CN104311654A

CN104311654A - 一种cide3多肽及其抗体的制备和应用

Info

Publication number: CN104311654A
Application number: CN201410391896.0A
Authority: CN
Inventors: 吴芬芳; 陈立勇; 寇尚龙; 侯健; 李尹雄
Original assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Current assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Priority date: 2014-08-11
Filing date: 2014-08-11
Publication date: 2015-01-28

Abstract

本发明公开了一种CIDE3多肽及其抗体的制备和应用，属于生物基因工程和医学领域。所述CIDE3多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，以此序列为抗原制备得到的抗体可特异性识别人CIDE3蛋白。本发明经过大量分析，该SEQIDNO.1所示序列的抗原性、亲水性及表面可及性最强，因此，本发明提供的多克隆抗体对CIDE3蛋白的特异性识别效果非常好，性能稳定，敏感性更高，特异性更强。本发明提供的多克隆抗体可用于特异性识别检测人CIDE3蛋白，有望为肝癌诊断提供帮助，并指导临床预后判断和治疗方案的选择。

Description

一种CIDE3多肽及其抗体的制备和应用

技术领域

本发明属于生物基因工程和医学领域。更具体地，涉及一种CIDE3多肽及其抗体的制备和应用。

背景技术

DNA断裂因子（DNA Fragmentation Factor，DFF）是参与细胞凋亡的一类重要蛋白因子，是由40KD和45KD的两个亚基构成的异二聚体。细胞死亡激活因子（Cell death activator，CIDE）是一类特殊的DNA断裂因子（DFF）。CIDEs 蛋白与DFF 45KD亚基的N段同源，促进细胞凋亡的发生。现在已知的CIDE蛋白中，人类有CIDE-A、CIDE-B和CIDE3。其中，CIDE3基因于2003年发现，位于人类3p25染色体上，全长约169 kb，其cDNA含有1305个碱基，存在选择性剪切。

人CIDE3蛋白存在于原发性肝癌HCC（10/37例）、胃腺癌（4/19例）和乳腺癌（1/17例），HCC细胞中人CIDE3蛋白的阳性表达率（10/37例）显著低于癌旁肝细胞（28/29例）（P<0.05），其中各分化阶段HCC细胞（高、中、低分化）中人CIDE3蛋白的阳性表达率分别低于癌旁肝细胞（P<0.05）。由于人CIDE3基因为凋亡相关基因，而凋亡同肿瘤的发生和发展密切相关，这些结果提示人CIDE3基因同肿瘤的发生有一定的相关性。特别是在HCC中人CIDE3蛋白的阳性表达率明显低于癌旁肝细胞，推测有可能是人CIDE3蛋白的表达缺失引起了凋亡功能障碍或同其他基因发挥着协同作用至使肿瘤的发生与发展。综上所述，CIDE3基因与肝癌之间存在着很强的相关性，提示我们，CIDE3可作为肝癌的一种标志物。

专利200610041899.7公开了一种人CIDE-3蛋白兔抗多克隆抗体，以人CIDE-3蛋白N端172个氨基酸为抗原免疫新西兰白兔获得。该抗体可用于CIDE-3功能的分子生物学及组织学实验研究，但是，其仍存在多肽片段较长，需要重组表达，操作复杂耗时等问题。因此，我们并不满足于此，进一步研究探索CIDE-3蛋白的标记是一项意义重大的研究课题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有CIDE3标记技术的局限和不足，提供一种CIDE3多肽及其抗体的制备和应用。该CIDE3多肽抗体可特异性识别人肝脏肿瘤标志物CIDE3，可用于肝癌标志物CIDE3的检测，进而用于肝脏肿瘤诊断、鉴别诊断、预测肿瘤转移和预后。

本发明的目的是提供一种CIDE3多肽。

本发明的另一目的是提供一种CIDE3多肽的多克隆抗体。

本发明再一目的是提供上述CIDE3多肽及其抗体在特异性标记人肝脏肿瘤标志物CIDE3中应用。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种CIDE3多肽序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。SEQ ID NO.1所示序列为：C-ATEEGQPPKGKASSL。

本发明还提供了一种偶联蛋白抗原，由SEQ ID NO.1所示序列与载体蛋白偶联获得。

优选地，所述载体蛋白为匙孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemacyanin，KLH）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、卵清蛋白（ovalbumin，OVA）或牛甲状腺球蛋白（bovine thyroglobulin，THY）。

更优选地，所述载体蛋白为匙孔血蓝蛋白。

另外，本发明还提供了一种多克隆抗体，是以上述偶联蛋白抗原为抗原制备得到的。

优选地，该多克隆抗体是以上述偶联蛋白抗原免疫兔子制备得到的。

本发明还提供上述多克隆抗体在标记肝脏肿瘤标志物CIDE3中的应用。

本发明从GenBank数据库获得一种人CIDE3氨基酸序列NP_001186481.1，是一种脂滴蛋白，由238个氨基酸组成（如SEQ ID NO.2所示），蛋白分子质量26.8KD。

SEQ ID NO.2所示序列如下：

MEYAMKSLSLLYPKSLSRHVSVRTSVVTQQLLSEPSPKAPRARPCRVSTADRSVRKGIMAYSLEDLLLKVRDTLMLADKPFFLVLEEDGTTVETEEYFQALAGDTVFMVLQKGQKWQPPSEQGTRHPLSLSHKPAKKIDVARVTFDLYKLNPQDFIGCLNVKATFYDTYSLSYDLHCCGAKRIMKEAFRWALFSMQATGHVLLGTSCYLQQLLDATEEGQPPKGKASSLIPTCLKILQ。

本发明对上述CIDE3蛋白氨基酸序列的二级结构、免疫原性、亲疏水性、表面可及性等进行分析，确定了一段合适的肽序列进行人工合成，得到SEQ ID NO.1所示多肽序列；将该多肽序列与马来酰亚胺活化的载体mcKLH偶联，将此偶联产物进行脱盐柱纯化后免疫新西兰兔；经过多次免疫的兔血清用ELISA法对抗体效价进行检测，效价达理想值后收集免疫兔血清，并用CIDE3抗原肽亲和纯化柱纯化抗体；对纯化后抗体进行ELISA、Western Bot等鉴定。鉴定结果表明，该多克隆抗体可特异性识别CIDE3蛋白，可用于检测肝癌细胞表达的CIDE3蛋白，为肝癌诊断提供帮助，并能指导其临床预后判断和治疗方案的选择。

并且本发明提供的抗CIDE3的多克隆抗体是以SEQ ID NO.1所示序列为抗原制备得到，SEQ ID NO.1所示序列即人CIDE3蛋白近C末端的15个氨基酸。本发明经过大量分析，该SEQ ID NO.1所示序列的抗原性、亲水性及表面可及性最强，且位于蛋白C末端，更容易暴露和识别。因此，本发明提供的多克隆抗体对CIDE3蛋白的特异性识别效果好，性能稳定，敏感性高，特异性强。

本发明具有以下有益效果：

本发明选择了CIDE3蛋白近C末端15肽作为候选多肽，并采用人工方法进行多肽合成制备免疫原，进一步免疫新西兰兔获得抗CIDE3的多克隆抗体，最后通过抗原肽亲和纯化方法获得抗CIDE3的单特异性兔多克隆抗体。该单特异性兔多克隆抗体可特异性识别CIDE3蛋白，可用于检测肝脏肿瘤细胞表达的CIDE3蛋白，为肝癌诊断提供帮助，并能指导其临床预后判断和治疗方案的选择。

另外，本发明采用C末端短肽作为抗原，可以直接人工合成，不需要重组表达，制备快捷方便，成本低廉，周期短。此外，该抗原表位明确，且位于C末端更容易暴露，以此抗原免疫动物获得的兔抗体具有单克隆抗体的特性，极易特异性识别临床样本中抗原表位。

附图说明

图1是采用DNAstar软件分析人CIDE3蛋白特性。框中标注的序列为选定的多肽序列，此多肽序列位于CIDE3蛋白质近C末端，其抗原性、亲水性及表面可及性较强。

图2是抗CIDE3多克隆抗体经抗原肽亲和纯化后经SDS-PAGE电泳（12%）检测结果。M为蛋白Marker；Lane 1为上样峰；Lane 2为流穿峰；Lane 3为平衡峰；Lane 4为洗脱峰。

图3是本发明中的抗CIDE3多克隆抗体的Western-Blot鉴定结果。上样为HepG2细胞（人肝癌细胞系）裂解液。

图4本发明中的抗CIDE3多克隆抗体的免疫斑点鉴定。

图5本发明的实施流程。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。在不背离本发明解决问题的技术方案的前提下，本领域普通技术人员对本发明所作的容易实现的任何改动都将落入本发明的权利要求范围之内。

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

实施例1 CIDE3多肽序列的设计

1、CIDE3氨基酸序列

本发明从GenBank数据库获得一种人CIDE3氨基酸序列NP_001186481.1，由238个氨基酸组成（如SEQ ID NO.2所示），蛋白分子质量26.8KD。

SEQ ID NO.2所示序列如下：

2、http://www.uniprot.org/uniprot在线分析CIDE3结构域。

分析结果（如表1所示）显示，人CIDE3蛋白含有1个结构域，即。

表1

其中，aa表示氨基酸，Chain表示DNA链，Domain表示蛋白结构域，Cell death activator CIDE-3就是指细胞凋亡激活蛋白CIDE-3。

3、用DNAstar软件分析CIDE3蛋白特性，分析结果如表2所示。人CIDE3蛋白分子量为26.753KD，等电点为8.75，为碱性蛋白。

表2

其中，各个单词的译文是：Analysis：分析；Molecular Weight：分子量；Length：长度；Molar Extinction Coefficient：摩尔消光系数；Isoelectric Point：等电点（pl）；charge at pH 7：在pH7条件下的电荷；Whole Protein：全蛋白；pMoles即单位pmol。

4、用DNAstar软件分析CIDE3免疫原性、亲疏水性及表面可及性，结果如附图1所示。人CIDE3蛋白近C末端有15个氨基酸抗原性、亲水性及表面可及性较强。因此，本发明选择的多肽序列为ATEEGQPPKGKASSL（215aa~229aa）。

实施例2 偶联蛋白抗原的合成

1、多肽合成

为便于与载体蛋白偶联，合成多肽时在N端加入一个半胱氨酸，即：C-ATEEGQPPKGKASSL。多肽由上海吉尔生化公司合成。

2、多肽与载体蛋白偶联

化学合成的多肽抗原是小分子，本身很难具有好的抗原性，只能诱导动物产生很弱的免疫反应，因而本发明将其与载体蛋白交联。载体蛋白含有很多抗原决定基，能够刺激T辅助细胞，进而诱导 B细胞反应。

用于与多肽交联的载体蛋白有多种，其中最普遍使用的载体是匙孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemacyanin，KLH）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、卵清蛋白（ovalbumin，OVA）和牛甲状腺球蛋白（bovine thyroglobulin，THY）。其中，KLH和BSA是常用的，但是由于BSA也经常被用做检测试验的阻断剂，而使得该方法生产的抗体在应用上存在着一定的局限性。本发明KLH具有更高的抗原性。

3、多肽与载体蛋白偶联：

（1）用200μL超纯水稀释一管马来酰亚胺活化的mcKLH，稀释成10 mg/mL的溶液。（注：上述溶液呈蓝白色半透明状，不得振荡或加热，否则会导致mcKLH沉淀。）

