更进一步检测的。

图2描绘了在野生型(WT)小鼠的肝脏、肾和脾脏中检测到的人类α-半乳糖苷酶(GLA)蛋白质的浓度，其中所述的小鼠经过一周的时间，在第1天和第5天(再次)时2次静脉给予90μg、60μg、30μg、20μg或10μg中单一剂量的GLAmRNA，其被囊封于HGT5000基脂质纳米颗粒中。在第8天时，在给予第二静脉剂量后的72小时处死小鼠，并测定野生型(WT)小鼠的肝脏、肾和脾脏中GLA蛋白质的浓度。如图2所示，在给予GLA mRNA之后，在肝脏、肾和脾脏中可以检测到毫微克浓度的人类GLA蛋白质。

图3示出了在静脉给予单一90μg静脉剂量的GLA mRNA之后，经过72小时，在Fabry疾病的鼠模型血清中检测到的人类α-半乳糖苷酶(GLA)蛋白质的浓度，其中所述的GLA mRNA囊封于HGT5000基脂质纳米颗粒中。在给予单一90μg剂量的GLA mRNA之后的24小时，在Fabry小鼠的血清中可以检测到超生理浓度的GLA蛋白质，其中所述的GLA mRNA囊封于HGT5000基脂质纳米颗粒中。

图4描绘了在静脉给予单一剂量的GLA之后，在24和72小时时，在Fabry疾病的鼠模型的肝脏、肾和心脏中可以检测到的人类α-半乳糖苷酶(GLA)蛋白质的浓度，其中所述的GLA囊封于HGT5000基脂质纳米颗粒中。如图4所示，在给予GLA mRNA后，在24小时和72小时时，GLA蛋白质在Fabry小鼠的评价器官中是可检测到的。

图5示出了在静脉输注30μg剂量的GLA mRNA之后，经过24小时，在野生型(WT)小鼠的血清中可以检测到的人类α-半乳糖苷酶(GLA)蛋白质的浓度，其中所述的GLA mRNA囊封于HGT5001基脂质纳米颗粒中。如图5所示，在给予GLA mRNA的6小时内，在血清中可以检测到浓度超过正常生理水平100倍的人类GLA蛋白质。类似地，在给予GLAmRNA之后的24小时内，在血清中可以检测到浓度超过正常生理水平30倍的人类GLA蛋白质。

图6示出了在静脉输注GLAmRNA之后，经过24小时，在野生型(WT)小鼠的肝脏、肾和脾脏中可以检测到的人类α-半乳糖苷酶(GLA)蛋白质的浓度，其中所述的GLA mRNA囊封于HGT5001基脂质纳米颗粒中。如图6所描绘，在静脉给予GLA mRNA之后的24小时，在WT小鼠的肝脏、肾和脾脏中可以检测到相当高水平的人类GLA蛋白质，其中所述的GLAmRNA囊封于HGT5001基脂质纳米颗粒中。

图7比较了在静脉给予单一剂量的EPO mRNA之后，经过24小时的时间，在Sprague-Dawley大鼠中可以检测到的人类红细胞生成素(EPO)蛋白质的血清浓度，其中所述的EPO mRNA囊封于HGT5000基或HGT5001基脂质纳米颗粒中。如图7所示，在静脉给予EPO mRNA之后，在6、12、18和24小时时可以检测到高浓度的EPO蛋白质，其中所述的EPO mRNA囊封于HGT5000基和HGT5001基脂质纳米颗粒中。

发明详述

本发明公开新型化合物，其可用作例如脂质体传递媒介物或脂质体传递媒介物的成分。在某些实施方案中，本发明所公开的化合物可以用作脂质体组合物，或者被选地用作脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)的成分。此外，本发明公开药物组合物(例如脂质纳米颗粒)及与该药物组合物有关的使用方法。在某些实施方案中，此类化合物和组合物有利于例如囊封材料(例如多核苷酸)向一种或多种靶细胞、组织和器官的传递。

本发明所公开的阳离子和/或可电离的化合物通常包括极性(亲水性)头部基团或部分，以及非极性(疏水性或亲脂性)尾部基团或部分。在某些实施方案中，此类极性头部基团和非极性尾部基团通常彼此(例如头部基团和尾部基团通过可任选地取代的、可变的不饱和C₁-C₁₀烷基或烯基而彼此共价结合)结合(例如通过氢键、范德华力、离子相互作用和共价键)。在某些实施方案中，头部基团或部分是亲水性的(例如包括可任选地取代的烷基氨基的亲水性头部基团)。如本文所用，术语“亲水性”在定性的术语中用于指官能团是喜欢水的，并且通常此类基团是水溶性的。例如本发明公开的化合物，其包括与一个或多个亲水性基团(例如亲水性头部基团)结合的可变的不饱和烷基官能团，其中此类亲水性基团包括氨基或可任选地取代的烷基氨基。

在某些实施方案中，所选的亲水性官能团或部分可以改变或以其他方式赋予化合物或脂质体组合物(所述的化合物为该组合物的成分)以多种性质(例如改善脂质纳米颗粒的转染效率，其中所述的化合物为脂质纳米颗粒的成分)。例如引入氨基作为本发明所公开的化合物中的亲水性头部基团可以促进此类化合物(或者脂质体组合物，所述的化合物为该脂质体组合物的成分)与一种或多种靶细胞的细胞膜的融合，从而增强例如此类化合物的转染效率。类似地，将一个或多个烷基氨基或部分引入到所公开的化合物(例如头部基团)中可以通过运用此类氨基的融合而进一步促进内涵体/溶酶体膜的破裂。这不仅基于所述的组合物的氨基的pKa，而且基于氨基经历六角形相变及与囊泡融合的能力(Koltover，et al.Science(1998)281：78-81)。结果被认为会促进囊泡膜的破裂及脂质纳米颗粒内含物的释放。

类似地，在某些实施方案中，在本发明所公开的化合物中引入例如正电荷的或可电离的亲水性头部基团可以促进囊封于本发明的脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)中的例如内含物的内涵体或溶酶体释放。此类增强的释放可以通过质子海绵介导的破裂机制和/或增强的融合机制来取得。质子海绵机制是基于化合物(具体为化合物的官能部分或基团)缓冲内涵体酸化的能力。这可以被操作或者以其他方式通过化合物的pKa或此类化合物所包含的一个或多个官能团(例如氨基)的pKa来控制。此类内涵体破裂的性质转而会促进脂质体膜的渗透膨胀和破裂，然后促进装载或囊封于靶细胞中的多核苷酸材料的转染或细胞内释放。

本发明所公开的脂质化合物通常可以包括一个或多个阳离子和/或可电离的官能头部基团，例如具有一个或多个烷基或芳基取代基的胺官能团。在某些实施方案中，本发明所公开的脂质化合物可以包括阳离子可电离的氨基官能头部基团，其中疏水性官能团、取代基或部分(例如R₁基团和R₂基团，其中R₁和R₂均独立地选自氢和C₁-C₁₀烷基)与所述的头部基团结合(共价结合)。在某些实施方案中，此类亲水性和疏水性官能团通过中间基团(例如烷基或可变的不饱和烯基)彼此结合(例如共价结合)。

此外，本发明所述的化合物(例如HGT5000、HGT5001和HGT5002)还可以通过它们降低的毒性(具体为相对于传统纸质和阳离子脂质，例如C12-200)来表征。因此，本发明所公开的一种或多种化合物可以代替一种或多种传统脂质来使用，其中所述的传统脂质可表征为将有效量的一种或多种试剂传递至靶细胞和组织所必需的量是有毒的。例如在一些实施方案中，可以制备药物和脂质体组合物，使得它们包括一种或多种本发明所公开的可电离的阳离子脂质化合物(例如HGT5000、HGT5001和/或HGT5002)作为降低或以其他方式消除与脂质体组合物有关的毒性的手段。阳离子可电离的化合物或脂质(例如HGT5000、HGT5001和/或HGT5002)在本发明所述的一种或多种药物和脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)中用作单独的阳离子脂质，或者被选地可以与传统的阳离子脂质(例如LIPOFECTIN或LIPOFECTAMINE)、非阳离子脂质、PEG改性的脂质和/或辅助脂质结合。在某些实施方案中，本发明所述的化合物，或者被选地药物和脂质体组合物的总的阳离子脂质成分在此类药物或脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)中可以包括摩尔比为大约1％至大约90％、大约2％至大约70％、大约50％至大约50％、大约10％至大约40％的总的脂质，或者优选的是在此类药物或脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)中可以包括大约20％至大约70％的总的脂质。此外，使脂质体媒介物与本发明所公开的阳离子可电离的脂质化合物结合或富集具有本发明所公开的阳离子可电离的脂质化合物的脂质体媒介物允许脂质体媒介物的其他脂质成分的浓度降低，由此提供降低或以其他方式缓解与其他阳离子脂质(例如C12-200)有关的毒性，其中所述的其他阳离子脂质也可以存在于脂质体媒介物中。

在某些实施方案中，包括本发明所公开的化合物的部分的至少一个官能团是天然疏水性的(例如疏水性尾部基团包括天然形成的脂质，例如胆固醇)。如本文所用，术语“疏水性”在定性术语中用于官能团是避开水的，并且此类基团通常不是水溶性的。例如在某些实施方案中，本发明所公开的化合物的疏水性或亲脂性尾部基团(例如一个或多个L₁基团和L₂基团)可以包括一个或多个非极性基团，例如胆固醇，或者可任选地取代的、可变的饱和或不饱和烷基或烯基(例如可任选地取代的十八碳-9，12-二烯)。

在某些实施方案中，本发明所公开的化合物包括例如至少一个亲水性头部基团和至少一个疏水性尾部基团，它们通过例如可任选地取代的、可变的饱和或不饱和烷基或烯基而彼此集合，由此赋予此类化合物的两性性质。如本发明描述化合物或组合物所用，术语“两性”是指溶解于极性(例如水)和非极性(例如脂质)环境中的能力。例如在某些实施方案中，本发明所公开的化合物包括至少一个亲脂性尾部基团(例如胆固醇、或者C₆-C₂₀烷基或烯基)和至少一个亲水性头部基团(例如烷基氨基)，它们与中间C₁-C₂₀烷基或烯基(例如己烷或己烯)结合。

应该注意的是，如描述本发明的化合物(特别是包括此类化合物的官能团)所用，术语“头部基团”和“尾部基团”用于方便地描述一个或多个官能团相对于其他官能团的取向。例如在某些实施方案中，亲水性头部基团(例如氨基)与烷基或烯基官能团(例如己-1-烯)结合(例如通过氢键、范德华力、离子相互作用和共价键中的一种或多种)，其中所述的烷基或烯基官能团转而与疏水性尾部基团(例如胆固醇，或C₆-C₂₀可变的不饱和烯基)结合。

此外，本发明还公开了具有式(I)结构的化合物：

其中R₁和R₂均独立地选自氢，可任选地取代的、可变的饱和或不饱和C₁-C₂₀烷基或烯基，和可任选地取代的、可变的饱和或不饱和C₆-C₂₀酰基；其中L₁和L₂均独立地选自氢，可任选地取代的C₁-C₃₀烷基，可任选地取代的、可变的不饱和C₁-C₃₀烯基，和可任选地取代的C₁-C₃₀炔基；其中m和o均独立地选自0，和任意的正整数(例如其中m为3)；以及其中n为0或任意的正整数(例如其中n为1)。

在某些实施方案中，化合物具有式(I)的结构，其中R₁和R₂均为甲基。在此类实施方案中，化合物的极性阳离子头部基团包括可电离的二甲基氨基。

在一些实施方案中，化合物具有式(I)的结构，其中L₁和L₂均为可任选地取代的多不饱和C₆-C₂₀烯基。例如考虑了其中L₁和L₂均为可任选地取代的多不饱和C₁₈烯基的化合物。在其他的实施方案中，L₁和L₂均为未被取代的多不饱和C₁₈烯基。在其他的实施方案中，L₁和L₂均为可任选地取代的十八碳-9，12-二烯(或十八碳-6，9-二烯)。在其他的实施方案中，L₁为氢，L₂为胆固醇。在某些实施方案中，L₁和L₂均为(9Z，12Z)-十八碳-9，12-二烯。在某些实施方案中，L₁和L₂均为十八碳-6，9-二烯。

在本发明所公开的某些实施方案中，本发明涉及具有式(I)结构的化合物，其中o为0。备选地，在其他的实施方案中，o为正整数(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多)。

在某些实施方案中，m和o独立地选自：0、1(这样烷基为乙基)、2(这样烷基为甲基)、3(这样烷基为例如丙基或异丙基乙基)、4(这样烷基为例如丁基、异丁基、伯丁基或叔丁基)、5(这样烷基为例如庚烷)、6(这样烷基为例如己烷)、7(这样烷基为例如庚烷)、8(这样烷基为例如辛烷)、9(这样烷基为例如壬烷、或10(这样烷基为例如癸烷)。

在一些具体的实施方案中，本发明涉及具有式(I)结构的化合物，其中R₁和R₂均为甲基；其中L₁和L₂均为可任选地取代的十八碳-9，12-二烯(或十八碳-6，9-二烯)；其中m为4；其中n为0；并且其中o为1。例如在某些实施方案中，本发明涉及具有式(II)结构的化合物(15Z，18Z)-N，N-二甲基-6-(9Z，12Z)-十八碳-9，12-二烯-1-基)二十碳-15，18-二烯-1-胺(本发明称为“HGT5000”)。

在一些具体的实施方案中，本发明涉及具有式(I)结构的化合物，其中R₁和R₂均为甲基；其中L₁和L₂均为可任选地取代的十八碳-9，12-二烯(或十八碳-6，9-二烯)；其中m为3；其中n为0；并且其中o为1。例如在某些实施方案中，本发明涉及具有式(III)结构的化合物(15Z，18Z)-N，N-二甲基-6-((9Z，12Z)-十八碳-9，12-二烯-1-基)二十碳-4，15，18-三烯-1-胺(本发明称为“HGT5001”)。

应该理解的是，在本发明所公开的那些实施方案(其中n为1)中，此类化合物可以为顺式异构体、反式异构体或备选地它们的外消旋混合物。例如在某些实施方案(其中n为1)中，n为顺式异构体，如具有式(IV)结构的化合物所示：

备选地，在其他的实施方案(其中n为1)中，n为反式异构体，如具有式(V)结构的化合物所示：

此外，公开了具有式(VI)结构的化合物：

其中R₁和R₂均独立地选自氢，可任选地取代的、可变的饱和或不饱和C₁-C₂₀烷基或烯基，和可任选地取代的、可变的饱和或不饱和C₆-C₂₀酰基；其中L₁和L₂均独立地选自氢，可任选地取代的C₁-C₃₀烷基，可任选地取代的、可变的不饱和C₁-C₃₀烯基，和可任选地取代的C₁-C₃₀炔基；其中m、n和o均独立地选自0，和任意的正整数。

在一些具体的实施方案中，本发明涉及具有式(VI)结构的化合物，其中R₁和R₂均甲基。在其他的实施方案中，本发明涉及具有式(VI)结构的化合物，其中R₁和R₂均独立地选自氢和甲基。

此外，考虑了具有式(VI)结构的化合物，其中L₁和L₂均可任选地取代多不饱和C₆-C₂₀烯基(例如其中L₁和L₂均为可任选地取代的多不饱和C₁₈烯基，或者其中L₁和L₂均为未被取代的多不饱和C₁₈烯基)。在本发明所公开的某些实施方案中，L₁和L₂均为可任选地取代的十八碳-9，12-二烯(或十八碳-6，9-二烯)。在其他的实施方案那种，L₁为氢，L₂为胆固醇。

在本发明所公开的某些实施方案中，本发明涉及具有式(VI)结构的化合物，其中m为正整数(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多)。在一些具体的实施方案中，本发明涉及具有式(VI)结构的化合物，其中m为4。在某些实施方案中，本发明涉及具有式(VI)结构的化合物，其中m至少为5(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多)。

此外，本发明公开了具有式(VI)结构的化合物，其中n为正整数(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多)。在另一个具体的实施方案中，本发明涉及具有式(VI)结构的化合物，其中n为0。

在本发明所公开的某些实施方案中，本发明涉及具有式(VI)结构的化合物，其中o为正整数(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多)。在某些实施方案中，本发明涉及具有式(VI)结构的化合物，其中o至少为5(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多)。备选地，在其他具体的实施方案中，本发明涉及具有式(VI)结构的化合物，其中o为0。

此外，考虑了具有式(VI)结构的化合物，其中R₁和R₂均为甲基；其中L₁和L₂均为十八碳-9，12-二烯(或十八碳-6，9-二烯)；其中m为4；并且其中n和o为0。例如在某些实施方案中，本发明涉及具有式(VII)结构的化合物(15Z，18Z)-N，N-二甲基-6-((9Z，12Z)-十八碳-9，12-二烯-1-基)二十碳-4，15，18-三烯-1-胺(本发明称为“HGT5002”)。

此外，本发明公开具有式(VIII)结构的化合物：

其中R₁和R₂均独立地选自可任选地取代的、可变的饱和或不饱和C₁-C₂₀烷基或烯基，和可任选地取代的、可变的饱和或不饱和C₆-C₂₀酰基；其中L₁和L₂均独立地选自可任选地取代的C₁-C₃₀烷基，可任选地取代的、可变的不饱和C₁-C₃₀烯基，和可任选地取代的C₁-C₃₀炔基；其中x选自C₁-C₂₀烷基和可变的不饱和C₁-C₂₀烯基。

