CN104313011A - 一种选择性整体扩增不同长度dna片段的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉分子生物学领域，公开了一种通过调节变性温度选择性扩增小片段DNA的方法。首先通过改良的接头连接技术将底物DNA与通用接头相连接，然后利用连接产物为底物，以通用接头为模板，利用通用引物，进行底物DNA的PCR选择性扩增。本发明所述方法能够在保证DNA分子完整性的同时，选择性扩增小片段DNA分子。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学以及临床分子诊断领域，特别涉及DNA整体扩增与不同片段DNA分离，尤其涉及血浆游离不同长度DNA片段分离领域，具体指一种通过优化PCR扩增反应条件进行选择性整体扩增不同长度DNA片段的方法。
背景技术
血浆中存在着少量的游离DNA（Cell-free DNA，），这些DNA已逐步成为临床分子诊断重要的材料来源，包括针对产科学的无创性产前诊断技术、肿瘤早期诊断以及靶向药物敏感性的分子诊断，糖尿病相关基因诊断等。但是由于指导疾病诊断的血清DNA（如来源于胎儿细胞以及肿瘤细胞等）含量极少，仅为血浆总游离DNA的19%左右,并且与体细胞释放的DNA混杂在一起，造成高的机体正常DNA背景干扰下进行的，极容易引起误差。如何提高这些与疾病相关DNA浓度，从而提高诊断的灵敏度与特异性，已经成为了亟待解决的问题。
在血浆内DNA片段长度存在的一定的差异，DNA片段大小从几千Kb到几十Kb不等，对疾病诊断有关的DNA片段长度往往集中于一定范围内。如在孕妇母体内的血浆胎儿DNA片段大小集中于300bp左右，而大多数母体DNA分子片段长度大于300bp，血浆肿瘤细胞的DNA片段大小也多在200bp左右，主要是由于这些特殊DNA的来源由于细胞凋亡释放。从此有效富集这一长度片段DNA将有利于疾病诊断的敏感性。现有富集血浆中的不同片段DNA方法主要为以下两种：一种是通过琼脂糖凝胶电泳法将小片段的DNA与大片段DNA分离开，这种方法精确度低，并且极容易带入外源性核酸污染物；另一种是在磁珠法或硅胶模法提取DNA的基础上，通过调整吸附反应体系，选择性吸附小片段的DNA分子，从而达到富集cffDNA的目的。然而血浆中的DNA含量非常少，即使提取效率能够达到100%，仍然需要几毫升甚至几十毫升的血液样品才能够满足常规检测的要求。
发明内容
本发明的目的是为了克服上述现有技术中的缺点，提供一种通过优化扩增反应选择性扩不同片段DNA的方法，该方法能够选择性扩增不同片段的双链DNA分子，特别血浆中的DNA，并且在扩增的同时最大程度上保留DNA片段的完整性。
本发明所采用的技术方案是：
（1）底物DNA的预处理：通过改良的接头连接技术将底物DNA与通用接头相连接；
（2）利用步骤（1）产物为底物，以通用接头为模板，利用通用引物，进行底物DNA的PCR选择性扩增，所述PCR反应按如下步骤进行：
PCR反应体系：3μl的步骤（1）产物、2μl的10×Taq Polymerase Buffer、1.6μl的dNTP（2.5mM each）、1.2μl的MgCl2（25mM）、0.5μl的通用引物（20μM）、0.5μl的Taq Polymerase（2U/μl）、11.2μl的ddH2O；
反应条件是：
（a）72℃ 接头延伸5min，
（b）76.6-86.6℃ 预变性3min，
（c）76.6-86.6℃ 变性20s，
（d）72℃ 退火（每个循环较前一循环降低0.5℃）20s，
（e）72℃ 延伸2min，
（f）重复（c）-（e）30个循环，
（g）76.6-86.6℃ 变性20s，
（h）57℃ 退火20s，
（i）72℃ 延伸2min，
（j）重复（g）-（i）10-20个循环，
（k）72℃ 延伸5min，
（l）4℃ 保温。
本发明的有益效果是，能够在保证DNA分子完整性的同时，选择性扩增小片段DNA分子。
附图说明
图1是实施例2-7产物的电泳结果，其中泳道1为DL2000 DNA Marker，泳道2为实施例2产物，泳道3为实施例3产物,泳道4为实施例4产物，泳道5为实施例5产物，泳道6为实施例6产物，泳道7为实施例7产物,泳道8为空白对照。