（2）用相当于步骤（1）中溶液1.0~2.5倍体积的偶联Buffer溶解含巯基的半抗原。例如：将2 mg半抗原用200~500μL偶联Buffer溶解，加入到mcKLH。

（注：如果半抗原多肽是易溶的，可以以固体形式加入到mcKLH悬液中。如果半抗原不易溶，可以加入DMSO增加溶解。DMSO在偶联溶解液中浓度低于30%，否则载体蛋白易变性。）

（3）立即混匀多肽、mcKLH，然后在室温反应2h。

4、偶联产物纯化：通过凝胶层析脱盐柱来纯化偶联物

如果偶联物在一周以内注射，用PBS纯化。如果偶联物冻存，用纯化缓冲盐纯化，如果在偶联时形成沉淀，离心，收集上清，保留沉淀，仅纯化上清。将纯化的偶联物与沉淀结合。

纯化步骤如下：

（1）溶解一瓶纯化缓冲盐，加入60mL脱气的超纯水。在4℃保存。

（2）拿去脱盐柱的顶和底的盖子，使存储液排出。一脱盐柱可纯化0.5mL样品。

（3）用3~5倍柱体积（15~25mL）的纯化缓冲液冲洗柱子。

d．将0.5ml的多肽载体混合物直接加入柱中心。加入0.5ml的纯化缓冲液，在分离管中收集各峰。

e．在280nm下测定吸光度以确定哪部分含有偶联物。在第一个吸收峰检测出的将是半抗原偶联物。混合所有含偶联物的部分

f．在含有偶联物的部分出现后，继续向柱内加入缓冲液，收集没有偶联的半抗原。

g．将偶联物过滤除菌，无菌保存在-80℃。

5、结果：考马斯亮兰法测得偶联后蛋白浓度和含量，每管250μg分装，-80℃保存。

实施例3 抗CIDE3兔多克隆抗体的制备及纯化

1、动物免疫

每种偶联产物免疫两只新西兰雄兔，体重2~2.5kg。弗式完全佐剂和弗式不完全佐剂购自Sigma公司。

免疫程序（如表3所示）：

（1）用PBS稀释100μg抗原至1.25mL，用等体积佐剂混匀，旋涡振荡100分钟，检测乳化结果，取一滴抗原滴于水上，一分钟不溶解扩散。

（2）免疫前耳静脉取血，4℃静置后取血清，-80℃保存，作阴性对照血清。

表3

2、抗体效价ELISA检测方法

（1）实验试剂

磷酸盐缓冲液（PBS）（10×浓缩）、氯化钠（NaCl）50g、氯化钾（KCl）1.25g、磷酸二氢钾（KH₂PO₄） 1.25g、磷酸氢二钠（Na₂HPO₄12H₂O）18.1g，蒸馏水加至1000mL，用1M HCl调pH至7.2。

封闭液：正常牛血清10mL、1×PBS（不含吐温）90mL。

洗涤缓冲液：吐温-20（Tween 20）0.2mL、1×PBS 1000mL。

底物显色A液：醋酸钠（CH₃ COONa）13.6g、柠檬酸（C₆H₈O₇H₂O）1.6g、双氧水（H₂O₂ ，30%）0.3mL，蒸馏水加至500mL。

底物显色B液：乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na₂）0.2g、柠檬酸（C₆H₈O₇H₂O）0.95g、甘油（C₃H₈O₃）50mL、四甲基联苯胺（TMB）0.2g，蒸馏水加至 500mL。

终止液（2M H₂SO₄ ）：取浓H₂SO₄ 27.62mL，缓缓加入到473mL的蒸馏水中，混匀即可。

抗原包被液（0.1M碳酸盐缓冲液）pH 9.6：碳酸钠（Na₂CO₃）1.59g、碳酸氢钠（NaHCO₃）2.93g、叠氮钠（NaN₃）0.2g，蒸馏水加至1000mL。

辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG（已商品化）。

（2）实验步骤

S1.抗原包被：纯多肽抗原终浓度一般为1~2μg/mL，用包被液稀释后取100μL加入聚苯乙烯酶联检测板各孔中，4℃过夜后，洗液洗涤3次。建议4℃包被过夜。

S2.封闭：每孔加200μL或加满封闭液，4℃过夜或37℃两小时后，洗涤3次，拍干。置4℃冰箱保存备用。

S3.ELISA检测

S31.加待测样品：兔耳静脉采血后分离血清，用PBS倍比稀释，50~100μL/孔加样到包被好的酶标板中，同时，分别选取免疫前兔血清为阴性对照，37℃孵育30min，洗涤3次，拍干。

S32.加二抗：根据酶标二抗的效价选择稀释倍数，100μL/孔，37℃孵育30min，洗涤3次，拍干。

S33.显色：加入A、B液各80μL /孔，37℃显色15min。

S34.终止：加入终止液80μL /孔。

S35.读数：以450nm单波长测定各孔OD值，以与阴性对照孔OD值的比值（P/N）大于2.5为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点。

3、兔血清收集

采用劲动脉放血法，非抗凝兔全血收集后在37℃孵育2h。

4、抗体纯化：

用CIDE3抗原肽包被NHS活化琼脂糖凝胶（购于GE公司），步骤如下：

（1）用冰预冷的1 mM HCl溶胀1 g NHS活化琼脂糖凝胶干粉，用总体积200 mL的1 mM HCl洗涤四次，每次50 mL。

（2）将10 mg CIDE3抗原肽溶解于4 mL包被缓冲液（含0.1 M NaHCO₃，pH 8.3，0.5 M NaCl）中。

（3）立即转移溶液到活化的NHS活化琼脂糖凝胶中，上下颠倒混匀室温孵育2h。

（4）用0.2 M甘氨酸，pH 8.0室温封闭偶联琼脂糖胶2h。

（5）用0.1 M 乙酸钠，0.5 M NaCl，pH 4.0溶液和包被缓冲液交替洗涤偶联琼脂糖胶4到5次。

免疫兔血清中抗原特异性CIDE3抗体的亲和纯化步骤如下：

（1）20 mL兔血清用0.01M PBS 进行5倍稀释后，用0.45 μm滤膜过滤后上样。

（2）用洗脱缓冲液（0.1 M 甘氨酸 pH=2.7）洗脱目的蛋白，并加入中和缓冲液（1 M Tris-HCl pH=9.0）使抗体中和到中性左右（pH=7.0-8.0），然后将纯化蛋白立即用PBS进行透析。

（3）用超滤杯浓缩后，测定蛋白浓度。储存于4℃冰箱中备用。最后纯化的抗CIDE3抗体经SDS-PAGE初步鉴定。

结果显示，抗体纯化后经SDS-PAGE蛋白电泳鉴定结果如附图2所示，紫外分光光度计测定抗体浓度为1.3mg/mL。纯化后抗体保存于-20℃，0.01M PBS缓冲液中，溶液中含有40%甘油和0.5% BSA。

实施例4 抗CIDE3多克隆抗体的鉴定

1、抗CIDE3多克隆抗体的ELISA鉴定

以合成的CIDE3多肽为检测抗原，包被酶标板，以1：2000稀释的未免疫兔血清作为阴性对照，将兔血清及纯化后的抗体倍比稀释，应用ELISA方法检测，以与阴性血清的比值大于2.1判断为阳性，计算单抗效价。

结果显示，纯化的抗CIDE3抗体的效价达到1：16000（如表4所示）。

表4 抗CIDE3抗体效价

2、抗CIDE3多克隆抗体的Western-Blot鉴定

收集HepG2细胞1×10⁷个，将其裂解后，裂解液进行12% SDS-PAGE电泳，参照《分子克隆》中所述的免疫印迹方法，电转移条件为100 V电泳1 h，封闭液为含5%脱脂奶粉的TBST，一抗为本发明中的CIDE3多克隆抗体（终浓度1.3 mg/mL），二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体，通过ECL显色系统进行免疫印迹分析。