在某些实施方案中，所公开的化合物具有式(VIII)的结构，其中R₁和R₂均为甲基。在其他的实施方案中，所公开的化合物具有式(VIII)的结构，其中R₁和R₂均独立地选自氢和C₁-C₆烷基。

在其他的实施方案中，本发明涉及具有式(VIII)结构的化合物，其中L₁和L₂均为未被取代的多不饱和C₁₈烯基。例如在某些实施方案中，L₁和L₂均为可任选地取代的十八碳-9，12-二烯(例如L₁和L₂均为未被取代的十八碳-9，12-二烯或十八碳-6，9-二烯)。在某些其他的实施方案中，L₁为氢，L₂为胆固醇。

在某些实施方案中，所公开的化合物具有式(VIII)的结构，其中x为C₆烯基。在其他的实施方案中，所公开的化合物具有式(VIII)的结构，x为己烷。在其他的实施方案中，所公开的化合物具有式(VIII)的结构，x为己-1-烯。在其他的实施方案中，所公开的化合物具有式(VIII)的结构，x为己-2-烯。在某些实施方案中，x并非为己烷。在其他的实施方案中，所公开的化合物具有式(VIII)的结构，其中x为C₆-C₁₀烯基或C₆-C₁₀烷基。

在一个具体的实施方案中，本发明涉及具有式(VIII)结构的化合物，其中R₁和R₂均为甲基；其中L₁和L₂均为十八碳-9，12-二烯；并且其中x为己烷。在另一个具体的实施方案中，本发明涉及具有式(VIII)结构的化合物，其中R₁和R₂均为甲基；其中L₁和L₂均为十八碳-9，12-二烯(或十八碳-6，9-二烯)；并且其中x为己-1-烯。在另一个具体的实施方案中，本发明涉及具有式(VIII)结构的化合物，其中R₁和R₂均为甲基；其中L₁和L₂均为十八碳-9，12-二烯(或十八碳-6，9-二烯)；并且其中x为己-2-烯。

如本文所用，术语“烷基”是指支链或支链的C₁-C₄₀碳氢化合物(例如C₆-C₂₀碳氢化合物)，并且包括饱和的和不饱和的碳氢化合物。在某些实施方案中，烷基可以包括一种或多种环烷基和/或一种或多种杂原子，例如氧、氮或硫，并且可以可任选地被取代基取代(例如烷基、卤代、烷氧基、羟基、氨基、芳基、醚、酯或酰胺)。在某些实施方案中，所考虑的烷基疏水性尾部基团包括(9Z，12Z)-十八碳-9，12-二烯。在某些实施方案中，所考虑的烷基疏水性尾部基团包括十八碳-6，9-二烯。诸如“C₆-C₂₀”之类的名称的用途是指具有所述范围的碳原子的烷基(例如直链或直链，并包括烯烃和烷基)。

如本文所用，术语“芳基”是指环部分包括6至10个碳的芳香剂(例如单环、双环和三环结构)。芳基可以可任选地通过可利用的碳原子取代，并且在某些实施方案中，可以包括一个或多个杂原子，例如氧、氮或硫。

应该理解的是，在本发明所述的其中所述的化合物具有一个或多个不对称或手性分子(例如一个或多个不饱和的碳-碳双键)的那些实施方案中，顺式(Z)和反式(E)异构体均在本发明的范围内。

本发明所述的化合物可以用于构建脂质体组合物，该脂质体组合物促进或增强囊封材料(例如一种或多种治疗多核苷酸)传递并释放到一种或多种靶细胞(例如通过渗透或与此类靶细胞的脂质膜融合)。例如当脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)包括或以其他方式富集本发明所公开的一种或多种化合物时，一种或多种靶细胞的脂质双层的相变可以促进囊封材料(例如囊封于脂质纳米颗粒中的一种或多种治疗多核苷酸)传递至一种或多种靶细胞中。类似地，在某些实施方案中，本发明所公开的化合物可以用于制备脂质体媒介物，该脂质体媒介物可以通过它们在体内降低的毒性来表征。在某些实施方案中，降低的毒性为高转染效率的函数，而高转染效率与本发明所公开的组合物有关，这样给予受试对象的此类组合物的量降低，从而取得所需的治疗应答或结果。

在某些实施方案中，本发明所描述的化合物可表征为具有一种或多种性质，这些性质可以赋予此类化合物相对于其他相似类别的脂质的优点。例如在某些实施方案中，本发明所公开的化合物允许控制和调整脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒，其中所述的化合物为该组合物的成分)的性质。具体而言，本发明所公开的化合物可以通过转染效率的增强和它们激发特异性生物学结果的能力来表征。此类结果可以包括例如增强的细胞吸收，内涵体/溶酶体破裂的能力和/或促进囊封材料(例如多核苷酸)在细胞内的释放。

在某些实施方案中，本发明所述的化合物(及包括此类化合物的药物和脂质体组合物)使用了多功能的策略来促进囊封材料(例如一种或多种多核苷酸)向一种或多种靶细胞的传递，以及随后一种或多种靶细胞的转染。例如在某些实施方案中，本发明所述的化合物(及包括此类化合物的药物和脂质体组合物)可以表征为具有受体介导的内吞作用、网格蛋白介导的和细胞膜穴样内陷介导的内吞作用、吞噬作用、巨胞饮作用、融合作用、内涵体或溶酶体破裂和/或可释放的性质(这些性质赋予此类化合物相对于其他类似类别的脂质的优点)中的一种或多种。

在某些实施方案中，化合物，以及药物和脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒，其中此类化合物为该组合物的成分)表现为转染一种或多种靶细胞的能力增强(例如增高)。因此，本发明还提供了转染一种或多种靶细胞的方法。此类方法通常包括将一种或多种靶细胞与本发明所公开的化合物和/或药物组合物(囊封有一种或多种多核苷酸的HGT5000、HGT5001和/或HGT5002基脂质纳米颗粒)相接触的步骤，使得一种或多种靶细胞被囊封的材料(例如一种或多种多核苷酸)所转染。如本文所用，术语动词性的“转染”或名词性的“转染”是指将一种或多种囊封的材料(例如核酸和/或多核苷酸)以细胞内的方式引入到细胞中，或者优选地引入到靶细胞中。引入的多核苷酸可以稳定地或短暂地保持在细胞中。术语“转染效率”是指被经历转染的靶细胞所吸收的、引入到该经历转染的靶细胞中的和/或由该经历转染的靶细胞所表达的此类囊封的材料(例如多核苷酸)的相对量。在实践中，可以通过由靶细胞在转染后所产生的报告多核苷酸产物的量来估计转染效率。在某些实施方案中，本发明所述的化合物和药物组合物证明了高的转染效率，从而提高了合适剂量的囊封的材料(例如一种或多种多核苷酸)被传递至病理学位点并随后被表达的可能性，同时降低与所述的化合物或它们的囊封内含物有关的潜在的系统性不利作用或毒性。

可以发挥药物或治疗作用的多种材料可以被传递至使用本发明的化合物、组合物和方法的靶细胞。因此，本发明所述的化合物、以及药物和脂质体组合物可以用于囊封适用于细胞内传递的任何材料。在某些实施方案中，此类囊封材料能够赋予细胞(此类材料被传递至该细胞中)以治疗或诊断益处，并且可以包括任何药品、生物制剂和/或诊断制剂。所述的材料可以是有机的或无机的。有机分子可以为肽、蛋白质、碳水化合物、脂质、固醇、核酸(包括肽核酸)、或它们的任意组合。在某些实施方案中，本发明所述的药物和脂质体组合物可以包括或以其他方式囊封一种以上的材料，例如编码蛋白质、酶和/或甾类化合物的两种或多种不同的多核苷酸序列。在某些实施方案中，囊封的材料为一种或多种多核苷酸和核酸。

如本文所用，术语“多核苷酸”和“核酸”可以交换使用，其是指遗传物质(例如DNA和RNA)，当该术语用于本发明所述的化合物和组合物(例如脂质纳米颗粒)时，其通常是指被此类化合物和组合物(例如脂质纳米颗粒)囊封的遗传物质。在一些实施方案中，所述的多核苷酸为RNA。合适的RNA包括mRNA、siRNA、miRNA、snRNA和snoRNA。此外，所考虑的多核苷酸包括大的基因间的非编码RNA(lincRNA)，其通常不编码蛋白质，但在例如免疫信号传递、干细胞生物学和疾病的发展中发挥作用(例如参见Guttman，et al.，458：223-227(2009)；and Ng，et al.，Nature Genetics 42：1035-1036(2010)，该文献的内容以引用方式并入本文)。在某些实施方案中，被本发明的化合物、以及药物和脂质体组合物囊封的多核苷酸包括RNA或编码蛋白质或酶的稳定的RNA(例如编码α-半乳糖苷酶A或芳基硫酸酯酶A的mRNA)。本发明考虑了此类多核苷酸(具体为RNA或稳定的RNA)作为能够被靶细胞表达从而促进该靶细胞产生功能酶或蛋白质的治疗制剂的用途，例如在国际申请No.PCT/US2010/058457和2011年6月8日提交的美国临时申请No.61/494,881(代理人案号No.SHIR-025-001)中公开的那样，这些文献的教导均以引用方式全文并入本文。例如在某些实施方案中，在靶细胞表达一种或多种多核苷酸时，可以观察到生产出受试对象缺陷的功能酶或蛋白质(例如尿素循环酶或与溶酶体储存紊乱有关的酶)。如本文所用，用于限定蛋白质或酶的术语“功能”是指蛋白质或酶具有生物学活性，或者被选地能够执行与天然或正常功能的蛋白质或酶相同或相似的功能。

在某些实施方案中，本发明所述的化合物、以及药物和脂质体组合物被配制为共混的配制物或组合物。例如在一个实施方案中，药物组合物包括共混的配制物，其包括含有HGT5000的第一脂质纳米颗粒和含有HGT5001的第二脂质纳米颗粒，其中第一脂质纳米颗粒与第二脂质纳米颗粒的比例为3∶1。因此，本发明还提供了共混的药物组合物，以及用于调控多核苷酸在一种或多种靶细胞和组织中的表达的相关方法，例如在2011年6月8日提交的美国临时申请No.61/494,714(代理人案号No.SHIR-021-001)中所公开的那样，这些文献的教导均以引用方式全文并入本文。此外，还考虑了用于调控(例如增高或协同增高)一种或多种靶细胞生产和/或分泌例如一种或多种功能多肽、蛋白质或酶的方法，其中所述的功能多肽、蛋白质或酶由囊封于所述的共混的药物组合物中的一种或多种多核苷酸(例如mRNA)所编码。

在本发明的内容中，术语“表达”在广义上是指特异的基因或多核苷酸转录成至少一种mRNA转录物，或者将至少一种mRNA或多核苷酸翻译成蛋白质或酶。例如在某些实施方案中，本发明所述的化合物，以及药物或脂质体组合物包括编码功能蛋白质或酶的多核苷酸(例如mRNA)。在此类mRNA多核苷酸的内容中，术语表达是指翻译此类mRNA(例如通过靶细胞)，从而生产由此编码的多肽或蛋白质。

在某些实施方案中，本发明提供的化合物和药物组合物能够调控在一种或多种靶细胞和组织中异常表达的核酸和多核苷酸。因此，本发明还提供了通过向受试对象给予有效量的本发明所述的化合物和/或药物或脂质体组合物来治疗受试对象的疾病的方法。在某些实施方案中，此类方法可以增强(例如增多)多核苷酸的表达，和/或增多功能多肽产物在一种或多种靶细胞和组织(例如肝细胞)中的生产和分泌。在一些实施方案中，靶细胞或组织异常表达了被本发明所述的化合物，或药物和脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)所囊封的多核苷酸。此外，本发明还提供了增多一种或多种多核苷酸(例如mRNA)在一种或多种靶细胞、组织和器官(例如肺、心脏、脾脏、肝脏和/或肾)中的表达的方法。通常，此类方法包括将靶细胞与一种或多种化合物和/或药物或脂质体组合物相接触，其中所述的药物或脂质体组合物包括或以其他方式囊封了一种或多种多核苷酸。

在某些实施方案中，本发明所公开的化合物可以用作脂质体或脂质体的成分。具体而言，在某些实施方案中，本发明所公开的化合物可以用作脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)的脂质(例如阳离子脂质)成分。此类脂质体可以用于囊封物质及促进此类物质向一种或多种靶细胞、组织和器官的传递。如本文所用，术语“脂质体”通常是指由脂质(例如两性脂质)构成的囊泡，其中所述的脂质排布于一个或多个球形双层中。在某些实施方案中，脂质体为脂质纳米颗粒(例如脂质纳米颗粒包括本发明所公开的一种或多种阳离子脂质化合物)。此类脂质体可以是当层的或多层的囊泡，该囊泡具有由亲脂性物质形成的膜，和包括有囊封的物质(例如多核苷酸)的水性内心，气质所述的囊封的物质将被传递至一种或多种靶细胞、组织和器官。在某些实施方案中，本发明所述的药物和脂质体组合物包括一种或多种脂质纳米颗粒。所考虑的脂质体包括脂质纳米颗粒。可以用于形成特此考虑的脂质体和脂质纳米颗粒的、合适的脂质(例如阳离子脂质)的实例包括包括本发明所公开的一种或多种化合物(例如HGT5000、HGT5001和/或HGT5002)。此类脂质体和脂质纳米颗粒还可以包括其他的阳离子脂质，例如C12-200、DLin-KC2-DMA、DOPE、DMG-PEG-2000、非阳离子脂质、胆固醇基脂质、辅助脂质、PEG改性的脂质、磷脂酰化合物(例如磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂类、脑苷脂和神经节苷脂)、以及这些化合物的组合或混合物。

多种阳离子脂质已经在文献中有所描述，很多是市售可得的。在某些实施方案中，本发明所述的药物或脂质体组合物除了本发明所公开的一种或多种化合物或脂质(例如HGT5000)以外，还包括所述的阳离子脂质。在一些实施方案中，使用阳离子脂质N-[1-(2，3-二油基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基铵氯化物或“DOTMA”(Felgner et al.(Proc.Nat′lAcad.Sci.84，7413(1987)；美国专利No.4,897,355)。DOTMA可以单独配制或者可以与二油酰基磷脂酰乙醇胺、“DOPE”或者其他阳离子或非阳离子脂质结合到脂质纳米颗粒中。其他合适的阳离子脂质包括例如C12-200，5-羧基精胺基甘氨酸双十八烷基酰胺或“DOGS”，2，3-二油基氧基-N-[2(精胺-甲酰胺基)乙基]-N，N-二甲基-1-丙铵或“DOSPA”(Behr et al.Proc.Nat.′l Acad.Sci.86，6982(1989)；美国专利No.5,171,678；美国专利No.5,334,761)，1，2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷或“DODAP”，1，2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷或“DOTAP”。此外，所考虑的阳离子脂质还包括1，2-二硬脂酰氧基-N，N-二甲基-3-氨基丙烷或“DSDMA”，1，2-二油基氧基-N，N-二甲基-3-氨基丙烷或“DODMA”，1，2-二亚油醇基氧基-N，N-二甲基-3-氨基丙烷或“DLinDMA”，1，2-二亚麻基氧基-N，N-二甲基-3-氨基丙烷或“DLenDMA”，N-二油基-N，N-二甲基铵氯化物或“DODAC”，N，N-二硬脂酰-N，N-二甲基铵溴化物或“DDAB”，N-(1，2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N，N-二甲基-N-羟基乙基铵溴化物或“DMRIE”，3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁-4-氧基)-1-(cis，cis-9，12-十八碳二烯氧基)丙烷或“CLinDMA”，2-[5′-(胆甾-5-烯-3-β-氧基)-3′-氧杂戊氧基)-3-二甲基-1-(cis，cis-9′，1-2′-十八碳二烯氧基)丙烷或“CpLinDMA”，N，N-二甲基-3，4-二油基氧基苄基胺或“DMOBA”，1，2-N，N′-二油基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷或“DOcarbDAP”，2，3-二亚麻酰基氧基-N，N-二甲基丙基胺或“DLinDAP”，1，2-N，N′-二亚油醇基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷或“DLincarbDAP”，1，2-二亚麻酰基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷或“DLinCDAP”，2，2-二亚油醇基-4-二甲基氨基甲基-[1，3]-二恶茂烷或“DLin-K-DMA”，2，2-二亚油醇基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二恶茂烷或“DLin-K-XTC2-DMA”，或它们的混合物(Heyes，J.，et al.，J Controlled Release 107：276-287(2005)；Morrissey，DV.，et al.，Nat.Biotechnol.23(8)：1003-1007(2005)；PCT公开WO2005/121348A1)。此外，本发明还考虑了胆固醇基阳离子脂质配制所述的组合物(例如脂质纳米颗粒)的用途。此类胆固醇基阳离子脂质可以单独使用，或者与其他的阳离子或非阳离子组合使用。合适的胆固醇基阳离子脂质包括例如DC-Chol(N，N-二甲基-N-乙基甲酰胺基胆固醇)，1，4-双(3-N-油烯基氨基-丙基)哌嗪(Gao，et al.Biochem.Biophys.Res.Comm.179，280(1991)；Wolf et al.BioTechniques 23，139(1997)；美国专利No.5,744,335)。

此外，多种用于增强转染效率的试剂是市售可得的。合适的实施例包括LIPOFECTIN(DOTMA：DOPE)(Invitrogen，Carlsbad，Calif.)、LIPOFECT胺(DOSPA：DOPE)(Invitrogen)、LIPOFECTAMINE2000(Invitrogen)、FUGENE、TRANSFECTAM(DOGS)和EFFECTENE。此外，还考虑了阳离子脂质，例如二烷基氨基基、咪唑基和胍基脂质。例如，还考虑了阳离子脂质(3S，10R，13R，17R)-10，13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十四氢-1H-环戊烯[a]菲-3-基3-(1H-咪唑-4-基)丙酸或“ICE”的用途，如在国际申请No.PCT/US2010/058457中所公开的那样，该文献的教导以引用方式全文并入本文。

此外，还考虑了聚乙二醇(PEG)改性的二氧磷基脂质和衍生的脂质(例如衍生的神经酰胺(PEG-CER)，包括N-辛酰基-鞘氨醇-1-[琥珀酰(甲氧基聚乙二醇)-2000](C8PEG-2000神经酰胺))在本发明所述的脂质体和药物组合物中的用途，并将该聚乙二醇(PEG)改性的二氧磷基脂质和衍生的脂质包含在本发明所述的脂质体和药物组合物中，优选的是，所述的聚乙二醇(PEG)改性的二氧磷基脂质和衍生的脂质与本发明所公开的一种或多种化合物和脂质结合。所考虑的PEG改性的脂质包括但不限于长度至多5kDa的聚乙二醇链，其使用长度为C₆-C₂₀的烷基链与脂质共价连接。加入此类成分可以防止络合物聚集，还可以提供用于增加循环寿命及增加脂质-多核苷酸组合物向靶组织传递的手段(Klibanov et al.(1990)FEBS Letters，268(1)：235-237)，或者可以选择所述的成分，从而快速地将配制物由体内换出(参见美国专利No.5,885,613)。特别有用的可交换的脂质为酰基链较短(例如C14或C18)的PEG-神经酰胺。本发明的PEG改性的二氧磷基脂质和衍生的脂质占在脂质体的脂质纳米颗粒中存在的总脂质的摩尔比可以为大约0％至大约20％、大约0.5％至大约20％、大约1％至大约15％、大约4％至大约10％、或者大约2％。

此外，本发明还考虑了非阳离子脂质在一种或多种药物或脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)中的用途。此类非阳离子脂质优选地与本发明所公开的一种或多种化合物和脂质组合使用。如本文所用，短语“非阳离子脂质”是指任何中性、两性离子或阴离子脂质。如本文所用，短语“阴离子脂质”是指在所选的pH(例如生理学pH)下携带净的负电荷的多种脂质的任意一种。非阳离子脂质包括但不限于二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油l(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油l(DPPG)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧基酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、DLPE(1，2-二月桂酰-锡-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DPPS(1，2-二棕榈酰-锡-甘油-3-二氧磷基-L-丝氨酸)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、神经酰胺、鞘磷脂、胆固醇或它们的混合物。此类非阳离子脂质可以单独使用，但优选的是与其他赋形剂(例如本发明所公开的一种或多种阳离子脂质化合物，例如HGT5000、HGT5001和/或HGT5002)组合使用。当与阳离子脂质组合使用时，非阳离子脂质与脂质纳米颗粒中所存在的总脂质的摩尔比为5％至大约90％，或者优选地大约10％至大约70％。

此外，还考虑了将聚合物包含在脂质纳米颗粒中，该脂质纳米颗粒包括本发明所述的药物或脂质体组合物。合适的聚合物可以包括例如聚丙烯酸酯、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚乳酸、聚乳酸-聚乙交酯共聚物、聚己酸内酯、右旋糖苷、白蛋白、凝胶、藻酸酯、胶原蛋白、壳聚糖、环式糊精和聚乙烯亚胺。此类聚合物可以单独使用，但是优选的是与其他赋形剂组合使用，所述的赋形剂例如为本发明所公开的一种或多种阳离子脂质化合物(例如HGT5000、HGT5001和/或HGT5002)。

在某些实施方案中，药物和脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)可以部分基于它们促进靶细胞(例如多核苷酸)转染的能力来配制。在另一个实施方案中，可以选择和/或制备药物和脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)，从而优化多核苷酸向靶细胞、组织或器官的传递。例如如果靶细胞为肝细胞，则药物和/或脂质体组合物的性质(例如大小、电荷和/或pH)可以优化，从而有效地将此类组合物(例如脂质纳米颗粒)传递至靶细胞或器官，降低免疫清除，和/或促进在靶器官中的保留。备选地，如果靶组织为中枢神经系统，则药物和脂质体组合物的选择和制备必须考虑血脑屏障的渗透，在血脑屏障中的保留，和/或将此类组合物(例如脂质纳米颗粒)直接传递至此类靶组织的备选手段(例如通过脑血管内给予)的用途。在某些实施方案中，药物或脂质体组合物、或它们构成的脂质纳米颗粒可以与促进囊封物质转移的试剂(破裂或改善血脑屏障的渗透性并由此增强此类囊封多核苷酸向靶细胞的转移的试剂)结合。在本发明所述的药物和脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)可以促进囊封物质(例如一种或多种多核苷酸)引入到靶细胞中的同时，将聚阳离子(例如聚L-赖氨酸和精蛋白)加入到例如包括药物组合物作为共聚物的一种或多种脂质纳米颗粒还可以促进，并且在一些情况下在体外和体内会显著增强多种类型的阳离子脂质体在多种细胞系中的转染效率(2-28倍)(参见N.J.Caplen，et al.，GeneTher.1995；2：603；S.Li，et al.，Gene Ther.1997；4，891)。

在本发明的某些实施方案中，药物和脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)被制备成囊封了一种或多种物质或治疗剂(例如多核苷酸)。将所需的治疗剂(例如mRNA)并入到脂质体或脂质纳米颗粒中的过程在本文中称为“装载”或“囊封”(Lasic，et al.，FEBS Lett.，312：255-258，1992)。脂质纳米颗粒所装载或囊封的物质(例如多核苷酸)可以全部或部分装载于脂质纳米颗粒的内部空间，脂质纳米颗粒的双层膜上，或者与脂质纳米颗粒的外部表面有关。

将例如多核苷酸装载或囊封于脂质纳米颗粒中可以保护多核苷酸与一定的环境隔离，其中所述的环境可以包括降解此类多核苷酸的酶或化学品(例如血清)，和/或导致此类多核苷酸被快速分泌的系统或受体。因此，在一些实施方案中，本发明所述的组合物能够增强由此囊封的多核苷酸的稳定性(具体而言是对此类多核苷酸所暴露的环境)。此外，将诸如多核苷酸之类的物质囊封于本发明所述的一种或多种药物和脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)中还会促进此类多核苷酸向靶细胞和组织的传递。例如包括本发明所述的一种或多种脂质化合物的脂质纳米颗粒可以允许被囊封的多核苷酸到达靶细胞，或者可以优选地允许被囊封的多核苷酸以差异化的方式到达靶细胞或器官(例如脂质纳米颗粒可以在给予此类脂质纳米颗粒的受试对象的肝脏或脾脏中浓缩)。备选地，脂质纳米颗粒可以限制囊封的多核苷酸向其他非靶细胞或器官(其中囊封的多核苷酸的存在是不理想的或者是用途受限的)的传递。

在某些实施方案中，本发明所述的药物和脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)可以通过将多种脂质成分(例如本发明所公开的一种或多种化合物)与一种或多种聚合物成分结合来制备。例如可以使用HGT5000、DOPE、CHOL和DMG-PEG2000来制备脂质纳米颗粒。脂质纳米颗粒可以由脂质以多种比例形成的其他的组合构成(包括例如HGT5001、DOPE和DMG-PEG2000)。可以基于所选的脂质的特征、预期靶细胞或组织的本性和有待被脂质纳米颗粒传递的物质或多核苷酸的特征来选择阳离子脂质、非阳离子脂质和/或PEG改性的脂质(其包括脂质纳米颗粒，以及此类脂质彼此的相对摩尔比)。其他考虑包括例如所选脂质的烷基链的饱和情况，以及所选脂质的大小、电荷、pH、pKa、融合性和毒性。

用于本发明的药物和脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)可以通过本领域目前已知的多种技术来制备。多薄片状囊泡(MLV)可以通过传统技术来制备，例如通过将脂质溶解于合适的溶剂中将所选的脂质沉积在合适容器或器皿的内壁上，然后蒸发溶剂或通过喷雾干燥，从而使薄膜留在器皿的内壁上。然后，可以在涡旋运动下，将水性相加入到器皿中，这使得MLV形成。然后，可以通过多薄片状囊泡的均化丛、超声作用或挤出作用来形成淡薄片状囊泡(ULV)。此外，可以通过洗涤剂除去技术来形成单薄片状囊泡。

在某些实施方案中，本发明的药物和脂质体组合物包括脂质纳米颗粒，其中囊封的多核苷酸(例如mRNA)结合在脂质纳米颗粒的两个表面上，并被囊封于相同的脂质纳米颗粒中。例如在本发明的组合物的制备过程中，本发明所述的并包括脂质纳米颗粒的一种或多种阳离子脂质化合物可以通过多核苷酸的静电相互作用而与该多核苷酸(例如mRNA)有关。

在某些实施方案中，本发明的药物和脂质体组合物可以装载诊断放射性核、荧光物质或在体外和体内应用中可检测的其他物质。例如用于本发明的合适的诊断物质可以包括玫瑰精-二油酰基磷脂酰乙醇胺(Rh-PE)、Green Fluorescent Protein mRNA、Renilla Luciferase mRNA和FireflyLuciferase mRNA。

此外，在本发明所述的脂质体组合物的制备过程中，还可以通过将水溶性的载体试剂包含在水合溶液中而被囊封于水性内部，并且可以通过将亲脂性分子包含在脂质配制物中而将亲脂性分子引入到脂质双层中。在某些分子(例如阳离子或阴离子亲脂性多核苷酸)的情况下，例如可以通过在美国No.4,946,683中所述的方法将多核苷酸装载到配制的脂质纳米颗粒或脂质体中，其中所述的文献的公开内容以引用方式并入本文。在囊封多核苷酸之后，可以通过凝胶色谱、膜渗滤或超滤对脂质纳米颗粒进行加工，从而除去未囊封的mRNA。例如如果想要由本发明所述的脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)的表面上除去外部结合的多核苷酸，则可以使此类脂质纳米颗粒二乙氨基乙基SEPHACEL柱。

除了囊封的物质(例如多核苷酸)以外，一种或多种治疗剂或诊断剂可以被包含或囊封于脂质纳米颗粒中。例如此类其他的治疗剂可与脂质纳米颗粒的表面结合，可以通过包含脂质配制物或装载到配制的脂质纳米颗粒中而被引入到脂质纳米颗粒的脂质双层中(参见美国No.5,194,654和5,223,263，该文献以引用方式并入本文)。

当分选作为本发明的一部分时，具有多种方法用于减小本发明所公开的脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)的大小或对该组合物进行“分选”，并且通常可以使用这些方法的任一方法。挤出法为脂质体分选的一种方法(Hope，M J et al.Reduction of Liposome Size and Preparation of UnilamellarVesicles by Extrusion Techniques.In：Liposome Technology(G.Gregoriadis，Ed.)Vol.1.p 123(1993))。所述的方法由将脂质体挤出通过小孔聚碳酸酯膜或不对称的陶瓷膜组成，从而将脂质体大小减小至相对明确定义的大小的分布。通常，悬浮物一次或多处循环通过膜，直至得到所需的脂质体大小分布。脂质体可以通过孔连续变小的膜挤出，从而使得脂质体的大小逐渐减小。

本领域已知多种备选方法可用于分选脂质纳米颗粒群体。一种此类分选方法在美国专利No.4,737,323中有所描述，该文献以引用方式并入本文。通过浴式或探针式超声作用对脂质体或脂质纳米颗粒的悬浮物进行超声处理会产生大小连续减小至较小的ULV(直径小于大约0.05微米)。均化作用为另一种方法，其依赖于剪切能量，从而将大的脂质体破碎成较小的脂质体。在典型的均化作用过程中，MLV通过标准的乳化均化器再循环，直至观察到所选的脂质体大小，通常为大约0.1至0.5微米。如Bloomfield，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.，10：421-450(1981)所述，可以通过准电光散射(QELS)测定脂质纳米颗粒的大小，该文献以引用方式并入本文。可以通过对所形成的脂质纳米颗粒实施超声作用来减小脂质纳米颗粒的平均直径。间歇式超声循环可以与QELS评估交替，从而指导有效的脂质体合成。

本发明所述的脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)的合适大小的选择必须考虑靶细胞或组织的位点，及某种程度上制备脂质纳米颗粒的用途。如本文所用，短语“靶细胞”是指本发明所述的一种或多种药物和脂质体组合物所定向或靶向的细胞。在一些实施方案中，靶细胞包括特定的组织或器官。在一些实施方案中，靶细胞缺乏所关注的蛋白质或酶。例如在需要将多核苷酸传递至肝细胞的情况下，肝细胞代表靶细胞。在一些实施方案中，本发明的药物或脂质体组合物(例如其中囊封的多核苷酸物质)以差异化的方式转染靶细胞(即，不会转染非靶细胞)。可以制备本发明的组合物和方法来优选地靶向多种靶细胞，这些细胞包括但不限于肝细胞、造血细胞、上皮细胞、内皮细胞、肺细胞、肺泡细胞、骨细胞、干细胞、间充质细胞、神经细胞(例如脑膜、星细胞、运动神经元、背根神经节和前角运动神经元的细胞)、光感受器细胞(例如视杆和视锥)、视网膜色素上皮细胞、分泌细胞、心脏细胞、脂肪细胞、血管平滑肌细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、β细胞、垂体细胞、滑膜衬里细胞、卵巢细胞、睾丸细胞、成纤维细胞、B细胞、T细胞、网状细胞、白细胞、粒细胞和肿瘤细胞。

在一种或多种靶细胞被例如囊封于一种或多种脂质纳米颗粒(包括本发明所公开的药物或脂质体组合物)的多核苷酸转染后，可以优选地刺激由此类多核苷酸所编码的产物(例如多肽或蛋白质)的生产，并增强此类靶细胞表达多核苷酸及生产例如所关注的多肽或蛋白质的能力。例如靶细胞被囊封有mRNA的一种或多种化合物或药物组合物转染将会增强(即，增多)由此类mRNA所编码的蛋白质或酶的生产。

在一些实施方案中，理想的是限制多核苷酸对某些细胞或组织的转染。例如肝脏由于其在蛋白质的新陈代谢和生产中的中心作用而代表了本发明的组合物的重要靶器官，因此由于肝脏特异性基因产物的缺陷所导致的疾病(例如尿素循环紊乱)可以受益于细胞(例如肝细胞)的特异性靶向。因此，在本发明的某些实施方案中，可以利用靶组织的结构特征使本发明的药物和脂质体组合物(例如HGT5001基脂质纳米颗粒)定向分布于此类靶组织。例如为了靶向肝细胞，可以使包括本发明所述的药物或脂质体组合物的一种或多种脂质纳米颗粒具有一定的大小，这样它们的维度比肝脏中肝窦内膜的内皮细胞层的窗孔更小；因此，一种或多种此类脂质纳米颗粒可以容易地渗透此类内皮细胞窗孔，而到达靶肝细胞。备选地，可以使脂质纳米颗粒具有一定的大小，这样脂质体的维度具有足够的直径来限制或明显地避免分布于某些细胞或组织中。例如可以使包括本发明所述的药物和脂质体组合物的脂质纳米颗粒具有一定的大小，使得它们比肝窦内膜的内皮细胞层的窗孔更小，由此限定了脂质体的脂质纳米颗粒向肝细胞的分布。在此类实施方案中，较大的脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)不会容易地渗透内皮细胞窗孔，反而将被肝窦内膜的巨噬Kupffer细胞所清除。例如包括药物组合物的脂质纳米颗粒的分选因此可以提供这样的机会：进一步操纵及精确地控制囊封多核苷酸的表达在一种或多种靶细胞中增强的程度。通常，包括本发明的药物和脂质体组合物的至少一种脂质纳米颗粒的大小在大约25至250nm，优选的是小于大约250nm，175nm，150nm，125nm，100nm，75nm，50nm，25nm或10nm的范围内。

类似地，可以制备本发明的组合物，从而优选地分布于其他的靶组织、细胞或器官中，例如心脏、肺、肾、脾脏。例如可以制备本发明的脂质纳米颗粒，从而取得增强的向靶细胞和组织的传递。因此，本发明的组合物可以使其他的阳离子、非阳离子和PEG改性的脂质进一步富集于靶组织或细胞。

在一些实施方案中，本发明所述的化合物、以及药物和脂质体组合物(例如HGT5002基脂质纳米颗粒)分布于肝细胞和组织，从而增强其中囊封的多核苷酸(例如mRNA)的传递、传染和被肝脏的细胞和组织(例如肝细胞)，以及由此类多核苷酸所编码的多肽或蛋白质的相应生产。尽管此类组合物可以优选地分布于肝脏的细胞和组织，但是所表达的多核苷酸的治疗效果和由其编码的蛋白质的随后的生产不必局限于靶细胞和组织。例如靶向的细胞(例如肝细胞)可以起到能够表达或生产、以及系统性或在外周上分泌功能蛋白质或酶的“储存器”或“仓库”的作用，例如在国际申请No.PCT/US2010/058457(代理人案号No.SHIR-004-WO1)和美国临时申请No.61/494,881(代理人案号No.SHIR-025-001)中所公开的那样，这些文献的教导均以引用方式全文并入本文。因此，在本发明的某些实施方案中，包括本发明所述的药物和脂质体组合物(例如HGT5000基脂质纳米颗粒)的一种或多种脂质纳米颗粒可以靶向肝细胞和/或优选地在传递时分布于肝脏的细胞和组织。在靶细胞被囊封于一种或多种此类脂质纳米颗粒所转染之后，此类多核苷酸表达(例如翻译)，并且功能产物(例如多肽或蛋白质)被分泌并系统性地分布，其中此类功能产物可以赋予所需的治疗作用。

囊封于本发明所述的一种或多种化合物、或者药物和脂质体组合物中的多核苷酸可以被传递至和/或转染靶细胞或组织。在一些实施方案中，囊封的多核苷酸能够被表达，并且功能多肽产物可能被靶细胞所生产(在一些情况下被分泌)，由此赋予例如靶细胞或组织以有利的性质。此类囊封的多核苷酸可以编码例如激素、酶、受体、多肽、肽或其他所关注的蛋白质。在某些实施方案中，此类囊封的多核苷酸还可以编码小干扰RNA(siRNA)或反义RNA，以便调控或以其他方式减少或消除内源核酸或基因的表达。在某些实施方案中，此类囊封的多核苷酸可以是天然的，或天然重组的，并且可以利用它们的正义或反义作用机制而赋予它们治疗活性(例如通过调控靶基因或核酸的表达)。

此外，本发明还考虑了将一种或多种独特的多核苷酸通过本发明所述的化合物、或药物和脂质体组合物共传递至靶细胞(例如通过将两者独特的治疗剂或多核苷酸结合到单一的脂质纳米颗粒中)。此外，还考虑了一种或多种囊封的多核苷酸向一种或多种靶细胞的传递，从而治疗单一的紊乱或缺陷，其中此类多核苷酸均通过不同的作用机制起作用。例如本发明的药物或脂质体组合物可以包括：第一多核苷酸，其例如被囊封于脂质纳米颗粒中，并将纠正内源蛋白质或酶的缺陷；以及第二多核苷酸，其将解除或“敲除”功能障碍的内源多核苷酸、及其蛋白质或酶的产物。此类囊封的多核苷酸可以编码例如mRNA或siRNA。

尽管体外转录的多核苷酸(例如mRNA)可以被转染到靶细胞中，但是此类多核苷酸可以容易且高效地被体内细胞降解，因此使此类多核苷酸无效。此外，一些多核苷酸在体液(具体为人类血清)中是不稳定的，并且甚至可以在到达靶细胞之前被降解或消化掉。此外，在细胞中，天然mRNA可以在30分钟至几天的半衰期内衰退。因此，在某些实施方案中，本发明所提供的囊封的多核苷酸，特别是本发明所提供的mRNA多核苷酸，优选地保留至少一些被表达或反义的能力，从而在一种或多种靶细胞内生产功能蛋白质或酶。

在某些实施方案中，药物和脂质体组合物包括本发明所公开的一种或多种脂质化合物，以及一种或多种脂质纳米颗粒，其包含或囊封一种或多种稳定的多核苷酸(例如在体内对核酸酶的消化或降解是稳定的mRNA)，而该多核苷酸调控了基因的表达或者可以被表达或翻译，从而在一种或多种靶细胞中生产功能多肽或蛋白质。在某些实施方案中，此类囊封的多核苷酸(例如编码功能蛋白质或酶的mRNA)的活性被持续延长的时间。例如多核苷酸的活性被延长，使得药物组合物可以半周或两周、或者更优选地一个月、两个月、一季度或一年的时间内给予受试对象。本发明的组合物、特别是囊封的mRNA的延长的或持续的活性与由此类mRNA翻译的功能蛋白质或酶的数量有直接的关系。类似地，本发明的组合物的活性可以通过化学改性而进一步被延长或持续，其中实施所述的化学改性，从而进一步改善或增强mRNA多核苷酸的翻译。例如Kozac共有序列其蛋白质翻译的开始中起作用，并且将此类Kozac共有序列包含在囊封的mRNA多核苷酸中可以进一步延长或持续mRNA多核苷酸的活性。此外，由靶细胞生产的功能蛋白质或酶的数量为被传递至白细胞的多核苷酸(例如mRNA)的数量和此类多核苷酸的稳定性的函数。被本发明的化合物或组合物囊封的多核苷酸的稳定性可以被改善或增强，就这一点而言，所翻译的蛋白质或酶的半衰期、活性以及组合物的定量给药频率可以被进一步延长。

在某些实施方案中，多核苷酸可以被化学改性，以例如赋予稳定性(例如相对于野生型或天然形成的mRNA和/或对靶细胞而言是天然内源的mRNA的稳定性)。因此，在一些实施方案中，本发明所提供的囊封的多核苷酸至少包括一种化学改性，其赋予多核苷酸以增加的或增强的稳定性，包括例如对体内核酸酶消化的改善的抗性。术语“稳定的”和“稳定性”如同该术语是指被本发明的化合物、或药物和脂质体组合物囊封的多核苷酸(具体为mRNA)对例如核酸酶(例如核酸内切酶或核酸外切酶)的降解具有抗性，其中所述的核酸酶通常能够降解此类RNA。增强的稳定性可以包括例如对内源酶(例如核酸内切酶或核酸外切酶)的水解或其他破坏、或者对靶细胞或组织内的条件的敏感性较低，由此增加或增强了此类多核苷酸在靶细胞、组织、受试对象和/或细胞质中的抗性。本发明所提供的稳定的多核苷酸分子证明了相对于它们天然形成的未经改性的相对物(例如野生型多核苷酸)的更长的半衰期。

在某些实施方案中，可以通过引入3′和/或5′非翻译(UTR)序列来改性多核苷酸，其中所述的非翻译序列并非是在野生型多核苷酸中发现的。此外，与本发明的化合物、或药物和脂质体组合物囊封的多核苷酸有关的术语“化学改性”和“化学改性的”如同该术语所考虑的那样，是指改善或增强mRNA多核苷酸的翻译的改变，包括例如将在蛋白质翻译的开始中起作用的序列(例如Kozac共有序列)包含在内(Kozak，M.，Nucleic AcidsRes 15(20)：8125-48(1987))。化学改性还包括引入化学组成的改性，所述的化学组成与在天然形成的多核苷酸中所见的那些不同，例如共价改性，如引入改性的核苷酸(例如核苷酸类似物或包含不能在此类多核苷酸分子中天然发现的侧基)。在一些实施方案中，多核苷酸发生了化学或生物学改性，使得它们在囊封于一种或多种脂质纳米颗粒中之前更稳定。在某些实施方案中，可以引入到多核苷酸中的示例性化学改性包括假尿苷、2-硫脲嘧啶，5-甲基胞苷、5-甲基胞核嘧啶、异胞核嘧啶、假异胞核嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤胞核嘧啶。对多核苷酸的示例性化学改性包括碱基的去除(例如去除一个核苷酸，或者一个核苷酸取代另一个核苷酸)或碱基的化学改性。

此外，合适的改性包括密码子的一个或多个核苷酸的改变，使得密码子编码相同的氨基酸，但是比在野生型多核苷酸中发现的密码子更稳定。例如已经证明RNA的稳定性与较高数量的胞苷(C′)和/或尿苷(U′)残基之间的反向关系，并且已经发现缺乏C和U残基的RNA对大部分的RNase更稳定(Heidenreich，et al.J Biol Chem 269，2131-8(1994))。在一些实施方案中，mRNA序列中的C和/或U残基的数量被减少。在另一个实施方案中，C和/或U残基的数量通过编码特定氨基酸的一个密码子取代编码相同或相关氨基酸的另一个密码子取代而减少。此外，所考虑的对被本发明的化合物、或药物和脂质体组合物所囊封的mRNA的改性还包括引入假尿苷。向被本发明的化合物、或药物和脂质体组合物所囊封的mRNA多核苷酸中引入假尿苷可以增强稳定性和翻译能力，以及降低体内的免疫源性(例如参见Karikó，K.，et al.，Molecular Therapy 16(11)：1833-1840(2008))。对本发明的化合物、或药物和脂质体组合物所囊封的多核苷酸进行取代和改性可以通过本领域的人员或普通技术人员容易了解的方法来实施。

与非翻译区相比，在mRNA的编码区内，减少序列中C和U残基的数量的限制可能更多(即，不可能消除信使中存在的所有C和U残基，同时保留信使编码所需氨基酸序列的能力)。但是，遗传密码的简并性提供了这样的机会：允许在待减少的序列中存在的一定数量的C和/或U残基，同时保持相同的编码能力(即，根据密码子编码的氨基酸的种类，用于RNA序列的改性的多种不同的可能是可行的)。例如用于Gly的密码子可以改变为GGA或GGG，而非GGU或GGC。

此外，术语化学改性还包括例如将非核苷酸键或改性的核苷酸引入到本发明的多核苷酸序列中(例如对编码功能蛋白质或酶的mRNA分子的3′和/或5′末端进行末端封闭改性)。此类改性可以包括将碱基加入到多核苷酸序列中(例如包含poly A尾或更长的poly A尾)，改变3′UTR或5′UTR，使多核苷酸与试剂(例如蛋白质或互补性多核苷酸分子)络合，以及包含改变多核苷酸分子的结构(例如其形成了二级结构)的原件。

认为poly A尾可以稳定天然信使和合成的正义RNA。因此，在某些实施方案中，可以将长的poly A尾加入到mRNA分子中，由此使RNA更稳定。可以使用本领域公认的多种技术来加入poly A。例如可以使用poly A聚合酶将长的poly A尾加入到合成的或体外转录的RNA中(Yokoe，et al.Nature Biotechnology.1996；14：1252-1256)。此外，转录载体还可以编码长的poly A尾。此外，可以通过由PCR产物直接转录来加入poly A尾。此外，还可以使用RNA连接酶将polyA与正义RNA的3′末端连接(例如参见Molecular Cloning A Laboratory Manual，2nd Ed.，ed.by Sambrook，Fritschand Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1991edition))。在某些实施方案中，poly A尾的长度为至少大约90，200，300，400或至少500核苷酸。在某些实施方案中，poly A尾的长度经过调解，从而控制本发明的经改性的正义mRNA分子的稳定性，并由此控制蛋白质转录的稳定性。例如由于poly A尾的长度可以影响正义mRNA分子的半衰期，所以poly A尾的长度可以经过调解，从而mRNA对核酸酶的抗性的水平，并由此控制多核苷酸在靶细胞中的表达和蛋白质生产的时间过程。在某些实施方案中，稳定的多核苷酸分子足以抵抗体内降解(例如核酸酶的降解)，这样它们可以在不具有脂质纳米颗粒的条件下被传递至靶细胞。

在一些实施方案中，囊封的多核苷酸(例如编码缺陷蛋白质的mRNA)可以可任选地包括化学或生物学改性，这些改性例如会改善此类多核苷酸的稳定性和/或半衰期，或者改善或以其他方式促进此类多核苷酸的翻译。

在某些实施方案中，化学改性为一种或多种多核苷酸的末端封闭改性，其中所述的多核苷酸包括本发明的药物组合物。例如此类多核苷酸可以通过引入3′和/或5′非翻译(UTR)序列来进行改性，其中所述的序列不能天然地在野生型多核苷酸中发现。在某些实施方案中，天然地位于mRNA的侧翼并编码第二非翻译蛋白质的3′和/或5′侧翼序列可以被引入到编码功能蛋白质的mRNA分子的核苷酸序列中，以便将其改性。例如由稳定的mRNA分子(例如球蛋白、肌动蛋白、GAPDH、微管蛋白、组蛋白或柠檬酸循环酶)得到的3′和/或5′序列可以被引入到正义mRNA多核苷酸分子的3′和/或5′区域中，从而增加正义mRNA分子的稳定性。

此外，本发明还考虑了对多核苷酸序列的改性，该改性是对多核苷酸的3′和/或5′末端进行的。例如本发明考虑了对多核苷酸(例如mRNA)的5′末端进行改性，从而包括CMV即早1(IE1)基因的部分序列或其片段，由此改善了核酸酶抗性和/或改善了多核苷酸的半衰期。除了增加mRNA多核苷酸序列的稳定性以外，已经惊奇地发现包含CMV即早1(IE1)基因的部分序列(例如包含到mRNA的5′非翻译区和/或3′非翻译区)会进一步增强mRNA的翻译。此外，还考虑了将编码人类生长激素(hGH)的序列或其片段包含到多核苷酸(例如mRNA)的5′非翻译区和/或3′非翻译区中，从而进一步稳定多核苷酸。通常，相对于未经改性的多核苷酸，所考虑的化学改性会改善多核苷酸的稳定性和/或药代动力学性质(例如半衰期)，并且包括例如这样的改性，进行此改性会改善此类多核苷酸对体内核酸酶消化的抗性。

在一些实施方案中，药物组合物、其在所包括的两种或多种脂质纳米颗粒或由此类脂质纳米颗粒囊封的多核苷酸可以包括稳定剂。所述的组合物可以包括一种或多种配制试剂，该试剂可以与多核苷酸直接或间接结合，并稳定该多核苷酸，从而增强在靶细胞的细胞质中的停留时间。此类试剂会优选地得到多核苷酸在靶细胞中的改善的半衰期。例如mRNA的稳定性和翻译效率可以通过引入“稳定剂”来增加，其中所述的稳定剂与在细胞中天然形成的多核苷酸(例如mRNA)形成络合物(例如参见美国专利No.5,677,124)。稳定剂的引入可以通过例如在体外使poly A和蛋白质与待稳定的mRNA结合、然后将该mRNA装载或囊封在包括药物组合物的一种或多种脂质纳米颗粒中来完成。示例性的稳定剂包括一种或多种蛋白质、肽、适体、翻译辅助蛋白、mRNA结合蛋白和/或翻译起始因子。

此外，本发明所述的药物和脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)的稳定还可以通过使用抑制调理素作用的部分来改善，其中所述的抑制调理素作用的部分通常为较大的亲水性聚合物，其以化学或物理结合的方式或者以其他方式被引入到脂质纳米颗粒(例如通过将脂质可溶性的锚加入到膜本身中，或者通过直接与膜脂质的活性基团结合)中。这些抑制调理素作用的亲水性聚合物形成了保护性表面层，其通过吞噬细胞-单核细胞系统和网状结构-内皮细胞系统显著地降低脂质体的吸收(例如在美国专利No.4,920,016中所述，该文献的全部公开内容以引用方式并入本文)。例如可以通过将亲水性聚合物的表面涂料加入到脂质纳米颗粒上或脂质纳米颗粒中来掩饰网状结构-内皮细胞系统对脂质体基脂质纳米颗粒的识别和吸收，来促进网状结构-内皮细胞系统对脂质纳米颗粒的吸收的延迟。例如在某些实施方案中，包括本发明所公开的药物组合物的一种或多种脂质纳米颗粒包括聚乙二醇(PEG)聚合物或PEG改性的脂质，从而进一步增强此类脂质纳米颗粒向靶细胞和组织的传递。

当RNA与互补性多核苷酸分子(例如DNA或RNA)杂交时，可以免于核酸酶而受到保护(Krieg，et al.Melton.Methods in Enzymology.1987；155，397-415)。杂交的mRNA的稳定性可能是由于大部分RNase的固有的单链特异性。在一些实施方案中，选择与多核苷酸络合的稳定剂为真核生物的蛋白质(例如哺乳动物的蛋白质)。在另一个实施方案中，用于正义疗法的多核苷酸(例如mRNA)可以通过与第二多核苷酸分子杂交而被改性。如果完整的mRNA分子与互补性多核苷酸分子杂交，则可以减少翻译起始。在一些实施方案中，mRNA分子的5′非翻译区和AUG起始区可以可任选地保留为未杂交的。在翻译起始后，核糖体络合物的解螺旋活性甚至可以在高亲和性的双链分子上发挥作用，这样可以是翻译得以进行(Liebhaber.J.Mol.Biol.1992；226：2-13；Monia，et al.J Biol Chem.1993；268：14514-22)。应该理解的是用于增强多核苷酸的稳定性的任何上文所述的方法都可以单独使用，或者与其他上文所述的任意一种或多种方法和/或组合物组合使用。

在某些实施方案中，本发明的药物组合物会增强脂质纳米颗粒囊封的多核苷酸向一种或多种靶细胞、组织或器官的传递。在一些实施方案中，向一种或多种靶细胞传递的增强包括增多将与靶细胞接触或以其他方式被传递至靶细胞的多核苷酸的量。在一些实施方案中，增强向靶细胞的传递包括减少将与非靶细胞接触的多核苷酸的量。在一些实施方案中，增强向靶细胞的传递包括使用囊封的多核苷酸传染至少一些靶细胞。在一些实施方案中，由脂质纳米颗粒(其包括题述药物组合物)囊封的多核苷酸的表达水平及由其所编码的功能蛋白质或酶的相应生产在靶细胞中增多。

被本发明的化合物、或药物和脂质体组合物囊封的多核苷酸可以可任选地与报告基因(例如多核苷酸编码区的上游或下游)结合，所述的报告基因例如会促进多核苷酸传递至靶细胞或组织中的测定。合适的报告基因可以包括例如Green Fluorescent Protein mRNA(GFP mRNA)、RenillaLuciferase mRNA(Luciferase mRNA)、Firefly Luciferase mRNA或它们的任意组合。例如GFP mRNA可以与编码GLA mRNA(SEQ ID NO：4)或EPO mRNA(SEQ ID NO：1)的多核苷酸融合，从而促进mRNA定位于血浆或者一种或多种靶细胞、组织或器官中的确认。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物包括一种或多种其他的分子(例如蛋白质、肽、适体或寡核苷酸)，其会促进多核苷酸(例如mRNA、miRNA、snRNA和snoRNA)由脂质纳米颗粒向靶细胞的细胞内分隔区中的转移。在一些实施方案中，其他的分子会促进多核苷酸向靶细胞的细胞溶胶、溶酶体、线粒体、细胞核、核仁或蛋白酶体中的传递。此外，还包括这样的试剂，该试剂会促进所关注的翻译蛋白质由细胞质向正常细胞内的位置(例如在线粒体中)的运送，从而治疗该细胞器中的缺陷。在一些实施方案中，所述的试剂选自蛋白质、肽、适体和寡核苷酸。

在一些实施方案中，本发明的组合物会促进受试对象以内源方式生产一种或多种功能蛋白质和/或酶，具体而言会促进以内源方式生产相对于重组制备的相对物而言，免疫源性降低的蛋白质和/或酶。在某本发明的些实施方案中，脂质纳米颗粒包括编码的缺陷蛋白质或酶的mRNA的多核苷酸。在此类组合物相靶组织分布及此类靶细胞随后的转染中，装载或囊封于脂质纳米颗粒(包括所述的组合物)中的外源mRNA可以在体内被翻译，从而生产由此类囊封的mRNA所编码的功能蛋白质或酶(例如其中受试对象缺陷的蛋白质或酶)。因此，在某些实施方案中，本发明的组合物利用了受试对象的能力：翻译外源或重组制备的mRNA，从而生产内源翻译的蛋白质或酶，并由此生产(以及其中适当分泌)功能蛋白质或酶。此外，翻译蛋白质或酶还可以通过体内包含天然翻译后的改性来表征，其中所述的改性在重组制备的蛋白质或酶中是缺乏的，因此可以进一步降低翻译蛋白质或酶的免疫源性。

mRNA在脂质纳米颗粒中的囊封以及给予包括此类脂质纳米颗粒的药物组合物避免了将mRNA传递至靶细胞内特定细胞器(例如线粒体)中的需要。而且，在转染靶细胞并将囊封的mRNA传递至靶细胞的细胞质中时，脂质纳米颗粒的mRNA内含物可以被翻译，功能蛋白质或酶可以被生产。

此外，本发明还考虑了通过被动和主动靶向手段来差异化地靶向一种或多种靶细胞和组织。被动靶向现象利用了脂质纳米颗粒在体内的天然分布模式，而不依赖于使用用于增强脂质纳米颗粒被一种或多种靶细胞识别的其他赋形剂或手段。例如经历网状结构-内皮细胞系统的细胞的吞噬作用的脂质纳米颗粒可能累积在肝脏或脾脏中，因此，可以提供被动定向传递组合物至此类靶细胞的手段。

备选地，本发明考虑了主动靶向，其涉及使用其他的赋形剂(在本文中被称为“靶向配体”)，这些赋形剂可以与脂质纳米颗粒结合(以共价或非共价的方式)，从而鼓励此类脂质纳米颗粒在某些靶细胞或靶组织处的定位。例如靶向可以通过以下方式介导：将一种或多种内源靶向配体(例如载脂蛋白E)包含在脂质纳米颗粒中或脂质纳米颗粒上，从而鼓励向靶细胞或组织中的分布。靶组织对靶向配体的识别会主动促进脂质纳米颗粒和/或它们的内含物的组织分布，以及靶细胞和组织对脂质纳米颗粒和/或它们的内含物的细胞吸收。例如在某些实施方案中，包括药物配制物的一种或多种脂质纳米颗粒可以包括处于此类脂质纳米颗粒中或在此类脂质纳米颗粒上的载脂蛋白E的靶向配体，从而促进或鼓励此类脂质纳米颗粒对例如肝细胞所表达的内源低密度脂蛋白受体的识别和结合。如本发明所提供，所述的组合物可以包括能够增强该组合物对一种或多种靶细胞的亲和性的配体。靶向配体在配制过程中或配制后与脂质纳米颗粒的外部双层连接。这些方法是本领域公知的。此外，一些脂质纳米颗粒可以包括融合聚合物(例如PEAA、血凝素、其他脂肽)和用于体内和/或细胞内传递的其他特征(参见美国专利申请系列No.08/835,281和60/083,294，这些申请以引用方式并入本文)。在其他的实施方案中，本发明的组合物证明了改善的转染效力，和/或证明了对所关注的靶细胞或组织的增强的选择性。因此，考虑了这样的组合物或脂质纳米颗粒，其包括一种或多种配体(例如肽、适体、寡核苷酸、维生素或其他分子)，这些配体能够增强组合物或它们构成的脂质纳米颗粒和它们的多核苷酸内含物对一种或多种靶细胞或组织的亲和性。合适的配体可以可任选地与脂质纳米颗粒的表面结合或连接。在一些实施方案中，靶向配体可以跨越脂质纳米颗粒的表面或者被囊封在脂质纳米颗粒中。可以根据配体的物理、化学或生物学性质(例如靶细胞表面标志物或特征的选择亲和性和/或识别)来选择合适的配体。细胞特异性靶位点及它们相应的靶向配体可以广泛改变。选择合适的靶向配体，这样利用靶细胞的独特特征，由此允许组合物区分靶细胞和非靶细胞。例如本发明的组合物可以带有表面标志物(例如载脂蛋白B或载脂蛋白E)，这些标志物选择性地增强对肝细胞的识别或亲和性(例如通过此类表面标志物的受体介导的识别及与此类表面标志物的结合)。此外，预计使用半乳糖作为靶向配体可以使本发明的组合物定向于实质肝细胞，或者被选地预计使用包括糖残基的甘露糖作为靶向配体可以使本发明的组合物定向于肝脏内皮细胞(例如包括糖残基的甘露糖可以优选地与肝细胞中存在的无唾液酸糖蛋白受体结合)(参见Hillery AM，et al.“Drug Deliveryand Targeting：For Pharmacists and Pharmaceutical Scientists”(2002)Taylor&Francis，Inc.)。已经与脂质纳米颗粒中存在的部分缀合的此类靶向配体的存在因此会促进本发明的脂质体组合物被一种或多种靶细胞和组织的识别和吸收。合适的靶向配体的实例包括一种或多种肽、蛋白质、适体、维生素和寡核苷酸。

如本文所用，术语“受试对象”是指可以给予本发明的化合物、药物或脂质体组合物、以及方法的任何动物(例如哺乳动物)，包括但不限于人类、非人类灵长动物、啮齿动物等。通常，就人类受试对象而言，术语“受试对象”和“患者”在本文中可交换使用。

本发明所述的化合物、药物或脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)调控或增强囊封的多核苷酸的表达以及多肽或蛋白质的生产的能力提供了实施体内生产用于治疗宿主的疾病或病理学状况的多肽和蛋白质的、新型且更有效的手段。此类脂质纳米颗粒组合物特别适用于治疗与编码蛋白质或酶的核酸异常表达有关的疾病或病理学状况。例如将诸如mRNA之类的多核苷酸成功传递至诸如肝脏之类的靶器官(特别是肝细胞)可以用于治疗或纠正局限于肝脏中的先天性代谢缺陷。因此，本发明所述的化合物、药物组合物和相关方法可以用于治疗多种疾病或病理学状况，特别是由于蛋白质或酶缺陷的那些疾病。被本发明所述的化合物、或者药物和脂质体组合物(例如HGT5001基脂质纳米颗粒)囊封多核苷酸可以编码功能产物(例如蛋白质、酶、多肽、肽、功能RNA和/或反义分子)，并且优选地编码需要在体内生产的产物。

本发明的化合物、药物组合物及相关方法可以广泛地用于传递治疗剂，例如多核苷酸，特别是mRNA，从而治疗多种紊乱。具体而言，本发明的此类化合物、组合物和相关方法适用于治疗与蛋白质和/或酶的缺陷有关的疾病或紊乱。在某些实施方案中，脂质纳米颗粒囊封的多核苷酸(例如编码激素和神经传递素的mRNA)编码了功能蛋白质或酶，其被一种或多种靶细胞外排或分泌至周围的细胞外液中。备选地，在另一个实施方案中，被本发明的化合物、或者药物和脂质体组合物囊封的多核苷酸(例如编码了与尿素循环或溶酶体储存代谢紊乱有关的酶的mRNA)编码了保持在一种或多种靶细胞的细胞溶胶中的功能蛋白质或酶。可以使用本发明的化合物、药物组合物和相关方法的其他紊乱包括但不限于以下的紊乱，例如：SMN1相关的脊髓性肌萎缩(SMA)；侧索硬化(ALS)；GALT相关的半乳糖血症；囊性纤维化(CF)；SLC3A1相关的紊乱，包括胱氨酸尿症；COL4A5相关的紊乱，包括Alport综合症；半乳糖脑苷脂酶缺乏症；X连锁的肾上腺脑白质营养不良和肾上腺脊髓神经病；Friedreich共济失调；Pelizaeus-Merzbacher病；TSC1和TSC2相关的结节性脑硬化；Sanfilippo B综合症(MPS IIIB)；CTNS相关的胱氨酸储积症；FMR1相关的紊乱，包括脆性X综合症、脆性X相关的震颤/共济失调综合症和脆性X卵巢早衰综合症；Prader-Willi综合症；Fabry疾病；遗传性出血性毛细血管扩张(AT)；Niemann-Pick疾病C1型；神经元蜡样脂褐质沉积症有关的疾病，包括少年神经元蜡样脂褐质沉积症(JNCL)、少年Batten疾病、Santavuori-Haltia疾病、Jansky-Bielschowsky疾病、以及PTT-1和TPP1缺陷；EIF2B1，EIF2B2，EIF2B3，EIF2B4和EIF2B5相关的儿童共济失调伴中枢神经系统髓鞘化不良/白质消失；CACNA1A和CACNB4相关的2型周期性共济失调；MECP2相关的紊乱，包括Classic Rett综合症；MECP2相关的重度新生儿脑病和PPM-X综合症；CDKL5相关的非典型Rett综合症；Kennedy疾病(SBMA)；Notch-3相关的显性遗传性脑血管病伴皮层下梗死和白质脑病(CADASIL)；SCN1A和SCN1B相关的发作性疾病；聚合酶G相关的紊乱，包括Alpers-Huttenlocher综合症、POLG相关的感觉性共济失调神经病变、构音障碍和、ophthalmoparesis和常染色体显性和隐性进行性眼外肌麻痹伴线粒体DNA缺失；X连锁的肾上腺发育不全；X连锁的无丙种球蛋白血症；和Wilson病。在某些实施方案中，本发明的多核苷酸，特别是mRNA，可以编码功能蛋白质或酶。例如本发明的组合物可以包括编码鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)、氨甲酰磷酸合成酶1(CPS1)、精氨酸琥珀酸合成酶(ASS1)、精氨酸代琥珀酸裂解酶(ASL)或精氨酸酶1(ARG1)、囊性纤维化跨膜转运调节因子(CFTR)、酸性α葡萄糖苷酶、芳基硫酸酯酶A、α-半乳糖苷酶A、红细胞生成素(例如SED ID NO：4)、α1-胰蛋白酶、羧肽酶N、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖酸酯-2-硫酸酯酶、艾杜糖酸酯硫酸酯酶、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶、N-乙酰氨基葡糖苷酶、α-氨基葡糖苷乙酰基转移酶、N-乙酰葡糖胺6-硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶、β-葡萄糖苷酶、半乳糖-6-硫酸硫酸酯酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、葡萄糖脑苷脂酶、硫酸乙酰肝素硫酸脂酶、肝素-N-硫酸酯酶、溶酶体酸脂酶、透明质酸酶、半乳糖脑苷脂酶、人类生长激素、存活运动神经元、因子VIII、因子IX和低密度脂蛋白受体的mRNA。

在一个实施方案中，mRNA编码选自以下的蛋白质或酶：人类生长激素、红细胞生成素、α1-胰蛋白酶、酸性α葡萄糖苷酶、芳基硫酸酯酶A、羧肽酶N、α-半乳糖苷酶A、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖酸酯-2-硫酸酯酶、艾杜糖酸酯硫酸酯酶、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶、N-乙酰氨基葡糖苷酶、α-氨基葡糖苷乙酰基转移酶、N-乙酰葡糖胺6-硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶、β-葡萄糖苷酶、半乳糖-6-硫酸硫酸酯酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、葡萄糖脑苷脂酶、硫酸乙酰肝素硫酸脂酶、肝素N-硫酸酯酶、溶酶体酸脂酶、透明质酸酶、半乳糖脑苷脂酶、鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)、氨甲酰磷酸合成酶1(CPS1)、精氨酸琥珀酸合成酶(ASS1)、精氨酸代琥珀酸裂解酶(ASL)、精氨酸酶1(ARG1)、囊性纤维化跨膜转运调节因子(CFTR)、存活运动神经元(SMN)、因子VIII、因子IX和低密度脂蛋白受体(LDLR)。

可以将本发明所述的化合物和药物组合物给予受试对象。在一些实施方案中，所述的组合物与一种或多种其他的多核苷酸、载体、靶向配体、稳定剂或其他合适的赋形剂组合配制。用于配制和给予药品的技术可以在“Remington’s Pharmaceutical Sciences，”Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，latest edition中找到。

本发明的化合物、以及药物和脂质体组合物(例如脂质纳米颗粒)可以根据当前的医疗实践给予和制定一剂的剂量，其中所述的医疗实践考虑了受试对象的临床状况、囊封物质的本性、给予的位点和方法、给予的时间安排、受试对象的年龄、性别、体重和与本领域普通技术人员的门诊医生有关的其他因素。用于本发明目的的“有效量”可以通过此类相关的考虑来确定，所述的相关考虑是试验性临床研究、药理学、临床和医药领域中那些普通技术人员已知的。在一些实施方案中，给予的量可以取得症状和其他指示剂的至少一些稳定、改善或消除，其中所述的症状和指示剂被本领域的那些技术人员选作疾病进程、衰退或改善的合适的量度。例如合适的量和定量给药方案为可以使一种或多种多核苷酸在靶细胞中至少短暂地表达的量和方案。

本发明所公开的化合物和药物组合物的合适的给予途径包括例如：口服、直肠、阴道、经粘膜或肠道给予；肠胃外传递，包括肌肉内、皮下、髓内注射；以及膜内、侧脑室、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内、眼内注射或输注。在某些实施方案中，将本发明所述的化合物或组合物(例如脂质纳米颗粒)给予受试对象会促进此类化合物或组合物与一种或多种靶细胞、组织或器官相接触。

备选地，本发明的化合物和组合物可以以局部方式而非系统的方式给予，例如通过将药物组合物优选地以储存式或缓释配制的方式直接注射或输注至靶组织中，从而进一步促进靶细胞与构成的脂质纳米颗粒的接触。可以根据待靶向的组织以多种方式提供局部传递。例如包括本发明的组合物的气溶胶可以被吸入(用于经鼻、气管或支气管传递)；例如本发明的组合物可以被注入到创伤、疾病显露或疼痛的位点；组合物可以以锭剂的形式提供用于口服、气管或食道用途；可以以液体、片剂或胶囊形式提供，以用于直肠或引导用途；或者甚至可以通过使用乳脂、滴剂或者甚至注射来传递至眼睛。包括本发明的化合物(其与治疗分子或配体络合)的配制物甚至可以与聚合物或者其他结构或物质(其可以允许组合物由植入位点扩散至周围的细胞中)通过外科手术联合给予。备选地，此类组合物可以在未使用聚合物或支持物的条件下通过外科手术给予。

此外，本发明还考虑了包括本发明所公开的一种或多种化合物的冻干的药物组合物，及使用该冻干的组合物的相关方法，例如在2011年6月8日提交的美国临时申请No.61/494,882(代理人案号No.SHIR-023-001)所公开的那样，该文献的教导以引用方式全文并入本文。

在某些实施方案中，配制本发明的组合物，使得它们适用于延迟释放例如其中囊封的多核苷酸或核酸。此类延迟释放的组合物可以以延迟的定量给药间隔方便地给予受试对象。例如在某些实施方案中，本发明的组合物每天2次、每天或每隔一天给予受试对象。在某些实施方案中，本发明的组合物每周2次、每周1次、每10天、每2周、每3周给予受试对象，或者更优选地每4周、每个月1次、每6周、每8周、每隔1个月、每3个月、每4个月、每6个月、每8个月、每9个月或每年1次给予受试对象。此外，还考虑了组合物和脂质纳米颗粒，其被配制用于储存式给予(例如肌肉内、皮下、玻璃体内)，从而经过延迟的时间传递或释放多核苷酸(例如mRNA)。优选地，所采用的延迟释放的手段与引入到多核苷酸中的改性(例如化学改性)结合，以增强稳定性。

尽管根据某些实施方案特异地描述了本发明的某些化合物、组合物和方法，但是以下实施例仅用于说明本发明的化合物，并无意于限定该化合物。用于描述本发明的背景及对其实施提供额外的详细描述的本发明所参考的公开、参考材料等均以引用方式全文并入本文。

