CN104328162B - 一种副干酪乳杆菌直投式菌种中霉菌和酵母的定性检测方法 - Google Patents
一种副干酪乳杆菌直投式菌种中霉菌和酵母的定性检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种副干酪乳杆菌直投式菌种中霉菌和酵母的定性检测方法，属于微生物检验技术领域。该检测方法包括下述顺序的检验步骤：（1）制备样品：制得1:20的样品匀液；（2）制备培养基；（3）第一次抽滤，将过滤好的滤膜贴在已制备好的孟加拉红琼脂平板上；（4）第二次抽滤，将第一次抽滤后的滤膜放入20‑40g无菌生理盐水中稀释后，进行第二次抽滤，过滤好的滤膜贴在已制备好的孟加拉红琼脂平板上；（5）第三次抽滤；（6）结果观察：最后将上述平板置于28±1℃培养5天，观察滤膜上菌落的生长情况。本发明主要解决直接用国标法检测会受稀释倍数、抑制作用等因素的干扰而使检测结果有很大误差的问题。
Description
技术领域
本发明属于微生物检验技术领域，具体涉及一种副干酪乳杆菌直投式菌种中霉菌和酵母的检测方法。
背景技术
直投式酸奶发酵剂（Directed Vat Set,DVS）是指一系列高度浓缩和标准化的冷冻干燥发酵剂菌种，可直接加入到热处理的原料乳中进行发酵，而无需对其进行活化、扩培等其它预处理工作。直投式发酵剂的活菌数一般为1010-1012CFU/g，由于直投式发酵剂的活力强、类型多，生产厂家可以根据需要任意选择，从而丰富了乳酸菌产品的品种。直投发酵剂不需要扩大培养，可直接使用，产品质量相对稳定，成为目前大型乳品企业的首选。乳酸菌直投式菌种基本是国外进口，有一百多年的生产历史，质量相对稳定，由于直投式菌种价格相对较贵，打开后如不及时使用，会导致活力下降并且容易污染，故对乳酸菌直投式菌种进厂检验相对较少，偶尔抽检一下活菌数，霉菌酵母含量直接用国标法检测，没有对直投式菌种进行预处理，由于乳酸菌对霉菌酵母的抑制作用，检测结果不准确。在实际生产中，偶尔有部分批次产品生产过程中产酸弱，同时伴随保质期过程有鼓盖现象，无法查找到产品出质量问题的原因。目前国内对直投式菌种的研究论文有90多篇，基本围绕乳酸菌遗传稳定性、传代培养、菌株选育、分离鉴定、生化特性等，而对直投式菌种纯度的检验方法没有相应报道。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种简单实用的副干酪乳杆菌直投式菌种中霉菌和酵母的定性检测方法，主要解决直接用国标法检测会受稀释倍数、抑制作用等因素的干扰而使检测结果有很大误差的问题。
为实现上述发明目的，本发明是通过下述技术方案来实现的：
与现有技术相比，本发明的具有的有益效果有：
1、本发明根据乳酸菌与霉菌酵母不同的形态大小，通过抽滤的微过滤形式，避免了乳酸菌抑制霉菌酵母生长的干扰因素，使检测结果更加准确。酵母细胞的大小是（1-5）um×(5-30)um、霉菌孢子的大小是（2-10）um，副干酪乳杆菌直投式菌种由于采用冷冻真空干燥，工艺菌株宽度一般小于1um。根据不同菌株分子大小不同的特性，通过1um微膜抽滤，将副干酪乳杆菌和霉菌酵母分离开，即霉菌和酵母留在滤膜上，副干酪乳杆菌分离在滤液中。
2、本发明通过定性检验，首次将直投式菌种中是否有霉菌和酵母检测出来，避免了副干酪乳杆菌对检测过程的干扰。
3、本发明的实施将有效的控制国外进口直投式菌种的产品质量，保证乳酸菌发酵产品在生产过程中的稳定性，同时避免了产品保质期发生的鼓盖质量问题。
附图说明
图1为实施例1中第一次抽滤后滤膜上菌落的培养结果；
图2为实施例1中第二次抽滤后滤膜上菌落的培养结果；
图3为实施例1中第三次抽滤后滤膜上菌落的培养结果；
图4为试验例A中滤膜上菌落的培养结果。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的说明，但不限于该实施例。
实施例1
一种副干酪乳杆菌直投式菌种中霉菌和酵母的定性检测方法，包括下述顺序的工艺步骤：
（1）制备样品：在100级的洁净工作台进行过滤操作，称取5g副干酪乳杆菌直投式菌种至盛有95g灭菌生理盐水的锥形瓶中，用拍击式震荡器震荡2min，在无菌环境中静置30min，制得质量比为1:20的样品匀液；
（2）制备培养基：加热溶解商用孟加拉红培养基，高压蒸汽121℃灭菌15min，灭菌后，待培养基冷却至45-50℃时，倾注到灭菌平板上，培养基厚度为5mm，凝固待用；