结果显示，本发明的抗CIDE3多克隆抗体可在HepG2细胞裂解液中检测到26.8KD大小左右的蛋白条带，与人CIDE3蛋白分子量大小相符（如附图3所示）。

3、抗CIDE3多克隆抗体的免疫斑点鉴定，CIDE3多肽10μg点PVDF膜，兔抗CIDE3多抗3μg/mL孵育。

结果如附图4所示。

鉴定NG8另外，本发明所做研究的实施流程如附图5所示。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院广州生物医药与健康研究院

<120> 一种CIDE3多肽及其抗体的制备和应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> CIDE3多肽序列

<400> 1

Cys Ala Thr Glu Glu Gly Gln Pro Pro Lys Gly Lys Ala Ser Ser Leu

1 5 10 15

<210> 2

<211> 238

<212> PRT

<213> CIDE3蛋白氨基酸序列

<400> 2

Met Glu Tyr Ala Met Lys Ser Leu Ser Leu Leu Tyr Pro Lys Ser Leu

1 5 10 15

Ser Arg His Val Ser Val Arg Thr Ser Val Val Thr Gln Gln Leu Leu

20 25 30

Ser Glu Pro Ser Pro Lys Ala Pro Arg Ala Arg Pro Cys Arg Val Ser

35 40 45

Thr Ala Asp Arg Ser Val Arg Lys Gly Ile Met Ala Tyr Ser Leu Glu

50 55 60

Asp Leu Leu Leu Lys Val Arg Asp Thr Leu Met Leu Ala Asp Lys Pro

65 70 75 80

Phe Phe Leu Val Leu Glu Glu Asp Gly Thr Thr Val Glu Thr Glu Glu

85 90 95

Tyr Phe Gln Ala Leu Ala Gly Asp Thr Val Phe Met Val Leu Gln Lys

100 105 110

Gly Gln Lys Trp Gln Pro Pro Ser Glu Gln Gly Thr Arg His Pro Leu

115 120 125

Ser Leu Ser His Lys Pro Ala Lys Lys Ile Asp Val Ala Arg Val Thr

130 135 140

Phe Asp Leu Tyr Lys Leu Asn Pro Gln Asp Phe Ile Gly Cys Leu Asn

145 150 155 160

Val Lys Ala Thr Phe Tyr Asp Thr Tyr Ser Leu Ser Tyr Asp Leu His

165 170 175

Cys Cys Gly Ala Lys Arg Ile Met Lys Glu Ala Phe Arg Trp Ala Leu

180 185 190

Phe Ser Met Gln Ala Thr Gly His Val Leu Leu Gly Thr Ser Cys Tyr

195 200 205

Leu Gln Gln Leu Leu Asp Ala Thr Glu Glu Gly Gln Pro Pro Lys Gly

210 215 220

Lys Ala Ser Ser Leu Ile Pro Thr Cys Leu Lys Ile Leu Gln

225 230 235

Claims

1.一种CIDE3多肽序列，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种偶联蛋白抗原，其特征在于，是由SEQ ID NO.1所示序列与载体蛋白偶联获得。

3.根据权利要求2所述偶联蛋白抗原，其特征在于，所述载体蛋白为匙孔血蓝蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白或牛甲状腺球蛋白。

4.根据权利要求2所述偶联蛋白抗原，其特征在于，所述载体蛋白为匙孔血蓝蛋白。

5.一种多克隆抗体，其特征在于，是以权利要求2所述偶联蛋白抗原为抗原制备得到的。

6.根据权利要求5所述多克隆抗体，其特征在于，是以权利要求2所述偶联蛋白抗原免疫兔子制备得到的。

7.权利要求5所述多克隆抗体在标记肝脏肿瘤标志物CIDE3中的应用。