除非清楚地作出相反的指示，如说明书和权利要求书中所用，不定冠词“a”和“an”应该被理解为包括复数的指示物。除非作出相反的指示或者以其他方式由内容中显而易见的，则如果1、多于1或者所有组中的成员存在于给定产物或过程中，在给定产物或过程中使用，或者以其他方式与给定产物或过程相关，认为在组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求书或说明书是令人满意的。本发明包括多个实施方案，其中组中的恰好1个成员存在于给定产物或过程中，在给定产物或过程中使用，或者以其他方式与给定产物或过程相关。此外，本发明还包括多个实施方案，其中多于1个或者组的全部成员均存在于给定产物或过程中，在给定产物或过程中使用，或者以其他方式与给定产物或过程相关。此外，应该理解的是本发明涵盖所有的变体、组合和排列，其中除非另外指示，或者除非出现的矛盾或不一致对于本领域的一名普通技术人员是显而易见的，否则根据相同的基础权利要求(或者相关的任何其他的权利要求)，由一个或多个所列的权利要求得到的一个或多个限定、元件、原因、描述术语等被引入到另一个权利要求中。在元件被列于列表中(例如在Markush组中或相似的形式中)的条件下，应该理解的是元件的每个亚组也都被公开，并且任何元件可以由组中除去。应该理解的是，一般情况下，在本发明或本发明的方面是指包括具体的原件、特征等的条件下，本发明的某些实施方案或本发明的方法由或者基本上由此类原件、特征等组成。为了简便，这些实施方案在各种情况下均未特异地明确列出。此外，还应该理解的是，不管说明书中是否叙述了具体的排除，本发明的任何实施方案或方面都可以明确地由权利要求书中排除。用于描述本发明的背景及对其实施提供额外的详细描述的本发明所参考的公开和其他参考材料均以引用方式并入本文。

实施例

实施例1

根据以下反应1所示的一般合成方案来制备化合物(15Z，18Z)-N，N-二甲基-6-(9Z，12Z)-十八碳-9，12-二烯-1-基)二十碳-15，18-二烯-1-胺(本文中称为“HGT5000”)。

反应1

按照如下所述制备上述反应1中被确认为化合物(2)的中间体化合物(15Z，18Z)-6-[(9Z，12Z)-十八碳-9，12-二烯-1-基]二十碳-15，18-二烯-1，6-二醇。向100mL圆底烧瓶中加入10g(30mmol)化合物(1)(亚油醇基溴化物)并在氮气下干燥THF(2mL)。在室温下，将镁粉(1.11g，45mmol)加入到搅拌的反应溶液中，然后加入2滴二溴乙烷。将反应混合物在50℃下搅拌1小时，然后使用干燥的THF(40mL)稀释。将反应混合物在室温下再搅拌15分钟。

在氮气下，将处于干燥的THF(20mL)中的ε-己内酯(1.44mL，13.5mmol)加入到单独的250mL 3颈烧瓶中。在0℃下，通过套管向搅拌后的溶液中加入Grignard试剂。所得的混合物在85℃下加热3个小时。在冷却至室温后，使用NH₄Cl溶液将反应混合物淬灭，并用二氯甲烷(3x100mL)提取。使用卤水(50mL)洗涤合并的提取物，干燥(Na₂SO₄)并浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱(由己烷至3：2己烷/EA梯度洗脱)纯化2次，得到化合物(2)的油。产率：5.46％。¹H NMR(301MHz，CDCl₃)δ：5.25-5.45(m，8H)，3.65(m，2H)，2.77(t，J＝6.2Hz，4H)，1.95-2.1(m，8H)，1.2-1.70(m，50H)，0.88(t，J＝6.9Hz，6H)。

按照如下所述制备上述反应1中被确认为化合物(3)的中间体化合物(15Z，18Z)-6-[(9Z，12Z)-十八碳-9，12-二烯-1-基]二十碳-15，18-二烯-1-醇。将化合物(2)(4.4g，7.15mmol)溶解于二氯甲烷(70mL)中。在0℃，在氮气下搅拌溶液，并加入Et₃SiH(8.07mL，50.08mmol)。在0℃下，滴加三氟化硼二乙醚(8.77mL，71.5mmol)。然后，将反应混合物在相同的温度下搅拌3小时，再在室温下搅拌30分钟。接着通过10％碳酸钠溶液(200mL)淬灭反应。使用二氯甲烷(2x150mL)2次提取所得的混合物。将合并的提取物用卤水洗涤，在硫酸钠上干燥，过滤并在减压下浓缩。将产物粗品通过硅胶柱色谱(由己烷至2∶1己烷/EA梯度洗脱)纯化2次，得到所需的中间体产物化合物(3)的油。产率：3.86％(90％)。¹H NMR(301MHz，CDCl₃)δ：5.2-5.5(m，8H)，3.62(q，J＝6.6Hz，2H)，2.77(t，J＝6Hz，4H)，1.9-2.1(m，8H)，1.5-1.65(m，2H)，1.1-1.45(m，48H)，0.88(t，J＝6.9Hz，6H)。

按照如下所述制备上述反应1中被确认为化合物(4)的中间体化合物(6Z，9Z，28Z，31Z)-19-(5-溴戊基)四十七-6，9，28，31-四烯。在0℃下，将化合物(3)(3.86g，6.45mmol)在二氯甲烷(80mL)中形成的溶液在氮气下搅拌。将三苯比磷(1.86g，7.10mmol)加入到溶液中，在加入四溴甲烷(2.14g，6.45mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌3小时，然后在室温下搅拌30分钟。TLC仍显示由起始物质的存在，因此在0℃下加入另一部分的三苯比磷(0.4g)。30分钟后，所有起始物质都被消耗掉，然后浓缩反应混合物。向残余物中加入乙醚与己烷(2∶1，200mL)的混合物，并将浆液搅拌15分钟。滤出固体，在减压下浓缩滤液。将残余物通过硅胶柱色谱(由己烷至3：2己烷/EA梯度洗脱)纯化，得到所需的中间体产物化合物(4)。产率：2.7g(63％)。¹H NMR(301MHz，CDCl₃)δ：5.2-5.5(m，8H)，3.40(t，J＝7Hz，2H)，2.77(t，J＝6Hz，4H)，1.8-2.1(m，8H)，1.15-1.5(m，46H)，0.88(t，J＝6.6Hz，6H)。

为了制备HGT5000化合物(15Z，18Z)-N，N-二甲基-6-(9Z，12Z)-十八碳-9，12-二烯-1-基)二十碳-15，18-二烯-1-胺)，将化合物(4)(2.70g，4.07mmol)溶解于二甲基胺在THF(204mL，100当量)中形成的2M溶液。在室温下，将所得的溶液在氮气下搅拌16小时。然后，在减压下浓缩反应混合物。将残余物通过硅胶柱色谱(由0％-10％甲烷在二氯甲烷中形成的梯度洗脱)纯化，得到HGT5000化合物的浅黄色油。产率：2.52g(96％)。¹H NMR(301MHz，CDCl₃)δ：5.42-5.29(m，8H)，2.77(t，J＝6.0Hz，4H)，2.28-2.24(m，8H)，2.01-2.08(m，8H)，1.66-1.63(m，2H)，1.41-1.20(m，48H)，0.88(t，J＝6.9Hz，6H).13C NMR(CDCl3)δ：130.3，128.0，59.9，45.3，37.5，33.8，31.6，30.3，29.8，29.7，29.4，28.0，27.5，27.3，26.8，26.7，25.7，22.7.APCI[M+H]626.6.Rf＝0.48(10％MeOH于DCM中)。

实施例2

根据以下反应2所示的一般合成方案来制备化合物(15Z，18Z)-N，N-二甲基-6-((9Z，12Z)-十八碳-9，12-二烯-1-基)二十碳-4，15，18-三烯-1-胺(本文中称为“HGT5001”)。

反应2

在烤箱干燥的3颈500mL烧瓶中制备在上述反应2中分别被确认为化合物(6)和(7)的中间体化合物(6Z，9Z，28Z，31Z)-四十七-6，9，28，31-四烯-19-基甲酸酯(6)和(6Z，9Z，28Z，31Z)-四十七-6，9，28，31-四烯-19-醇，其中所述的烧瓶在氩气下装有Mg(0.5g，20.83mmol，1.37当量)和I2(一种晶体)。将烧瓶在高度真空管线中脱气，然后使用氩气冲洗(该过程重复4次)，然后在室温下搅拌大约5分钟。将无水乙醚(22mL)加入到该烧瓶中，并将浆液搅拌大约10分钟。接着，在氩气下加入5g(15.2mmol，1当量)化合物(5)(溴化亚油醇)(在加入大约4.5mL化合物(5)后观察颜色变化)，并在室温下搅拌反应物。在室温下搅拌大约5分钟之后，观察到放热反应。因此，使用冰水浴将混合物冷却大约2分钟，然后除去冰浴，将反应混合物在室温下搅拌2小时，得到灰色的反应混合物，并且并非所有的Mg都被消耗。将混合物冷却至0℃，并将HCO₂Et(0.58mL，7.17mmol，0.47当量)直接滴加到溶液中。在室温下搅拌3小时后(通过MS和TLC的1小时后，观察产物)，倒出混合物，并用乙醚洗涤Mg屑。将合并的洗涤液用乙醚(100mL)稀释，用10％H₂SO₄(2x50mL)、水和卤水洗涤，然后干燥(Na₂SO₄)。将溶液过滤、浓缩，并将残余物通过硅胶柱色谱纯化。

处于己烷中的5-7％乙醚由残余物洗脱醇(化合物(7))。产率：0.34g(8％)。化合物7：¹HNMR(300MHz，CDCl₃)：δ5.38-5.31(m，8H)，3.58(brs，1H)，2.76(t，J＝6Hz，4H)，2.04(q，J＝6.8Hz，8H)，1.39-1.26(m，40H)，0.88(t，J＝6.8Hz，6H).APCI[M+H]527，511(-H₂O)。

处于己烷中的2％乙醚由残余物洗脱甲酸酯(化合物(6))。产率：1.7g(40％)。化合物6：¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ8.08(s，1H)，5.42-5.28(m，8H)，4.99-4.95(m，1H)，2.76(t，J＝6Hz，4H)，2.04(q，J＝6.6Hz，8H)，1.39-1.26(m，40H)，0.88(t，J＝6.6Hz，6H).APCI[M+H]557。为了由化合物(6)获得化合物(7)，将KOH(粉末，0.76g，13.5mmol，1.4当量)加入到化合物(6)(5.33g，9.59mmol，1当量)在EtOH/H2O(90mL/16mL)中形成的浑浊的溶液中。在N₂atm下，将反应混合物在室温下过夜搅拌。然后，浓缩该混合物，使用乙醚洗涤，用5％当量的HCl(2x100mL)和水洗涤，并干燥(Na₂SO₄)。将溶液洗涤，浓缩，然后在高度真空下干燥，得到化合物(7)的无色油。产率：4.9g(96％)。¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ5.38-5.31(m，8H)，3.58(br s，1H)，2.76(t，J＝6Hz，4H)，2.04(q，J＝6.8Hz，8H)，1.39-1.26(m，40H)，0.88(t，J＝6.8Hz，6H).APCI[M+H]527，511(-H₂O)。

按照如下所述制备上述反应2中被确认为化合物(8)的中间体化合物(6Z，9Z，28Z，31Z)-四十七-6，9，28，31-四烯-19-酮。向化合物(7)(4.81g，9.09mmol)在无水CH₂Cl₂(230mL)中形成的溶液中滴加Na₂CO₃(0.49g，4.54mmol)，然后经过15分钟的时间，滴加PCC(4.9g，22.7mmol，2.5当量)。将黑色混合物在室温下搅拌1.5小时。TLC显示反应完全。将反应混合物通过硅胶垫(200g)过滤，并使用CH₂Cl₂(3x400mL)洗涤硅胶垫。浓缩滤液，并在高度真空管线上干燥，得到酮化合物(8)的无色油。产率：4.5g(98％)。¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ5.36-5.33(m，8H)，2.76(t，J＝5.8Hz，4H)，2.37(t，J＝7.4Hz，4H)，2.04(q，J＝6Hz，8H)，1.32-1.27(m，36H)，0.88(t，J＝6.8Hz，6H).APCI[M+H]527。

按照如下所述制备上述反应2中被确认为化合物(9)的中间体化合物(6Z，9Z，28Z，31Z)-19-(甲氧基亚甲基)四十七-6，9，28，31-四烯。将化合物(8)(2.7g，5.12mmol，1当量)和(甲氧基甲基)三苯基膦氯化物(2.63g，7.67mmol，1.5当量)的混合物在高度真空下脱气，并使用氩气冲洗(4次)。加入无水THF(68mL)，然后通过注射器滴加处于THF中的1M KOt-Bu(7.67mL，7.67mmol，1.5当量)。将所得的红色溶液在室温下搅拌过夜。反应混合物用乙醚稀释，用水和卤水洗涤，并干燥(Na₂SO₄)。除去溶剂，残余物色谱(1-4％乙醚于己烷中)产生产物化合物(9)的无色油。产率：2.7g(95％)。¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ5.72(s，1H)，5.36-5.33(m，8H)，3.5(s，3H)，2.76(t，J＝6Hz，4H)，2.05-1.98(m，10H)，1.85-1.80(m，2H)，1.31-1.27(m，36H)，0.88(t，J＝6.6Hz，6H).APCI[M+H]555。

按照如下所述制备上述反应2中被确认为化合物(10)的中间体化合物(11Z，14Z)-2-((9Z，12Z)-十八碳-9，12-二烯-1-基)二十-11，14-二烯醛。在0℃下，经过10分钟的时间，向化合物(9)(1.3g，2.34mmol)在二恶烷/H₂O(56mL/29mL)中形成的浑浊的溶液中滴加处于二恶烷(29mL，116mmol，49当量)中的4M HCl。使混合物温暖至室温，然后在室温下搅拌40小时(通过TLC监测)。然后将混合物用乙醚稀释，冷却至0℃，然后使用水性NaHCO₃缓慢淬灭。分离有机层，用卤水洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤，浓缩并通过硅胶柱色谱纯化残余物。处于己烷中的1％乙醚洗脱产物化合物(10)的无色油。产率：1.21g(96％)。¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ9.53(d，J＝3.3Hz，1H)，5.36-5.33(m，8H)，2.76(t，J＝5.8Hz，4H)，2.23-2.18(m，1H)，2.05-1.96(m，8H)，1.61-1.16(m，40H)，0.88(t，J＝7Hz，6H).APCI[M+H]541。

根据以下反应3所示的一般合成方案来制备中间体化合物(4-二甲基氨基丁基)三苯基膦溴化物(化合物(14))。

反应3

通过将10g(46.3mmol)的1，4-二溴丁烷(化合物(11))和12.1gPPh₃(46.3mmol)放置于干燥的甲苯(74mL)中并将混合物加热至回流且沸腾过夜来制备上述反应3中所示的中间体化合物(4-溴丁基)三苯基膦溴化物(化合物(12))。将形成的固体过滤，用甲苯洗涤，并在真空下干燥，得到产物化合物(12)的白色固体。产率：16.4g(73％)。¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ7.84-7.68(m，15H)，4.03-3.93(m，2H)，3.58(t，J＝6Hz，2H)，2.36-2.28(m，2H)，1.89-1.76(m，2H).APCI[M+H]397(M-Br)，399(M+2-Br)。

接着，通过在N₂中，在0℃下将3g(6.28mmol，1当量)的化合物(12)滴加到2M二甲基胺在THF(31.4mL，62.8mmol，10当量)中形成的溶液中来制备中间体化合物(4-二甲基氨基丁基)三苯基膦溴化物(化合物(14))。使所得的悬浮物在室温下搅拌4小时。然后，将CH₃CN(35mL)加入到该悬浮物中，并将其在室温下进一步过夜搅拌。然后，将氮气鼓入反应混合物中，从而除去过量的二甲基胺和溶剂。将所得的固体在高度真空下干燥，并提供干燥的产物化合物(13)的浅黄色固体。产率：3.16g(96％)。将产物化合物(13)与饱和的水性NaHCO₃(110mL)搅拌15分钟，并冻干，从而产生浅黄色的固体。将该固体与氯仿一起搅拌并过滤。将滤液在MgSO₄上干燥，过滤，浓缩，并在45℃下将残余物在高度真空下干燥，从而产生产物化合物(14)的浅粉色固体。产率：2.7g(97％)。¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ7.89-7.75(m，9H)，7.71-7.65(m，6H)，3.93-3.83(m，2H)，2.47(t，J＝6.8Hz，2H)，2.25(s，6H)，1.94-1.87(m，2H)，1.75-1.62(m，2H).APCI[M+H]362(M-Br)。

接着，通过将带电荷的中间体化合物(14)(0.58g，1.32mmol，1.5当量)加入到火焰干燥的RB烧瓶(3颈，100mL)中、然后将该烧瓶装配有磁力搅拌棒来制备HGT5001((15Z，18Z)-N，N-二甲基-6-((9Z，12Z)-十八碳-9，12-二烯-1-基)二十碳-4，15，18-三烯-1-胺)。将该设置脱气(在高度真空下)，并使用氩气冲洗(3次)。然后使用注射器将无水THF(10mL)加入到烧瓶中。间所得的悬浮物在氩气下搅拌5分钟，然后冷却至-78℃。接着，将KHMDS(1M于THF中，1.32mL，1.32mmol，1.5当量)滴加到反应烧瓶中，并得到橘黄色的浑浊溶液。将该溶液在-78℃下搅拌45分钟。除去冷却浴，并将反应物在室温下搅拌15分钟，从而得到橘红色溶液。将混合物再次冷却至-78℃，并通过套管加入中间体化合物(10)(0.47g，0.88mmol)在干燥的THF(13mL)中形成的溶液。反应混合物的颜色变为浅黄色。将反应混合物在-78℃下搅拌45分钟，然后除去冷却浴，在室温下使搅拌再持续30分钟。将混合物再次冷却至-20℃，然后使用水(7mL)淬灭。将反应混合物用乙醚稀释，并搅拌10分钟。分离有机层，用卤水洗涤，在MgSO₄上干燥，过滤，浓缩并将残余物在硅胶柱上通过柱色谱纯化。处于氯仿中的1.5-2％甲醇洗脱HGT5001产物的浅黄色油。产率：0.43g(79％)。¹H NMR(300MHz，C₆D₆)：δ5.52-5.46(m，9H)，5.22-5.12(m，1H)，2.89(t，J＝5.8Hz，4H)，2.43(br s，1H)，2.24-2.03(m，18H)，1.55-1.37(m，2H)，1.35-1.22(m，40H)，0.88(t，J＝6.8Hz，6H).APCI[M+H]624。C44H81N的元素分析计算(理论，实测)：C(84.67，84.48)；H(13.08，13.12)；N(2.24，2.19)。