（3）第一次抽滤：首先用无菌镊子夹起灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，取10g步骤(1)制得的样品匀液通过孔径1um的滤膜过滤，然后将过滤好的滤膜贴在已制备好的孟加拉红琼脂平板上，平铺并避免在滤膜和培养基之间夹留着气泡；
（4）第二次抽滤：取10g步骤 (1)制得的样品匀液通过孔径1um的滤膜过滤，然后将过滤好的滤膜放入20g无菌生理盐水中,用拍击式震荡器震荡2min，制得二次稀释液，取10g二次稀释液通过孔径1um的滤膜过滤，然后将过滤好的滤膜贴在已制备好的孟加拉红琼脂平板上，平铺并避免在滤膜和培养基之间夹留着气泡；
（5）第三次抽滤：取10g步骤（4）制得的二次稀释液，通过孔径1um的滤膜过滤，将过滤好的滤膜放入20g无菌生理盐水中，用拍击式震荡器震荡2min，制得三次稀释液，取10g三次稀释液通过孔径1um的滤膜过滤，然后将过滤好的滤膜贴在已制备好的孟加拉红琼脂平板上，平铺并避免在滤膜和培养基之间夹留着气泡；
（6）结果观察：将上述平板置于28±1℃培养5天，观察滤膜上菌落的生长情况，看有无霉菌和酵母典型菌落。
该实施例滤膜上菌落的培养结果如下：
第一次抽滤后滤膜上菌落的培养结果见图1。从图1可见滤膜一片白色，霉菌酵母没有检测出来。这是因为第一次抽滤后滤膜上副干酪乳杆菌数量较多，抑制了霉菌、酵母的生长。
第二次抽滤后滤膜上菌落的培养结果见图2。从图2可见滤膜出现淡粉色，有少量酵母菌。这是因为第二次抽滤后滤膜上副干酪乳杆菌数量相对减少，对霉菌、酵母生长的抑制作用相对减弱。
第三次抽滤后滤膜上菌落的培养结果见图3。从图3可见滤膜出现粉色，可确定此副干酪乳杆菌直投式菌种样品中有霉菌酵母存在。这是因为第三次抽滤后滤膜上副干酪乳杆菌数量相对较少，对霉菌、酵母生长基本没有抑制作用。
总之，一次抽滤后由于乳酸菌抽滤下去的少，滤膜上乳酸菌还较多，阻碍酵母和霉菌的生长，二次抽滤后滤膜上酵母和霉菌的生长情况受乳酸菌抑制作用弱，滤膜微红，三次抽滤后留在滤膜上的乳酸菌数量基本很少了，故滤膜上有霉菌酵母的典型菌落，证明乳酸菌直投式菌种样品中有霉菌和酵母存在。
试验例A
（1）取一定量的副干酪乳杆菌直投式菌种，加入无菌MRS培养基中，在37±1℃温度条件下培养24小时；
（2）用无菌镊子夹起灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，取10g上述(1)中MRS样品，通过孔径1um的滤膜过滤，然后将过滤好的滤膜贴在已制备好的孟加拉红琼脂平板上，平铺并避免在滤膜和培养基之间夹留着气泡；
（3）将平板置于28±1℃培养5天，并防止干燥；
培养5天后，滤膜上菌落的生长情况见图4。从图4可以看出，副干酪乳杆菌直投式菌种通过扩培后，霉菌、酵母检测现象较为明显，能确定副干酪乳杆菌直投式菌种中有霉菌、酵母存在。
Claims (1)
1.一种副干酪乳杆菌直投式菌种中霉菌和酵母的定性检测方法，其特征在于：包括下述顺序的检测步骤：
（1）制备样品：称取5g副干酪乳杆菌直投式菌种至盛有95g灭菌生理盐水的锥形瓶中，震荡2min后静置30min，制得1:20的样品匀液；
（2）制备培养基：加热溶解商用孟加拉红培养基，高压蒸汽121℃灭菌15min，灭菌后，待培养基冷却至45-50℃时，倾注到灭菌平板上，培养基厚度在5mm以上，凝固待用；
（3）第一次抽滤：固定好滤器，取10g步骤 (1)制得的样品匀液通过孔径1μm的滤膜过滤，然后将过滤好的滤膜贴在已制备好的孟加拉红琼脂平板上；
（4）第二次抽滤：取10g步骤 (1)制得的样品匀液通过孔径1μm的滤膜过滤，然后将过滤好的滤膜放入20-40g无菌生理盐水中,用拍击式震荡器震荡2min，制得二次稀释液，取10g二次稀释液通过孔径1μm的滤膜过滤，然后将过滤好的滤膜贴在已制备好的孟加拉红琼脂平板上；
（5）第三次抽滤：取10g步骤（4）制得的二次稀释液，通过孔径1μm的滤膜过滤，将过滤好的滤膜放入20-40g无菌生理盐水中，用拍击式震荡器震荡2min，制得三次稀释液，取10g三次稀释液通过孔径1μm的滤膜过滤，然后将过滤好的滤膜贴在已制备好的孟加拉红琼脂平板上；
（6）结果观察：将上述平板置于28±1℃培养5天，观察滤膜上菌落的生长情况，看有无霉菌和酵母典型菌落。
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