具体实施方式
以下用实施例对本发明做进一步详细说明，但并不限定本发明的保护范围。
实施例1
底物DNA的预处理
（1）利用T4 Polymerase将底物DNA的末端钝化。
（2）利用Taq DNA Polymerase将步骤（1）产物DNA加A。
（3）利用T4 DNA Ligase将将步骤（2）产物DNA与通用引物接头链接。
实施例2
DNA的PCR选择性扩增：以实施例1产物为模板，进行如下反应（总体系20μl）：
实施例1产物 3μl
10×Platinum HiProof Taq PCR Buffer 2μl
MgCl2（25mM） 1.2μl
dNTP（2.5mM each） 1.6μl
通用引物（20μM） 0.5μl
Platinum HiProof Taq（2U/μl） 0.5μl
ddH2O补至 20μl
PCR扩增反应条件如下：
72℃ 接头延伸 5min
76.6℃ 预变性 3min
76.6℃ 变性 20s ┐
72℃ 退火（每个循环降低0.5℃） 20s（30个循环）
72℃ 延伸 2min ┘
76.6℃ 变性 20s ┐
57℃ 退火 20s（10个循环）
72℃ 延伸 2min ┘
72℃ 延伸 5min
4℃ 保温 ∞
扩增产物即是选择性扩增的DNA。
实施例3
DNA的PCR选择性扩增：以实施例1产物为模板，进行如下反应（总体系20μl）：
实施例1产物 3μl
10×Platinum HiProof Taq PCR Buffer 2μl
MgCl2（25mM） 1.2μl
dNTP（2.5mM each） 1.6μl
通用引物（20μM） 0.5μl
Platinum HiProof Taq（2U/μl） 0.5μl
ddH2O补至 20μl
PCR扩增反应条件如下：
72℃ 接头延伸 5min
78.4℃ 预变性 3min
78.4℃ 变性 20s ┐
72℃ 退火（每个循环降低0.5℃） 20s（30个循环）
72℃ 延伸 2min ┘
78.4℃ 变性 20s ┐
57℃ 退火 20s（10个循环）
72℃ 延伸 2min ┘
72℃ 延伸 5min
4℃ 保温 ∞
扩增产物即是选择性扩增的DNA。
实施例4
DNA的PCR选择性扩增：以实施例1产物为模板，进行如下反应（总体系20μl）：
实施例1产物 3μl
10×Platinum HiProof Taq PCR Buffer 2μl
MgCl2（25mM） 1.2μl
dNTP（2.5mM each） 1.6μl
通用引物（20μM） 0.5μl
Platinum HiProof Taq（2U/μl） 0.5μl
ddH2O补至 20μl
PCR扩增反应条件如下：
72℃ 接头延伸 5min
80.4℃ 预变性 3min
80.4℃ 变性 20s ┐
72℃ 退火（每个循环降低0.5℃） 20s（30个循环）
72℃ 延伸 2min ┘
80.4℃ 变性 20s ┐
57℃ 退火 20s（10个循环）
72℃ 延伸 2min ┘
72℃ 延伸 5min
4℃ 保温 ∞
扩增产物即是选择性扩增的DNA。
实施例5
DNA的PCR选择性扩增：以实施例1产物为模板，进行如下反应（总体系20μl）：
实施例1产物 3μl
10×Platinum HiProof Taq PCR Buffer 2μl
MgCl2（25mM） 1.2μl
dNTP（2.5mM each） 1.6μl
通用引物（20μM） 0.5μl
Platinum HiProof Taq（2U/μl） 0.5μl
ddH2O补至 20μl
PCR扩增反应条件如下：
72℃ 接头延伸 5min
82.4℃ 预变性 3min
82.4℃ 变性 20s ┐
72℃ 退火（每个循环降低0.5℃） 20s（30个循环）
72℃ 延伸 2min ┘
82.4℃ 变性 20s ┐
57℃ 退火 20s（10个循环）
72℃ 延伸 2min ┘
72℃ 延伸 5min
4℃ 保温 ∞
扩增产物即是选择性扩增的DNA。
实施例6
DNA的PCR选择性扩增：以实施例1产物为模板，进行如下反应（总体系20μl）：
实施例1产物 3μl
10×Platinum HiProof Taq PCR Buffer 2μl
MgCl2（25mM） 1.2μl