实施例3

通过标准的乙醇注射方法形成包括HGT5000、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2000的以及囊封有人类红细胞生成素(EPO)mRNA的脂质纳米颗粒(Ponsa，et al.，Int.J.Pharm.(1993)95：51-56)。提前制备浓度为50mg/ml的脂质的乙醇原液并储存在-20℃下。

通过由编码基因的质粒DNA模板的体外转录来合成人类红细胞生成素(EPO)mRNA，其中所述的模板加有5’帽子结构(Cap1)(Fechter，P.et al.，J.Gen.Virology(2005)86：1239-1249)和通过凝胶电泳测定的长度为大约200个核苷酸的3’poly(A)尾。EPO mRNA中存在的5’和3’非翻译区分别以SEQ ID NO：1中的X和Y表示，如以下所示。

人类红细胞生成素mRNA

SEQ ID NO：1

XAUGGGGGUGCACGAAUGUCCUGCCUGGCUGUGGCUUCUCCUGUCCCUGCUGUCGCUCCCUCUGGGCCUCCCAGUCCUGGGCGCCCCACCACGCCUCAUCUGUGACAGCCGAGUCCUGGAGAGGUACCUCUUGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAAUAUCACGACGGGCUGUGCUGAACACUGCAGCUUGAAUGAGAAUAUCACUGUCCCAGACACCAAAGUUAAUUUCUAUGCCUGGAAGAGGAUGGAGGUCGGGCAGCAGGCCGUAGAAGUCUGGCAGGGCCUGGCCCUGCUGUCGGAAGCUGUCCUGCGGGGCCAGGCCCUGUUGGUCAACUCUUCCCAGCCGUGGGAGCCCCUGCAGCUGCAUGUGGAUAAAGCCGUCAGUGGCCUUCGCAGCCUCACCACUCUGCUUCGGGCUCUGGGAGCCCAGAAGGAAGCCAUCUCCCCUCCAGAUGCGGCCUCAGCUGCUCCACUCCGAACAAUCACUGCUGACACUUUCCGCAAACUCUUCCGAGUCUACUCCAAUUUCCUCCGGGGAAAGCUGAAGCUGUACACAGGGGAGGCCUGCAGGACAGGGGACAGAUGAY

X＝GGGAUCCUACC(SEQ ID NO：2)

Y＝UUUGAAUU(SEQ ID NO：3)

在-80℃下，将EPO mRNA以最终浓度为1mg/mL储存在水中直至使用。通过Ribogreen检验(Invitrogen)测定所有mRNA的浓度。通过在0.1％Triton-X 100存在和不存在下实施Ribogreen检验来计算mRNA的囊封。使用Malvern Zetasizer仪器分别在1xPBS和1mM KCl溶液中测定粒径(动态光散射(DLS))和ζ电势。

将HGT5000、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K的50mg/mL乙醇溶液的等分液混合，并使用乙醇稀释至3mL的最终体积。另外，由1mg/mL原液制备EPO mRNA的水性缓冲溶液(10mM柠檬酸盐/150mM NaCl，pH4.5)。将脂质溶液快速注射到水性mRNA溶液中，并摇动，从而产生处于20％乙醇中的最终悬浮物。将所得的纳米颗粒悬浮物过滤，使用1xPBS(pH7.4)渗滤，浓缩并在2-8℃下储存。最终浓度＝1.82mg/mL EPO mRNA(囊封的)。Z_ave＝105.6nm(Dv₍₅₀₎＝53.7nm；Dv₍₉₀₎＝157nm)。

实施例4

通过标准的乙醇注射方法形成包括HGT5000、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2000的以及囊封有人类α-半乳糖苷酶(GLA)mRNA的脂质纳米颗粒(Ponsa，etal.，Int.J.Pharm.(1993)95：51-56)。提前制备浓度为50mg/ml的脂质的乙醇原液并储存在-20℃下。

通过由编码基因的质粒DNA模板的体外转录来合成人类GLAmRNA，其中所述的模板加有5’帽子结构(Cap1)(Fechter，P.et al.，J.Gen.Virology(2005)86：1239-1249)和通过凝胶电泳测定的长度为大约200个核苷酸的3’poly(A)尾。GLA mRNA中存在的5’和3’非翻译区分别以SEQID NO：4中的X和Y表示，如以下所示。

α-半乳糖苷酶(GLA)mRNA

SEQ ID NO：4

XAUGCAGCUGAGGAACCCAGAACUACAUCUGGGCUGCGCGCUUGCGCUUCGCUUCCUGGCCCUCGUUUCCUGGGACAUCCCUGGGGCUAGAGCACUGGACAAUGGAUUGGCAAGGACGCCUACCAUGGGCUGGCUGCACUGGGAGCGCUUCAUGUGCAACCUUGACUGCCAGGAAGAGCCAGAUUCCUGCAUCAGUGAGAAGCUCUUCAUGGAGAUGGCAGAGCUCAUGGUCUCAGAAGGCUGGAAGGAUGCAGGUUAUGAGUACCUCUGCAUUGAUGACUGUUGGAUGGCUCCCCAAAGAGAUUCAGAAGGCAGACUUCAGGCAGACCCUCAGCGCUUUCCUCAUGGGAUUCGCCAGCUAGCUAAUUAUGUUCACAGCAAAGGACUGAAGCUAGGGAUUUAUGCAGAUGUUGGAAAUAAAACCUGCGCAGGCUUCCCUGGGAGUUUUGGAUACUACGACAUUGAUGCCCAGACCUUUGCUGACUGGGGAGUAGAUCUGCUAAAAUUUGAUGGUUGUUACUGUGACAGUUUGGAAAAUUUGGCAGAUGGUUAUAAGCACAUGUCCUUGGCCCUGAAUAGGACUGGCAGAAGCAUUGUGUACUCCUGUGAGUGGCCUCUUUAUAUGUGGCCCUUUCAAAAGCCCAAUUAUACAGAAAUCCGACAGUACUGCAAUCACUGGCGAAAUUUUGCUGACAUUGAUGAUUCCUGGAAAAGUAUAAAGAGUAUCUUGGACUGGACAUCUUUUAACCAGGAGAGAAUUGUUGAUGUUGCUGGACCAGGGGGUUGGAAUGACCCAGAUAUGUUAGUGAUUGGCAACUUUGGCCUCAGCUGGAAUCAGCAAGUAACUCAGAUGGCCCUCUGGGCUAUCAUGGCUGCUCCUUUAUUCAUGUCUAAUGACCUCCGACACAUCAGCCCUCAAGCCAAAGCUCUCCUUCAGGAUAAGGACGUAAUUGCCAUCAAUCAGGACCCCUUGGGCAAGCAAGGGUACCAGCUUAGACAGGGAGACAACUUUGAAGUGUGGGAACGACCUCUCUCAGGCUUAGCCUGGGCUGUAGCUAUGAUAAACCGGCAGGAGAUUGGUGGACCUCGCUCUUAUACCAUCGCAGUUGCUUCCCUGGGUAAAGGAGUGGCCUGUAAUCCUGCCUGCUUCAUCACACAGCUCCUCCCUGUGAAAAGGAAGCUAGGGUUCUAUGAAUGGACUUCAAGGUUAAGAAGUCACAUAAAUCCCACAGGCACUGUUUUGCUUCAGCUAGAAAAUACAAUGCAGAUGUCAUUAAAAGACUUACUUUAAY

X＝GGGAUCCUACC(SEQ ID NO：2)

Y＝UUUGAAUU(SEQ ID NO：3)

在-80℃下，将GLAmRNA以最终浓度为1mg/mL储存在水中直至使用。通过Ribogreen检验(Invitrogen)测定所有mRNA的浓度。通过在0.1％Triton-X 100存在和不存在下实施Ribogreen检验来计算mRNA的囊封。使用Malvern Zetasizer仪器分别在1xPBS和1mM KCl溶液中测定粒径(动态光散射(DLS))和ζ电势。

将HGT5000、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K的50mg/mL乙醇溶液的等分液混合，并使用乙醇稀释至3mL的最终体积。另外，由1mg/mL原液制备GLA mRNA的水性缓冲溶液(10mM柠檬酸盐/150mM NaCl，pH4.5)。将脂质溶液快速注射到水性mRNA溶液中，并摇动，从而产生处于20％乙醇中的最终悬浮物。将所得的纳米颗粒悬浮物过滤，使用1xPBS(pH7.4)渗滤，浓缩并在2-8℃下储存。最终浓度＝1.38mg/mL GLA mRNA(囊封的)。Z_ave＝77.7nm(Dv₍₅₀₎＝62.3nm；Dv₍₉₀₎＝91.7nm)。

实施例5

通过标准的乙醇注射方法形成包括HGT5001、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2000的以及囊封有人类α-半乳糖苷酶(GLA)mRNA的脂质纳米颗粒(Ponsa，et al.，Int.J.Pharm.(1993)95：51-56)。提前制备浓度为50mg/ml的脂质的乙醇原液并储存在-20℃下。

通过由编码基因的质粒DNA模板的体外转录来合成人类α-半乳糖苷酶(GLA)mRNA，其中所述的模板加有5’帽子结构(Cap1)(Fechter，P.et al.，J.Gen.Virology(2005)86：1239-1249)和通过凝胶电泳测定的长度为大约200个核苷酸的3’poly(A)尾。人类α-半乳糖苷酶(GLA)mRNA中存在的5’和3’非翻译区分别以SEQ ID NO：4中的X和Y表示，如以下所示。

人类α-半乳糖苷酶(GLA)mRNA

SEQ ID NO：4

XAUGCAGCUGAGGAACCCAGAACUACAUCUGGGCUGCGCGCUUGCGCUUCGCUUCCUGGCCCUCGUUUCCUGGGACAUCCCUGGGGCUAGAGCACUGGACAAUGGAUUGGCAAGGACGCCUACCAUGGGCUGGCUGCACUGGGAGCGCUUCAUGUGCAACCUUGACUGCCAGGAAGAGCCAGAUUCCUGCAUCAGUGAGAAGCUCUUCAUGGAGAUGGCAGAGCUCAUGGUCUCAGAAGGCUGGAAGGAUGCAGGUUAUGAGUACCUCUGCAUUGAUGACUGUUGGAUGGCUCCCCAAAGAGAUUCAGAAGGCAGACUUCAGGCAGACCCUCAGCGCUUUCCUCAUGGGAUUCGCCAGCUAGCUAAUUAUGUUCACAGCAAAGGACUGAAGCUAGGGAUUUAUGCAGAUGUUGGAAAUAAAACCUGCGCAGGCUUCCCUGGGAGUUUUGGAUACUACGACAUUGAUGCCCAGACCUUUGCUGACUGGGGAGUAGAUCUGCUAAAAUUUGAUGGUUGUUACUGUGACAGUUUGGAAAAUUUGGCAGAUGGUUAUAAGCACAUGUCCUUGGCCCUGAAUAGGACUGGCAGAAGCAUUGUGUACUCCUGUGAGUGGCCUCUUUAUAUGUGGCCCUUUCAAAAGCCCAAUUAUACAGAAAUCCGACAGUACUGCAAUCACUGGCGAAAUUUUGCUGACAUUGAUGAUUCCUGGAAAAGUAUAAAGAGUAUCUUGGACUGGACAUCUUUUAACCAGGAGAGAAUUGUUGAUGUUGCUGGACCAGGGGGUUGGAAUGACCCAGAUAUGUUAGUGAUUGGCAACUUUGGCCUCAGCUGGAAUCAGCAAGUAACUCAGAUGGCCCUCUGGGCUAUCAUGGCUGCUCCUUUAUUCAUGUCUAAUGACCUCCGACACAUCAGCCCUCAAGCCAAAGCUCUCCUUCAGGAUAAGGACGUAAUUGCCAUCAAUCAGGACCCCUUGGGCAAGCAAGGGUACCAGCUUAGACAGGGAGACAACUUUGAAGUGUGGGAACGACCUCUCUCAGGCUUAGCCUGGGCUGUAGCUAUGAUAAACCGGCAGGAGAUUGGUGGACCUCGCUCUUAUACCAUCGCAGUUGCUUCCCUGGGUAAAGGAGUGGCCUGUAAUCCUGCCUGCUUCAUCACACAGCUCCUCCCUGUGAAAAGGAAGCUAGGGUUCUAUGAAUGGACUUCAAGGUUAAGAAGUCACAUAAAUCCCACAGGCACUGUUUUGCUUCAGCUAGAAAAUACAAUGCAGAUGUCAUUAAAAGACUUACUUUAAY(SEQ ID NO：2)

X＝GGGAUCCUACC(SEQ ID NO：2)

Y＝UUUGAAUU(SEQ ID NO：3)

将HGT5001、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K的50mg/mL乙醇溶液的等分液混合，并使用乙醇稀释至3mL的最终体积。另外，由1mg/mL原液制备GLA mRNA的水性缓冲溶液(10mM柠檬酸盐/150mM NaCl，pH4.5)。将脂质溶液快速注射到水性mRNA溶液中，并摇动，从而产生处于20％乙醇中的最终悬浮物。将所得的纳米颗粒悬浮物过滤，使用1xPBS(pH7.4)渗滤，浓缩并在2-8℃下储存。最终浓度＝0.68mg/mL GLAmRNA(囊封的)。Z_ave＝79.6nm(Dv₍₅₀₎＝57.26nm；Dv₍₉₀₎＝100nm)。

实施例6

通过标准的乙醇注射方法形成包括HGT5001、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2000的以及囊封有人类红细胞生成素(EPO)mRNA的脂质纳米颗粒(Ponsa，et al.，Int.J.Pharm.(1993)95：51-56)。提前制备浓度为50mg/ml的脂质的乙醇原液并储存在-20℃下。

通过由编码基因的质粒DNA模板的体外转录来合成人类红细胞生成素(EPO)mRNA，其中所述的模板加有5’帽子结构(Cap1)(Fechter，P.et al.，J.Gen.Virology(2005)86：1239-1249)和通过凝胶电泳测定的长度为大约200个核苷酸的3’poly(A)尾。人类红细胞生成素(EPO)mRNA中存在的5’和3’非翻译区分别以SEQ ID NO：1中的X和Y表示，如以下所示。

人类红细胞生成素mRNA

SEQ ID NO：1

X＝GGGAUCCUACC(SEQ ID NO：2)

Y＝UUUGAAUU(SEQ ID NO：3)

将HGT5001、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K的50mg/mL乙醇溶液的等分液混合，并使用乙醇稀释至3mL的最终体积。另外，由1mg/mL原液制备EPO mRNA的水性缓冲溶液(10mM柠檬酸盐/150mM NaCl，pH4.5)。将脂质溶液快速注射到水性mRNA溶液中，并摇动，从而产生处于20％乙醇中的最终悬浮物。将所得的纳米颗粒悬浮物过滤，使用1xPBS(pH7.4)渗滤，浓缩并在2-8℃下储存。最终浓度＝1.09mg/mL EPO mRNA(囊封的)。Z_ave＝62.1nm(Dv₍₅₀₎＝45.2nm；Dv₍₉₀₎＝74.6nm)。

实施例7

为了测定囊封有人类GLA mRNA的并根据上述实施例4制备的HGT5000基脂质纳米颗粒是否能够将囊封的多核苷酸构建体传递至一种或多种靶细胞，在野生型(CD-1)小鼠中实施剂量应答研究，随后监测该小鼠的人类GLA蛋白质生产。

在每个试验开始时，使用大约6-8周龄的CD-1雄鼠或雌鼠来实施之前的研究。在1周的时间内，通过单次尾静脉团注在第1天及第5天(再次)引入样品。在第二次静脉剂量给予后的6小时、24小时、48小时和72小时时测定GLA蛋白质的血清浓度。在第8天，在第二次静脉剂量给予后的72小时时处死小鼠，并对器官灌注盐水。收获各小鼠的肝脏、脾和脑(在需要使用时)，分成2份，储存在10％中性缓冲的福尔马林中或速冻起来，并储存在80℃下。

如图1所示，在2次静脉注射10μg，20μg，30μg，60μg或90μg剂量的GLA mRNA(装载于HGT5000基脂质纳米颗粒中)后，在6小时内，在小鼠的血清中可以检测到相当高水平的人类GLA蛋白质。此外，在静脉给予第二次单次剂量之后的48小时时，在血清中可以观察到可检测水平的GLA蛋白质。如图2所示，在第二次尾静脉团注给予GLA mRNA之后的72小时时，在小鼠的所选器官(例如肝脏、肾和脾)中，毫微克水平的人类GLA蛋白质也是可检测的。

此外，使用Fabry疾病的鼠模型实施其他的研究，来评价囊封有人类GLA mRNA的并根据实施例4制备的HGT5000基脂质纳米颗粒。通过尾静脉注射，单次团注90μg剂量|(基于囊封的GLA)装载有GLA的脂质纳米颗粒来引入样品。在给予单次90μg剂量GLA后的24小时时，在血清中检测到超生理水平的GLA蛋白质(大约50倍以上)。如图3和图4所示，在尾静脉团注给予HGT5000基脂质纳米颗粒后，在Fabry小鼠的血清和所选器官中，可以检测到人类GLA蛋白质。具体而言，在给予装载有GLA mRNA的HGT5000基脂质纳米颗粒后，经过72小时的时间在Fabry小鼠的血清中可以检测到人类GLA蛋白质。此外，在给予装载有GLAmRNA的HGT5000基脂质纳米颗粒后，在给予后的24小时和72小时时，在所选的Fabry小鼠器官中可以检测到人类GLA蛋白质水平。

实施例8

为了测定囊封有人类GLA mRNA的并根据上述实施例5制备的HGT5001基脂质纳米颗粒是否能够将囊封的多核苷酸构建体传递至一种或多种靶细胞，在野生型(CD-1)小鼠中实施剂量应答研究，随后监测该小鼠的人类GLA蛋白质生产。

在每个试验开始时，使用大约6-8周龄的CD-1雄鼠或雌鼠来实施之前的研究。通过单次尾静脉团注引入样品。在指定时间点处死小鼠，并对器官灌注盐水。收获各小鼠的肝脏、脾和脑(在需要使用时)，分成2份，储存在10％中性缓冲的福尔马林中或速冻起来，并储存在-80℃下。

将单次30μg剂量的装载有GLA mRNA的HGT5001基脂质纳米颗粒给予野生型小鼠，并且在给予后6小时时如图5所示，在血清中检测到浓度超过正常生理水平100倍的人类GLA蛋白质。此外，如图5所示，在将装载有GLAmRNA的HGT5001基脂质纳米颗粒给予野生型小鼠后的24小时时，浓度超过正常生理浓度30倍以上的人类GLA蛋白质保持是可检测的。此外，如图6所示，在给予装载有GLA mRNA的HGT5001基脂质纳米颗粒后的24小时时，在野生型小鼠的肝脏、肾和脾脏中可以检测到相当高浓度的人类GLA蛋白质。

实施例9

在野生型Sprague Dawley大鼠中进行短期的研究，以进一步证明HGT5000基和HGT5001基的脂质纳米颗粒将囊封的人类红细胞生成素(EPO)mRNA传递至一种或多种靶细胞的能力。根据上述实施例所列的方案来制备装载有EPO mRNA的HGT5000和HGT5001基的脂质纳米颗粒。通过单次尾静脉团注给予样品。经过24小时的时间，监测分泌至血流中的EPO蛋白质的浓度，并在给予后的6、12、18和24小时获得血清样品。

在给予装载有EPO mRNA的HGT5000基和HGT5001基脂质纳米颗粒后，经过24小时的时间，测定Sprague-Dawley大鼠血清中的人类EPO蛋白质。如图7所示，在野生型Sprague Dawley大鼠中，HGT5000基和HGT5001基的脂质纳米颗粒都得到有效的蛋白质的生产。在本研究的过程中，对于HGT5000基和HGT5001基的纳米颗粒系统而言，都检测到显著高水平的人类EPO蛋白质。因此，本实施例表明HGT5000基和HGT5001基的脂质纳米颗粒均提供了将多核苷酸构建体传递至一种或多种靶细胞的高度有效的手段，并且在此类靶细胞表达此类脂质纳米颗粒后，血清中可以检测到由囊封的mRNA编码的表达蛋白质。

讨论

之前的研究表明本发明所公开的脂质化合物可用于脂质体传递媒介物或脂质体传递媒介物的成分。具体而言，此类化合物和组合物会促进囊封的多核苷酸(例如编码功能蛋白质或酶的mRNA多核苷酸)向一种或多种靶细胞、组织和器官的传递，由此使此类细胞表达囊封的多核苷酸。例如在单次静脉注射给定剂量的、囊封于HGT5000基脂质纳米颗粒中的mRNA多核苷酸后，在受试小鼠的血清和一种或多种靶器官中都检测到相当高浓度的编码蛋白质。此外，如实施例显而易见的是，在许多情况下，表达的蛋白质的浓度恰好超过治疗功效所需的那些浓度，因此表明仅需要所述组合物的给予剂量的一部分来在血浆、靶器官、组织或细胞中取得治疗有效浓度。结果，可以降低传递治疗有效量的囊封试剂所需的阳离子脂质的总给予量，从而使组合物的毒性相应地降低。

Claims

1.一种具有以下结构的化合物：

其中R₁和R₂均独立地选自氢，可任选地取代的、可变的饱和或不饱和C₁-C₂₀烷基，和可任选地取代的、可变的饱和或不饱和C₆-C₂₀酰基；

其中L₁和L₂均独立地选自可任选地取代的C₁-C₃₀烷基，可任选地取代的、可变的不饱和C₁-C₃₀烯基，和可任选地取代的C₁-C₃₀炔基；

其中m和o均独立地选自0，和任意的正整数；以及

其中n为0或任意的正整数。

2.权利要求1所述的化合物，其中R₁和R₂均为甲基。

3.权利要求1所述的化合物，其中L₁和L₂均为可任选地取代的、多不饱和C₆-C₂₀烯基。

4.权利要求1所述的化合物，其中L₁和L₂均为可任选地取代的、多不饱和C₁₈烯基。

5.权利要求4所述的化合物，其中L₁和L₂均为未被取代的、多不饱和C₁₈烯基。

6.权利要求1所述的化合物，其中L₁和L₂均为可任选地取代的十八碳-9，12-二烯。

7.权利要求5所述的化合物，其中L₁和L₂均为可任选地取代的十八碳-9，12-二烯。

8.权利要求1所述的化合物，其中m为3。

9.权利要求1所述的化合物，其中n为1。

10.权利要求9所述的化合物，其中n为顺式异构体。

11.权利要求9所述的化合物，其中n为反式异构体。

12.权利要求1所述的化合物，其中o为0。

13.权利要求1所述的化合物，其中R₁和R₂均为甲基；其中L₁和L₂均为十八碳-9，12-二烯；其中m为3；其中n为1；以及其中o为0。

14.权利要求13所述的化合物，其中n为顺式异构体。

15.权利要求13所述的化合物，其中n为反式异构体。

16.一种包括权利要求1所述的化合物的药物组合物。

17.权利要求16所述的药物组合物，其进一步包括选自阳离子脂质、PEG改性的脂质、非阳离子脂质和辅助脂质中的一种或多种化合物。

18.权利要求16所述的药物组合物，其进一步包括一种或多种多核苷酸。

19.权利要求18所述的药物组合物，其中所述的一种或多种多核苷酸包括化学改性。

20.权利要求18所述的药物组合物，其中所述的一种或多种多核苷酸包括一种或多种锁核酸(LNA)。

21.权利要求18所述的药物组合物，其中所述的一种或多种多核苷酸选自DNA、RNA、反义寡核苷酸、siRNA、miRNA、snRNA、snoRNA、mRNA及它们的组合。

22.权利要求18所述的药物组合物，其中所述的一种或多种多核苷酸包括mRNA。

23.权利要求22所述的药物组合物，其中所述的mRNA编码了酶或蛋白质。

24.权利要求23所述的药物组合物，其中所述的mRNA编码了蛋白质或酶，该蛋白质或酶选自：人类生长激素，红细胞生成素、α1-胰蛋白酶、酸性α葡萄糖苷酶、芳基硫酸酯酶A、羧肽酶N、α-半乳糖苷酶A、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖酸酯-2-硫酸酯酶、艾杜糖酸酯硫酸酯酶、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶、N-乙酰氨基葡糖苷酶、α-氨基葡糖苷乙酰基转移酶、N-乙酰葡糖胺6-硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶、β-葡萄糖苷酶、半乳糖-6-硫酸硫酸酯酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、葡萄糖脑苷脂酶、硫酸乙酰肝素硫酸脂酶、肝素-N-硫酸酯酶、溶酶体酸脂酶、透明质酸酶、半乳糖脑苷脂酶、鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)、氨甲酰磷酸合成酶1(CPS1)、精氨酸琥珀酸合成酶(ASS1)、精氨酸代琥珀酸裂解酶(ASL)、精氨酸酶1(ARG1)、囊性纤维化跨膜转运调节因子(CFTR)、存活运动神经元(SMN)、因子VIII、因子IX和低密度脂蛋白受体(LDLR)。

25.一种具有以下结构的化合物：

26.一种具有以下结构的化合物：

27.一种具有以下结构的化合物：

28.一种包括权利要求25或26所述的化合物的药物组合物。

29.权利要求28所述的药物组合物，其中所述的组合物为脂质纳米颗粒。

30.权利要求29所述的药物组合物，其中所述的脂质纳米颗粒在给予受试对象时基本上是无毒的。

31.权利要求30所述的药物组合物，其进一步包括选自阳离子脂质、PEG改性的脂质、非阳离子脂质和辅助脂质中的一种或多种化合物。

32.权利要求30所述的药物组合物，其进一步包括C14-DMG-PEG2000、DOPE和胆固醇。

33.权利要求30所述的药物组合物，其进一步包括一种或多种治疗剂。

34.权利要求33所述的药物组合物，其中所述的治疗剂为多核苷酸。

35.一种具有以下结构的化合物：

其中R₁和R₂均独立地选自可任选地取代的、可变的饱和或不饱和C₁-C₂₀烷基，和可任选地取代的、可变的饱和或不饱和C₆-C₂₀酰基；

其中L₁和L₂均独立地选自可任选地取代的C₁-C₃₀烷基，可任选地取代的、可变的不饱和C₁-C₃₀烯基，和可任选地取代的C₁-C₃₀炔基；以及

其中m、n和o均独立地选自0和任意的正整数。

36.权利要求35所述的化合物，其中R₁和R₂均为甲基。

37.权利要求35所述的化合物，其中L₁和L₂均为可任选地取代的、多不饱和C₆-C₂₀烯基。

38.权利要求35所述的化合物，其中L₁和L₂均为可任选地取代的、多不饱和C₁₈烯基。

39.权利要求38所述的化合物，其中L₁和L₂均为未被取代的、多不饱和C₁₈烯基。

40.权利要求39所述的化合物，其中L₁和L₂均为可任选地取代的十八碳-9，12-二烯。

41.权利要求39所述的化合物，其中L₁和L₂均为十八碳-9，12-二烯。

42.权利要求35所述的化合物，其中m为4。

43.权利要求35所述的化合物，其中n为0。

44.权利要求35所述的化合物，其中o为0。

45.权利要求35所述的化合物，其中R₁和R₂均为甲基；其中L₁和L₂均为十八碳-9，12-二烯；其中m为4；其中n和o为0。

46.一种包括权利要求35所述的化合物的药物组合物。

47.权利要求46所述的药物组合物，其进一步包括选自阳离子脂质、PEG改性的脂质、非阳离子脂质和辅助脂质中的一种或多种化合物。

48.权利要求46所述的药物组合物，其进一步包括一种或多种多核苷酸。

49.权利要求48所述的药物组合物，其中所述的一种或多种多核苷酸包括化学改性。

50.权利要求48所述的药物组合物，其中所述的一种或多种多核苷酸包括一种或多种锁核酸(LNA)。

51.权利要求48所述的药物组合物，其中所述的一种或多种多核苷酸选自DNA、RNA、反义寡核苷酸、siRNA、miRNA、snRNA、snoRNA、mRNA及它们的组合。

52.权利要求48所述的药物组合物，其中所述的一种或多种多核苷酸包括mRNA。

53.权利要求52所述的药物组合物，其中所述的mRNA编码了酶或蛋白质。

54.权利要求53所述的药物组合物，其中所述的mRNA编码了蛋白质或酶，该蛋白质或酶选自：人类生长激素，红细胞生成素、α1-胰蛋白酶、酸性α葡萄糖苷酶、芳基硫酸酯酶A、羧肽酶N、α-半乳糖苷酶A、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖酸酯-2-硫酸酯酶、艾杜糖酸酯硫酸酯酶、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶、N-乙酰氨基葡糖苷酶、α-氨基葡糖苷乙酰基转移酶、N-乙酰葡糖胺6-硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶、β-葡萄糖苷酶、半乳糖-6-硫酸硫酸酯酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、葡萄糖脑苷脂酶、硫酸乙酰肝素硫酸脂酶、肝素-N-硫酸酯酶、溶酶体酸脂酶、透明质酸酶、半乳糖脑苷脂酶、鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)、氨甲酰磷酸合成酶1(CPS1)、精氨酸琥珀酸合成酶(ASS1)、精氨酸代琥珀酸裂解酶(ASL)、精氨酸酶1(ARG1)、囊性纤维化跨膜转运调节因子(CFTR)、存活运动神经元(SMN)、因子VIII、因子IX和低密度脂蛋白受体(LDLR)。

55.一种具有以下结构的化合物：

56.一种包括权利要求55所述的化合物的药物组合物。

57.权利要求56所述的药物组合物，其中所述的组合物为脂质纳米颗粒。

58.权利要求57所述的药物组合物，其中所所述的脂质纳米颗粒在给予受试对象时基本上是无毒的。

59.权利要求57所述的药物组合物，其进一步包括选自阳离子脂质、PEG改性的脂质、非阳离子脂质和辅助脂质中的一种或多种化合物。

60.权利要求57所述的药物组合物，其进一步包括C14-DMG-PEG2000、DOPE和胆固醇。

61.权利要求57所述的药物组合物，其进一步包括一种或多种治疗剂。

62.权利要求61所述的药物组合物，其中所述的治疗剂为多核苷酸。

63.一种具有以下结构的化合物：

其中x选自C₅-C₂₀烷基，和可变的不饱和C₁-C₂₀烯基。

64.权利要求63所述的化合物，其中R₁和R₂均为甲基。

65.权利要求63所述的化合物，其中L₁和L₂均为未被取代的、多不饱和C₁₈烯基。

66.权利要求63所述的化合物，其中L₁和L₂均为可任选地取代的十八碳-9，12-二烯。

67.权利要求66所述的化合物，其中L₁和L₂均为十八碳-9，12-二烯。

68.权利要求63所述的化合物，其中x为C₆烯基。

69.权利要求63所述的化合物，其中x为己烷。

70.权利要求63所述的化合物，其中x为己-1-烯。

71.权利要求63所述的化合物，其中x为己-2-烯。

72.权利要求63所述的化合物，其中x并非为己烷。

73.权利要求63所述的化合物，其中R₁和R₂均为甲基；其中L₁和L₂均为十八碳-9，12-二烯；并且其中x为己烷。

74.权利要求63所述的化合物，其中R₁和R₂均为甲基；其中L₁和L₂均为十八碳-9，12-二烯；并且其中x为己-1-烯。

75.权利要求63所述的化合物，其中R₁和R₂均为甲基；其中L₁和L₂均为十八碳-9，12-二烯；并且其中x为己-2-烯。

76.一种包括权利要求63所述的化合物的药物组合物。

77.权利要求63所述的药物组合物，其进一步包括选自阳离子脂质、PEG改性的脂质、非阳离子脂质和辅助脂质中的一种或多种化合物。

78.权利要求76所述的药物组合物，其中所述的组合物为脂质纳米颗粒。

79.权利要求78所述的药物组合物，其进一步包括一种或多种多核苷酸。

80.权利要求79所述的药物组合物，其中所述的一种或多种多核苷酸包括化学改性。

81.权利要求79所述的药物组合物，其中所述的一种或多种多核苷酸包括一种或多种锁核酸(LNA)。

82.权利要求79所述的药物组合物，其中所述的一种或多种多核苷酸选自DNA、RNA、反义寡核苷酸、siRNA、miRNA、snRNA、snoRNA、mRNA及它们的组合。

83.权利要求79所述的药物组合物，其中所述的一种或多种多核苷酸包括mRNA。

84.权利要求83所述的药物组合物，其中所述的mRNA编码了酶和蛋白质。

85.权利要求83所述的药物组合物，其中所述的mRNA编码了蛋白质和酶，该蛋白质或酶选自：人类生长激素，红细胞生成素、α1-胰蛋白酶、酸性α葡萄糖苷酶、芳基硫酸酯酶A、羧肽酶N、α-半乳糖苷酶A、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖酸酯-2-硫酸酯酶、艾杜糖酸酯硫酸酯酶、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶、N-乙酰氨基葡糖苷酶、α-氨基葡糖苷乙酰基转移酶、N-乙酰葡糖胺6-硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶、β-葡萄糖苷酶、半乳糖-6-硫酸硫酸酯酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、葡萄糖脑苷脂酶、硫酸乙酰肝素硫酸脂酶、肝素-N-硫酸酯酶、溶酶体酸脂酶、透明质酸酶、半乳糖脑苷脂酶、鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)、氨甲酰磷酸合成酶1(CPS1)、精氨酸琥珀酸合成酶(ASS1)、精氨酸代琥珀酸裂解酶(ASL)、精氨酸酶1(ARG1)、囊性纤维化跨膜转运调节因子(CFTR)、存活运动神经元(SMN)、因子VIII、因子IX和低密度脂蛋白受体(LDLR)。

86.一种具有以下结构的化合物：

其中x为C₁-C₁₀烯基。

87.一种治疗受试对象的疾病的方法，其中所述的方法包括向所述的受试对象给予有效量的权利要求33、61或79所述的药物组合物。

88.权利要求86所述的方法，其中所述的药物组合物在给予所述的受试对象时基本上是无毒的。

89.一种使用多核苷酸转染一种或多种靶细胞的方法，其中所述的方法包括使所述的一种或多种靶细胞与权利要求33、61或79所述的药物组合物相接触，使得所述的一种或多种靶细胞被所述的多核苷酸转染。