dNTP（2.5mM each） 1.6μl
通用引物（20μM） 0.5μl
Platinum HiProof Taq（2U/μl） 0.5μl
ddH2O补至 20μl
PCR扩增反应条件如下：
72℃ 接头延伸 5min
84.6℃ 预变性 3min
84.6℃ 变性 20s ┐
72℃ 退火（每个循环降低0.5℃） 20s（30个循环）
72℃ 延伸 2min ┘
84.6℃ 变性 20s ┐
57℃ 退火 20s（10个循环）
72℃ 延伸 2min ┘
72℃ 延伸 5min
4℃ 保温 ∞
扩增产物即是选择性扩增的DNA。
实施例7
DNA的PCR选择性扩增：以实施例1产物为模板，进行如下反应（总体系20μl）：
实施例1产物 3μl
10×Platinum HiProof Taq PCR Buffer 2μl
MgCl2（25mM） 1.2μl
dNTP（2.5mM each） 1.6μl
通用引物（20μM） 0.5μl
Platinum HiProof Taq（2U/μl） 0.5μl
ddH2O补至 20μl
PCR扩增反应条件如下：
72℃ 接头延伸 5min
86.6℃ 预变性 3min
86.6℃ 变性 20s ┐
72℃ 退火（每个循环降低0.5℃） 20s（30个循环）
72℃ 延伸 2min ┘
86.6℃ 变性 20s ┐
57℃ 退火 20s（10个循环）
72℃ 延伸 2min ┘
72℃ 延伸 5min
4℃ 保温 ∞
扩增产物即是选择性扩增的DNA。
实施例2-7产物的电泳结果如图1所示，其中泳道1为DL2000 DNA Marker，泳道2为实施例2产物，泳道3为实施例3产物,泳道4为实施例4产物，泳道5为实施例5产物，泳道6为实施例6产物，泳道7为实施例7产物,泳道8为空白对照。
本发明使用一种通过调节变性温度选择性扩增小片段DNA的方法，能够在保证DNA分子完整性的同时，选择性扩增小片段DNA分子。
Claims (4)
1.通过调节变性温度选择性扩增小片段DNA的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
（1）底物DNA的预处理：通过改良的接头连接技术将孕妇血浆游离DNA与通用接头相连接；
（2）利用步骤（1）产物为底物，以通用接头为模板，利用通用引物，进行底物DNA的PCR选择性扩增。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）通过改良的接头连接技术是通过对于样本DNA进行末端钝化、加A反应制备成3’端为A粘性末端的底物DNA，再然后将末端为A粘性末端的DNA与连接面的5’端磷酸化、3’端为T粘性末端的通用接头进行连接反应。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）通用引物是与通用接头序列互补的寡核苷酸引物，具体指序列为5’-GCG GTG ACC CGG GAG ATC TGA ATT CT-3’的寡核苷酸引物。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）PCR选择性扩增是按如下步骤进行：
PCR反应体系：3μl的步骤（1）产物、2μl的10×Taq Polymerase Buffer、1.6μl的dNTP（2.5mM each）、1.2μl的MgCl2（25mM）、0.5μl的通用引物（20μM）、0.5μl的Taq Polymerase（2U/μl）、11.2μl的ddH2O；
反应条件是：
（a）72℃ 接头延伸5min，
（b）76.6-86.6℃ 预变性3min，
（c）76.6-86.6℃ 变性20s，
（d）72℃ 退火（每个循环较前一循环降低0.5℃）20s，
（e）72℃ 延伸2min，
（f）重复（c）-（e）30个循环，
（g）76.6-86.6℃ 变性20s，
（h）57℃ 退火20s，
（i）72℃ 延伸2min，
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150128 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |